專利名稱：體液中人組織激肽釋放酶的測(cè)定方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腦缺血的診斷技術(shù)，特別是體液中人組織激肽釋放酶的測(cè)定方法及在腦缺血診斷試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
組織激肽釋放酶是在血液，其他體液和組織中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白酶，它的活性代謝產(chǎn)物為激肽，激肽具有強(qiáng)烈的血管擴(kuò)充活性；組織激肽釋放酶可以以游離形式存在，或與它的天然抑制劑，如組織激肽釋放酶抑制劑結(jié)合成復(fù)合物存在。腦組織中的組織激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)參與心血管功能的中樞調(diào)節(jié)(Madeddu P.et al.，Hypertension 1996；28980-989；Emanueli C.et al.，Br.J.Pharmacol.1999；1261769-1776)，組織激肽釋放酶的產(chǎn)物激肽擴(kuò)張腦血管網(wǎng)(Toda N.，Am.J.Physiol.，1997；222H267-H274)。腦組織中的組織激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)可由組織缺血激活。此系統(tǒng)通過(guò)誘導(dǎo)新生血管形成參與腦血流重建(Emanueli C.et al.，Circulation.2001；103125-132)。
中風(fēng)是由于腦血流急性中斷引起的腦血管事件，它是致死和致殘的主要原因之一；腦中風(fēng)通常由阻塞腦主要?jiǎng)用}的粥樣硬化斑塊進(jìn)展，粥樣硬化斑塊破裂及其形成的栓子脫落引起。腦血管功能障礙是老年人的一個(gè)主要健康問題；隨著人口老齡化進(jìn)展，它越來(lái)越成為一個(gè)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)問題；最近一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)超過(guò)65歲的人口中10％的男性和7％的女性受到頸動(dòng)脈狹窄的困擾。
流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)高度頸動(dòng)脈狹窄患者易發(fā)生中風(fēng)，通過(guò)手術(shù)使梗阻動(dòng)脈再通可以降低中風(fēng)危險(xiǎn)性；然而對(duì)于低度至中度頸動(dòng)脈狹窄患者，綜合考慮圍手術(shù)期的危險(xiǎn)性與動(dòng)脈再通的好處，其手術(shù)指征不是很明顯；而且頸動(dòng)脈狹窄患者也可能發(fā)生急性或慢性缺血，從而發(fā)生進(jìn)展性腦功能損傷。腦血流灌注情況不能夠由腦血管造影準(zhǔn)確估計(jì)。即使目前有比腦血管造影更精確的診斷技術(shù)，這種技術(shù)通常比較昂貴，不適合腦中風(fēng)危險(xiǎn)人群的普遍篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種體液中人組織激肽釋放酶的測(cè)定方法及在腦缺血診斷試劑盒中的應(yīng)用，其測(cè)定成本低，在診斷腦缺血上的可行性好，是新的腦缺血生物標(biāo)記物。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為體液中人組織激肽釋放酶的測(cè)定方法，具體操作過(guò)程如下1)將人組織激肽釋放酶或組織激肽釋放酶片段特異性免疫球蛋白與生物樣品中組織激肽釋放酶反應(yīng)形成免疫復(fù)合物；
2)檢測(cè)生物樣品形成的免疫復(fù)合物結(jié)果，將其與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品比較獲得生物樣品中組織激肽釋放酶的含量；所述步驟2)中抗原抗體復(fù)合物的檢測(cè)可以由酶聯(lián)免疫方法、放射免疫方法、由酶底物生色反應(yīng)或生成熒光的生物化學(xué)反應(yīng)(顏色的深度或熒光的強(qiáng)度與組織激肽釋放酶的濃度成正比)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行，檢測(cè)系統(tǒng)指任何可檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物和定量抗原濃度的方法系統(tǒng)；所述的檢測(cè)系統(tǒng)可以利用生物素-親和素-過(guò)氧化物酶、生物素-親和素-堿性磷酸酶、熒光素或其他本領(lǐng)域技術(shù)工人熟悉的復(fù)合物；所述人組織激肽釋放酶或組織激肽釋放酶片段特異性免疫球蛋白可以利用本領(lǐng)域技術(shù)工人熟知的方法例如由人組織激肽釋放酶或組織激肽釋放酶片段免疫異種動(dòng)物產(chǎn)生并獲得(產(chǎn)生的血清被用來(lái)制備抗體)；人組織激肽釋放酶或組織激肽釋放酶片段(組織激肽釋放酶片段也可以作為免疫原，如一段含有組織激肽釋放酶表位的合成多肽與免疫原載體的結(jié)合物)，其作為免疫原的來(lái)源為合成的含有組織激肽釋放酶表位的多肽、由從人尿液或其他體液提取純化的組織激肽釋放酶或由基因工程方法重組制備的人組織激肽釋放酶；生物樣品為被測(cè)定者的血液樣品或其他體液樣品；組織激肽釋放酶可為游離形式或與其抑制劑結(jié)合形式；免疫異種動(dòng)物可以為綿羊，山羊，兔子，驢，馬，大鼠，猴子或其他動(dòng)物；獲得的抗體試劑可以為全部免疫球蛋白IgG，免疫球蛋白片段(Fab，F(xiàn)(ab’)2)，可以進(jìn)行酶標(biāo)記或固定化，如固定在微孔板，塑料或磁珠上，抗體試劑；組織激肽釋放酶特異性免疫球蛋白可用于包括其自身和一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的免疫學(xué)檢測(cè)程序；腦缺血診斷試劑盒，它包括人組織激肽釋放酶特異性免疫球蛋白(抗體)或免疫球蛋白片段(Fab，F(xiàn)(ab’)2)；其中含有稀釋，洗滌，維持最適酸堿度的緩沖系統(tǒng)；含有已知濃度組織激肽釋放酶標(biāo)準(zhǔn)樣品和檢測(cè)系統(tǒng)。
以下列步驟診斷腦缺血方法(1)利用組織激肽釋放酶與組織激肽釋放酶特異性免疫反應(yīng)測(cè)量生物樣品中組織激肽釋放酶含量；(2)腦缺血程度估計(jì)生物樣品中組織激肽釋放酶含量比正常人群組織激肽釋放酶含量增高的程度與頸動(dòng)脈梗塞程度成正相關(guān)，與腦血管功能障礙嚴(yán)重程度成正相關(guān)；其中步驟(1)為隨時(shí)間收集的一系列生物樣品的測(cè)定，在隨時(shí)間對(duì)步驟(2)估計(jì)時(shí)，組織激肽釋放酶水平升高表示梗塞程度惡化，水平降低表示梗塞程度改善。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明揭示了血液中組織激肽釋放酶是一種新的腦缺血生物標(biāo)記物，通過(guò)與免疫球蛋白反應(yīng)檢測(cè)生物樣品中組織激肽釋放酶含量，以此制備了診斷試劑盒并創(chuàng)建了基于此試劑盒的檢測(cè)方法進(jìn)行腦缺血診斷和疾病進(jìn)展監(jiān)測(cè)；本發(fā)明的出現(xiàn)必然導(dǎo)致腦缺血診斷、治療方案設(shè)計(jì)和疾病隨診的巨大進(jìn)步。
2.檢測(cè)成本低，本發(fā)明是用組織激肽釋放酶或組織激肽釋放酶片段免疫異種動(dòng)物產(chǎn)生組織激肽釋放酶特異性的免疫球蛋白，建立包括此免疫球蛋白及一種檢測(cè)系統(tǒng)的診斷試劑盒及腦缺血免疫學(xué)診斷方法，它的應(yīng)用特別有益于占人群大部分的低危險(xiǎn)性腦阻塞患者。
3.本發(fā)明通過(guò)測(cè)量外周血中組織激肽釋放酶的水平可以揭示頸動(dòng)脈梗阻或狹窄患者的腦血流動(dòng)力學(xué)情況(估計(jì)腦缺血程度生物樣品中組織激肽釋放酶與正常人群平均水平相比增加的程度直接與腦動(dòng)脈梗塞程度成正比，即與腦缺血程度成正比)；揭示了腦動(dòng)脈粥樣硬化斑塊梗阻患者組織激肽釋放酶水平增高，增高水平與梗阻水平成正相關(guān)，因此衡量外周血血清或血漿中組織激肽釋放酶可以說(shuō)明腦缺血狀態(tài)和進(jìn)展情況，成為腦缺血患者是否進(jìn)行頸動(dòng)脈再通的衡量指標(biāo)。
4.利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行組織激肽釋放酶測(cè)定是一種快捷簡(jiǎn)便的篩查方法，可以確定哪些患者急切需要頸動(dòng)脈再通，哪些患者需要加強(qiáng)治療和預(yù)防措施；利用此試劑盒可以衡量單個(gè)生物樣品組織激肽釋放酶與正常人群平均水平的偏離程度，從而獲得一個(gè)腦血流灌注情況的間接指標(biāo)。
5.隨時(shí)間多次測(cè)量組織激肽釋放酶水平可以估計(jì)其在血液樣品中的變化，從而估計(jì)腦缺血程度變化，組織激肽釋放酶增高說(shuō)明腦缺血程度惡化，而組織激肽釋放酶水平隨時(shí)間或在再通術(shù)后減低則說(shuō)明腦缺血改善，在雙側(cè)頸動(dòng)脈阻塞患者單側(cè)再通術(shù)后組織激肽釋放酶持續(xù)不降低說(shuō)明對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈仍需要再通；利用此試劑盒進(jìn)行組織激肽釋放酶測(cè)定可以簡(jiǎn)單快速估計(jì)頸動(dòng)脈手術(shù)再通的危險(xiǎn)/益處比；增高的組織激肽釋放酶表明需要手術(shù)干預(yù)重建腦灌流，正常的組織激肽釋放酶表明可以延緩手術(shù)干預(yù)或進(jìn)行損傷較小的處置。


圖1為進(jìn)展性頸動(dòng)脈狹窄(CAS)(由血管造影發(fā)現(xiàn)的梗塞血管的百分比表示)患者組織激肽釋放酶水平(TK單位pg/mL)分布曲線，虛線代表正常健康人群組織激肽釋放酶上限。
圖2為低/中度危險(xiǎn)性(RISKS)(左側(cè))或高度危險(xiǎn)性(右側(cè))患者組織激肽釋放酶水平分布曲線柱形圖。(縱坐標(biāo)％patients with elevated TK)圖3為內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)(簡(jiǎn)稱CEA)頸動(dòng)脈血管重建前，后患者組織激肽釋放酶水平。(縱坐標(biāo)內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)術(shù)后天數(shù)(Days after CEA))圖4A為手術(shù)患者CEA術(shù)前和手術(shù)3個(gè)月后組織激肽釋放酶水平。(橫坐標(biāo)，左側(cè)為內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)術(shù)前(Base CEA)；右側(cè)為內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)術(shù)后)圖4B為圖4A的柱形圖。
圖4C為雙側(cè)內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)第一次術(shù)前和手術(shù)3個(gè)月后組織激肽釋放酶水平示意圖。
圖4D為圖4C的柱形圖。
圖5A為2名發(fā)生圍手術(shù)期缺血并發(fā)癥患者CEA術(shù)前和術(shù)后組織激肽釋放酶水平示意圖。(橫坐標(biāo)左側(cè)為內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)術(shù)前(Base CEA)；右側(cè)為內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)術(shù)后)圖5B為圖5A的柱形圖。
具體實(shí)施例方式
以下例作為本試劑盒應(yīng)用參照。
實(shí)施例1人尿液中組織激肽釋放酶的純化利用親和色譜方法可以從人尿液中提取組織激肽釋放酶(ShimamotoK.，Chao，J.，Margolius H.S.(1980).J.Clin.Endocinology and Metabolism，51840-848)。收集12升尿液超濾濃縮至300毫升，貯存于-20度。反復(fù)凍融，經(jīng)三層紗布和Nitex膜過(guò)濾，5000g離心30分鐘，沉淀經(jīng)35-80％硫酸銨鹽析，離心收集沉淀，重溶解后透析，透析液經(jīng)過(guò)DE-52纖維素層析柱，以0.1-0.5M氯化鈉-0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)進(jìn)行洗脫，收集具有Tos-Arg-Ome酯酶活性的流出峰，對(duì)0.2M氯化鈉-0.1M磷酸鹽緩沖液(pH6.5)進(jìn)行透析，透析液經(jīng)過(guò)以抑酶肽為配體的瓊脂糖凝膠親和柱，以透析緩沖液洗脫直至流出液中無(wú)蛋白，再以0.1M乙酸鈉緩沖液(pH3.5)洗脫組織激肽釋放酶，親和洗脫的具有Tos-Arg-Ome酯酶活性的流出峰再經(jīng)過(guò)Sephacryl S-200進(jìn)一步純化。由聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)蛋白純度，經(jīng)過(guò)上述過(guò)程由原尿到純化的蛋白，組織激肽釋放酶被純化了2114倍。測(cè)量純化蛋白的Tos-Arg-Ome酯酶活性和生成激肽的活性。組織激肽釋放酶裂解低分子量激肽原產(chǎn)生激肽，激肽的量由放射免疫方法測(cè)定(Shimamoto K，Ando T，Nakao T，Tanaka，S，Sakuma M，Myyahara M.(1978)J Lab Clin Med.，91721-728)。
多克隆抗血清的制備和純化以100毫克純化組織激肽釋放酶和氟氏完全佐劑乳液免疫雌性新西蘭白兔，一個(gè)月后以50毫克上述乳液加強(qiáng)免疫一次，末次免疫后1-2月由耳緣靜脈收集血樣于玻璃試管中，立即離心(1500g/分鐘，15分鐘)，血清儲(chǔ)存于-20度。將15-20毫升抗血清樣品過(guò)蛋白A-cepharose凝膠柱，以0.5M磷酸緩沖液(pH8.0)洗脫至基線，以0.1M甘氨酸緩沖液(pH3.0)洗脫免疫球蛋白，洗脫條件為34滴/分鐘，100滴/試管。洗脫液以0.5M Tris堿(pH9.0)中和，收集280nm吸光度大于0.15樣品。
制備生物素標(biāo)記的組織激肽釋放酶抗體將2mg/ml純化的兔抗人組織激肽釋放酶免疫球蛋白對(duì)0.1M碳酸氫鈉(pH9.5)于4度透析24小時(shí)后加入10毫升新鮮制備的生物素N-羥基琥珀酸亞胺酯，室溫反應(yīng)1小時(shí)后對(duì)磷酸鹽緩沖液透析，加入等體積的雙蒸甘油，貯存于-80度備用(197，J.Hischem Cytochem.271131-1139)。
人組織激肽釋放酶特異性免疫反應(yīng)以未標(biāo)記的抗人組織激肽釋放酶免疫球蛋白包被96孔板(2μg/ml，100μl/孔)，加入200μl含1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液(10mmol/L磷酸鹽pH7.4 150mmol/L氯化鈉)37度封閉1小時(shí)，以含0.1％Tween-20的磷酸鹽洗滌液洗滌3次，每孔加入100微升純化的人組織激肽釋放酶標(biāo)準(zhǔn)品(0.4-2.5ng范圍)或待測(cè)血清樣品，37度反應(yīng)90分鐘，樣品以稀釋緩沖液配制，稀釋緩沖液的成分為磷酸鹽緩沖液加0.05％Tween-20和0.5％明膠。洗滌液洗板三次，每孔加入100微升稀釋緩沖液稀釋的生物素標(biāo)記組織激肽釋放酶抗體，(濃度為1μg/mL)，37度反應(yīng)1小時(shí)，洗滌液洗板三次，每孔加入100微升稀釋緩沖液稀釋的親和素-過(guò)氧化物酶(濃度為1μg/mL)，37度反應(yīng)1小時(shí)，洗滌液洗板5次，磷酸鹽緩沖液洗板1次，加入100微升新鮮配制的底物溶液(0.1mol/L檸檬酸緩沖液pH 4.3 0.03％ABTS，0.03％H2O2)室溫反應(yīng)30分鐘，由酶標(biāo)儀測(cè)定414或405納米處吸光度，由組織激肽釋放酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)414納米處吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品組織激肽釋放酶含量由與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比獲得。
本實(shí)施例中組織激肽釋放酶的測(cè)定利用了雙抗夾心ELISA方法，組織激肽釋放酶特異性免疫球蛋白與生物樣品中組織激肽釋放酶形成復(fù)合物，此復(fù)合物可被連有檢測(cè)系統(tǒng)的第二抗體識(shí)別；組織激肽釋放酶的測(cè)定也可以利用放射免疫方法或其他物理，化學(xué)，色譜方法進(jìn)行測(cè)定。
臨床實(shí)驗(yàn)測(cè)定血管外科頸動(dòng)脈狹窄實(shí)施血管重建或內(nèi)動(dòng)脈切除手術(shù)患者血清組織激肽釋放酶水平，實(shí)驗(yàn)對(duì)象不包括患有心臟，腎臟，肝臟疾患，腫瘤或感染的患者。以年齡組配的健康人作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)同時(shí)評(píng)價(jià)了吸煙，高血壓，糖尿病，高膽固醇血癥等危險(xiǎn)因素。頸動(dòng)脈狹窄嚴(yán)重程度由臨床癥狀，Doppler PW評(píng)分和頸動(dòng)脈造影確定。頸動(dòng)脈造影圖由兩位有經(jīng)驗(yàn)的神經(jīng)放射學(xué)家來(lái)審閱，確定頸動(dòng)脈梗阻嚴(yán)重程度。頸動(dòng)脈梗阻嚴(yán)重程度分級(jí)由北美頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)試驗(yàn)合作者聯(lián)合會(huì)(North AmericanSymptomatic Carotid Endarterectomy Trial Collaborators，NASCET)(N Engl JMed.，1991；325445-453)和依據(jù)Ozgur HT(Am J Neuroradiol.2001；22928-936)提出的分類重建的對(duì)側(cè)血流模式確定，測(cè)定組織激肽釋放酶的血液樣品每日早8-9點(diǎn)由住院患者左氣管靜脈插管獲得。采血前夜要求患者平臥。
血清樣品儲(chǔ)存于-20度，由一位不了解患者病情的研究者以上述ELISA方法平行測(cè)定組織激肽釋放酶濃度。測(cè)定結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以SigmaStat軟件包對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行多參數(shù)和單參數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果實(shí)驗(yàn)測(cè)定了53名患者(45名男性8名女性，年齡42-85歲，平均年齡69歲)和32名對(duì)照(29名男性3名女性，年齡40-78歲，平均年齡64歲)。其中21(40％)名患者無(wú)臨床癥狀，17名(32％)患者經(jīng)歷過(guò)一過(guò)性缺血，余下15名(29％)患者患有中風(fēng)，所有患者的血管造影均顯示單測(cè)(N＝27)或雙側(cè)(N＝26)頸動(dòng)脈梗阻。由下列標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者的阻塞嚴(yán)重程度進(jìn)一步分級(jí)，(對(duì)雙側(cè)病灶患者，以狹窄嚴(yán)重一側(cè)作為分級(jí)依據(jù))
中度頸動(dòng)脈狹窄50-69％狹窄(N＝10，19％)；重度頸動(dòng)脈狹窄70-99％狹窄(N＝26，49％)；頸動(dòng)脈阻塞(N＝17，32％)；患者對(duì)側(cè)血流模式由血管造影檢測(cè)。
由上述結(jié)果患者被分為1期(N＝2)2期(N＝6)3期(N＝16)4期(N＝4)；1期患者最輕，而4期患者最重。由Doppler檢查發(fā)現(xiàn)32名患者斑塊不穩(wěn)定，Doppler檢查結(jié)果由患者重建手術(shù)過(guò)程中檢查得到確定，12名患者其他血管區(qū)域發(fā)現(xiàn)梗阻病灶。
血清組織激肽釋放酶水平與頸動(dòng)脈梗阻分級(jí)關(guān)系所有患者平均組織激肽釋放酶水平為(1133±163pg/mL)。53名患者中有36名超過(guò)正常值(373±38pg/mL范圍160-658pg/mL P＜0.05)可信上限。組織激肽釋放酶水平隨頸動(dòng)脈梗塞分級(jí)提高而升高(參見圖1)，50-69％狹窄患者組織激肽釋放酶水平為(595±36pg/mL)，70-99％狹窄患者組織激肽釋放酶水平為(1112±177pg/mL)，頸動(dòng)脈阻塞患者組織激肽釋放酶水平為(1534±426pg/mL)。上述結(jié)果顯示組織激肽釋放酶水平與頸動(dòng)脈梗塞分級(jí)成明顯正相關(guān)，檢測(cè)外周血組織激肽釋放酶水平是一種有效的中風(fēng)危險(xiǎn)性人群篩查手段。
血清組織激肽釋放酶測(cè)定與腦缺血治療指征患者按以下中風(fēng)危險(xiǎn)因素進(jìn)行分級(jí)高危險(xiǎn)性包括具有臨床癥狀，70-99％程度頸動(dòng)脈狹窄和頸動(dòng)脈阻塞；中度危險(xiǎn)性包括無(wú)臨床癥狀的50-79％程度頸動(dòng)脈狹窄或有臨床癥狀的50-69％程度頸動(dòng)脈狹窄。
在高危險(xiǎn)組(參見圖2，右側(cè))79％患者(N＝20)組織激肽釋放酶水平升高。在中度危險(xiǎn)組(參見圖2，左側(cè))45％患者(N＝9)組織激肽釋放酶水平升高。所有組織激肽釋放酶水平升高的中度危險(xiǎn)組患者中一人經(jīng)歷過(guò)一過(guò)性缺血，5人表現(xiàn)單側(cè)頸動(dòng)脈狹窄，4人表現(xiàn)雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄，其余無(wú)臨床癥狀。
由血清組織激肽釋放酶水平確定危險(xiǎn)程度的精確度達(dá)到72％?；谘茉煊拔ｋU(xiǎn)分級(jí)，62％患者需進(jìn)行血管重建。但由組織激肽釋放酶水平確定的需進(jìn)行血管重建的患者數(shù)達(dá)到79％。
上述結(jié)果顯示組織激肽釋放酶升高水平與血管梗阻成正比。因此測(cè)定循環(huán)系統(tǒng)組織激肽釋放酶水平是一種有用的腦血管功能障礙篩查方法，這種新的生物標(biāo)記物對(duì)于發(fā)現(xiàn)有臨床癥狀或無(wú)臨床癥狀的中度頸動(dòng)脈狹窄具有特殊意義，這種中度頸動(dòng)脈狹窄需要加強(qiáng)目前治療或需要血管重建手術(shù)。而目前臨床上對(duì)這種中度頸動(dòng)脈狹窄的治療還存在爭(zhēng)議，所以組織激肽釋放酶對(duì)中度頸動(dòng)脈狹窄的治療具有特別意義。NASCET結(jié)果顯示50-69％程度頸動(dòng)脈狹窄患者接受頸動(dòng)脈內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)比非手術(shù)治療同側(cè)腦中風(fēng)中等減少。然而無(wú)癥狀性腦動(dòng)脈狹窄發(fā)生中風(fēng)危險(xiǎn)性低，其中45％缺血性腦血管事件是由心臟栓子和其他原因引起。與上述研究不同，ACAS和VACS的兩次大規(guī)模臨床試驗(yàn)顯示手術(shù)治療比非手術(shù)治療中風(fēng)和死亡率年下降率為1.2％，從而導(dǎo)致實(shí)施頸動(dòng)脈內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)患者數(shù)目大量增加。NASCET和VACS臨床試驗(yàn)的一個(gè)重要缺陷是其過(guò)于依賴血管造影來(lái)進(jìn)行危險(xiǎn)性分級(jí)，而血管造影對(duì)腦血流動(dòng)力學(xué)缺血的診斷能力有限，因此許多重度腦血管狹窄患者沒有估計(jì)腦血流是否可由血管自然重建恢復(fù)而實(shí)施了腦血管重建手術(shù)。而中度腦血管狹窄患者被打發(fā)掉，沒有充分考慮個(gè)體的血流動(dòng)力學(xué)情況，事實(shí)上許多中度腦血管狹窄患者應(yīng)該實(shí)施腦血流重建。最近可以通過(guò)SPECT估計(jì)腦灌流情況，但是篩查低危險(xiǎn)人群發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重腦血管功能障礙通常受到篩查費(fèi)用和人數(shù)過(guò)多的限制。與之相比組織激肽釋放酶作為腦缺血生物標(biāo)記物的診斷方法費(fèi)用低，簡(jiǎn)便，迅速，只需要少量實(shí)驗(yàn)室操作，安全性高，易于被患者接受。組織激肽釋放酶作為診斷方法可以加強(qiáng)現(xiàn)有的預(yù)防措施，延緩疾病進(jìn)展，改善生活質(zhì)量。
組織激肽釋放酶檢驗(yàn)和腦血管功能障礙隨診在頸動(dòng)脈內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)后前3天和3個(gè)月后測(cè)定組織激肽釋放酶，20名患者頸動(dòng)脈內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)成功，另兩名患者，1名發(fā)生同側(cè)中風(fēng)，1名發(fā)生一過(guò)性腦缺血。
如圖3所示，頸動(dòng)脈內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)后腦灌流改善，循環(huán)系統(tǒng)組織激肽釋放酶水平明顯降低，手術(shù)后第一天，組織激肽釋放酶水平下降，術(shù)后第三天達(dá)到術(shù)前一半水平，術(shù)后3個(gè)月，組織激肽釋放酶水平由866±147下降到477±93pg/ml(n＝17 P＜0.02)如圖4A、B所示，組織激肽釋放酶水平在單側(cè)頸動(dòng)脈狹窄實(shí)施頸動(dòng)脈內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)患者下降更明顯。雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄患者通常分兩次實(shí)施頸動(dòng)脈內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)，其第一次手術(shù)后可能不出現(xiàn)組織激肽釋放酶水平下降(如圖4C、D所示)，而第二次手術(shù)后所有患者均出現(xiàn)組織激肽釋放酶水平下降。因此持續(xù)的組織激肽釋放酶水平升高暗示殘留的腦缺血病灶，需要對(duì)未手術(shù)的動(dòng)脈實(shí)施血管重建。
在上述頸動(dòng)脈內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)圍手術(shù)期出現(xiàn)缺血癥狀的2名患者其組織激肽釋放酶水平升高。
所有結(jié)果顯示成功的腦血流再通總是伴隨著組織激肽釋放酶水平下降，，而圍手術(shù)期缺血癥狀惡化總是伴隨著組織激肽釋放酶水平升高，組織激肽釋放酶檢驗(yàn)為腦血管功能障礙隨診提供了重要的信息。
總之專利申請(qǐng)人的研究證明了組織激肽釋放酶作為一種新的生物標(biāo)記物對(duì)腦血管功能障礙選擇治療措施具有指導(dǎo)意義。
與其他疾病診斷方法類似臨床醫(yī)生應(yīng)將組織激肽釋放酶生物標(biāo)記物診斷方法與其他檢驗(yàn)數(shù)據(jù)和臨床發(fā)現(xiàn)相結(jié)合進(jìn)行腦缺血診斷，制定治療措施，組織激肽釋放酶生物標(biāo)記物檢測(cè)為監(jiān)測(cè)治療效果提供了一定依據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種體液中人組織激肽釋放酶的測(cè)定方法，其特征在于1)將人組織激肽釋放酶或組織激肽釋放酶片段特異性免疫球蛋白與生物樣品中組織激肽釋放酶反應(yīng)形成免疫復(fù)合物；2)檢測(cè)生物樣品形成的免疫復(fù)合物結(jié)果，將其與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品比較獲得生物樣品中組織激肽釋放酶的含量。
2.按照權(quán)利要求1所述體液中人組織激肽釋放酶的測(cè)定方法，其特征在于所述步驟2)中檢測(cè)是由酶聯(lián)免疫方法、放射免疫方法、由酶底物生色反應(yīng)或生成熒光的生物化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行。
3.按照權(quán)利要求2所述腦缺血診斷試劑盒，其特征在于所述的檢測(cè)系統(tǒng)是利用生物素-親和素-過(guò)氧化物酶、生物素-親和素-堿性磷酸酶、熒光素或其他復(fù)合物。
4.按照權(quán)利要求1所述體液中人組織激肽釋放酶的測(cè)定方法，其特征在于所述人組織激肽釋放酶或組織激肽釋放酶片段特異性免疫球蛋白由人組織激肽釋放酶或組織激肽釋放酶片段免疫異種動(dòng)物產(chǎn)生并獲得。
5.按照權(quán)利要求4所述體液中人組織激肽釋放酶的測(cè)定方法，其特征在于所述人組織激肽釋放酶或組織激肽釋放酶片段，其作為免疫原的來(lái)源為從人尿液或其他體液提取的組織激肽釋放酶或由基因工程方法制備的人組織激肽釋放酶或合成的含有組織激肽釋放酶表位的多肽。
6.一種腦缺血診斷試劑盒，其特征在于它包括人組織激肽釋放酶特異性免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。
7.按照權(quán)利要求6所述腦缺血診斷試劑盒，其特征在于其中含有已知濃度組織激肽釋放酶標(biāo)準(zhǔn)樣品。
8.按照權(quán)利要求6所述腦缺血診斷試劑盒，其特征在于其中含有稀釋，洗滌，維持最適酸堿度的緩沖系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及腦缺血的診斷技術(shù)，特別是體液中人組織激肽釋放酶的測(cè)定方法及在腦缺血診斷試劑盒中的應(yīng)用。測(cè)定方法為首先將人組織激肽釋放酶或組織激肽釋放酶片段特異性免疫球蛋白與生物樣品中組織激肽釋放酶反應(yīng)形成免疫復(fù)合物；然后檢測(cè)生物樣品形成的免疫復(fù)合物結(jié)果，將其與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品比較獲得生物樣品中組織激肽釋放酶的含量；揭示了一種新的腦缺血生物標(biāo)記物，其檢測(cè)成本低，篩查快捷簡(jiǎn)便；以此制備包括人組織激肽釋放酶特異性免疫球蛋白或免疫球蛋白片段腦缺血診斷試劑盒；其可以簡(jiǎn)單快速估計(jì)頸動(dòng)脈手術(shù)再通的危險(xiǎn)/益處比，衡量單個(gè)生物樣品組織激肽釋放酶與正常人群平均水平的偏離程度，從而獲得一個(gè)腦血流灌注情況的間接指標(biāo)。
文檔編號(hào)G01N33/573GK1532549SQ0310812
公開日2004年9月29日 申請(qǐng)日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月20日
發(fā)明者伊曼紐李·康斯坦察, 嘜德杜·保羅, 趙朱麗, 趙立, 寶庫(kù)·保羅, 保羅, 伊曼紐李 康斯坦察, 保羅 申請(qǐng)人:趙立, 趙 立