一種扇貝抗氧化肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種利用扇貝加工廢棄物一一扇貝外套膜及加工碎肉，通過生物酶解技術(shù)制備抗氧化肽的方法，屬于食品科學(xué)高新技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]扇本發(fā)明主要利用生物酶解技術(shù)，利用扇貝加工廢棄物制備抗氧化肽，實(shí)現(xiàn)扇貝加工廢棄物的綜合利用的目的。
[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明是利用扇貝加工廢棄物一一扇貝外套膜及加工碎肉，利用蛋白酶進(jìn)行水解，制備抗氧化肽的方法，其特點(diǎn)是:
1)將扇貝外套膜及加工碎肉速凍，搗碎備用；
2)稱取定量扇貝廢棄物，選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解扇貝廢棄物，以水解度和抗氧化活性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出制備扇貝抗氧化肽的最佳蛋白酶；
3)通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝條件；
4)酶解產(chǎn)物進(jìn)一步經(jīng)過超濾、凝膠色譜層析、反向液相色譜等技術(shù)進(jìn)行分離純化，獲得抗氧化肽，并利用質(zhì)譜儀測(cè)定其分子量范圍。
[0004]本發(fā)明具有明顯的優(yōu)點(diǎn)是:
I)產(chǎn)品活性強(qiáng)。通過此工藝可獲得扇貝抗氧化肽，其超氧陰離子的清除率達(dá)到70%以上。
[0005]2)工藝簡(jiǎn)單易于實(shí)施。本發(fā)明只需要經(jīng)過原料處理和酶解過程即可。
[0006]3)產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)了無廢棄物加工，通過本發(fā)明可以使扇貝廢棄物的附加值得到很大的提高，實(shí)現(xiàn)了扇貝無廢棄物加工。
[0007]【具體實(shí)施方式】:
下面通過實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體的說明。
[0008]實(shí)施例1:
1)將扇貝裙邊進(jìn)行速凍后搗碎備用；
2)菠蘿蛋白酶酶解扇貝裙邊制備抗氧化肽的工藝研究。以DPPH清除率即抗氧化活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)得到了菠蘿蛋白酶水解制備扇貝裙邊抗氧化肽的最佳工藝條件。該工藝條件為反應(yīng)溫度68.37°C，pH 9.35，底物濃度6.25%，加酶量6000U/g，反應(yīng)時(shí)間6 ho在此最優(yōu)酶解條件下測(cè)定DPPH的清除率達(dá)到70.32%。
[0009]3)利用超濾技術(shù)對(duì)扇貝裙邊酶解液進(jìn)行初步分離，比較不同截留分子量膜包(10kDa、5kDa、3kDa、lkDa)獲得活性肽組分的體外抗氧化活性。結(jié)果表明:六種分子量多肽組分中，SSPH-n(l kDa?3 kDa)的組分清除DPPH自由基和羥自由基能力最強(qiáng)。
[0010]4)利用葡聚糖凝膠Sephadex G-25對(duì)SSPH-Π進(jìn)行進(jìn)一步純化得到兩個(gè)組分SSPH-n-F^SSPH-n-F2。測(cè)定其DPPH自由基清除能力得知SSPH-11士的抗氧化能力高于SSPH-Π-F2t3RH-HPLC 分離純化 SSPH-m-Fi 并得到單一組分 SSPH-m-F1-P。
[0011]5) RH-HPLC分離純化SSPH-11-F1，得到SSPH-Π-F沖含量相對(duì)較高并且分離效果較好的 SSPH-Π-F1-P7.6)海灣扇貝裙邊多肽的組分SSPH-11-F1-P7經(jīng)過在線凈化液相色譜-四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(Q Exative)分析鑒定可知該組份由7種多肽組成，它們的分子量1000 Da-1700 Da之間。
[0012]貝是一種海產(chǎn)貝類，屬于軟體動(dòng)物門、瓣鰓綱、珍珠貝目、扇貝科。世界上共有扇貝60多種。在我國(guó)分布的扇貝主要有四種，即櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、海灣扇貝及蝦夷扇貝。目前我國(guó)沿海人工養(yǎng)殖量最大的是海灣扇貝。自20世紀(jì)80年代以來，隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，扇貝的養(yǎng)殖量以及凍貝柱、干貝柱的加工和出口量也越來越大。在加工貝柱的過程中產(chǎn)生了大量的加工廢棄物，小部分扇貝加工廢棄物被作為飼料低價(jià)出售，大部分棄于海邊任其腐爛，造成極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。扇貝外套膜及加工碎肉是加工扇貝柱時(shí)的加工廢棄物，其蛋白含量高、氨基酸組成齊全，綜合開發(fā)利用潛力巨大。
[0013]目前，制備活性肽的方法主要有以下幾種:酶解法，微生物發(fā)酵法，生物提取法，化學(xué)降解法，DNA重組法，化學(xué)合成法。(I)酶解法:采用商品蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行適度水解，產(chǎn)品安全性高，生產(chǎn)條件溫和，這是目前制備抗氧化肽的主要手段；(2)微生物發(fā)酵法:從產(chǎn)酶菌中篩選出抗氧化活性肽高產(chǎn)菌株，將其與原料混合，置于最適條件下發(fā)酵，發(fā)酵后對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到抗氧化肽；(3)生物提取法:存在于細(xì)菌、真菌、動(dòng)植物等生物體內(nèi)的激素、酶抑制劑等天然活性肽;(4)化學(xué)降解法:在密閉的容器里，將原料蛋白質(zhì)置于適宜濃度的強(qiáng)酸或強(qiáng)堿溶液中，加熱至適宜溫度并持續(xù)一段時(shí)間后終止反應(yīng)。該法操作簡(jiǎn)單，成本低廉但會(huì)生成有毒物質(zhì)；(5)DNA重組法:獲得抗氧化肽的基因片段，采用分子生物技術(shù)使基因在其它生物體上表達(dá)，以達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)；(6)化學(xué)合成法:采用液相或固相化學(xué)合成法制取，但該法生產(chǎn)成本高，副產(chǎn)物及殘留化合物多等因素而制約其發(fā)展。
[0014]本發(fā)明采用扇貝加工廢棄物作為主要原料，通過篩選優(yōu)良的蛋白酶，優(yōu)化酶解工藝，制備具有較強(qiáng)抗氧化活性的扇貝裙邊酶解產(chǎn)物，進(jìn)一步分離純化得到活性最強(qiáng)的抗氧化組分，得到抗氧化肽產(chǎn)品，使原料變廢為寶達(dá)到綜合利用資源的目的。
[0015]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明主要利用生物酶解技術(shù)，利用扇貝加工廢棄物制備抗氧化肽，實(shí)現(xiàn)扇貝加工廢棄物的綜合利用的目的。
[0017]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明是利用扇貝加工廢棄物一一扇貝外套膜及加工碎肉，利用蛋白酶進(jìn)行水解，制備抗氧化肽的方法，其特點(diǎn)是:
1)將扇貝外套膜及加工碎肉速凍，搗碎備用；
2)稱取定量扇貝廢棄物，選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解扇貝廢棄物，以水解度和抗氧化活性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出制備扇貝抗氧化肽的最佳蛋白酶；
3)通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝條件； 4)酶解產(chǎn)物進(jìn)一步經(jīng)過超濾、凝膠色譜層析、反向液相色譜等技術(shù)進(jìn)行分離純化，獲得抗氧化肽，并利用質(zhì)譜儀測(cè)定其分子量范圍。
[0018]本發(fā)明具有明顯的優(yōu)點(diǎn)是:
I)產(chǎn)品活性強(qiáng)。通過此工藝可獲得扇貝抗氧化肽，其超氧陰離子的清除率達(dá)到70%以上。
[0019]2)工藝簡(jiǎn)單易于實(shí)施。本發(fā)明只需要經(jīng)過原料處理和酶解過程即可。
[0020]3)產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)了無廢棄物加工，通過本發(fā)明可以使扇貝廢棄物的附加值得到很大的提高，實(shí)現(xiàn)了扇貝無廢棄物加工。
[0021]【具體實(shí)施方式】:
下面通過實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體的說明。
[0022]實(shí)施例1:
1)將扇貝裙邊進(jìn)行速凍后搗碎備用；
2)菠蘿蛋白酶酶解扇貝裙邊制備抗氧化肽的工藝研究。以DPPH清除率即抗氧化活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)得到了菠蘿蛋白酶水解制備扇貝裙邊抗氧化肽的最佳工藝條件。該工藝條件為反應(yīng)溫度68.37°C，pH 9.35，底物濃度6.25%，加酶量6000U/g，反應(yīng)時(shí)間6 ho在此最優(yōu)酶解條件下測(cè)定DPPH的清除率達(dá)到70.32%。
[0023]3)利用超濾技術(shù)對(duì)扇貝裙邊酶解液進(jìn)行初步分離，比較不同截留分子量膜包(10kDa、5kDa、3kDa、lkDa)獲得活性肽組分的體外抗氧化活性。結(jié)果表明:六種分子量多肽組分中，SSPH-n(l kDa?3 kDa)的組分清除DPPH自由基和羥自由基能力最強(qiáng)。
[0024]4)利用葡聚糖凝膠Sephadex G-25對(duì)SSPH-Π進(jìn)行進(jìn)一步純化得到兩個(gè)組分SSPH-Π-F^SSPH-n-F2。測(cè)定其DPPH自由基清除能力得知SSPH-Π 士的抗氧化能力高于SSPH-Π-F2t3RH-HPLC 分離純化 SSPH-m-Fi 并得到單一組分 SSPH-m-F1-P。
[0025]5) RH-HPLC分離純化SSPH-Π -F1，得到SSPH-Π -F沖含量相對(duì)較高并且分離效果較好的 SSPH-Π-F1-P7.6)海灣扇貝裙邊多肽的組分SSPH-11-F1-P7經(jīng)過在線凈化液相色譜-四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(Q Exative)分析鑒定可知該組份由7種多肽組成，它們的分子量1000 Da-1700 Da之間。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種扇貝抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下制備過程: (1)將扇貝外套膜及加工碎肉速凍，搗碎備用；以DPPH清除率即抗氧化活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)得到了菠蘿蛋白酶水解制備扇貝裙邊抗氧化肽的最佳工藝條件，在最優(yōu)酶解條件下DPPH的清除率達(dá)到70%以上； (2)利用超濾技術(shù)對(duì)扇貝裙邊酶解液進(jìn)行初步分離，比較不同截留分子量膜包獲得活性肽組分的體外抗氧化活性;利用葡聚糖凝膠Sephadex G_25和反相HPLC分離純化抗氧化肽，對(duì)抗氧化活性最高的組分進(jìn)行在線凈化液相色譜-四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(QExative)分析鑒定，抗氧化肽由7種多肽組成，它們的分子量1000 Da?1700 Da之間。
【專利摘要】一種扇貝抗氧化肽的制備方法，本發(fā)明選用扇貝加工廢棄物——扇貝外套膜及加工碎肉為主要原料，通過生物酶解技術(shù)制備抗氧化肽的方法。以DPPH清除率即抗氧化活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)定反應(yīng)溫度，pH值，底物濃度為三個(gè)待優(yōu)化因素，利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行優(yōu)化分析，得到菠蘿蛋白酶水解制備扇貝裙邊抗氧化肽的最佳工藝條件，在此最優(yōu)酶解條件下測(cè)定DPPH的清除率達(dá)到70.32%。所得產(chǎn)品可作為功能食品直接食用或作為附加材料添加到其他食品中，增強(qiáng)保健作用，實(shí)現(xiàn)廢棄物綜合環(huán)保利用。
【IPC分類】C12P21/06, C07K1/16, C07K1/36, C07K1/34, C07K1/20
【公開號(hào)】CN105713945
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610271264
【發(fā)明人】桑亞新, 王向紅, 李榮喬, 李彩, 劉衛(wèi)華, 韓軍
【申請(qǐng)人】河北農(nóng)業(yè)大學(xué)