專(zhuān)利名稱(chēng)：制備聚環(huán)氧烷羧酸的高效方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備高純度的活化的聚環(huán)氧烷酸(polyalkylene oxide acid)和 酯的改良的和更有效的方法。
背景技術(shù)：
水溶性聚環(huán)氧烷(polyalkylene oxide) ("PAO")與治療部分(如蛋白和多肽) 的結(jié)合是已知的。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利4,179,337,其公開(kāi)內(nèi)容在此引用作為參 考。'337專(zhuān)利公開(kāi)了用PEG修飾的生理學(xué)活性的多肽延長(zhǎng)了在體內(nèi)循環(huán)的 周期，該多肽具有降^f氐的免疫原性和抗原性。
為了使PAO與其它化合物結(jié)合，首先必須將聚合物的羥基末端轉(zhuǎn)化為 活性官能團(tuán)。該過(guò)程通常稱(chēng)作"活化"，且產(chǎn)物稱(chēng)作活化的聚環(huán)氧烷或活化的 PAO。
對(duì)于大多數(shù)，研究已經(jīng)涉及將PAO與蛋白質(zhì)、酶和多肽的s氨基共價(jià) 連接。PAO與賴(lài)氨酸氨基的共價(jià)連接受連接基團(tuán)的影響，如琥珀?；?N-羥 基琥珀酰亞胺酯(如Abuchowski等人，Cancer Biochem. Biophys" 7， 175-86 (1984))、氮雜內(nèi)酯、亞氨酸芳基酯(aryl imidates)和環(huán)狀酰亞胺硫酮(cyclic imide thiones)。例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,298,643、 5,321,095和5,349,001。每 篇上述專(zhuān)利的內(nèi)容在此引用作為參考。PAO也已經(jīng)用肼基活化，從而將聚合 物偶聯(lián)至活化的碳水化合物基團(tuán)。
而且，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了 PAO (如聚乙二醇("PEG"))的末端羥基向羧酸的轉(zhuǎn) 化。PEG-酸至少可以用于兩個(gè)方面。第一，羧酸衍生物可以直4妄用于通過(guò)可 用的羥基或氨基部分結(jié)合親核物質(zhì)。第二， PEG羧酸可以用作中間體以形成 其它類(lèi)型的活化的聚合物。例如mPEG羧酸可以通過(guò)N-羥基琥珀酰亞胺和 縮合劑(如二異丙基碳二亞胺)轉(zhuǎn)化為琥珀酰亞胺基酯衍生物。其它活化的 PAO可以通過(guò)活性酯與肼反應(yīng)制備PAO-酰肼衍生物。
共有(co-owned)的美國(guó)專(zhuān)利5,605,976 ('976專(zhuān)利)在此引用作為參考，解 決了許多以前在制備聚環(huán)氧烷羧酸(polyalkylene oxide carboxylic acid)中的困
難。該'976專(zhuān)利教導(dǎo)了制備PAO羧酸的方法，該方法通過(guò)在;成存在下使 PAO(即PAO-OH)與卣代乙酸叔烷基酯反應(yīng)，形成PAO的叔烷基酯，然后將 PAO叔烷基酯與酸反應(yīng)形成所需的聚環(huán)氧烷羧酸。
開(kāi)發(fā)了'976專(zhuān)利的方法后，需要進(jìn)一步的改善。例如，隨著NMR儀器 的改善，批量的PEG-酸仍含有 5。/。 PEG-OH雜質(zhì)變得明顯起來(lái)。而且，檢 測(cè)到含原始PEG-OH的污染水平隨聚合物分子量，且隨二取代的和支鏈PEG 聚合物的使用趨于增加。而且，該'976專(zhuān)利所教導(dǎo)的方法需要至少18小時(shí) 的反應(yīng)時(shí)間，以及需要反應(yīng)溶劑的回流和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。
由于至少上述原因，本領(lǐng)域中仍然長(zhǎng)期需求更快速的方法，且由此更經(jīng) 濟(jì)的制備PAO羧酸的方法，而且需要制備具有更高純度的PAO酸和中間體 的方法，而不含任何可檢測(cè)的PAO-OH污染物。本發(fā)明解決了這些需求。
發(fā)明概述
一方面，本發(fā)明包括以高純度制備聚環(huán)氧烷羧酸和其相關(guān)中間體的方 法。所述方法包括首先制備聚環(huán)氧烷的叔烷基酯，然后轉(zhuǎn)化為其羧酸衍生物。 聚環(huán)氧烷的叔烷基酯通過(guò)下述步驟制備
(a) 在第一溶劑體系中，使聚環(huán)氧烷與堿反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間約IO分鐘至 約60分鐘；和
(b) 在第二溶劑體系中，使步驟(a)的產(chǎn)物與卣代乙酸叔烷基酯反應(yīng)， 反應(yīng)時(shí)間小于約30分鐘。步驟(a)和(b)的反應(yīng)在約10 。C至約35 。C的溫度下 進(jìn)行。
然后通過(guò)聚環(huán)氧烷的叔烷基酯與酸反應(yīng)，將所得的聚環(huán)氧烷的叔烷基酯 轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸，形成聚環(huán)氧烷羧酸。該方法以高產(chǎn)率和高純度有利地提 供了產(chǎn)物。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，優(yōu)選的聚環(huán)氧烷包括聚乙二醇和co-曱氧基-聚乙二 醇。優(yōu)選的卣代乙酸叔烷基酯包括溴代-或氯代-乙酸叔丁基酯以及其它卣代 乙酸的叔醇酯。該方法中所用的優(yōu)選的堿包括，例如叔丁醇鉀、丁基鋰等。 該方法使用金屬叔丁醇化物在醇(如叔丁醇或)或在其它惰性溶劑(如曱苯)中 進(jìn)行。
本發(fā)明的方法可以使用大約等摩爾比的鹵代乙酸叔烷基酯與聚環(huán)氧烷 進(jìn)行。然而優(yōu)選地，卣代乙酸7J5l烷基酯以大于聚環(huán)氧烷的摩爾量存在。本發(fā)明的另 一方面中，提供了制備高純度CX和/或CO取代的聚環(huán)氧烷的
方法，所述a和/或co取代的聚環(huán)氧烷如PEG-肼、PEG-酰胺和PEG-酯，其 包括琥珀酰亞胺基、曱基和乙基酯。這些方面包括將上述聚環(huán)氧烷羧酸轉(zhuǎn)化 為所需的末端被取代的聚合物。
本發(fā)明的另 一個(gè)方面中，公開(kāi)了制備聚環(huán)氧烷-生物學(xué)活性的親核體結(jié) 合物的方法。本發(fā)明的該方面中，聚環(huán)氧烷羧酸與生物學(xué)活性的親核體反應(yīng)， 從而在聚合物和生物學(xué)活性親核體之間形成酯連接。例如，在本發(fā)明的該方 面中，可以使用雙-活化的PEG制備紫杉醇-2， PEG-單酯和20-喜樹(shù)堿 (campthothecin) PEG-酉旨或二酯。
本發(fā)明的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)為即使與最近開(kāi)發(fā)的技術(shù)相比，所得到的聚環(huán) 氧烷羧酸是以高純度制備的。因此，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可觀察的量的產(chǎn)品污染，即起 始物質(zhì)，如m-PEG-OH,即優(yōu)選發(fā)現(xiàn)的量小于約2%，且優(yōu)選小于1%,且最 優(yōu)選小于0.5%。結(jié)果，不需要從起始醇分離所需的羧酸衍生物。而且，不 需要冗長(zhǎng)的離子交換或反相HPLC技術(shù)以得到所需的羧酸衍生物。


圖1為對(duì)應(yīng)于實(shí)施例1的NMR圖譜。
圖2為對(duì)應(yīng)于比較實(shí)施例4的NMR圖鐠。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了制備聚環(huán)氧烷羧酸和合成中間體(如聚環(huán)氧烷的叔烷基酉旨) 的改進(jìn)的方法。總體來(lái)說(shuō)，PAO羧酸通過(guò)在適合的堿中使PAO(即PAO-OH) 與適合的囟代乙酸叔烷基酯反應(yīng)，得到PAO叔烷基酯，然后使PAO叔烷基 酯與酸反應(yīng)得到PAO羧酸。上述方法在回流下反應(yīng)，然后旋轉(zhuǎn)干燥以從溶 劑體系中分離產(chǎn)物?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)這些方法步驟都使PAO叔烷基酯部分地恢復(fù) 為起始物料，即再形成PAO-醇。該逆反應(yīng)產(chǎn)生不希望的雜質(zhì)，如高分子量 的PEG雜質(zhì)和具有不同連接的PEG-藥物結(jié)合物(cojugate)，從而導(dǎo)致更慢和 效率更4氏的反應(yīng)方法。
因此，與上述制備PAO酯和酸的方法相反，出人意料的發(fā)現(xiàn)當(dāng)在堿存 在下，在最低實(shí)際溫度范圍和最低有效濃度的堿下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)得到了改善。 反應(yīng)溫度的下限根據(jù)反應(yīng)試劑和產(chǎn)物在所選溶劑體系中的沉淀點(diǎn)設(shè)定。下面
進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
1.聚合物取代基和聚環(huán)氧烷
本發(fā)明的羧酸衍生物優(yōu)選由室溫下水溶性的聚(環(huán)氧烷)(PAO's)制備，例 如聚乙二醇。co-取代的聚環(huán)氧烷衍生物，如曱氧基聚(乙二醇)(mPEG-OH) 在這些基團(tuán)的范圍中。其它適合的烷基-取代的PAO衍生物包括含有那些單-末端d-C4基團(tuán)的衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選直鏈的非-抗原性 (non-antigenic)聚合物，如單曱基PEG均聚物。在其它實(shí)施方案中，優(yōu)選使 用支鏈聚合物或"U-PEGs"，取決于與聚合物結(jié)合的試劑或藥物的性質(zhì)?；蛘?， 也可使用聚環(huán)氧烷，如其它聚(乙二醇)均聚物、其它的烷基-聚(乙二醇)嵌段 共聚物，和聚(環(huán)氧烷)的嵌段共聚物的共聚物。本發(fā)明的聚合物的分子量為 約200至約100,000道爾頓，且優(yōu)選為約2,000至約80,000道爾頓。然而最 優(yōu)選為約4,000至約50,000道爾頓。
為了說(shuō)明而不是為了限制，聚乙二醇(PEG)殘基可以為下述基團(tuán)的 一種
Me-0-(CH2CH20)x-CH2CH2-0-
Me-0-(CH2CH20)x-CH2CH2-S-
-0-CH2CH2-0-(CH2CH20)x-CH2CHrO-,和
-S-CH2CH2-0-(CH2CH20)x-CH2CH2-S-。
聚合物的聚合度表示在聚合物鏈中重復(fù)單元的數(shù)目，且依賴(lài)于聚合物的 分子量。雖然，基本上非-抗原性聚合物，PAO's和PEG'S可以基本上在重均 分子量中變化，但優(yōu)選在本發(fā)明的大多數(shù)方面中，R,的重均分子量為約200 至約100,000道爾頓。更優(yōu)選地，基本上為非-抗原性聚合物的重均分子量為 約2,000至約48,000道爾頓。
PEG也可以為"星狀-PEG"或多臂PEG，如在NOF Corp. Drug Delivery System catalog, 2005中所公開(kāi)的那些，其公開(kāi)內(nèi)容在此引用作為參考。尤其 是，PEG可以為下式
<formula>formula see original document page 7</formula>
或
)、0、
CH2CH2_(0CH2CH2)「O
卜o、
CH2CH2—(OCH2CH2)j-
-0
Q—(CH2CH20)j—CH2CH
-"
、(CH2CH20)j—CH2CH2-0'
其中
j為約10至約340的整數(shù)，使得優(yōu)選纟是供具有約12,000至約40，000總 分子量的聚合物；且該殘基的至少l個(gè)但至多3個(gè)末端被甲基或其它低級(jí)烷 基封端(capped)。轉(zhuǎn)化為C02H衍生物之前的這些化合物包括
H3c、(0CH2CH2)j\■0.
H3C、(OCH2CH2)f"
O
O、
,(CH2CH20)r
、CH,CH,
—OH
■(CH2CH20)
(OCH2CH2)j、0
H3C (OCH2CH2)fO
"CH2CH20)j O
O
、CH2CH2、oh
(C 、CH2CH2\
OH
-(OCH2CH2)j\0
<formula>formula see original document page 8</formula> <formula>formula see original document page 9</formula>
本發(fā)明的范圍內(nèi)也考慮了其它具有末端C02H的PEG-基化合物的形成， 包括共同轉(zhuǎn)讓(commonly assigned)的美國(guó)專(zhuān)利5,605,976、 5,643,575 、 5,919,455
和6,113,906中所述的支鏈聚合物殘基，其公開(kāi)內(nèi)容在此引用作為參考。一 些對(duì)應(yīng)于式I的具體聚合物的代表性例子包括 (2a)
<formula>formula see original document page 10</formula>(2b)
<formula>formula see original document page 10</formula>
和
(2c)
<formula>formula see original document page 10</formula>
其中
、L2和L3獨(dú)立地選自雙功能連接基且或者L2可以為支《連連接基基團(tuán)， 如二氨基烷基或賴(lài)氨酸殘基。參見(jiàn)，例如，上述美國(guó)專(zhuān)利6,113,906;且 z為1至約120的整數(shù)。
對(duì)于普通技術(shù)人員，雙功能連接基團(tuán)是已知的。因此，Lw部分可以獨(dú) 立地選自雙功能連接基團(tuán)，如下述非限制性化合物中的一個(gè)
-NH(CH2CH20)y(CH2)qNR9-，
-NH(CH2CH20)yC(0)-,
-NH(CF^oRn)qOC(0)-,
-C(O)(CR10R")qNHC(O)(CR13R12)qNR9-,
-C(。)。(CH2)qO-，
-C(O)(CR10R")qNR9- -C(0)NH(CH2CH20)y(CH2)qNR9-, -C(0)CT(CH2CH20)yNR9-,
-C(O)O(CR10R")qO-， -C(0)NH(CH2CH20)y-,
隱MH(CF^n)q
<CR13R12)tOC(0)-
和
-NH(CR10R")q-^ >~~(CR13R12)tNR9C(0)-
其中
119.13獨(dú)立地選自d.6烷基等，且優(yōu)選為H或CH3;
Ri4選自與定義R^3的基團(tuán)一樣的基團(tuán)，以及N02、 d，6鹵代-烷基和鹵
素；
q、 t和y每個(gè)獨(dú)立地選自1至約12的正整lt。
本發(fā)明的方法還可以用下列物質(zhì)進(jìn)行其它的聚合物質(zhì)如葡聚糖或其它 相似的能夠被官能化或活化為單-或二-羧酸的非-免疫原性聚合物，如葡聚 糖、聚乙烯醇、糖-基的聚合物、羥基丙基-曱基丙烯酰胺(HPMA)、聚環(huán)氧 烷和/或其共聚物。也參見(jiàn)共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)專(zhuān)利6,153,655，其內(nèi)容在此引用 作為參考。上述列表僅為說(shuō)明性的，且不是為了限制適合在本文中使用的非 -抗原性聚合物的種類(lèi)。
2.叔烷基酯衍生物的合成
本發(fā)明用于制備聚環(huán)氧烷羧酸的方法包括首先通過(guò)下述方法制備PAO 的叔烷基酯衍生物
(a) 在第一溶劑體系中，使聚環(huán)氧烷與石咸反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為約IO分鐘至 約60分鐘，或更優(yōu)選時(shí)間為約20分鐘至約40分鐘，
(b) 在第二溶劑體系中，使步驟(a)的產(chǎn)物與卣代乙酸叔烷基酯反應(yīng)，反 應(yīng)時(shí)間小于30分鐘，如從約1分鐘至約30分鐘，或更優(yōu)選時(shí)間為約1分鐘
至約15分鐘，得到PAO叔烷基酯。
所述溶劑體系優(yōu)選從步驟(a)至步驟(b)保持相同，如同溫度一樣，溫度 優(yōu)選為約10。C至約35。C，或更優(yōu)選為約20至約31 。C。因此第一和第二溶 劑體系通常是相同的。為了使PAO叔烷基酯的逆反應(yīng)最小化，PAO在溶劑 體系中必須足夠稀。PAO與溶劑體系的比例優(yōu)選為約1 g的PAO比約10-25 ml或更多的溶劑體系。更優(yōu)選地，PAO與溶劑體系的比例為約1 g的PAO 比約15 ml的溶劑體系。
可以使用任何合適的本領(lǐng)域已知的方法，如通過(guò)向溶劑體系加入可混溶 的溶劑，該溶劑對(duì)于反應(yīng)產(chǎn)物是相對(duì)不溶的，和/或通過(guò)降低溶劑體系的溫度， 從溶劑體系中沉淀PAO叔烷基酯反應(yīng)產(chǎn)物。收集沉淀物，用適合的非溶解 性溶劑洗滌一次或多次，且進(jìn)一步純化，如通過(guò)重結(jié)晶。
溶劑體系可以為任何合適的本領(lǐng)域已知的溶劑或所選溶劑的混合物，從
而使反應(yīng)物和反應(yīng)產(chǎn)物含于溶液中。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇溶劑體系 以避免在低溫時(shí)反應(yīng)物和反應(yīng)產(chǎn)物沉淀。如下所示，所述溶劑體系包括曱苯， 如100%曱苯，且沉淀劑為乙醚。在替代實(shí)施方案中，所述溶劑體系任選包 括濃度范圍99%至5%的曱苯，與一種或多種其它相容的溶劑(如二氯曱烷和 /或二氯乙烯)混合。
所述堿選自叔丁醇鉀、叔丁醇鈉、丁基鋰、氨基鈉、氫化鈉及其組合。 適合的卣代乙酸-，又烷基酯為下式化合物
<formula>formula see original document page 12</formula>其中X為氯、溴或碘；
RL3獨(dú)立地選自d.8烷基、被取代的烷基或支鏈烷基、芳基如苯基或取 代的苯基。
優(yōu)選的卣代乙酸叔丁基酯包括溴代乙酸叔丁基酯、氯代乙酸叔丁基酯、 和碘代乙酸叔丁基酯。這些囟代乙酸叔丁基酯可購(gòu)自，例如Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo?；蛘?，可以使用三苯曱基酯或取代的芳基酯。
3.羧酸衍生物的合成 為了制備PAO羧酸，然后在適合的溶劑體系中，在合適的酸的存在下， 將所得PAO叔烷基酯進(jìn)行反應(yīng)，得到PAO羧酸。所述用于酸化反應(yīng)的溶劑 體系示例性的如二氯曱烷，雖然也任選使用其它合適的本領(lǐng)域已知的溶劑， 如氯仿或二氯乙烷。所述酸為任何有效產(chǎn)生所需PAO羧酸的本領(lǐng)域已知的 酸，包括，例如三氟乙酸、硫酸、磷酸和鹽酸。三氟乙酸為示例性的，且在 本發(fā)明的 一些方面中是優(yōu)選的。
制備本發(fā)明PAO羧酸的第一步驟包括形成中間體聚環(huán)氧烷羧酸的叔丁 基酯。該中間體通過(guò)在石威存在下，使PAO與上述卣代乙酸4又丁基酯反應(yīng)形 成。優(yōu)選的堿為叔丁醇鉀，雖然也可以使用例如丁基鋰、氨基鈉或氫化鈉的 替代物。本文所述的方法中使用的這些堿可以為固體形式，或更優(yōu)選溶解在 適合的溶劑中，如叔丁醇、苯、曱苯、四氫呋喃(THF)、 二曱基曱酰胺(DMF)、 二曱亞砜(DMSO)、己烷等。
為了形成中間體，聚環(huán)氧烷與卣代乙酸^k丁基酯反應(yīng)，二者的量為大約 摩爾比為約1:1至約1:10。然而優(yōu)選地，卣^乙酸^又丁基酯以摩爾比約1:8 存在。而且，堿與聚環(huán)氧烷的摩爾比范圍為約1:1至約1:2。
一旦形成叔丁基酯中間體后，可以容易地得到聚環(huán)氧烷的羧酸衍生物， 且其純度超過(guò)92%，優(yōu)選超過(guò)97%,更優(yōu)選超過(guò)99%，且最優(yōu)選超過(guò)99.5% 的純度。因此，污染物，尤其是對(duì)于起始物料，如mPEG-OH或PEG 二醇 僅是痕量的。在本發(fā)明優(yōu)選的方面中，當(dāng)制備單或二-聚乙二醇羧酸時(shí)，通 過(guò)"CNMR檢測(cè)，在終產(chǎn)物中起始物料污染物的量小于1%。
在本發(fā)明的該方面中，叔丁基酯中間體與至少等量的酸(如三氟乙酸)反 應(yīng)以提供PAO的末端被取代的羧酸?；蛘?，可以使用稀鹽酸(即約1N)、硫 酸、磷酸等。過(guò)量使技術(shù)人員將叔丁基酯中間體轉(zhuǎn)化為所需羧酸衍生物，并 消除了 PEG或相關(guān)起始聚合物料的緩沖能力。與酸反應(yīng)的溫度不如與石成反 應(yīng)的溫度嚴(yán)格，且與酸的反應(yīng)通常在環(huán)境溫度，如約18至約30。C的溫度下 進(jìn)行。
在保證中間體向最終酸衍生物轉(zhuǎn)化足夠的時(shí)間后(可為約2-3小時(shí))，得 到所需的單-或二-羧酸衍生物。然而反應(yīng)時(shí)間在一定程度上將根據(jù)具體的反 應(yīng)物和反應(yīng)條件而改變。中間體轉(zhuǎn)化為最終所需羧酸后，使用例如本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員已知的技術(shù)(如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等)通過(guò)蒸餾除去溶劑，即二氯曱烷。所 得殘余物從下述溶劑中重結(jié)晶得到最終產(chǎn)物，所述溶劑為二氯曱烷/乙醚、2-
丙醇、二曱基曱酰胺/2-丙醇、甲苯/乙醚或曱苯/己烷。
完成該新穎的方法后，因?yàn)楸疚乃龅姆椒ㄒ苑浅８叩募兌?即優(yōu)選大
于99。/。)提供了所需的羧酸，所以不需要額外的通過(guò)常規(guī)方法的純化，因此
當(dāng)需要藥物級(jí)聚合物時(shí)，對(duì)于技術(shù)人員本發(fā)明明顯節(jié)約了時(shí)間、勞動(dòng)力和物料。
4. 其它a和/或Q末端部分
本發(fā)明的其它方面，可以使用單-或二-羧酸衍生物以形成其它活化的聚 環(huán)氧烷。例如，末端羧S吏基團(tuán)可以轉(zhuǎn)化為
I. 能夠與氨基反應(yīng)的官能團(tuán)，如
a) 琥珀酰亞胺基酯；
b) 羰基咪唑；
c) 氮雜內(nèi)酯；
d) 環(huán)狀酰亞胺石克酮(cyclic imide thiones);
e) 異氰酸或異錄b氰酸；或
f) 醛
II. 能夠與羧酸基團(tuán)和反應(yīng)性的羰基反應(yīng)的官能團(tuán)，如肼或酰肼官能 團(tuán)，如酰基酰肼(acyl hydrazide)、肼基曱酸酯(carbazates)、肼基 半曱酸酉旨(semicarbazates)、肼基硫代曱酸酯(thiocarbazates)等。
使用本領(lǐng)域技術(shù)普通人員已知的技術(shù)而不用過(guò)度的實(shí)驗(yàn)可以將 PEG-C02H轉(zhuǎn)化為多種其它離去基團(tuán)。在相關(guān)文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
末端活化基團(tuán)也可以包括位于聚環(huán)氧烷附近的間隔部分。間隔部分可以 為雜烷基、烷氧基、含有最多18個(gè)碳原子的烷基或甚至其它聚合物鏈。可 以使用標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)加入間隔部分。
5. 羧酸衍生物的轉(zhuǎn)化
聚合物羧酸衍生物也作為高純度的中間體，用于形成其它聚環(huán)氧烷衍生 物。例如，可以從PAO羧酸活化的N-羥基琥珀酰亞胺酯使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò) 與適合的反應(yīng)物(酰胺、肼等)縮合形成高純度的酰胺、酰肼、其它酯等。
或者，通過(guò)使羧酸與二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或二異丙基碳二亞胺在堿 存在下反應(yīng)，可以將羧酸衍生物轉(zhuǎn)化為琥珀酰亞胺基酯。
這些隨后的轉(zhuǎn)化反應(yīng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)普通人員來(lái)說(shuō)基本上是已知的標(biāo)
準(zhǔn)技術(shù)。本發(fā)明特征的一個(gè)重要方面是中間體，如PEG-羧酸是基本上純的 (99+%),且由此保證了基本上純的最終產(chǎn)物。
6.適于結(jié)合的生物學(xué)活性物質(zhì)
與羧酸衍生物結(jié)合的親核體被稱(chēng)為"生物學(xué)活性"。然而，該術(shù)語(yǔ)并不限 于生理學(xué)或藥理學(xué)活性。例如， 一些親核體結(jié)合物，如那些含有酶的親核體 結(jié)合物，能夠在有機(jī)溶劑中催化反應(yīng)。同樣， 一些發(fā)明的聚合物結(jié)合物也可 用于實(shí)驗(yàn)室診斷。所有的結(jié)合物的關(guān)鍵特征是保持了至少部分的與未修飾的 生物學(xué)活性物質(zhì)相關(guān)的活性。
關(guān)于本發(fā)明的一個(gè)方面，C02H-PEG書(shū)f生物與親核體反應(yīng)，該親核體具 有可用的羥基部分能夠經(jīng)歷取代反應(yīng)而不損失生物學(xué)活性，其與聚合物的羧 酸衍生物，如高純度的PEG-COOH，在足以引起形成兩個(gè)取代基之間的酯
為限制，本發(fā)明的前藥通常通過(guò)下述步驟制備
1) 如本文制備，提供活化的聚合物，如PEG-酸或PEG-二酸，和生物 學(xué)活性化合物，該化合物上具有形成可水解連接(linkage)的位置，和
2) 使2個(gè)取代基在惰性溶劑中，如二氯曱烷、氯仿、曱苯或DMF中， 在偶聯(lián)試劑和堿存在下在0°C至高達(dá)22。C(室溫)下進(jìn)行反應(yīng)，所述偶聯(lián)試劑 如1,3-二異丙基-碳二亞胺(DIPC)、 1，(3-二曱基氨基丙基)3-乙基碳二亞胺 (EDC)、任何適合的二烷基碳二亞胺、Mukaiyama試劑(如2-卣代-l-烷基-口比 咬錯(cuò)卣化物)或丙烷磷酸環(huán)酐(propane phosphonic acid cyclic anhydride) (PPACA)等，這些偶聯(lián)試劑購(gòu)自，例如Sigma Chemical,或使用已知技術(shù)合 成，且所述堿如二曱基氨基吡啶(優(yōu)選的)、二異丙基乙基胺、吡啶、三乙胺 等。
可以與本文制備的聚合物結(jié)合的化合物的示例性例子如下所示 <formula>formula see original document page 16</formula>紫杉醇
<formula>formula see original document page 16</formula>7
<formula>formula see original document page 16</formula>-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿(SN38)
托泊替康
和任何數(shù)量的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的小分子，所述小分子具有與本文所
述的活化的聚合物結(jié)合的-OH基團(tuán)。當(dāng)多于1個(gè)OH可用于結(jié)合時(shí)，需要使
用本領(lǐng)域已知的保護(hù)或去保護(hù)技術(shù)得到適合地凈皮保護(hù)的化合物。
在本發(fā)明的另一方面中，當(dāng)羧酸已經(jīng)轉(zhuǎn)化為其它末端官能團(tuán)，如琥珀酰 亞胺基酯時(shí)，通過(guò)使聚合物與含有可用氨基的生物學(xué)活性親核體反應(yīng)實(shí)現(xiàn)活
化的聚合物與所需的親核體的結(jié)合。也參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利5,122,614，其公 開(kāi)內(nèi)容在此引用作為參考。相似地，當(dāng)使用其它連接基團(tuán)(如部分3中所述 的那些基團(tuán))時(shí)，可以通過(guò)使所需的活化的聚合物與含有所需的目標(biāo)連接基 團(tuán)(即麗2、 COOH等)的生物學(xué)活性物質(zhì)反應(yīng)制備PAO-結(jié)合物。應(yīng)該理解選 擇用于完成這些結(jié)合反應(yīng)的條件使得保持結(jié)合物的最佳的生物學(xué)活性。
所述結(jié)合物(conjugate)是生物學(xué)活性的且具有多種治療應(yīng)用。需要治療 (包括生物學(xué)活性物質(zhì))的哺乳動(dòng)物可以通過(guò)給藥有效量的含有所需生物活 性物質(zhì)的聚合物結(jié)合物治療。例如，可以向需要酶替代療法或血液因子的哺
乳動(dòng)物給予含有所需物質(zhì)的聚合物結(jié)合物。這些結(jié)合物的劑量為足以實(shí)現(xiàn)所 需治療結(jié)果的量，且根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)對(duì)于普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明關(guān)注的生物學(xué)活性親核物質(zhì)包括，但不限于，蛋白、肽、多肽、 酶、天然和合成的有機(jī)分子，如藥物化學(xué)物等。
所關(guān)注的酶包括碳水化合物-特異性的酶、蛋白水解酶、氧化還原酶、 轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和連接酶。不限制在具體的酶中，所關(guān)注 的酶的實(shí)例包括天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、?？嗝摪泵?、超氧
化物歧化酶、內(nèi)毒素酶(endotoxinases)、過(guò)氧化氫酶、糜蛋白酶、脂肪酶、 尿酸酶、酰苦二磷酸酶、酪氨酸酶和膽紅素氧化酶。所關(guān)注的碳水化合物-特異性酶包括葡萄糖氧化酶、糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖腦苦脂酶、葡糖 芬酸酵(glucouronidases)等。
所關(guān)注的蛋白、多肽和肽包括，但不限于血紅蛋白、血清蛋白，如血液 因子，包括因子VII、 VIII和IX;免疫球蛋白、細(xì)胞因子如白介素，a-、 (3-和y-干擾素、集落刺激因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子、血小板衍生的生長(zhǎng)因 子和磷脂酶-活化的蛋白(PLAP)。 一般生物學(xué)或治療所關(guān)注的其它蛋白質(zhì)包 括胰島素、植物蛋白如外源凝集素和蓖麻毒素、腫瘤壞死因子、生長(zhǎng)因子、 組織生長(zhǎng)因子、TGFa's或TGF(3's和表皮生長(zhǎng)因子、激素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、促 紅細(xì)胞生成素、色素激素(pigmentary hormones)、 下丘腦釋放因子 (hypothalamic eleasing factors)、血管升壓素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、 促卵泡成熟激素、促曱狀腺激素、組織纖維蛋白溶酶原激活劑等。所關(guān)注的 免疫球蛋白包括IgG、 IgE、 IgM、 IgA、 IgD及其片段。
一些蛋白質(zhì)如白介素、干擾素和集落刺激因子通常由于使用重組技術(shù)也 以非糖基化(non-glycosylated)形式存在。非糖基化形式也在本發(fā)明的生物學(xué) 活性的親核物質(zhì)中。
的任何部分。其包括氨基酸序列、翻譯部分等、抗體片段、單鏈抗原結(jié)合蛋 白(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利4,946,778,其公開(kāi)內(nèi)容在此引用作為參考)、結(jié)合 分子，其包括抗體或片段的融合、多克隆抗體、單克隆抗體、催化抗體、核 香酸和寡核普酸。
蛋白質(zhì)或其部分可以通過(guò)使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)制備或 分離，例如組織培養(yǎng)、從動(dòng)物源提取或通過(guò)重組DNA方法。也考慮轉(zhuǎn)基因
源的蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸序列等。這些物質(zhì)從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(即，小鼠、豬、 牛等)得到，其中所述蛋白在奶、血或組織中表達(dá)。轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)和桿狀病毒
表達(dá)體系也考慮作為來(lái)源。然而，突變體形式的蛋白質(zhì)，如突變TNFs和突
變干擾素也在本領(lǐng)域的范圍內(nèi)。
所關(guān)注的其它蛋白為變應(yīng)原蛋白，如豕草屬、抗原E、蜜蜂毒液、螨變 應(yīng)源等。
有用的生物學(xué)活性親核物質(zhì)不限于蛋白和肽?；旧先魏紊飳W(xué)活性的 化合物都包括在本發(fā)明的領(lǐng)域中。包括化療分子，如藥物化合物，即抗肺瘤 劑、心血管試劑、抗瘤形成劑、抗感染藥、抗焦慮藥、胃腸試劑、中樞神經(jīng) 系統(tǒng)-活化試劑、鎮(zhèn)痛藥、致育或避孕因子、抗炎因子、甾體試劑、anti-urecemic agents、心血管試劑、血管擴(kuò)張劑、血管收縮劑等。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中， 在聚合物與化療部分酯連接的條件下，使羧酸衍生物進(jìn)行反應(yīng)。尤其優(yōu)選的 生物學(xué)活性親核物質(zhì)包括紫杉醇、紫杉烷、多西紫杉醇、喜樹(shù)堿、鬼臼毒素、 血紅蛋白、葡糖腦苷脂酶、半乳糖苷酶、精氨酸酶、天門(mén)冬酰胺酶、精氨酸 脫氨酶和超氧化物歧化酶。
上述是適合與本發(fā)明的聚合物結(jié)合的生物學(xué)活性親核物質(zhì)的示例。應(yīng)該
也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。 實(shí)施例
下述非限制性實(shí)施例說(shuō)明了一些本發(fā)明的方面。除另有說(shuō)明，所有份和 百分比均基于重量，且所有溫度均為攝氏度。
30K m-PEG -OH
t-BuOK
曱苯
30K
m國(guó)PEG -0- K+
Brt-BuOAc
m-PEG 3吸-0—CH2,、0
CHATFA
<formula>formula see original document page 19</formula>
實(shí)施例1<formula>formula see original document page 20</formula>
參見(jiàn)圖1，將31g(1.03摩爾)的m-PEG"K-OH(化合物l)在600 ml曱苯 中的溶液共沸移除130ml餾出物。然后將反應(yīng)混合物冷卻至30°C,然后加 入2.1 ml (2.07毫摩爾)的1.0摩爾叔丁醇鉀的叔丁醇溶液。所得混合物在 30° C下攪拌10-60分鐘(得到化合物2),然后加入1.6g(8.3摩爾)的溴代乙 酸叔丁基酯。在30。C下，攪拌所得混濁混合物1小時(shí)。用乙醚將產(chǎn)物(化 合物3)從反應(yīng)混合物中沉淀，然后通過(guò)過(guò)濾收集，并用額外的乙醚洗滌。從 12%的DMF/IPA中重結(jié)晶得到27.8g (產(chǎn)率90%)粗產(chǎn)物。通過(guò)"CNMR確證 產(chǎn)物，純度>99°/。，因?yàn)樵?0.5ppm處沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PEG-OH的峰。參見(jiàn)圖1。
13C畫(huà)R (75.4 MHz, CDC13) 5 169.07, 81.01, 71.54-68.62(PEG), 58.65， 27.82。
實(shí)施例2 m-PEG 3QK酸4
將8.7g (0.13毫摩爾)的m-PEG皿酉旨(化合物3)在90 ml 二氯曱烷和45 ml的TFA中的溶液在室溫下攪拌3小時(shí)，然后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去部分溶劑， 并用乙醚沉淀產(chǎn)物。通過(guò)過(guò)濾收集固體，然后用乙醚洗滌幾次，從12%的 DMF/IPA中重結(jié)晶，然后干燥到8.2g(產(chǎn)率94。/。)產(chǎn)物(化合物4)。通過(guò)13C NMR確證產(chǎn)物，純度>99%。
13C薩R (75.4 MHz, CDC13) S 170.卯，71.54-68.18(PEG), 58.65。
實(shí)施例3
紫杉醇-2，mPEG皿單酯制備
共沸來(lái)自實(shí)施例2的mPEG 30,000 S交(3750 mg， 0.125 mmol,化合物4)， 然后在室溫下溶解于20 ml無(wú)水二氯曱烷中。在0。 C下，用1,3-二異丙基-碳二亞胺(26pl， 0.17 mmol), 4-二曱基氨基。比咬(32 mg， 0.26 mmol)和紫杉醇 (146 mg， 0.17 mmol)處理上述溶液。30分鐘后，將反應(yīng)溶液溫?zé)嶂潦覝?，?在該溫度下保持16小時(shí)。然用用0.1N的HC1洗滌反應(yīng)混合物，干燥并蒸發(fā) 得到白色固體，將該固體從2-丙醇中結(jié)晶得到3000 mg (產(chǎn)率80%)的純產(chǎn)物
5。
比專(zhuān)交實(shí)施例4
對(duì)于制備m-PEG"K酯的實(shí)施例1的方法，在一部分合成中進(jìn)行如下改 變。形成化合物2后，力口入1.6g(8.3摩爾)溴代乙酸叔丁基酯，加熱所得的 混濁混合物6至回流，然后除去加熱，然后在室溫下攪拌18小時(shí)(制備化合 物7)。這是為了與在30° C下攪拌所得混濁混合物1小時(shí)相對(duì)比。通過(guò)13C NMR確證產(chǎn)物，純度僅為約60%，而不是上述的純度>99%，因?yàn)樗脵z測(cè) 峰的儀器明顯更靈敏且在61.18 ppm處有明顯的PEG-OH峰。見(jiàn)圖2。注意， 在200.26未知峰處發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)。
13C NMR (75,4mHz, CDC13) 5 200.26， 169.00, 80.95, 74.00-68.00 (PEG), 63.00,未知雜質(zhì)，61.18 (起始物質(zhì)-PEG-OH)， 58.60， 27.77。
實(shí)施例5
m一PEG孤RNL 8a醛9
m-PEG30K RNL 8a連接基方案
m-PEG30K RNL 8a連接基
<formula>formula see original document page 21</formula>
在冰浴中，將10.0g(0.33毫摩爾)的m-PEG 3ok酸8、 0.15g (1.0毫摩 爾)的3，5-二曱基-4-羥基苯曱醛和0.15g (1.24毫摩爾)的DMAP在90 ml無(wú)水 二氯曱烷中的溶液冷卻至0。C,然后加入0.19g(1.0毫摩爾)的EDC鹽酸鹽。 將混合物溫?zé)嶂潦覝?，過(guò)夜。這時(shí)，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去部分溶劑，用乙醚沉 淀產(chǎn)物，然后收集并用乙醚洗滌。粗產(chǎn)物從12%的DMF/IPA中重結(jié)晶得到 9.4g (產(chǎn)率94%)。
13C畫(huà)R (75.4 MHz, CDC13) S 190.80， 167.26， 152.01, 133.74, 131.02， 129.74， 71.57畫(huà)67.83(PEG), 58.68， 16.19。
實(shí)施例6
m-PEG皿RNL 8a醇10
將4.8g(0.16毫摩爾)的m-PEG3吸RNL8a醛9在63ml無(wú)水曱醇中的 溶液冷卻至15°C,然后加入O.Olg (0.25毫摩爾)硼氫化鈉。在15-20。C下攪 拌混合物2小時(shí)，然后用1N的HC1調(diào)節(jié)pH至6.5。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移除曱醇， 然后殘余物溶于水中。用0.5N的HCl將pH降低至2.0,并用二氯曱烷從水 中萃取產(chǎn)物。萃取物用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，然后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去部分 溶劑。產(chǎn)物用乙醚沉淀，通過(guò)過(guò)濾收集，然后用乙醚洗滌得到4.6g (產(chǎn)率96%) 的產(chǎn)物。
13C麗R (75.4 MHz, CDC13) S 167.76， 146.25, 138,68, 129.42, 126.67， 71.55-67.87(PEG), 63.86， 58.65， 16.11。
實(shí)施例7
m-PEG 3QK RNL 8a連接劑11
將1.8g (0.06毫摩爾)的m-PEG 3°K RNL 8a醇10在18ml二氯曱烷和 l.8ml的DMF的混合物中的溶液冷卻至0°C,然后加入O.Ug (0.48毫摩爾) 的DSC和0.33g (0.43毫摩爾)吡啶。將混合物溫?zé)嶂潦覝剡^(guò)夜。這時(shí)，通過(guò) 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去部分溶劑，用乙醚沉淀產(chǎn)物，然后收集并用乙醚洗滌。從12% 的DMF/IPA中重結(jié)晶得到1.6 (產(chǎn)率88%)粗產(chǎn)物。
13C畫(huà)R (75.4 MHz， CDC13) S 168.14， 167.59， 151.03， 147.76， 130.53, 130.27, 128.50, 72.97-67.83(PEG), 58.67， 25.17, 16.11。
最終產(chǎn)物能用于與任何多種生物學(xué)活性多肽、酶、蛋白、小分子等結(jié)合, 所述生物學(xué)活性多肽、酶、蛋白、小分子等具有用于結(jié)合的可用的胺或羥基。
對(duì)于這些結(jié)合反應(yīng)的方法描述于例如在共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)專(zhuān)利6,180,095或 Greenwald等人J. Med. Chem. 1999 Vol. 42, No. 18, 3657-3667中所述的方 法，每篇內(nèi)容在此引用作為參考。
權(quán)利要求
1.制備聚環(huán)氧烷的叔烷基酯的方法，該方法包括(a)在第一溶劑體系中，使聚環(huán)氧烷與堿反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為約10分鐘至約60分鐘；和(b)在第二溶劑體系中，使步驟(a)的產(chǎn)物與鹵代乙酸叔烷基酯反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間小于約30分鐘；其中在約10℃至約35℃的溫度下進(jìn)行步驟(a)和(b)的反應(yīng)。
2. 制備聚環(huán)氧烷羧酸的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的聚環(huán)氧烷的 叔烷基酯與S吏反應(yīng)形成聚環(huán)氧烷羧酸。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中所述聚環(huán)氧烷為聚乙二醇。
4. 權(quán)利要求1的方法，該方法還包括從第二溶劑體系中分離所得的聚 環(huán)氧烷的叔烷基酯。
5. 權(quán)利要求3的方法，其中所述聚乙二醇為co-曱氧基聚乙二醇。
6. 權(quán)利要求l的方法，其中所述鹵代乙酸叔烷基酯包括下式物質(zhì)<formula>formula see original document page 2</formula>其中X為氯、溴或碘；RL3獨(dú)立地選自d.8烷基、被取代的CL8烷基或CL8支鏈烷基和芳基。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述鹵代乙酸叔烷基酯為鹵代乙酸叔丁基酯。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述鹵代乙酸叔丁基酯為溴代乙酸叔丁基 酯或氯代乙酸叔丁基酯。
9. 權(quán)利要求1的方法，其中所述聚環(huán)氧烷與堿的摩爾比的范圍為1:1至 約1:2。
10. 權(quán)利要求l的方法，其中所述堿選自叔丁醇鉀、丁基鋰、氨基鈉、 氫化鈉及其組合。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述堿為叔丁醇鉀。
12. 權(quán)利要求2的方法，其中所述酸選自三氟乙酸、硫酸、磷酸和鹽酸。
13. 權(quán)利要求2的方法，其中所述酸為三氟乙酸。
14. 權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(a)的反應(yīng)進(jìn)行約20分鐘至40 分鐘。
15. 權(quán)利要求1的方法，其中所述溶劑體系包括甲苯，且步驟(a)和(b) 的反應(yīng)在約25至約31 。C的溫度下進(jìn)行。
16. 權(quán)利要求l的方法，其中所述溶劑體系包括曱苯和二氯曱烷，且步 驟(a)和(b)的反應(yīng)在約20至約31 。C溫度下進(jìn)行。
17. 權(quán)利要求2的方法，其中所述反應(yīng)在約18至約30。C溫度下進(jìn)行。
18. 權(quán)利要求l的方法，其中聚環(huán)氧烷與溶劑體系的比例為lg聚環(huán)氧 烷比約15至約25 ml的溶劑體系。
19. 權(quán)利要求1的方法，其中所述聚環(huán)氧烷的分子量為約200至約 100,000。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述聚環(huán)氧烷的分子量為約2,000至約 80,000。
21. 權(quán)利要求19的方法，其中所述聚環(huán)氧烷的分子量為約4,000至約 50,000。
22. 權(quán)利要求2的方法，其中通過(guò)"C NMR檢測(cè)，制備的聚環(huán)氧烷羧 酸的純度大于99%。
23. 權(quán)利要求l的方法，其中所述聚環(huán)氧烷為直鏈或支鏈。
全文摘要
本發(fā)明提供了制備聚環(huán)氧烷的叔烷基酯的新穎的方法。所述新方法使用更溫和的條件，從而避免了至起始的聚環(huán)氧烷的逆反應(yīng)。然后聚環(huán)氧烷的叔烷基酯與適合的酸反應(yīng)，得到聚環(huán)氧烷酸。
文檔編號(hào)C08F255/06GK101356203SQ200680050851
公開(kāi)日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2006年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月10日
發(fā)明者安東尼·J·馬丁內(nèi)斯, 洪 趙 申請(qǐng)人:安佐制藥股份有限公司