一種利用米曲霉發(fā)酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用米曲霉發(fā)酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，具體涉及一種抗氧化效果顯著的羅非魚魚皮抗氧化活性肽的制備方法，屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有研究表明，魚皮的蛋白質(zhì)含量比魚體的其他部位高，且魚皮中膠原含量最高可占其蛋白質(zhì)總量的80%以上。尤其是羅非魚皮，其蛋白質(zhì)含量達(dá)23%，僅次于草魚皮(29.80%)，約占其干重的88.5%ο所以羅非魚皮是一種很好的膠原蛋白原料。而從前人的研究情況看，膠原蛋白酶解產(chǎn)物中至少包括了抗菌肽、ACE抑制肽、抗氧化肽等。這些特性使膠原蛋白及其水解產(chǎn)物在醫(yī)療、保健及美容方面具有良好的應(yīng)用前景，同時(shí)也為從羅非魚皮魚皮膠原蛋白酶解液中制備抗氧化肽奠定了基礎(chǔ)。針對(duì)此現(xiàn)象，中國(guó)專利CN101225104開發(fā)了羅非魚魚皮小分子肽螯合鋅鹽的制備方法，但沒有涉及到抗氧化活性肽的制備方法，更沒有涉及到發(fā)酵法制備羅非魚魚皮抗氧化活性肽的方法。因此，目前發(fā)酵法制備羅非魚魚皮抗氧化活性肽的研究是一個(gè)新的領(lǐng)域。
[0003]微生物發(fā)酵法是以底物蛋白作為發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分之一，選擇優(yōu)良的發(fā)酵菌種，利用微生物在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的蛋白酶水解底物蛋白制備生物活性肽。微生物發(fā)酵法制備生物活性肽具有有機(jī)溶劑使用量少、高效等特點(diǎn)。
[0004]本專利選擇羅非魚魚皮為原料，針對(duì)目前羅非魚加工業(yè)中加工利用率低，產(chǎn)品形式單一，精深加工及研究少等現(xiàn)狀，運(yùn)用生物發(fā)酵技術(shù)制備具有抗氧化活性的多肽。不僅能夠回收利用魚皮中的膠原蛋白，擴(kuò)大膠原蛋白和抗氧化肽的資源，拓寬膠原蛋白的應(yīng)用范圍，實(shí)現(xiàn)羅非魚皮等加工下腳料的潔凈(環(huán)保型)利用，豐富產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，提高我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展能力，增強(qiáng)在國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力，縮短與發(fā)達(dá)國(guó)家在海洋生物資源綜合利用技術(shù)和理論上的差距有重大意義；同時(shí)還能填補(bǔ)發(fā)酵法制備羅非魚皮抗氧化肽的相關(guān)空白，為抗氧化類產(chǎn)品的研發(fā)和作為功能性食品、藥品及化妝品輔料和功能因子積累有效的參考數(shù)據(jù)，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和良好的社會(huì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種利用米曲霉發(fā)酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，能充分滿足市場(chǎng)上對(duì)抗氧化活性肽的需求，最大限度的為人類提供健康的食品原料，并在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)羅非魚加工下腳料一魚皮的高值化利用。
[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
一種利用米曲霉發(fā)酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，包括如下步驟:
(1)預(yù)處理:清洗后的羅非魚魚皮經(jīng)脫脂后，依次用0.1-0.13mol/L的鹽酸溶液和0.1-0.12mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡1_2小時(shí)；
(2)水提:預(yù)處理后的魚皮經(jīng)洗滌至中性后，在45-50°C條件下，用1-2倍體積的蒸餾水恒溫勻漿8-10小時(shí)后，抽濾提取上清液； (3)滅菌:提取的上清液在121°C條件下滅菌20分鐘，然后冷卻備用；
(4)米曲霉發(fā)酵:種子液添加量為1_8%，在溫度為28-31°C，pH為6-8條件下發(fā)酵50-80小時(shí)；
(5)離心超濾:將上述發(fā)酵液于5000r/min離心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量為lOkDa的超濾膜進(jìn)行處理，得到超濾液；
(6)冷凍干燥:將超濾液于-40?_50°C，真空度0~20Pa下進(jìn)行冷凍干燥，即得到抗氧化活性肽產(chǎn)品。
[0007]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)是:
(1)通過生物發(fā)酵法制備羅非魚魚皮抗氧化活性肽；
(2)本發(fā)明制備的羅非魚魚皮抗氧化活性肽抗氧化效果顯著，其DPPH自由基和羥自由基的IC50值分別為1.09 mg/mL和L 21mg/mL，是一種極具潛力的生物活性肽原料；
(3)生物活性肽由于其安全、易吸收、成本低等特點(diǎn)，具有良好的市場(chǎng)前景。本發(fā)明采用酶法水解米渣蛋白制備抗氧化活性肽，不僅原料成本低廉，而且所得到的活性肽具有氨基酸組成合理、低過敏性、安全可靠等特點(diǎn)，特別是具有較強(qiáng)的抗氧化性，是極具潛力的一種功能性食品基料；
(4)本發(fā)明是以羅非魚加工下腳料一魚皮為原料，提供一種利用米曲霉發(fā)酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，大大提高了羅非魚下腳料的附加值，且生產(chǎn)成本低，工藝簡(jiǎn)便，綠色環(huán)保，實(shí)現(xiàn)了羅非魚下腳料的高值化利用，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0008]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實(shí)施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。
[0009]實(shí)施例1
一種利用米曲霉發(fā)酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，包括如下步驟:
(1)預(yù)處理:清洗后的羅非魚魚皮經(jīng)脫脂后，依次用0.13mol/L的鹽酸溶液和0.lmol/L的氫氧化鈉溶液浸泡1小時(shí)；
(2)水提:預(yù)處理后的魚皮經(jīng)洗滌至中性后，在50°C條件下，用1倍體積的蒸餾水恒溫勻漿8小時(shí)后，抽濾提取上清液；
(3)滅菌:提取的上清液在121°C條件下滅菌20分鐘，然后冷卻備用；
(4)米曲霉發(fā)酵:種子液添加量為1%，在溫度為28°C，pH為6條件下發(fā)酵50小時(shí)；
(5)離心超濾:將上述發(fā)酵液于5000r/min離心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量為lOkDa的超濾膜進(jìn)行處理，得到超濾液；
(6)冷凍干燥:將超濾液于_40°C，真空度20Pa下進(jìn)行冷凍干燥，即得到抗氧化活性肽
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[0010]實(shí)施例2
一種利用米曲霉發(fā)酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，包括如下步驟:
(1)預(yù)處理:清洗后的羅非魚魚皮經(jīng)脫脂后，依次用0.13mol/L的鹽酸溶液和0.lmol/L的氫氧化鈉溶液浸泡1小時(shí)；
(2)水提:預(yù)處理后的魚皮經(jīng)洗滌至中性后，在50°C條件下，用2倍體積的蒸餾水恒溫勻漿10小時(shí)后，抽濾提取上清液；
(3)滅菌:提取的上清液在121°C條件下滅菌20分鐘，然后冷卻備用；
(4)米曲霉發(fā)酵:種子液添加量為8%，在溫度為31°C，pH為8條件下發(fā)酵80小時(shí)；
(5)離心超濾:將上述發(fā)酵液于5000r/min離心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量為lOkDa的超濾膜進(jìn)行處理，得到超濾液；
(6)冷凍干燥:將超濾液于_50°C，真空度5Pa下進(jìn)行冷凍干燥，即得到抗氧化活性肽產(chǎn)品Ο
[0011]實(shí)施例3
稱取900.8g沖洗干凈的羅非魚魚皮，脫脂處理后依次用700ml的0.llmol/L的鹽酸溶液和0.llmol/L的氫氧化鈉溶液浸泡2小時(shí)，蒸餾水洗滌至中性后，在48°C條件下，用1500ml的蒸餾水恒溫勻漿10小時(shí)，抽濾提取得到上清液；
滅菌:提取的上清液在121°C條件下滅菌20分鐘，然后冷卻備用；
米曲霉發(fā)酵:種子液添加量為5%，在溫度為28°C，pH為7條件下發(fā)酵70小時(shí)；
離心超濾:將上述發(fā)酵液于5000 r/min離心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量為lOkDa的超濾膜進(jìn)行處理，得到超濾液；
冷凍干燥:將超濾液于_45°C，真空度10Pa下進(jìn)行冷凍干燥，即得到抗氧化活性肽產(chǎn)品Ο
[0012]DPPH自由基清除活性的測(cè)定:清除穩(wěn)定的DPPH自由基的能力已被廣泛用來測(cè)試各種抗氧化物的抗氧化能力。不同濃度的羅非魚魚皮發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力隨著濃度的增加而增長(zhǎng)。經(jīng)計(jì)算，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)物的濃度達(dá)到7.7mg/mL時(shí)其DPPH自由基清除率可達(dá)99.91%，表現(xiàn)出與Vc相似的自由基清除能力。
[0013]用IC50值(清除率為50%時(shí)的抗氧化劑濃度)來評(píng)估清除能力，IC50值越低表示自由基清除能力越高。羅非魚魚皮發(fā)酵產(chǎn)物的IC50值為1.09mg/mL。
[0014]羥自由基清除活性測(cè)定:細(xì)胞中發(fā)生的許多生化反應(yīng)均與羥自由基有關(guān)，它可導(dǎo)致DNA斷裂、突變、脂質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)變性等多種病理性變化，羥自由基是已知的最強(qiáng)氧化劑。羅非魚魚皮發(fā)酵產(chǎn)物的羥自由基清除能力隨著發(fā)酵產(chǎn)物濃度的增加而增加。經(jīng)計(jì)算當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)物濃度為8.8 mg/mL時(shí)米渣蛋白發(fā)酵產(chǎn)物的羥自由基清除率為99.78%，表現(xiàn)出與Vc相似的自由基清除能力。羅非魚魚皮產(chǎn)物的IC50值為1.21mg/mL。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用米曲霉發(fā)酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，其特征在于:包括如下步驟:(1)預(yù)處理:清洗后的羅非魚魚皮經(jīng)脫脂后，依次用0.1-0.13mol/L的鹽酸溶液和.0.1-0.12mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡1-2小時(shí)； (2)水提:預(yù)處理后的魚皮經(jīng)洗滌至中性后，在45-50°C條件下，用1-2倍體積的蒸餾水恒溫勻漿8-10小時(shí)后，抽濾提取上清液； (3)滅菌:提取的上清液在121°C條件下滅菌20分鐘，然后冷卻備用； (4)米曲霉發(fā)酵:種子液添加量為1-8%，在溫度為28-31°C，pH為6-8條件下發(fā)酵50-80小時(shí)； (5)離心超濾:將上述發(fā)酵液于5000r/min離心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量為lOkDa的超濾膜進(jìn)行處理，得到超濾液； (6)冷凍干燥:將超濾液于-40?-50°C，真空度0~20Pa下進(jìn)行冷凍干燥，即得到抗氧化活性肽產(chǎn)品。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用米曲霉發(fā)酵羅非魚魚皮制備抗氧化活性肽的方法，屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域；以羅非魚魚皮為原料，經(jīng)預(yù)處理、提取后，以米曲霉為發(fā)酵菌株對(duì)羅非魚魚皮進(jìn)行發(fā)酵、而后經(jīng)離心、超濾、冷凍干燥得到羅非魚魚皮抗氧化活性肽；其發(fā)酵條件為：以米曲霉為發(fā)酵菌株，種子液添加量為1-8%，在溫度為25-31℃，pH為6-8條件下發(fā)酵50-80小時(shí)；本發(fā)明制備的羅非魚魚皮抗氧化活性肽抗氧化效果顯著，其DPPH自由基和羥自由基的IC50值分別為1.09mg/mL和1.21mg/mL，是一種極具潛力的生物活性肽原料。
【IPC分類】C12P21/00, C12R1/69
【公開號(hào)】CN105255972
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510776192
【發(fā)明人】汪恒森
【申請(qǐng)人】汪恒森
【公開日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年11月13日