一種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蘿卜硫素的獲取方法，尤其涉及一種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]西蘭花中含有豐富的抗癌物質(zhì)蘿卜硫素，被美國《時代周刊》評為十大最佳營養(yǎng)蔬菜之一。西蘭花可以增強機體免疫力、促進生長、增強血管韌性等功效，可以預(yù)防患乳腺癌、胃癌等癌癥的風(fēng)險。西蘭花種子與幼苗中的蘿卜硫素含量低，但毛狀根培養(yǎng)體系中蘿卜硫素的產(chǎn)量高。
[0003]目前，蘿卜硫素制備方法主要有化學(xué)合成法和酶法?；瘜W(xué)合成法工藝復(fù)雜，中間產(chǎn)物難以控制;酶法是目前常用的蘿卜硫素制備方法。但西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中蘿卜硫素的提取鮮有報道，對蘿卜硫素的提取大多數(shù)都集中在西蘭花幼苗、花蕾、種子中，且未有西蘭花毛狀根中蘿卜硫素外分泌的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡單、高效的從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法。
[0005]為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法，包括以下步驟:
⑴將西蘭花毛狀根按接種量為鮮重0.1g接種于300mL的液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，15d后得到增殖培養(yǎng)的西蘭花毛狀根;然后于超凈工作臺上，用滅菌后的鑷子取出所述液體培養(yǎng)基中所述培養(yǎng)后的西蘭花毛狀根，置于濾紙上，吸附根表面水分，經(jīng)冷凍干燥至恒重后研磨成粉末，得到凍干的毛狀根粉末;同時，所述液體培養(yǎng)基封口置于4°C條件下保存；
⑵將新收獲的芥籽粉碎至55?65目，得到芥籽粉;該芥籽粉用蒸餾水經(jīng)超聲波振蕩提取后真空抽濾除雜，得到粗酶液；
(3)將所述凍干的毛狀根粉末按照Ig:1OmL?Ig: 30mL加入粗酶液，攪拌均勻，于35°C下靜置酶解0.5?1.5h，然后用體積濃度為70?95%的乙醇經(jīng)超聲波振蕩提取后真空抽濾除雜，得到蘿卜硫素粗提液；
⑷將所述蘿卜硫素粗提液先于45?55°C真空濃縮，再于65°C濃縮，得到膏狀物A;所述膏狀物A用其質(zhì)量3?5倍的乙酸乙酯溶解后經(jīng)蒸餾水萃取2?3次，得到乙酸乙酯相A;
(5)將所述步驟⑴中的液體培養(yǎng)基與乙酸乙酯按1:1?3的體積比萃取2?3次，得到乙酸乙酯相B;
(6)將所述乙酸乙酯相A與所述乙酸乙酯相B合并后，在50?60°C下真空濃縮，得到膏狀物B，該膏狀物用其質(zhì)量5?10倍的甲醇溶解，得到蘿卜硫素甲醇溶液，該蘿卜硫素甲醇溶液于-10°C下避光保存?zhèn)溆茫?br> ⑵將所述蘿卜硫素甲醇溶液于40?50°C真空濃縮至膏狀，即得蘿卜硫素粗提物； (8)所述蘿卜硫素膏狀粗提物經(jīng)冷凍干燥至恒重，即得純度為5?30%的蘿卜硫素粗品。
[0006]所述液體培養(yǎng)基均指MS基本培養(yǎng)基。
[0007]所述步驟⑴與所述步驟(8)中冷凍干燥的條件均是指先對材料進行預(yù)冷凍，待溫度達至lj-35—45°C時抽真空，待壓力達到25?35Pa開始加熱;從-35至O°C，每5°C為一個階段，每階段控溫加熱0.5?1.5h，最后在5 °C控溫加熱I?3h即可。
[0008]所述步驟⑵中超聲波振蕩提取的條件是指料液比為Ig:55?65mL，溫度為30?40 °C，超聲波功率為700?900W，提取時間為8?12min。
[0009]所述步驟⑶中超聲波振蕩提取的條件是指凍干的毛狀根粉末與乙醇的料液比為Ig: 15-30mL，溫度為30?40 °C，超聲波功率為700?900W，提取時間為15?45min。
[0010]所述步驟⑷和所述步驟(6)及所述步驟(7)中真空濃縮的條件均是指真空度為-0.06?-0.08MPa。
[0011 ]所述步驟⑷中乙酸乙酯與蒸餾水的體積比為I: I?3。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:
1、本發(fā)明合并提取毛狀根及其液體培養(yǎng)基中的蘿卜硫素，且毛狀根培養(yǎng)基中含有大量的蘿卜硫素，填補了蘿卜硫素的分泌性研究空白。
[0013]2、本發(fā)明接種量為鮮重0.1g接種于300mL的液體MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個周期(15d)的西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中蘿卜硫素收獲量可達3~6.25mg，毛狀根生物量可達4.5?5g。
[0014]3、本發(fā)明投資少，工藝簡單，適合工廠化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0015]實施例1一種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法，包括以下步驟: ⑴將西蘭花毛狀根按接種量為鮮重0.1g接種于300mL的液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，15d后得到增殖培養(yǎng)后的西蘭花毛狀根;然后于超凈工作臺上，用滅菌后的鑷子取出液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的西蘭花毛狀根，置于濾紙上，吸附根表面水分，經(jīng)冷凍干燥至恒重后研磨成粉末，得到凍干的毛狀根粉末;同時，液體培養(yǎng)基封口置于4°C條件下保存。
[0016]其中:冷凍干燥的條件是指先對材料進行預(yù)凍，待溫度達到-35°C時抽真空，待壓力達到25Pa開始加熱；從-35至(TC，每5°C為一個階段，每階段控溫加熱0.5h，最后在5°C控溫加熱Ih即可。
[0017]⑵將新收獲的芥籽粉碎至55目，得到芥籽粉;該芥籽粉用蒸餾水以lg:55mL的料液比在溫度為30°C、超聲波功率為700W的條件下經(jīng)超聲波振蕩提取Smin后真空抽濾除雜，得到粗酶液。
[0018]⑶將凍干的毛狀根粉末按照lg:1OmL加入粗酶液，攪拌均勻，于35°C下靜置酶解
0.5h，然后用體積濃度為70%的乙醇經(jīng)超聲波振蕩提取后真空抽濾除雜，得到蘿卜硫素粗提液。
[0019]其中:超聲波振蕩提取的條件是指凍干的毛狀根粉末與乙醇的料液比為lg:15mL，溫度為30°C，超聲波功率為700W，提取時間為15min。
[0020]⑷將蘿卜硫素粗提液先于45°C、真空度為_0.06MPa條件下真空濃縮(除去大部分乙醇)，再于65°C濃縮，得到膏狀物A(完全除去乙醇)；膏狀物A用其質(zhì)量3倍的乙酸乙酯溶解后經(jīng)蒸餾水萃取2次，得到乙酸乙酯相A。
[0021]其中:乙酸乙酯與蒸餾水的體積比為ImL:l mL。
[0022](5)將步驟⑴中的液體培養(yǎng)基與乙酸乙酯按I mL:l mL的體積比萃取2次，得到乙酸乙酯相B。
[0023](6)將乙酸乙酯相A與乙酸乙酯相B合并后，在50°C、真空度為-0.06MPa條件下真空濃縮，得到膏狀物B，該膏狀物用其質(zhì)量5倍的甲醇溶解，得到蘿卜硫素甲醇溶液，該蘿卜硫素甲醇溶液于-10°C下避光保存?zhèn)溆谩?br>[0024]⑵將蘿卜硫素甲醇溶液于40°C、真空度為-0.06MPa條件下真空濃縮至膏狀，即得蘿卜硫素粗提物。
[0025](8)蘿卜硫素膏狀粗提物經(jīng)冷凍干燥至恒重，即得純度為5%的蘿卜硫素粗品。
[0026]其中:冷凍干燥的條件同步驟⑴。
[0027]實施例2—種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法，包括以下步驟: ⑴將西蘭花毛狀根按接種量為鮮重0.1g接種于300mL的液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，15d后得到增殖培養(yǎng)后的西蘭花毛狀根;然后于超凈工作臺上，用滅菌后的鑷子取出液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的西蘭花毛狀根，置于濾紙上，吸附根表面水分，經(jīng)冷凍干燥至恒重后研磨成粉末，得到凍干的毛狀根粉末;同時，液體培養(yǎng)基封口置于4°C條件下保存。
[0028]其中:冷凍干燥的條件是指先對材料進行預(yù)凍，待溫度達到-40°C時抽真空，待壓力達到30Pa開始加熱;從-35至(TC，每5°C為一個階段，每階段控溫加熱lh，最后在5°C控溫加熱2h即可。
[0029]⑵將新收獲的芥籽粉碎至65目，得到芥籽粉;該芥籽粉用蒸餾水以lg:65mL的料液比在溫度為40°C、超聲波功率為900W的條件下經(jīng)超聲波振蕩提取12min后真空抽濾除雜，得到粗酶液。
[0030]⑶將凍干的毛狀根粉末按照Ig:30mL加入粗酶液，攪拌均勻，于35 V下靜置酶解
1.5h，然后用體積濃度為95%的乙醇經(jīng)超聲波振蕩提取后真空抽濾除雜，得到蘿卜硫素粗提液。
[0031]其中:超聲波振蕩提取的條件是指凍干的毛狀根粉末與乙醇的料液比為lg:30mL，溫度為40°C，超聲波功率為900W，提取時間為45min。
[0032]⑷將蘿卜硫素粗提液先于55°C、真空度為-0.0SMPa條件下真空濃縮(除去大部分乙醇)，再于65°C濃縮，得到膏狀物A(完全除去乙醇)；膏狀物A用其質(zhì)量5倍的乙酸乙酯溶解后經(jīng)蒸餾水萃取3次，得到乙酸乙酯相A。
[0033]其中:乙酸乙酯與蒸餾水的體積比為ImL:3 mL。
[0034](5)將步驟⑴中的液體培養(yǎng)基與乙酸乙酯按I mL:3 mL的體積比萃取2次，得到乙酸乙酯相B。
[0035](6)將乙酸乙酯相A與乙酸乙酯相B合并后，在60°C、真空度為-0.0SMPa條件下真空濃縮，得到膏狀物B，該膏狀物用其質(zhì)量10倍的甲醇溶解，得到蘿卜硫素甲醇溶液，該蘿卜硫素甲醇溶液于-10°C下避光保存?zhèn)溆谩?br>[0036]⑵將蘿卜硫素甲醇溶液于50°C、真空度為-0.0SMPa條件下真空濃縮至膏狀，即得蘿卜硫素粗提物。
[0037](8)蘿卜硫素膏狀粗提物經(jīng)冷凍干燥至恒重，即得純度為20%的蘿卜硫素粗品。
[0038]其中:冷凍干燥的條件同步驟⑴。
[0039]實施例3—種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法，包括以下步驟: ⑴將西蘭花毛狀根按接種量為鮮重0.1g接種于300mL的液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，15d后得到增殖培養(yǎng)后的西蘭花毛狀根;然后于超凈工作臺上，用滅菌后的鑷子取出液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的西蘭花毛狀根，置于濾紙上，吸附根表面水分，經(jīng)冷凍干燥至恒重后研磨成粉末，得到凍干的毛狀根粉末;同時，液體培養(yǎng)基封口置于4°C條件下保存。
[0040]其中:冷凍干燥的條件是指先對材料進行預(yù)凍，待溫度達到-45°C時抽真空，待壓力達到35Pa開始加熱；從-35至(TC，每5°C為一個階段，每階段控溫加熱1.5h，最后在5°C控溫加熱3h即可。
[0041]⑵將新收獲的芥籽粉碎至60目，得到芥籽粉;該芥籽粉用蒸餾水以lg:60mL的料液比在溫度為35°C、超聲波功率為800W的條件下經(jīng)超聲波振蕩提取1min后真空抽濾除雜，得到粗酶液。
[0042]⑶將凍干的毛狀根粉末按照Ig:20mL加入粗酶液，攪拌均勻，于35 V下靜置酶解lh，然后用體積濃度為85%的乙醇經(jīng)超聲波振蕩提取后真空抽濾除雜，得到蘿卜硫素粗提液。
[0043]其中:超聲波振蕩提取的條件是指凍干的毛狀根粉末與乙醇的料液比為lg:25mL，溫度為35°C，超聲波功率為800W，提取時間為30min。
[0044]⑷將蘿卜硫素粗提液先于50°C、真空度為_0.07MPa條件下真空濃縮(除去大部分乙醇)，再于65°C濃縮，得到膏狀物A(完全除去乙醇)；膏狀物A用其質(zhì)量4倍的乙酸乙酯溶解后經(jīng)蒸餾水萃取2次，得到乙酸乙酯相A。
[0045]其中:乙酸乙酯與蒸餾水的體積比為ImL:2 mL。
[0046](5)將步驟⑴中的液體培養(yǎng)基與乙酸乙酯按I mL:2 mL的體積比萃取3次，得到乙酸乙酯相B。
[0047](6)將乙酸乙酯相A與乙酸乙酯相B合并后，在55°C、真空度為-0.07MPa條件下真空濃縮，得到膏狀物B，該膏狀物用其質(zhì)量8倍的甲醇溶解，得到蘿卜硫素甲醇溶液，該蘿卜硫素甲醇溶液于-10°C下避光保存?zhèn)溆谩?br>[0048](7)將蘿卜硫素甲醇溶液于45°C、真空度為-0.07MPa條件下真空濃縮至膏狀，即得蘿卜硫素粗提物。
[0049](8)蘿卜硫素膏狀粗提物經(jīng)冷凍干燥至恒重，即得純度為30%的蘿卜硫素粗品。
[0050]其中:冷凍干燥的條件同步驟⑴。
[0051 ]上述實施例1?3中的液體培養(yǎng)基均指MS基本培養(yǎng)基。
【主權(quán)項】
1.一種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法，包括以下步驟: ⑴將西蘭花毛狀根按接種量為鮮重0.1g接種于300mL的液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，15d后得到增殖培養(yǎng)的西蘭花毛狀根;然后于超凈工作臺上，用滅菌后的鑷子取出所述液體培養(yǎng)基中所述培養(yǎng)后的西蘭花毛狀根，置于濾紙上，吸附根表面水分，經(jīng)冷凍干燥至恒重后研磨成粉末，得到凍干的毛狀根粉末;同時，所述液體培養(yǎng)基封口置于4°C條件下保存； ⑵將新收獲的芥籽粉碎至55?65目，得到芥籽粉;該芥籽粉用蒸餾水經(jīng)超聲波振蕩提取后真空抽濾除雜，得到粗酶液； (3)將所述凍干的毛狀根粉末按照lg:1OmL?lg:30mL加入粗酶液，攪拌均勻，于35°C下靜置酶解0.5?1.5h，然后用體積濃度為70?95%的乙醇經(jīng)超聲波振蕩提取后真空抽濾除雜，得到蘿卜硫素粗提液； ⑷將所述蘿卜硫素粗提液先于45?55°C真空濃縮，再于65°C濃縮，得到膏狀物A;所述膏狀物A用其質(zhì)量3~5倍的乙酸乙酯溶解后經(jīng)蒸餾水萃取2?3次，得到乙酸乙酯相A; (5)將所述步驟⑴中的液體培養(yǎng)基與乙酸乙酯按1:1?3的體積比萃取2?3次，得到乙酸乙酯相B; (6)將所述乙酸乙酯相A與所述乙酸乙酯相B合并后，在50?60°C下真空濃縮，得到膏狀物B，該膏狀物用其質(zhì)量5?10倍的甲醇溶解，得到蘿卜硫素甲醇溶液，該蘿卜硫素甲醇溶液于-10°C下避光保存?zhèn)溆茫? ⑵將所述蘿卜硫素甲醇溶液于40?50°C真空濃縮至膏狀，即得蘿卜硫素粗提物； (8)所述蘿卜硫素膏狀粗提物經(jīng)冷凍干燥至恒重，即得純度為5?30%的蘿卜硫素粗品。2.如權(quán)利要求1所述的一種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法，其特征在于:所述液體培養(yǎng)基均指MS基本培養(yǎng)基。3.如權(quán)利要求1所述的一種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法，其特征在于:所述步驟⑴與所述步驟(8)中冷凍干燥的條件均是指先對材料進行預(yù)冷凍，待溫度達到_35~-45°C時抽真空，待壓力達到25?35Pa開始加熱；從-35至(TC，每5°C為一個階段，每階段控溫加熱0.5?1.5h，最后在5 °C控溫加熱I?3h即可。4.如權(quán)利要求1所述的一種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法，其特征在于:所述步驟⑵中超聲波振蕩提取的條件是指料液比為lg:55?65mL，溫度為30?40 °C，超聲波功率為700?900W，提取時間為8?12min。5.如權(quán)利要求1所述的一種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法，其特征在于:所述步驟⑶中超聲波振蕩提取的條件是指凍干的毛狀根粉末與乙醇的料液比為Ig: 15?30mL，溫度為30?40 °C，超聲波功率為700?900W，提取時間為15?45min。6.如權(quán)利要求1所述的一種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法，其特征在于:所述步驟⑷和所述步驟(6)及所述步驟(7)中真空濃縮的條件均是指真空度為-0.06—0.08MPa。7.如權(quán)利要求1所述的一種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法，其特征在于:所述步驟⑷中乙酸乙酯與蒸餾水的體積比為1:1?3。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中獲取蘿卜硫素的方法，該方法包括以下步驟：⑴將西蘭花毛狀根接種于液體培養(yǎng)基，經(jīng)增殖培養(yǎng)后冷凍干燥并研磨成粉末，得到凍干的毛狀根粉末；⑵將新收獲的芥籽粉碎后經(jīng)超聲波振蕩提取、抽濾除雜，得到粗酶液；⑶凍干的毛狀根粉末中加入粗酶液，經(jīng)酶解、超聲波振蕩提取后真空抽濾除雜，得到蘿卜硫素粗提液；⑷將蘿卜硫素粗提液濃縮后萃取，得到乙酸乙酯相A；⑸將液體培養(yǎng)基萃取，得到乙酸乙酯相B；⑹合并乙酸乙酯相A與乙酸乙酯相B后經(jīng)真空濃縮、溶解，得到蘿卜硫素甲醇溶液；⑺蘿卜硫素甲醇溶液真空濃縮，即得蘿卜硫素粗提物；⑻蘿卜硫素膏狀粗提物干燥，即得純度為5~30%的蘿卜硫素粗品。本發(fā)明簡單，高效。
【IPC分類】C07C331/22, C12P13/00
【公開號】CN105713937
【申請?zhí)枴緾N201610050128
【發(fā)明人】李勝, 馬紹英, 俞穎, 張真, 李秉建
【申請人】甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)