含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽及制備方法和應(yīng)用，含有2個(gè)亮氨酸重復(fù)單元抗菌肽其氨基酸序列如SEQ?No.1所示。本發(fā)明首先根據(jù)亮氨酸重復(fù)單元的基序和抗菌肽的氨基酸組成特點(diǎn)，得到亮氨酸重復(fù)單元的氨基酸序列，并將重復(fù)單元串聯(lián)，以提高其肽鏈長(zhǎng)度和凈電荷數(shù)目；然后使用多肽合成儀，進(jìn)行固相合成法合成多肽粗品；最后將合成多肽使用高效液相色譜進(jìn)行純化，并利用電噴霧質(zhì)譜法進(jìn)行鑒定。本發(fā)明的有益效果：(1)該多肽是根據(jù)生物體廣泛存在的亮氨酸重復(fù)單元為基礎(chǔ)而設(shè)計(jì)得到，具有廣譜抗菌活性；(2)該多肽由22個(gè)氨基酸組成，肽鏈較短，制備方法和技術(shù)成熟，合成成本低。
【專利說明】含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽及制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]抗生素的應(yīng)用提高了人類健康和動(dòng)物生產(chǎn)效率。但耐藥性菌株、藥物殘留等問題也隨之出現(xiàn)，一直困擾著人類。由于產(chǎn)生藥物殘留及細(xì)菌耐藥性問題，因此亟須發(fā)現(xiàn)新型抗菌制劑?？咕嚯淖鳛槿梭w重要免疫組成部分具有重大的發(fā)展?jié)摿?，是科研工作者研究的熱點(diǎn)。一般認(rèn)為，抗菌肽是通過物理吸附等作用來破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，從而殺死細(xì)菌，因此細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的幾率較小?？咕囊话闶怯?0至50個(gè)氨基酸所組成，凈電荷一般在+2~+9范圍內(nèi)，疏水性氨基酸的比例可以達(dá)到50%或更多。
[0003]抗菌肽的上述結(jié)構(gòu)和組成特征與許多蛋白質(zhì)組成基序相似。亮氨酸重復(fù)單元為大家所廣泛周知，因其富含疏水性殘基亮氨酸而得名。亮氨酸重復(fù)單元廣泛存在于包括動(dòng)物、植物和微生物在內(nèi)的超過60000種生物體蛋白質(zhì)中。其中一種重要的亮氨酸重復(fù)單元的基序?yàn)?LxxLxLxxNxL,包含這些基序的蛋白質(zhì)可以形成螺旋、折置等多樣的結(jié)構(gòu)形式。因此，本發(fā)明以此基序作為基本單位，通過合成由單個(gè)亮氨酸重復(fù)單元及將2個(gè)亮氨酸重復(fù)單元串聯(lián)的抗菌肽，從而設(shè)計(jì)得到全新的抗菌肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽及制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明將具有亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽進(jìn)行串聯(lián)，從而得到全新的抗菌肽，以提高其抗囷效果。
[0005]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0006]1、一種含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽，序列如SEQ N0.1所示。
[0007]2、如上所述的一種含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽，制備方法如下:
[0008](I)根據(jù)亮氨酸重復(fù)單元的基序LxxLxLxxNxL，將疏水性殘基和正電荷殘基充實(shí)到基序中去，從而得到亮氨酸重復(fù)單元的氨基酸序列(Leu)1，序列如SEQ N0.2所示；將這一重復(fù)單元串聯(lián)，以提高其肽鏈長(zhǎng)度和凈電荷數(shù)目，得到含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽(Leu)2，序列如SEQ N0.1所示；
[0009](2)采用固相化學(xué)合成法，通過多肽合成儀合成這兩條多肽粗品；
[0010](3)將合成的多肽使用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，并利用電噴射質(zhì)譜法對(duì)合成的多肽進(jìn)行鑒定，完成多肽的制備。
[0011]3、如上所述的一種含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽，采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所推薦的測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)的方法，(Leu)2的最小抑菌濃度為2-4 μ M，顯示出很強(qiáng)的抑制革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌生長(zhǎng)的活性。從而為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的更進(jìn)一步提供含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽，在制備治療革蘭氏陽(yáng)性菌或革蘭氏陰性菌感染性疾病藥物中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的有益效果:(1)該多肽是根據(jù)生物體廣泛存在的亮氨酸重復(fù)單元為基礎(chǔ)而設(shè)計(jì)得到，具有廣譜抗菌活性；(2)該多肽由22個(gè)氨基酸組成，肽鏈較短，制備方法和技術(shù)成熟，合成成本低。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為抗菌肽(Leu)1的質(zhì)譜圖。
[0014]圖2為抗菌肽(Leu)2的質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0016]實(shí)施例1:亮氨酸重復(fù)單元抗菌肽序列的設(shè)計(jì)
[0017]已知亮氨酸重復(fù)單元的基序?yàn)長(zhǎng)xxLxLxxNxL，其中L為亮氨酸，x為任意氨基酸。抗菌肽的氨基酸組成特點(diǎn)主要為疏水性和凈正電荷。因此，我們將疏水性殘基和正電荷殘基充實(shí)到基序中去，從而得到亮氨酸重復(fù)單元的氨基酸序列LeuArgArgLeuTrpLeuArgAlaAsHArgLeu0同時(shí)還將這一重復(fù)單元串聯(lián)，以提高其肽鏈長(zhǎng)度和凈電荷數(shù)目，得到兩條抗菌肽序列。如表1所示。
[0018]表1抗菌肽的氨基酸序列和分子量
【權(quán)利要求】
1.一種含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽，其特征在于:序列如SEQ N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽，其特征在于，制備方法如下: (1)根據(jù)亮氨酸重復(fù)單元的基序LxxLxLxxNxL，將疏水性殘基和正電荷殘基充實(shí)到基序中去，從而得到亮氨酸重復(fù)單元的氨基酸序列(Leu)1，序列如SEQ N0.2所示；將這一重復(fù)單元串聯(lián)，以提高其肽鏈長(zhǎng)度和凈電荷數(shù)目，得到含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽(Leu)2，序列如SEQ N0.1所示； (2)采用固相化學(xué)合成法，通過多肽合成儀合成這兩條多肽粗品； (3)將合成的多肽使用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，并利用電噴射質(zhì)譜法對(duì)合成的多肽進(jìn)行鑒定，完成多肽的制備。
3.—種如權(quán)利要求1所述的一種含有兩個(gè)亮氨酸重復(fù)單元的抗菌肽的應(yīng)用，其特征在于:在制備治療革蘭氏陽(yáng)性菌或革蘭氏陰性菌感`染性疾病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/00GK103788184SQ201310715120
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】馬清泉, 單安山, 董娜, 呂銀鳳, 焦文靜 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)