專利名稱：一種枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵制備亮氨酸氨肽酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵制備亮氨酸氨肽酶的方法，具體地說是利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵，收集發(fā)酵液，通過絮凝、過濾、超濾濃縮、冷凍干燥等提取操作，獲得亮氨酸氨肽酶制品，屬于酶制劑、食品添加劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白酶的商品生產(chǎn)始于20世紀(jì)初，30年代微生物蛋白酶開始應(yīng)用于食品和制革工業(yè)，近年來，微生物產(chǎn)酶的研究蓬勃發(fā)展。20世紀(jì)50年代初，日本學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)霉菌中存在幾種類型的蛋白酶，特別是酸性蛋白酶，20世紀(jì)60年代初，荷蘭開始生產(chǎn)添加堿性蛋白酶的洗滌劑。到目前為止，國際市場上商品蛋白酶達(dá)100種以上。蛋白酶制劑在蛋白加工領(lǐng)域中主要被用于改良風(fēng)味、改善營養(yǎng)價值、生產(chǎn)抽提物、 以及改變物理性質(zhì)等。廣義上，蛋白酶制劑包括兩種類型一類是蛋白酶，它能分解蛋白生成多肽或寡肽；另一類是肽酶，它能從末端開始切割蛋白和肽鏈并釋放出游離單個氨基酸。酶作為生物催化劑具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高和專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，并因其高效、節(jié)能、經(jīng)濟(jì)、綠色、環(huán)保等的特點(diǎn)，其應(yīng)用范圍已遍及工業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療診斷、環(huán)境保護(hù)、食品加工等領(lǐng)域。由于食品工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的日益擴(kuò)大，食品行業(yè)的快速發(fā)展，食品添加劑特別是天然鮮味劑的需求也得到了快速增長。營養(yǎng)性天然鮮味劑是一類含氨基酸、肽類、核苷酸和糖分等物質(zhì)并具有魚肉和蔬菜等風(fēng)味的調(diào)味料，主要包括動植物提取浸膏、蛋白質(zhì)水解濃縮物和酵母浸膏等。酶制劑是發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的核心產(chǎn)品，酶制劑行業(yè)推動了發(fā)酵工業(yè)和相關(guān)行業(yè)的發(fā)展，并產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。目前，我國酶制劑行業(yè)發(fā)展較快，基本上滿足了大宗產(chǎn)品生產(chǎn)的需求。但是在產(chǎn)品方面，要進(jìn)一步提升新酶種的結(jié)構(gòu)比例，特別是國外完全壟斷的小酶品種。同時，加快開發(fā)和生產(chǎn)復(fù)合酶制劑，包括食品、紡織、飼料、紙漿、制革、造紙等專用復(fù)合酶制劑。此外，繼續(xù)提高現(xiàn)有酶制劑酶的活性，提高產(chǎn)品檔次。國內(nèi)在氨肽酶生產(chǎn)方面的研究處于快速發(fā)展研究的階段，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，填補(bǔ)國內(nèi)產(chǎn)品的空白，替代進(jìn)口產(chǎn)品，增強(qiáng)我國酶制劑行業(yè)競爭力，打破該產(chǎn)品被國外的壟斷有著重要的意義。目前蛋白質(zhì)的水解方式逐漸從化學(xué)法向酶解法轉(zhuǎn)變。用傳統(tǒng)的方式水解蛋白質(zhì)制備活性多肽，已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代人民生活要求，在科技日新月異的今天，酶解蛋白質(zhì)生產(chǎn)多肽已成為當(dāng)今熱門研究，通過不同的酶切方式可以獲得不同功能的活性多肽，關(guān)于這方面已有很多相關(guān)的報(bào)道。大豆蛋白水解生產(chǎn)大豆多肽是大豆深加工的一個重要方向，因?yàn)榇蠖苟嚯牟粌H具有良好的營養(yǎng)特性，還具有廣泛的生理藥理作用和比大豆蛋白更豐富的功能特性，所以大豆多肽是一種很有前景的功能性食品原料。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步和生命科學(xué)的發(fā)展，生理活性肽的生理功能逐步被人們發(fā)現(xiàn)，并受到越來越多的重視，尤其是一些活性肽的結(jié)構(gòu)和生理功能逐漸明確，推動了活性肽的研究，也促進(jìn)了大豆肽的研究與開發(fā)。大豆多肽產(chǎn)品帶有不同程度的苦味會直接影響食品的風(fēng)味，給人們食用時會有一些“不愉快”，也在一定程度上限制了它在食品工業(yè)中的推廣應(yīng)用。研究證實(shí)當(dāng)疏水性氨基酸殘基處于多肽鏈的外側(cè)時多肽呈現(xiàn)苦味，而單個的疏水性氨基酸苦味卻低的多，因此采用外切酶將疏水性氨基酸從多肽鏈末端切去可以有效地減少苦味。另外該氨肽酶與其他蛋白酶復(fù)合使用，可以大幅度提聞蛋白質(zhì)的水解度，在醫(yī)油釀造、干釀生廣中，可以提聞蛋白質(zhì)的利用率，節(jié)約成本。在醫(yī)學(xué)研究中，該氨肽酶可用作醫(yī)學(xué)上的解毒劑，也可用作環(huán)境消毒劑，亮氨酸氨肽酶還可用作蛋白質(zhì)序列測定的分子工具。一株野生枯草芽孢桿菌zjoie經(jīng)過傳統(tǒng)誘變育種和發(fā)酵過程優(yōu)化，發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活單位可達(dá)7000U/L。本發(fā)明對在野生枯草芽孢桿菌zj016基礎(chǔ)上成功構(gòu)建的高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢桿菌工程菌，進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵過程優(yōu)化，采用培養(yǎng)基的預(yù)處理、培養(yǎng)基組成的調(diào)整、溶氧水平的控制等策略，使7L發(fā)酵罐產(chǎn)亮氨酸氨肽酶酶活得到大幅度提高，達(dá)到 200000U/L 左右。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是利用一株高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢桿菌工程菌，通過發(fā)酵培養(yǎng)、 絮凝、過濾除菌、超濾濃縮、冷凍干燥等操作，獲得固體亮氨酸氨肽酶，整個流程的收率為72.8%，酶粉酶活為7500 U/g，所得的固體酶的基本特性最適溫度50°C，溫度穩(wěn)定范圍30 60°C，最適pH8. 5，pH穩(wěn)定范圍6. O 9. 5，存在一定的底物特異性，已發(fā)現(xiàn)其對多肽N端一種疏水的亮氨酸，一種堿性的精氨酸有較強(qiáng)水解作用。本發(fā)明的技術(shù)方案一種枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵制備亮氨酸氨肽酶的方法，將該枯草芽孢桿菌工程菌接入種子培養(yǎng)基中，待長到對數(shù)生長期后，以2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)30h，收集發(fā)酵液，通過絮凝、過濾除菌、超濾濃縮和冷凍干燥操作，獲得亮氨酸氨肽酶酶粉，工藝為
A枯草芽孢桿菌工程菌的發(fā)酵
Cl)出發(fā)菌株采用枯草芽孢桿菌工程菌以重組質(zhì)粒PMA5-SAP為出發(fā)菌株；
所述枯草芽孢桿菌Zj016，詳見田亞平、須瑛敏一種枯草芽孢桿菌氨肽酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)[J]。食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32 (3) :7-10?？莶菅挎邨U菌工程菌重組質(zhì)粒PMA5-SAP詳見中國專利CN102492645A[—種高產(chǎn)氨肽酶的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用]，公布日2012. 06. 13。(2)種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)蛋白胨10,酵母膏5, NaCl 10,以去離子水配制,控制ρΗ7· 4 ；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)可溶性淀粉6，豆柏18，酵母膏24，胰蛋白胨8，甘油O. 2% V/V, K2HPO4*3H20 6，CoCl2 O. 5mmol/L，硫酸卡那霉素5(^g/mL，以去離子水配制，控制pH8. O。(4)發(fā)酵條件
搖瓶條件接種量2%，裝液量50mL/250mL，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，溫度37°C，培養(yǎng)時間
34h ；
發(fā)酵罐發(fā)酵條件全自動式7L發(fā)酵罐，Bioflo 110、美國NBS公司，罐中裝液量為4. 5L，發(fā)酵溫度37°C，接種量為2%V/V，攪拌轉(zhuǎn)速30(T600rpm，通氣比為1.2 1，罐壓控制在O. 06、. 08Mpa,溶氧與攪拌轉(zhuǎn)速偶聯(lián)，維持最低溶氧在30%，培養(yǎng)時間控制在30h ;通過對原料預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化，控制溶氧水平，不時加消泡劑控制起泡策略，使發(fā)酵產(chǎn)酶水平得到進(jìn)
一步提聞;其中原料豆柏的預(yù)處理
豆柏的適當(dāng)水解將豆柏與一定的水混勻，調(diào)節(jié)PH至7. 5，中性蛋白酶用量為中性蛋白酶300U/g豆柏，在40°C下，不停地?cái)嚢?，酶解Ih ；
B亮氨酸氨肽酶的提取
(O發(fā)酵液的收集、絮凝過濾除菌向發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液中加入O. 15%V/V的陽離子絮凝劑(美國凱米拉公司)，在適宜的條件下絮凝，之后再以3g/L的量加入助濾劑硅藻土，混勻，過濾除去絮凝物及菌體，獲得澄清發(fā)酵液；
(2)將得到的澄清發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，濃縮倍數(shù)在Γ10倍，獲得較純的濃縮液，所選用的超濾膜截留分子量為30kDa ；
(3)將濃縮液冷凍干燥，獲得亮氨酸氨肽酶酶粉。所得亮氨酸氨肽酶的基本特性
A底物特異性
對收集獲得的澄清發(fā)酵液進(jìn)行底物的特異性研究，發(fā)現(xiàn)其無內(nèi)切型蛋白酶活性(酸性、中性和堿性蛋白酶)，僅具有外切氨肽酶活性，并存在一定的特異性，對N末端為亮氨酸這種疏水氨基酸及精氨酸這種堿性氨基酸的多肽有較強(qiáng)水解作用。B酶學(xué)特性
最適溫度50°C，溫度穩(wěn)定范圍為30 60°C ;最適pH8. 5，pH穩(wěn)定范圍為6. O 9. 5。C金屬離子影響
通過向發(fā)酵液中添加不同金屬離子，發(fā)現(xiàn)Co2+對該酶有較強(qiáng)的激活作用，Mg2+、K+、Na+對該酶酶活的影響較小，其中Zn2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+有一定程度的抑制。酶活測定方法
采用LNA法，測定時，首先加入一定量的Tris-HCl緩沖液和底物(L-亮氨酸-對硝基苯胺L-leu-pNA)，然后再加入稀釋一定倍數(shù)的粗酶液，在50°C水浴反應(yīng)IOmin后，405nm比色測定酶活。酶活力定義在水浴50°C下，每分鐘分解L-亮氨酸-對硝基苯胺產(chǎn)生IMfliol的對硝基苯胺所需酶量，定義為一個酶活單位。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明對在野生枯草芽孢桿菌zj016基礎(chǔ)上構(gòu)建的高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢桿菌工程菌PMA5-SAP，進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵過程優(yōu)化，采用培養(yǎng)基的預(yù)處理、培養(yǎng)基組成的調(diào)整、溶氧水平的控制等策略，使7L發(fā)酵罐產(chǎn)亮氨酸氨肽酶酶活得到大幅度提高，發(fā)酵產(chǎn)酶又從7000U/L酶活單位提高到200000U/L左右。


圖I亮氨酸氨肽酶的制備流程。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
將枯草芽孢桿菌工程菌重組質(zhì)粒PMA5-SAP由甘油管接入種子液中，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，再按接種量2%接入4. 5L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐為全自動式7L發(fā)酵罐，Bioflo 110、美國NBS公司，發(fā)酵培養(yǎng)基組成如說明書所述。發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH8. O,培養(yǎng)溫度37°C，攪拌轉(zhuǎn)速300 600rpm,通氣量1.2 I，罐壓維持在O. 06-0. 08MPa,最低DO控制在30%, DO與轉(zhuǎn)速相偶聯(lián)，培養(yǎng)30h。發(fā)酵結(jié)束后，獲得發(fā)酵液4. 2L，向該發(fā)酵液中添加6. 3mL陽離子絮凝齊U (美國凱米拉公司)，在20 30°C溫度下，不斷攪拌，開始快速攪拌使絮凝劑與發(fā)酵液混合均勻，之后緩慢攪拌，使其形成絮凝體，再加入12. 6g助濾劑硅藻土，混合均勻后，過濾獲得澄清發(fā)酵液3. 8L，接著選用30kDa的超濾膜濃縮，最終獲得濃縮發(fā)酵液O. 8L，濃縮倍數(shù)為 4. 75，最后再將濃縮發(fā)酵液冷凍干燥，獲得固體亮氨酸氨肽酶36g，酶活單位為7500 U/g。
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵制備亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于將該枯草芽孢桿菌工程菌接入種子培養(yǎng)基中，待長到對數(shù)生長期后，以2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)30h，收集發(fā)酵液，通過絮凝、過濾除菌、超濾濃縮和冷凍干燥操作，獲得亮氨酸氨肽酶酶粉，工藝為 A枯草芽孢桿菌工程菌的發(fā)酵 (1)出發(fā)菌株采用枯草芽孢桿菌工程菌以重組質(zhì)粒PMA5-SAP為出發(fā)菌株； 重組質(zhì)粒PMA5-SAP詳見中國專利CN102492645A ； (2)種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)蛋白胨10，酵母膏5，NaCl10，以去離子水配制，控制pH7.4 ； (3)發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)可溶性淀粉6，豆柏18，酵母膏24，胰蛋白胨8，甘油0.2% V/V，K2HPO4CH2O 6，CoCl2 0. 5mmol/L，硫酸卡那霉素50l^g/mL，以去離子水配制，控制pH8. 0 ； (4)發(fā)酵條件 搖瓶條件接種量2%，裝液量50mL/250mL，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，溫度37°C，培養(yǎng)時間34h ； 發(fā)酵罐發(fā)酵條件7L發(fā)酵罐，罐中裝液量為4. 5L，發(fā)酵溫度37°C，接種量為2%V/V，攪拌轉(zhuǎn)速30(T600rpm，通氣比為I. 2 I，罐壓控制在0. 06^0. 08Mpa,溶氧與攪拌轉(zhuǎn)速偶聯(lián)，維持最低溶氧在30%，培養(yǎng)時間控制在30h ;通過對原料預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化，控制溶氧水平，不時加消泡劑控制起泡策略，使發(fā)酵產(chǎn)酶水平得到進(jìn)一步提高； 其中原料豆柏的預(yù)處理 豆柏的適當(dāng)水解將豆柏與一定的水混勻，調(diào)節(jié)PH至7. 5，中性蛋白酶用量為中性蛋白酶300U/g豆柏，在40°C下，不停地?cái)嚢?，酶解Ih ； B亮氨酸氨肽酶的提取 (1)發(fā)酵液的收集、絮凝過濾除菌向發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液中加入0.15%V/V的陽離子絮凝劑，進(jìn)行絮凝，之后再以3g/L的量加入助濾劑硅藻土，混勻，過濾除去絮凝物及菌體，獲得澄清發(fā)酵液； (2)將得到的澄清發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，濃縮倍數(shù)在4 10倍，獲得較純的濃縮液，所選用的超濾膜截留分子量為30kDa ； (3)將濃縮液冷凍干燥，獲得亮氨酸氨肽酶酶粉。
全文摘要
一種枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵制備亮氨酸氨肽酶的方法，屬于酶制劑、食品添加劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及利用枯草芽孢桿菌工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵液經(jīng)絮凝、過濾除菌、超濾濃縮、冷凍干燥等提取操作，獲得亮氨酸氨肽酶的酶粉，并對所制備的酶考察其基本酶學(xué)特性。本發(fā)明對在野生枯草芽孢桿菌zj016基礎(chǔ)上構(gòu)建的高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢桿菌工程菌PMA5-SAP，進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵過程優(yōu)化，采用培養(yǎng)基的預(yù)處理、培養(yǎng)基組成的調(diào)整、溶氧水平的控制等策略，使7L發(fā)酵罐產(chǎn)亮氨酸氨肽酶酶活得到大幅度提高，發(fā)酵產(chǎn)酶又從7000U/L酶活單位提高到200000U/L左右。
文檔編號C12N9/48GK102703407SQ201210199820
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者曹松龍, 林穎, 田亞平, 高新星 申請人:江南大學(xué)