含有富含亮氨酸重復(fù)序列的融合蛋白及其制法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含有富含亮氨酸重復(fù)序列的融合蛋白及其制法和應(yīng)用。具體的，本發(fā)明涉及一種融合蛋白，所述的融合蛋白自N端至C端具有以下結(jié)構(gòu)：A—X—E—Y1—Y2式Ia；A—Y2—Y1—E—X式Ib；其中，A為任選的分泌信號(hào)肽；X為Slit3蛋白(神經(jīng)導(dǎo)向因子3)富含亮氨酸的重復(fù)序列2(LRRs2)元件；E為酶切位點(diǎn)；Y1為第一標(biāo)簽多肽元件；Y2為第二標(biāo)簽短肽元件，所述第二標(biāo)簽短肽元件為His標(biāo)簽元件；“—”表示連接上述元件的肽鍵或肽接頭。本發(fā)明融合蛋白有助于LRR正確折疊，形成有活性的功能多肽，而且可以簡便地通過一次酶切就將兩種標(biāo)簽元件清除，從而制得高純度、高活性的LRR序列。
【專利說明】含有富含亮氨酸重復(fù)序列的融合蛋白及其制法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物分子領(lǐng)域，尤其涉及含有富含亮氨酸重復(fù)序列的融合蛋白及其制 法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)導(dǎo)向因子Slit是一種在進(jìn)化上高度保守的分泌型細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，其 基因在1988年發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形成中發(fā)揮作用。Slit是一組相對分子質(zhì)量為 170-190kDa的細(xì)胞外分泌蛋白，對軸突生長和神經(jīng)元遷移起導(dǎo)向作用的軸突定向分子族成 員之一。
[0003] Slit蛋白是作為Roundabout (Robo)的配體發(fā)揮多功能的導(dǎo)向分子，它不僅具有 調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突生長方向、引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞遷移、影響神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)分化的功能。近年來的研究 發(fā)現(xiàn)，Slit在血管生成、心臟形態(tài)發(fā)生、腫瘤細(xì)胞遷移等多種生理過程中也發(fā)揮作用。
[0004] 在脊椎動(dòng)物中存在3種Slit基因，即Slitl、Slit2、Slit3,并在各種生物組織中 廣泛表達(dá)。
[0005] S1 i t蛋白的主要結(jié)構(gòu)包括N端的胞外分泌信號(hào)肽，4個(gè)連續(xù)的富含亮氨酸 的重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRRs),也被命名為D1-D4結(jié)構(gòu)域，串聯(lián)的6-9個(gè) EGF (epidermal growth factor)樣功能區(qū)，一個(gè)laminin G樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè)富含半光氨酸 的C末端結(jié)構(gòu)域。
[0006] 為了研究和應(yīng)用，有必要對Slit蛋白或其片段進(jìn)行表達(dá)和分離純化。然而，由于 天然蛋白的含量有限，分離困難，因此需要開發(fā)高效的重組生產(chǎn)工藝。
[0007] 在重組生產(chǎn)工藝中，高效地生產(chǎn)出構(gòu)象正確且便于分離和純化的目的蛋白，常常 是較為困難的。常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然可以較高效地表達(dá)目的蛋白，但卻常常需要 復(fù)雜的復(fù)性工藝，且復(fù)性后的目標(biāo)蛋白的活性往往難以令人滿意。
[0008] 當(dāng)采用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)時(shí)，雖然避免了復(fù)性工藝，但目標(biāo)蛋白的正確折疊、 如何實(shí)現(xiàn)高表達(dá)水平以及如何有效分離目標(biāo)蛋白仍然是難點(diǎn)，尤其是對于某些短肽或含重 復(fù)序列的多肽而言。
[0009] 獲得了含目標(biāo)蛋白的培養(yǎng)液（或發(fā)酵產(chǎn)物）后，可采用各種不同的純化手段進(jìn)行 分離純化。目前，一種常用的分離純化重組蛋白的方法為親和層析技術(shù)。
[0010] 以采用的His標(biāo)簽為例，6XHis是專門設(shè)計(jì)用于重組蛋白質(zhì)純化工作的標(biāo)簽蛋 白，是目前最常見的表達(dá)方式，其表達(dá)純化技術(shù)都很成熟，而且相對比便宜，它的優(yōu)點(diǎn)是表 達(dá)方便而且基本不影響蛋白的活性。通常帶組氨酸蛋白都可以在天然情況下被鎳瓊脂糖凝 膠或鎳NTA瓊脂糖凝膠吸附，但是因?yàn)镠is標(biāo)簽非常小，如果在融合蛋白折疊過程中被折疊 到蛋白內(nèi)部而導(dǎo)致His標(biāo)簽不容易暴露的話，則很難開展蛋白純化工作；同時(shí)His標(biāo)簽確實(shí) 還存在特異性不夠的問題。
[0011] 通常，使用His標(biāo)簽技術(shù)分離所得的蛋白質(zhì)純度約為90%左右，而現(xiàn)有技術(shù)中，使 蛋白進(jìn)一步純化的工藝和步驟都相對較為繁瑣，且添加的蛋白或肽段常會(huì)對目標(biāo)蛋白的活 性造成干擾，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的表達(dá)不準(zhǔn)確或雜質(zhì)過多。
[0012] 綜上所述，為了簡便高效地制備高純度、高活性的重組蛋白，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā) 高效簡便的生產(chǎn)工藝。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的就是提供一種高效簡便的生產(chǎn)外源蛋白的方法，從而簡便高效地制 備高純度、高活性的重組蛋白。
[0014] 本發(fā)明提供了一種融合蛋白，所述的融合蛋白自N端至C端具有式la或lb所述 的結(jié)構(gòu)：
[0015] A-X-E-Y1-Y2 式 la ;
[0016] A-Y2-Yl-E-X 式 lb ;
[0017] 其中，
[0018] A為任選的分泌信號(hào)肽；
[0019] X為Slit3蛋白的富含亮氨酸的重復(fù)序列2 (leucine-rich repeat2，LRR2)元件；
[0020] E為酶切位點(diǎn)；
[0021] Y1為第一標(biāo)簽多肽元件；
[0022] Y2為第二標(biāo)簽短肽元件，所述第二標(biāo)簽短肽元件為His標(biāo)簽元件；
[0023] "一，，表示連接上述元件的肽鍵或肽接頭。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白具有位于N端的分泌信號(hào)肽。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的分泌信號(hào)肽是來自于Slit3的分泌信號(hào)肽、或來自于其 他蛋白的分泌信號(hào)肽。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的分泌信號(hào)肽在其N端具有或不具有起始氨基酸Met。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一標(biāo)簽多肽元件的46aa。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，在X和E之間的"一"為肽鍵。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，在Y1和Y2之間無蛋白酶切位點(diǎn)。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，在Y1和Y2之間的"一"為肽鍵。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的酶切位點(diǎn)是TEV蛋白酶的酶切位點(diǎn)。
[0032] (LeuGluValLeuPheGlnGlyPro, SEQ ID NO. :3)
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的肽接頭長度為3-15個(gè)氨基酸；較佳地5-10個(gè)氨基酸。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的Slit3蛋白來源于哺乳動(dòng)物。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的Slit3蛋白來源于人、大鼠、小鼠；更佳地，來源于人。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的Y1包括SEQ ID N0. : 2所示的改良型親和素標(biāo)簽（Strap II標(biāo)簽）、鏈親和素（Strepavidin)標(biāo)簽。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的His標(biāo)簽元件包括8 XHis標(biāo)簽元件和6 XHis標(biāo)簽元件。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的Y1為Strap II標(biāo)簽，而Y2為8XHis標(biāo)簽元件。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的S1U3LRR2的氨基酸序列如SEQ ID N0. :5所示。
[0040] 本發(fā)明第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發(fā)明第一 方面所述的融合蛋白。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID N0. :6所示。
[0042] 本發(fā)明第三方面，提供了一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有本發(fā)明第二方面所 述的多核苷酸。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體包括真核表達(dá)載體、原核表達(dá)載體。
[0044] 本發(fā)明第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第三方面所 述的表達(dá)載體或轉(zhuǎn)染了本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞；較佳地包括CH0細(xì)胞、293 細(xì)胞。
[0046] 本發(fā)明第五方面，提供了一種制備S1U3LRR2蛋白的方法，所述的方法包括步驟：
[0047] (i)在合適的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)本發(fā) 明第一方面所述的融合蛋白；
[0048] (ii)從培養(yǎng)體系中分離純化出本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白；
[0049] (iii)對所述的融合蛋白，用針對元件E的蛋白酶進(jìn)行酶解，從而制得S1U3LRR2。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（ii)中，先用針對Y1元件的親和層析進(jìn)行第一次分離； 然后用針對Y2元件的親和層析進(jìn)行第二次分離。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（iii)中，還包括將S1U3LRR2與多肽E-Y1-Y2或Y2- Y1-E分開，從而制得純化的S1U3LRR2。
[0052] 本發(fā)明第六方面，提供了一種制備S1U3LRR2蛋白的方法，所述的方法包括步驟：
[0053] 對本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白，用針對元件E的蛋白酶進(jìn)行酶解，從而制得 Slit3LRR2。
[0054] 本發(fā)明第七方面，提供了一種純化的S1U3LRR2蛋白，是通過本發(fā)明第五或第六 方面所述的方法生產(chǎn)制備的。
[0055] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0056] 圖1為原始的pcDNA3. 1 (_)質(zhì)粒的圖譜；
[0057] 圖2顯示了實(shí)施例1中的真核表達(dá)Slit3蛋白的LRR2結(jié)構(gòu)域部分序列的表達(dá)質(zhì) 粒的構(gòu)建方法的流程圖；
[0058] 圖3為SI it3蛋白的LRR2結(jié)構(gòu)域部分序列的RT-PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0059] 圖4為Strap II蛋白標(biāo)簽、His蛋白標(biāo)簽以及TEV酶切位點(diǎn)序列的PCR擴(kuò)增電泳 圖；
[0060] 圖5為構(gòu)建好的pcDNA3. 1 (_)/Slit3LRR2質(zhì)粒的圖譜；
[0061] 圖6為Western Blot方法檢測構(gòu)建質(zhì)粒的蛋白表達(dá)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0062] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，在LRR序列的一端（尤其是C 端）添加第一標(biāo)簽多肽元件和第二標(biāo)簽短肽元件，不僅有助于LRR正確折疊，形成有活性的 功能多肽，而且可以極其簡便地通過一次酶切就將兩種標(biāo)簽元件清除，從而制得高純度、高 活性的LRR序列。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0063] 術(shù)語
[0064] 如本文所用，"本發(fā)明蛋白"、"本發(fā)明融合蛋白"、"具有式la或lb的融合蛋白"可 互換使用，均指具有式la或lb的融合蛋白，其N端至C端分別含有任選的分泌信號(hào)肽、目 標(biāo)基因、酶切位點(diǎn)、第一標(biāo)簽多肽元件以及第二標(biāo)簽短肽元件；或任選的分泌信號(hào)肽、第二 標(biāo)簽短肽元件、第一標(biāo)簽多肽元件、酶切位點(diǎn)以及目標(biāo)基因。本發(fā)明融合蛋白的一個(gè)顯著特 點(diǎn)是在C端或N端具有可通過酶切去除的連續(xù)串聯(lián)標(biāo)簽元件。此外，應(yīng)理解，所述術(shù)語還包 括重組融合蛋白的活性片段和衍生物。
[0065] 如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來（如果是天然的物質(zhì)， 原始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化 的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。 [0066] 如本文所用，術(shù)語"標(biāo)簽蛋白"、"標(biāo)簽"、"標(biāo)簽蛋白元件"、"標(biāo)簽元件"可互換使用， 均指可用于分離純化具有本發(fā)明式la或lb的融合蛋白的標(biāo)簽多肽。
[0067] Slit3 蛋白及其 LRR
[0068] Slit3蛋白的全長序列如SEQ ID N0. :15所示，編碼其蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0. :14所示。本發(fā)明S1U3LRR2蛋白的序列如SEQ ID N0. :5所示，編碼其蛋白的核苷 酸序列如SEQ ID N0. :4所示。
[0069] 本發(fā)明Slit3蛋白來源于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地，來源于人、大鼠、小鼠。
[0070] 如本文所用，"S1U3LRR2蛋白"是指Slit3蛋白的LRR2結(jié)構(gòu)域。
[0071] 如本文所用，"純化的S1U3LRR2蛋白"是指S1U3LRR2蛋白基本上不含天然與其 相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純 化S1U3LRR2蛋白。基本上純的蛋白在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
[0072] 肽鍵或肽接頭
[0073] 本發(fā)明的具有式la或lb的融合蛋白各元件之間可以直接以肽鍵相連接，或者通 過肽接頭連接。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方式，所述的具有式la或lb的融合蛋白各元件 之間通過肽鍵之間連接，從而形成融合蛋白。
[0074] 通常，過短的肽接頭可在融合蛋白內(nèi)部造成空間位阻，影響蛋白的正確折疊，過長 的肽接頭可能增加融合蛋白的免疫原性，還可能影響融合蛋白的活性和功能。因此，可用于 本發(fā)明的肽接頭一般包括3-15個(gè)氨基酸；較佳地為5-10個(gè)氨基酸。
[0075] 具有連續(xù)串聯(lián)標(biāo)簽元件的融合蛋白
[0076] 本發(fā)明融合蛋白的氨基端（或羧基端）連續(xù)地含有兩個(gè)標(biāo)簽元件（如式la或lb 所示）。
[0077] A-X-E-Y1-Y2 式 la
[0078] A-Y2-Yl-E-X 式 lb
[0079] 其中，A、X、E、Y1、Y2的定義如上所述。
[0080] 對于第一標(biāo)簽多肽元件Y1而言，優(yōu)選的Y1選自下組：改良型親和素標(biāo)簽（Strap II標(biāo)簽）（長度為46aa)、鏈親和素（Str印II標(biāo)簽）（長度為9aa)。
[0081] 改良型親和素標(biāo)簽（Strap II標(biāo)簽）是在鏈親和素（Str印II標(biāo)簽）的基礎(chǔ)上改 良過的一種標(biāo)簽蛋白，其多肽序列如SEQ ID N0. :2所示，編碼其多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. :1 所示。
[0082] 本發(fā)明Strap II標(biāo)簽與Str印II標(biāo)簽的純化方式可以是相同或基本相同，即通 過與生物素的親和力進(jìn)行層析。與Str印II標(biāo)簽相比，Strap II標(biāo)簽（SEQ ID NO. :2)增 加了標(biāo)簽的親和性，其優(yōu)點(diǎn)在于純化過程在生理?xiàng)l件下進(jìn)行，使用的脫硫生物素溫和程度 的洗脫保護(hù)了靶蛋白的活性。而且，避免了常規(guī)Strep II標(biāo)簽的純化技術(shù)需要進(jìn)行封閉處 理步驟。
[0083] Y2為第二標(biāo)簽短肽元件，且為His標(biāo)簽元件?？捎糜诒景l(fā)明的His標(biāo)簽元件包括 6XHis或8XHis短肽，優(yōu)選的，為8XHis標(biāo)簽元件。
[0084] 此外，Y1和Y2之間無蛋白酶切位點(diǎn)，并以肽鍵直接連接。
[0085] 連續(xù)串聯(lián)標(biāo)簽的蛋白表達(dá)方案，一方面是結(jié)合兩種載體的優(yōu)點(diǎn)，避免存在的問題， 另一方面可以優(yōu)化蛋白純化步驟，提高純化后蛋白的純度，盡量減少來自動(dòng)物源性的污染 和純化過程中的離子性污染。
[0086] 在本發(fā)明融合蛋白中，在元件Y1和X之間為蛋白酶酶切位點(diǎn)，可以包括本領(lǐng)域常 用的用于分離純化蛋白的酶切位點(diǎn)，如TEV蛋白酶、Hrv3C蛋白酶。附加條件是，在本發(fā)明 融合蛋白的其他元件序列中，不含有該酶切位點(diǎn)。
[0087] TEV蛋白酶是來源于煙草蝕紋病毒（TEV)的Nla蛋白酶經(jīng)改進(jìn)后的50kDa的蛋白 酶，經(jīng)過設(shè)計(jì)后與天然TEV蛋白酶相比其穩(wěn)定性更好。此蛋白酶被用來切除純化后融合蛋 白的親和標(biāo)簽；并且該酶是經(jīng)由6 XHis標(biāo)簽純化而得（含組氨酸標(biāo)簽），純度達(dá)99%，剪切 反應(yīng)完畢后可通過Ni親和層析去除。在PH7. 0, 30°C時(shí)可達(dá)到最佳活性，但在PH5. 5-8. 5和 4-30°C的廣泛范圍內(nèi)TEV蛋白酶皆有活性，使得反應(yīng)條件的選擇可根據(jù)目的蛋白的情況而 修改。
[0088] 一種可用于本發(fā)明的蛋白酶酶切位點(diǎn)為TEV蛋白酶，如SEQ ID N0. : 3所示。
[0089] 此外，在本發(fā)明的融合蛋白的N端，可具有或不具有分泌信號(hào)肽。當(dāng)具有分泌信號(hào) 肽時(shí)，有助于實(shí)現(xiàn)融合蛋白的分泌表達(dá)，以便提高純化效率。在本發(fā)明中，適用的分泌信號(hào) 肽包括來自于Slit3的分泌信號(hào)肽、或來外源導(dǎo)入的自于其他蛋白的分泌信號(hào)肽。其中，來 源于Slit3的分泌信號(hào)肽的核苷酸序列如SEQ ID N0. :16所不，其編碼的信號(hào)肽序列如SEQ ID N0. : 17 所示。
[0090] 編碼序列和重組生產(chǎn)
[0091] 對于本發(fā)明的融合蛋白而言，本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA 形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是 編碼鏈或非編碼鏈。
[0092] 本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的蛋 白質(zhì)片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然 發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域 所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失 或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。
[0093] 如本文所用，術(shù)語"引物"指的是在與模板配對，在DNA聚合酶的作用下能以其為 起點(diǎn)進(jìn)行合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈的寡居核苷酸的總稱。引物可以是天然的RNA、DNA，也可 以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物"大 致上"（或"基本上"）與模板上一條鏈上的一個(gè)特殊的序列互補(bǔ)。引物必須與模板上的一 條鏈充分互補(bǔ)才能開始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補(bǔ)。比如，在一個(gè)3' 端與模板互補(bǔ)的引物的5'端加上一段與模板不互補(bǔ)的序列，這樣的引物仍大致上與模板 互補(bǔ)。只要有足夠長的引物能與模板充分的結(jié)合，非完全互補(bǔ)的引物也可以與模板形成引 物-模板復(fù)合物，從而進(jìn)行擴(kuò)增。
[0094] 本發(fā)明融合蛋白的各元件的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重 組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開 放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制 備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR 擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0095] 一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。 [0096] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通 過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
[0097] 應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引 物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方 法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
[0098] 本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或融合蛋白編 碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及制備本發(fā)明所述融合蛋白的方法。
[0099] 通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組 蛋白。一般來說有以下步驟：
[0100] (1).用本發(fā)明的編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核苷酸 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0101] (2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
[0102] (3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
[0103] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明蛋白的編碼DNA序列和合適 的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi) 重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。 表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0104] 包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0105] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞 如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、C0S、或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
[0106] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl 2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0107] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)） 誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0108] 在上面的方法中的蛋白質(zhì)可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果 需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化蛋白。這些方法是 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀 劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過濾）、吸附層析、 離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
[0109] 表達(dá)載體
[0110] 在獲得了編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn) 入合適的宿主細(xì)胞。最后通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過分離純化得到本發(fā)明的融合蛋 白。
[0111] 因此，本發(fā)明還提供了包含編碼所述融合蛋白的核酸分子的載體。所述的載體還 可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，以便于所述融合蛋白的表達(dá)。
[0112] 如本文所用，"操作性相連"或"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列 的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體 表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽（分泌前導(dǎo)序列）DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如 果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置 于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般"可操作地連于"意味著相 鄰近，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
[0113] 在本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，比如一些用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳 動(dòng)物細(xì)胞的克隆和表達(dá)的載體，如Pouwels等，克隆載體：實(shí)驗(yàn)室手冊（Elsevier最新版） 中所描述的。可選用本領(lǐng)域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將 編碼本發(fā)明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成蛋白表達(dá)載體。
[0114] 可用于本發(fā)明的一種優(yōu)選的真核表達(dá)載體可以為pcDNA3. 1 (_)(購自Invitrogen 公司）。
[0115] 表達(dá)載體包括連接有合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列的融合蛋白DNA序列，如來源于 哺乳動(dòng)物、微生物、病毒或昆蟲的基因。調(diào)控序列可包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操縱子、增強(qiáng)子、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)或控制轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止的合適序列。在融合蛋白序列需要調(diào)節(jié)序列功能 的時(shí)候，則連接合適的調(diào)控序列。這樣，啟動(dòng)子序列被連接在編碼融合蛋白DNA序列前端。 在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制的能力通常由復(fù)制起始點(diǎn)控制。用于轉(zhuǎn)化株識(shí)別的篩選基因也可加入 表達(dá)載體。
[0116] 另外，非天然的Slit3蛋白的信號(hào)肽的編碼序列可以引入表達(dá)載體。例如：信號(hào)肽 (分泌引導(dǎo)物）序列可以和與融合蛋白編碼序列融合，從而使翻譯的融合蛋白可分泌到細(xì) 胞外。信號(hào)肽可增強(qiáng)宿主細(xì)胞向胞外分泌嵌合多肽。信號(hào)肽在多肽從細(xì)胞內(nèi)分泌出來的過 程中可被切去。
[0117] 生產(chǎn)S1U3LRR2蛋白的方法
[0118] 本發(fā)明還包括生產(chǎn)融合蛋白以及純化的S1U3LRR2蛋白的方法，所述方法包括培 養(yǎng)含有融合蛋白編碼核酸的宿主細(xì)胞，從而培養(yǎng)本發(fā)明融合蛋白，從培養(yǎng)體系中分離純化 出權(quán)利要求1所述的融合蛋白；以及對所述的融合蛋白，用針對元件E的蛋白酶進(jìn)行酶解， 從而制得純化的S1U3LRR2蛋白。
[0119] 在分離本發(fā)明融合蛋白的標(biāo)簽元件時(shí)，可以使用分別針對不同標(biāo)簽元件的親和 層析進(jìn)行兩次分離后，再使用針對酶切位點(diǎn)的蛋白酶進(jìn)行酶解，從而分離出純度更高的 Slit3LRR2 蛋白。
[0120] 所述的融合蛋白包括S1U3LRR2或其活性片段。所述方法可包括讓細(xì)胞表達(dá)編碼 的融合蛋白，以及使表達(dá)的融合蛋白的復(fù)性。此外所述方法還可包括復(fù)性的融合蛋白的分 離和/或純化。
[0121] 可將上述制備獲得的融合蛋白純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上 呈單一條帶。例如，當(dāng)重組蛋白為分泌表達(dá)時(shí)，可以采用商品化的超濾膜來分離所述蛋白， 例如Millipore、Pellicon等公司產(chǎn)品，首先將表達(dá)上清濃縮。濃縮液可采用凝膠層析的方 法進(jìn)一步加以純化，或采用離子交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析（DEAE等）或 陽離子交換層析。凝膠基質(zhì)可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的基質(zhì)。Q-或 SP-基團(tuán)是較為理想的離子交換基團(tuán)。最后，還可用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析，疏 水相互作用層析和反相高效液相色譜（RP-HPLC)等方法對上述純化產(chǎn)物進(jìn)一步精制純化。
[0122] 可利用含有Slit3LRR2結(jié)構(gòu)域的特異性抗體、受體或配體的親和層析柱對表達(dá)的 融合性多肽進(jìn)行純化。根據(jù)所使用的親和柱的特性，可利用常規(guī)的方法，如高鹽緩沖液、改 變pH等方法洗脫結(jié)合在親和柱上的融合性多肽。
[0123] 重組蛋白以及編碼該重組蛋白的核酸可利用適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽?，例如，化學(xué)合成、重 組表達(dá)，或其合并應(yīng)用。參見John Wiley & Sons, Inc2000年出版的《Current Protocols in Molecular Biology》，以及 Cold Spring Harbor Laboratory Pressl989 年出版的 ((Molecular Coning:A Laboratory Manual〉〉。
[0124] 本發(fā)明的有益效果
[0125] 1.本發(fā)明融合蛋白獨(dú)特的連續(xù)串聯(lián)標(biāo)簽元件設(shè)計(jì)，尤其是經(jīng)改良的Strap II標(biāo) 簽，其長度合適，使表達(dá)的蛋白在宿主細(xì)胞中能夠得到各種修飾，能在不影響蛋白質(zhì)折疊的 情況下，最大程度的還原其天然構(gòu)象，使S1U3LRR2蛋白能于宿主細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)量 高，且表達(dá)完整、準(zhǔn)確。
[0126] 2.本發(fā)明融合蛋白的連續(xù)串聯(lián)標(biāo)簽元件設(shè)計(jì)使目標(biāo)蛋白更易純化，且標(biāo)簽元件能 通過一次酶切完整切除，制備工藝簡單，制得的S1U3LRR2蛋白純度高，活性強(qiáng)。
[0127] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0128] 實(shí)施例 1 構(gòu)建 pcDNA3. 1 (_) /Slit3LRR2 載體
[0129] 方法：采用外切酶法構(gòu)建質(zhì)粒。構(gòu)建質(zhì)粒的過程，共PCR擴(kuò)增3段片段（信號(hào)肽序 列、目標(biāo)序列、酶切位點(diǎn)+標(biāo)簽蛋白序列），進(jìn)行3次片段連接插入。所使用的引物分別是 Primerl、Primer2 和 Primer3〇
[0130] 外切酶法具體步驟：
[0131] 1、配制反應(yīng)體系：載體片段（BamHI酶切后膠回收并測定濃度）和PCR片段（PCR 后膠回收并測定濃度）各50ng，lullOx外切酶buffer,補(bǔ)充ddH20至10ul ;
[0132] 2、冰上放置5min，加入lul稀釋至20U/ul的外切酶III(Takara公司），混勻后冰 上放置60min ;
[0133] 3、加入lulO. 5M EDTA(pH8. 0)溶液終止反應(yīng)，之后65°C水浴5min ;
[0134] 4、水浴后冰上放置5min ;
[0135] 5、轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物。
[0136] 引物：
[0137] Primerl-F ：CCACACTGGACTAGTTGCCCCACCAAGTGTACCTG SEQ ID NO. :8
[0138] Primerl-R ：ACCGAGCTCGGATCCTTAGGCGACGGCTGGAGGCCCA SEQ ID NO. :9
[0139] Primer2-F ：CCTCCAGCCGTCGCCATCTCCTGCCCTTCGCCCT SEQ ID NO. : 10
[0140] Primer2-R ：ACCGAGCTCGGATCCTTAGAAGCACTCGCTGCTGAACC SEQ ID NO. :11
[0141] Primer3-F ：AGCAGCGAGTGCTTC CTGGAAGTGCTGTTCCAG SEQ ID NO. : 12
[0142] Primer3-R ：ACCGAGCTCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTG SEQ ID NO. : 13
[0143] 結(jié)果：目標(biāo)序列、酶切位點(diǎn)+標(biāo)簽蛋白序列的擴(kuò)增結(jié)果圖3和4所示，圖中可見，目 標(biāo)序列、酶切位點(diǎn)+標(biāo)簽蛋白序列擴(kuò)增成功。
[0144] 實(shí)施例 2pcDNA3. 1 (_) /Slit3LRR2 的成功表達(dá)
[0145] 方法：為了檢測構(gòu)建的質(zhì)粒是否成功表達(dá)，通過把質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到AD293細(xì)胞中，之后 經(jīng)標(biāo)簽蛋白8XHis來做Western Blot,檢測融合蛋白是否成功表達(dá)。
[0146] 材料：High glucose DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自HyClone公司；轉(zhuǎn)染試劑 Magetran購自O(shè)rigene公司；AD293細(xì)胞用含10%胎牛血清的High glucose DMEM培養(yǎng)液 培養(yǎng)。倒置顯微鏡為Olympus產(chǎn)品，突光倒置顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。
[0147] 步驟：
[0148] 2. 1.將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，傳代3至4次使細(xì)胞達(dá)到良好的生長狀態(tài)，進(jìn)行鋪 板檢測。Magetran試劑轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞。
[0149] 2. 2.接種AD293細(xì)胞至6孔板，用含10%胎牛血清的High glucose DMEM培養(yǎng)基培 養(yǎng)至密度約為70%-80%時(shí)可用于轉(zhuǎn)染。將Magetran試劑及質(zhì)粒pcDNA3. 1 (_)/Slit3LRR2溶 液平衡至室溫，在離心管內(nèi)準(zhǔn)備下列混合液：200 μ lopti_DMEM、2 μ g質(zhì)粒、6 μ 1 Magetran 轉(zhuǎn)染試劑，震蕩混勻后靜置室溫孵育l〇min。給細(xì)胞更換新的培養(yǎng)基后將混合液加入培養(yǎng)盤 中，搖勻。置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)12小時(shí)候移除培養(yǎng)基，更換為新鮮的含10% 胎牛血清的High glucose DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48h后，收蛋白用于Western Blot 檢測質(zhì)粒的蛋白表達(dá)情況。
[0150] 2. 3去除培養(yǎng)基后加入4°C PBS將細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下來放入1. 5ml離心管中，2000 轉(zhuǎn)5min離心，去除上清。接著開始裂解細(xì)胞，將RIPA強(qiáng)裂解液與蛋白酶抑制劑，100:1的比 例混合后加到細(xì)胞沉淀中，4°C搖晃裂解lh后，4°C，14000g離心30min，取上清即樣品。最 后測樣品蛋白濃度，并加入Loading buffer煮沸8min，再調(diào)平上樣量用SDS-聚丙烯凝膠電 泳跑膠。電泳3小時(shí)，轉(zhuǎn)膜2小時(shí)，之后抗體孵育，一抗2小時(shí)，顯色曝光。
[0151] 結(jié)果：Western Blot檢測結(jié)果如圖6所示。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組蛋白表達(dá)正常，而轉(zhuǎn)染空 載組沒有檢測到蛋白表達(dá)，說明所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒能正常的在真核細(xì)胞中表達(dá)，質(zhì)粒 構(gòu)建成功。
[0152] 實(shí)施例3表達(dá)量的測試
[0153] 將一個(gè)純化得到的已知濃度（20 μ g/ml)的HisGFP蛋白作為對照，用Western Blot的方法進(jìn)行蛋白表達(dá)量的測定。
[0154] 具體方法同實(shí)施例2,先轉(zhuǎn)染細(xì)胞，之后做Western Blot檢測。區(qū)別在于，跑 SDS-PAGE電泳時(shí)，加入一定已知量的HisGFP蛋白作為陽性對照。
[0155] 曝光得到結(jié)果后，通過對條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算得到蛋白的表達(dá)量。
[0156] 實(shí)施例4S1U3LRR2蛋白的純化
[0157] 方法及材料：由于采用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)是哺乳動(dòng)物高效表達(dá)系統(tǒng)，選擇的細(xì)胞是 廣泛用于蛋白表達(dá)的經(jīng)過優(yōu)化的中國倉鼠卵巢細(xì)胞CH0-S，而表達(dá)載體中有加入胞外分泌 信號(hào)肽，因此采用懸浮培養(yǎng)的方法，使細(xì)胞在高密度情況下分泌盡可能多的蛋白到培養(yǎng)液 中，收集培養(yǎng)液用于后續(xù)蛋白純化。
[0158] 純化方法：
[0159] 4. 1先用針對第一標(biāo)簽多肽元件的生物素親和柱進(jìn)行層析，再用針對第二標(biāo)簽短 肽元件的Ni親和柱進(jìn)行層析；或
[0160] 4. 2先用針對第二標(biāo)簽短肽元件的Ni親和柱進(jìn)行層析，再用針對第一標(biāo)簽多肽元 件的生物素親和柱進(jìn)行層析。
[0161] 首先，對純化得到的蛋白片段進(jìn)行定量，按比例的加入TEV蛋白酶進(jìn)行酶切，去除 蛋白標(biāo)簽。
[0162] 酶切緩沖液：50mMTris7. 5,500mM NaCl，5%Glycerol 的反應(yīng)體系，于 4°C過夜酶 切。
[0163] 酶切過后體系內(nèi)的標(biāo)簽蛋白片段和TEV蛋白酶均可通過Ni親和層析去除。
[0164] 實(shí)施例5純化的S1U3LRR2的測定
[0165] 方法：純化得到S1U3LRR2蛋白之后，將采用細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能檢測。其 中，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)行蛋白功能的初步判斷。
[0166] 劃痕實(shí)驗(yàn)借鑒了體外細(xì)胞致傷愈合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致 傷，然后加入藥物觀察其抑制腫瘤細(xì)胞遷移的能力。
[0167] 胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為2-10X 105個(gè)/ml，24孔板每孔加 入500ul細(xì)胞懸液，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。用10uL移液槍槍頭（或者無 菌牙簽）在單層細(xì)胞上呈"一"字劃痕，用PBS清洗3次，然后加入用2%FBS培養(yǎng)基配好的 不同的S1U3LRR2蛋白片段（可設(shè)置濃度梯度）溶液，取3-4個(gè)平行樣本，依據(jù)腫瘤細(xì)胞的 侵襲能力不同，37°C培養(yǎng)12-24h。鏡下拍照測量細(xì)胞遷移的面積。
[0168] Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)主要采用24孔板小室。用膠原（collagen)包被 Transwell小室（Millipore公司）底部膜。消化細(xì)胞，PBS洗1-2遍，用含0. 2%BSA的無血 清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至1-10X105,取細(xì)胞懸液200 μ 1加入Transwell 小室，24孔板下室加入500μ 1含血清的培養(yǎng)基，其中加入不同的S1U3LRR2蛋白片段。依 據(jù)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力不同，37°C培養(yǎng)12-48h。采用結(jié)晶紫染色細(xì)胞，鏡下拍照計(jì)數(shù)穿過的 細(xì)胞數(shù)，評(píng)價(jià)S1U3LRR2蛋白片段對腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。
[0169] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
[0001] 序列表 <110>李華順 <120>含有富含亮Μ酸=?復(fù)序列的Λ合蛋白及其制法和燉出 <130> Ρ2013-0430 <160> 17 <170> PatentTj] version 3.5 <210> 1 <211> 138 <212> DNA <213>寡核苷酸 <220> <221〉 CDS <222〉 (1)., (138) <400> 1 ctg tcc B.cc, ggt ggc age gat gag aag acc a,ct ggt tgg aga ggt ggc 48 Leu Ser Thr Gly Glv Ser Asp Glu Lvs Thr Thr Gly Trp Arg Glv Gly 1 5 10 15 cat gtt gtg gaa sgc ttg set ggt gaa ttg gaa caa ttg aga gcc cgt 96 His Val Val Glu Gly Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gin Leu Arg Ala Arg 20 25 30 ctg gag cat cac cca caa ggc caa aga gaa cca ggc age ggc 138 Leu Glu His His Pro Gin Gly Glri Arg Glu Pro Gly Ser Gly 35 40 45 <210> 2 <211> 46 <212> PRT 人丁序列 <400> 2 Leu Ser Thr Gly Gly Ser Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly 1 ' 5 10 15 His Val Val Glu Gly Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gin Leu Arg Ala Arg 20 25 30 Leu GIo Ills ilis Pro Gin Gly GJ_n Arg Giu Pro Giy Ser Giy 35 40 45 ' <210：> 3 <211> S <212：> PRT <2i3>人丨:序列 <220> <221> MISC FEATURE <223> 人工序列 <400> 3 Leu Glu Yal Leu Phe Gin Gly Pro 1 5 <210> 4 <211> 669 <212> DNA <213〉智人（Homo sapiens) <220> <221> CDS
[0002] <222> (1)..(669) <400> 4 ate tee tgc cct teg ccc tgc aeg tgc age aat. aac ate gtg gac tgt 48 lie Ser C-ys Pro Ser Pro Cys Thr Cvs Ser Asn Asri i丄e Val Asp Cvs 1 '5 ^ 10 15 ega gga aag ggc tig atg gtig all ccl gee aac tig ccg gag ggc ate 96 Arg G1 v I.ys G1 y Leu Met Glu Tie Pro A1 a Asn Leu Prn Gin G1 v Tie 20 25 30 ' gtc gaa ata ege eta gaa. cag aac tee atx aaa gee ate cct gca gga 144 Val Glu lie Arg Leu Clu Cln Asn Ser lie Lys Ala lie Pro Ala Gly 35 40 45 gee ttc acc nag far, aag aaa ct.g a.ag ega ata gac ate age aag a.at 192 Ala Phe Thr Gin Tyr Lys Lys Leu Lys Arg lie Asp lie Ser Lvs Asn 50 55 60 cag rtii teg gat att get cca gat gee ttc cag ggc ctg aaa tea etc 240 Gin lie Ser Asp lie Ala Pro Asp Aia Phe G丄ii Gi\ r Leu Lys Ser Leu 65 TO 75 ~ 80 aca teg ctg gtc ctg tat ggg aac aag ate acc gag att gee aag gga 288 Thr Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys lie Thr Glu lie Ala Lvs Gly 85 ' ' 90 95 ctg --τ. gat figg ctg gtg tee eta cag ctg etc etc etc aat gee aac 336 Leu Phe Asp Glv Leu Val Ser Leu Gin Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn 100 105 110 aag a,tc aac tgc cig egg gig aac aeg Lit cag gac ctg cag aac etc 381 Lys lie Asn Cys Leu Arg Val Asn Thr Phe Gin Asp Leu Cln Asn Leu 115 120 125 aac ttg etc tee ctg tat gac aac aag ctg cag acc ate age aag ggg 432 Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lvs Leu Gin Thr lie Ser Lys Glr 130 135 140 etc ttc gee cct ctg cag too ate cag aca. etc cac 1:1:a, gee caa a,a.c 480 Leu Phe Ala Pro Leu Gin Ser lie Gin Thr Leu His Leu Ala Gin Asn 145 150 155 160 _ cca ttt gtg tgc gac tgc cac ttg aag tgg ctg gee gac. tac etc cag 528 Pro Phe Val Cvs Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tvr Leu Gin '165 170 ' 17E gac aac ccc ate gag aca age ggg gee ege tgc age age ccg ege ega 576 Asp Asn Pro lie G丄u Thr Ser (Uy Aia Airg Os Ser Ser Pro Arg Arg 180 185 " 190 etc gee aac aag ege ate age cag ate aag age aag aag tie ege tgc 624 Leu Ala Asn Lvs Arg lie Ser Gin lie LyvS Ser Lys Lys Phe Arg Cys 195 200 ' 205 ' tea ggc tee gag gat tac ege age agg ttc age age gag tgc ttc 669 Ser Gly Ser Glu Asp Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Ser Glu Cvs Phe 210 215 220 <210> 5 <211> 223 <212> PRT <213> 智人(Homo sapiens) <400> 5 lie Ser Cys Pro Ser Pro Cys Thr Cys Ser Asn Asn lie Yal Asp Cys 15 10 15 Arg Gly Lys Gly Leu Met Giu JJe Fro Ala Asn Leu Fro Glu Gly lie 20 25 30 Val Glu lie Arg Leu Glu Gin Asn Ser lie Lys Ala. lie Pro Ala Gly 3E 40 ^ 45 Ala Phe Tlu' Gin Tyr Lys Lys Leu Lys Arg 11^ Asp He Ser Lys Asn 50 55 60 Gin lie Ser Asp lie Ala Pro Asp Ala Phe Gin Glv Leu Lys Ser Leu 65 70 75 80 Thr Rer T；eo VbI Leu Tyr Gly Asn Lys Tie Thr Gin Tie Me. I.ys Gly 85 ' ' *90 95 Leu Phe Asp Gly Leu Yal Ser Leu Gin Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn 100 105 110 Lys lie Asn Cys Leu Ai'g Yal Asn Thr Phe Gin Asp Leu Gin Asn Leu
[0003] 115 120 125 Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lvs Leu Gin Thr lie Ser Lvs Glv 130 135 140 Leu Phe Ala Pro Leu Gin Ser He Gin Thr Leu His Leu Ala Gin Asn 145 150 155 160 Pro Phe Yal Cys Asp Cvs His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu Gin 165 170 ' 175 Asp Asn Pro lie Glu Thr Scr Gly Ala Arg Cys Scr Ser Pro Arg Arg 180 185 190 Lou Ala Asn Lys Arg lie Scr Gin lie Lys Sor Lys Lys Phe Arg Cys 195 200 205 Ser Gly Ser Glu Asp Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Ser Glu Cys Phe 210 215 220 <210> 6 <211> 957 <212> DNA <213>人丄序列 <220> <221> CDS <222> (1).. (957) <400> 6 at.g gcc ccr ggg tgg gca ggg gt.r ggc gcc gcc gtg ege gcc ege ctg 48 Met Ala Pro Gly Trp Ala Gly Val Gly Ala Ala Val Arg Ala Arg Leu 丄 5 丄0 i5 geg ctg gcc ttg geg cig geg age gtc ctg agt ggg cct cca gcc gtc 96 Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ser Val Leu Ser Glv Pro Pro Ala Val 20 25 30 gcc ate tcc tgc cct teg ccc tgc aeg tgc age aat aac ate gtg gac 111 Ala lie Ser Cys Pro Ser Pro Cys Thr Cys Ser Asn Asn lie Val Asp 35 ' 40 45 t^t ega gga aag ggc tig a,lg gay all cct. gcc aac Llg ccg gag ggc 192 Cys Arg Gly Lys Gly Leu Met Glu lie Pro Ala Asn Leu Pro Glu Gly 50 55 60 ate gtc gaa ata ege eta gaa cag aac tee ate aaa gcc ate cct gca 240 lie Val Glu lie Arg Leu Glu Gin Asn Ser He Lys Ala lie Pro Ala 65 70 75 ' 80 gga gcc ttc acc cag t.ac. aag aaa ctg aag ega ata gac ate age aag 288 Gly Ala Phe Thr Gin Tyr Lys Lys Leu Lys krg lie Asp lie Sor Lys 85 90 95 ' aat cag ata teg gat att get cca gat gcc ttc cag ggc ctg aaa tea 336 Asn Gin He Ser Asp lie Ala Pro Asp Ala Phe Gin Glv Leu Lys Ser 100 105 110 etc ar.a Teg ctg gtc ctg tat ggg aar aag ate acc gng att gcc aag 384 Leu Thr Ser Leu Vai Leu Tyr Gly Asn Lys lie Thr Glu 丄ie Ala Lys 115 120 125 gga ctg ttt gat ggg ctg gtg tee eta cag ctg etc etc etc aat gcc 432 Gly Leu Phe Asp Gly Leu Val Ser Leu Gin Leu Leu Leu Leu Asn Ala 130 ~ 135 140 aac aag ate aac tgc ctg egg gtg aac aeg ttt cag gac ctg cag aac 480 Asn Lys lie Asn Cys Leu Arg Val Asn Thr Phe Gin Asp Leu Gin Asn 145 ' 1B0 155 160 etc aac tig etc tec ctg tat gac aac aag ctg cag acc ate age aag 528 Leu Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn i,ys Leu Gin Thr Tie Ser Lvs 165 170 175 ggg etc ttc gcc cct ctg cag tec ate cag aca etc cac tta gcc caa 576 Gly Leu Phe Ala Pro Leu Gin Ser lie Gin Thr Leu His Leu Ala Gin 。 180 185 190 aac cca xtt gtg tgc gac tgc cac ttg aag tgg ctg gcc gac tac etc 621 Asn Pro Phe Val Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu 195 200 205 cag gac aac ccc ate gag aca age ggg gcc ege tgc age age ccg ege 672 Gin Asp Asn Pro lie Glu Thr Ser Glv Ala Aig Cys Ser Ser Pro krg 210 215 ' 22-0 ega etc gcc aac aag ege y.tc age cag ate aag age stig t tc ege 720 Arg Leu Ala Asn Lys Arg lie Ser Gin lie Lys Ser Lys Lys Phe Arg
[0004] 225 230 235 240 tgc tea ggc tee gag gat tac ege age agg ttc age age gag tgc ttc 768 Cys Ser Gly Ser Glu Asp Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Ser Glu Cys Phe ^ ' 245 ' 250 255 ctg gaa gtg ctg ttc cag ggc cct ctg tee acc ggt ggc age gat gag 816 Leu Glu Yal Leu Phe Gin Gly Pro Leu Ser Thr Gly Gly Ser Asp Glu 260 265 ' 270 aag acc act ggi tgg aga ggt ggc cat gtt gtg gaa ggc ttg get ggt 864 Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His ￥al Val Glu Gly Leu Ala Gly t 275 ' 280 285 ' gaa ttg gaa caa ttg aga gee cgt ctg gag cat cac cca caa ggc caa 912 Glu Leu Glu Gin Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro Gin Gly Gin 290 295 300 aga gaa cca ggc age ggc cac cac cac cac cac cac cac cac taa 957 Arg Glu Pro Gly Ser Gly Ilis ISis Ilis His His llis llis His 305 310 315 <210> 7 <211> 318 <212> PRT <213> 人工序列 <400> 7 Met Ala Pro Gly Trp Ala Glv Va.1 Gly Ala Ala Val Arg Ala Arg i.eti 1 5 10 15 Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ser Yal Leu Ser Gly Pro Pro Ala Val 20 25 30 Ala lie Ser Cys Pro Ser Pro Cys 丁hr Cys Ser Asn Asn lie Val Asp 35 40 45 Cys Arg Gly Lvs Civ Leu Met Glu lie Pro Ala Asn Leu Pro Glu Glv 50 55 60 lie Val Glu lie Arg Leu Glu Gin Asn Ser lie Lys Ala lie Pro Ala 65 70 75 80 Gly Ala Phe Thr Gin Tvr Lys Lys Leu Lys Arg He Asp lie Ser Lys 85 90 95 Asn Gin He Ser Asp lie Ala Pro Asp Ala Phe Gin Gly Leu Lys Ser 100 105 110 Leu Thr Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys He Thr Glu lie Ala Lys 115 120 125 Gly Lou Phe Asp Glv Leu Val Sor Leu Gin Leu Leu Leu Leu Asn Ala 130 135 140 Asn Lvs He Asn Os Lou Arg Val Asn Thr Phe Gin Asp Leu Gin Asn 145 150 155 160 Leu Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gin Thr lie Ser Lys 165 170 175 Gly Leu Phe Ala Pro Leu Gin Ser lie Gin Thr Leu His Leu Ala Gin 180 185 190 Asn Pro Phe Val Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu 195 200 205 Gin Asp Asn Pro lie Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Ser Ser Pro firg 210 215 220 Arg Leu Ala Asn Lys Arg lie Ser Gin lie Lys Ser Lys Lys Phe Arg 225 230 235 ' 240 Cys Ser Gly Ser Glu Asp Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Ser Glu Cys Phe ' ' 245 ' 250 25H Leu Glu Val Leu Phe Gin Glv Pro Leu Ser Thr Glv Gly Ser Asp Glu 260 265 270 Lys Thr Thr Gly Ti'p Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly Leu Ala Gly 275 280 285 Glu Leu Glu Gin Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro Gin Gly Gin 290 295 300 ' Arg Glu Pro Glv Ser Gly His His His His His His His Ilis 305 310 315 <210> 8 <211> 35 <212> DNA
[0005] <213>寡核苷酸 <220> <221> miscfoaturc χ223> 人工序列 <棚> 8 ccacactgga ctagttgccc caccaagtgt acctg 35 <210> 9 <211> 37 <212> DM <213>寡核舒酸 <220> <221> raise feature <223> 人工序列 <400> 9 accgagctcg gatcctlcigg cgacggclgg aggccca 37 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213〉ft核苻酸 <220> <221 ^ misc_reiilure <223；人 TJV:列 <400> 10 rctccagccg tcgccatctr ctgcccttcg ccct 34 <210> 11 <211> 38 <212> DM <213> S核苷酸 <220> <221> misc_feature <223、人工厗列 <備〉11 accgagctcg gat.eett.a.ga agcactcgct. gct.gaa.cc 38 <210> 12 <211:， 33 <212、 DNA <213:>寡核苷酸 <220/ mi sc_fea.ture <223> 人-T:m 列 <400> 12 ageagegagt gcttcctgga agtgctgttc cag 33 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213>寡核苷酸 <220> <221> miscfcaturc <223、人T序列 <400> 13
[0006] iiccgagcU-g galccLtagL ggtggtggt.g gLgglg 36 <210> 14 <211> 4572 <212> DNA <213> 智人(Homo sapiens) <220> <221> CDS <222> (1).. (4572) <!00> 14 atg gcc ccc ggg tgg gc.a ggg gtc ggc gcc gcc gtg cgc gcc c.gc ctg 48 Met Ala Pro Glv Trp Ma Giy Val Gly Ala Ala Val Arg Ala Arg Leu 15 10 15 gcg ctg gcc ttg gcg ctg gcg age gtc ctg agt ggg cct cca gcc gtc 96 Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ser Val Leu Ser Gly Pro Pro Ala Val 20 25 ' 30 gcc tgc. c.c.c acr. aa.g t.gt. acc tgc tcc get gcc age gtg gac tgc cac. 144 Ala Cys Pro Thr Lys Cys Thr Cys Ser Ala Ala Ser Val Asp Cys His 35 40 4B ggg ctg ggc etc cgc gcg gtt cct egg ggc ate ccc cgc aac get gag 192 Gly Leii Gly Leo Arg Ala Val Pro Arg Gly Tie Pro Arg Asn Ala G1 n 50 55 60 cgc ett, ga.c ctg ga.c aga aat aa.t ate acc agg ate acc a.ag a.tg gac 240 Arg Leu Asp Leu Asp Arg Asn Asn lie Thr Ar^ lie Thr Lys Met Asp 65 70 75 ' 80 ttc get ggg etc aag aac etc ega gtc ttg cat ctg gaa gac aac cag 288 Phe Ala Gly Leu Lys Asn Leo Arg Val Leu His Leu Glu Asp Asn Gin 85 90 95 gtc age gtc ate gag aga ggc gcc ttc cag gac ctg aag cag eta gag 336 Val Ser Val lie Glu Arg Gly Ala Phe Gin Asp Leu Lvs Gin Leu Glu 100 ' 105 ' 110 ega clg cgc ctg aac aag a,al aag ctg caa gtc ct l cca gaa ttg clt 384 Arg Leu Arg Leu Asn Lvs Asn Lys Leu Gin Val Leu Pro Glu Leu Leu 115 120 125 ttc cag age aeg ccg aag etc acc aga eta gat ttg agt gaa aac cag 432 Phe Gin Ser Ihr Pro Lvs Leu Thr Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Gin 130 ' 135 140 ate cag ggg ate ccg agg aag gcg ttc cgc ggc ate acc gat gtg aag 480 lie Gin Gly lie Pro Arg Lys Ala Phe Arg Glv Ilo Thr Asp Val Lys 145 150 155 160 aac ctg caa ctg gac aac aac cac ate age tgc att gaa gat gga geo 528 Asn Leu Gin Leu Asp Asn Asn His lie Ser Cys Tie Glu Asp Glv Ala 165 170 175 ttc ega gcg ctg cgc gat ttg gag ate ett acc etc aac aac aac aar 576 Phe Arg Ala Leu Arg Asp Leu Glu lie Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn 180 185 190 ate agt cgc ate ctg gtc acc age ttc aac cac atg ccg aag ate ega 624 lie Ser Arg lie Leu Val Thr Ser Phe Asn His Met Pro Lys lie Arg 195 200 205 act ctg cgc etc cac tec aac cac ctg tac tgc gac tgc cac ctg gcc 872 Thr Leu Arg Leu His Ser Asn His Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Ala 210 215 220 tgg etc teg gat tgg ctg ega cag ega egg aca gtt ggc cag ttc aca 720 Trp I.eu Ser Asp Trp Leu Arg Gin Arg Arg Thr Yal Gly Gin Phe Thr 225 230 235 ' 240 etc tgc atg get cct gtg cat ttg agg ggc ttc aac gtg gcg gat gtg 768 Leu Cys Met Ala Pro Val His Leu Arg Gly Phe Asn Val Ala Asp Val ' 245 250 255 cag aag aag gag tac gtg tgc cca gcc ccc cac teg gag ccc cca tee 816 Gin Lys Lys Glu ?ντ Val Cys Pro Ala Pro His Ser Glu Pro Pro Ser 260 265 270 tgc aat gee aac tec ate tee tgc cct teg ccc tgc aeg tgc ngc 864 Cys Asn hla Asn Ser lie Ser Cys Pro Ser Pro Cys Thr Cvs Sei· Asn ' 275 280 ' 285 aac tile gig gac tgt ega gga aag ggc llg alg gag all cct gcc aac 912 Asn lie Val Asp Cys Arg Gly Lys Gly Leu Met Glu lie Pro Ala Asn
[0007] 290 295 300 ttg ccg gag ggc ate gtc gaa ata ege eta gaa cag aac tee ate aaa b60 Leu Pro Glu Gly lie Val Glu lie Arg Leu Glu Gin Asn Ser lie Lvs 305 ' 310 315 320 gee ate cct gca gga gee ttc acc cag tac aag aaa ctg aag ega ata 1008 Ala lie Pro Ala Gly Ala Phe Thr Gin Tyr Lys Lys Leu Lys Arg lie 325 330 ' 335 gac ate age aag aat cag ata teg gat att get cca gat gee ttc cag 1056 Asp lie Ser Lvs Asn Gin lie Ser Asp lie Ala Pro Asp Ala Phe Gin 340 345 350 ggc ctg aaa tea etc aca teg ctg gtc ctg tat ggg aac aag ate acc 1104 Gly Leu Lvs Ser Leu Thr Ser Leu Val Leu Tvr Gly Asn Lys lie Thr 355 360 365 gag att gee aag gga ctg ttt gat ggg ctg gtg tee eta cag ctg etc 1152 Gin 丄丄e Ala Lys Gly Leu Phe Asp Giy Leti Vai Ser Leu Gin Leu Leu 370 ' ' 375 ' 380 etc etc aat gee aac aag ate aac tgc ctg egg gtg aac aeg ttt cag 1200 Leu Leu Asn Ala Asn Lys lie Asn Cys Leu Arg Val Asn Thr Phe Gin 385 390 395 400 gac ctg cag aac etc aac ttg etc tee ctg tat gac aac aag ctg cag 1248 Asp i.eu Gin A.sn l eu Asn I.ru i.eu Sei' i.eu Tyr Asp Asn 1 .ys l.en Gin 405 410 ' 415 acc ate age aag ggg etc ttc gee cct ctg ca.g tee ate cag aca etc 1296 Thr lie Ser Lys Gly Leu Phe Ala Fro Leu Gin Ser lie Gin Thr Leu 420 425 430 cac tta gee caa aac cca ttt gtg tgc gac tgc cac ttg aag tgg ctg 1344 His Leu Ala Gin Asn Pro Phe Val Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu 435 440 445 gee gac tac etc cag gac aac ccc ate gag aca age ggg gee ege tgc 13y2 Ala Asp T\rr Leu Gin Asp Asn Pro lie Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys 450 455 460 ' ' age age ccg ege ega etc gee aac aag ege ate a_gc cag ale aag age 1440 Ser Ser Pro Arg Arg Leu Ala Asn Lys Arg lie Ser Gin lie Lys Ser 465 470 475 4B0 aag aag ttc ege tgc tea ggc tee gag gat tac ege age agg ttc age 1488 Lys Lys Phe Arg Os Ser Gly Ser Glu Asp Tyr Arg Ser Arg Phe Ser ' 485 ^ 490 495 age gag tgc ttc atg gac etc gtg tgc ccc gag aag tgt ege tgt gag 153G Ser Glu Cys Phe Met Asp Leu Val Cys Pro Glu Lys Os Arg 〇s Glu 500 505 510 ggc aeg att gtg gac tgc tee aac cag aag ctg gtc ege at.c cca age 1584 Gly Thr lie Val Asp Cys Ser Asn Gin Lys Leu Val Arg lie Pro Ser ' 515 520 525 cac etc cct gaa tat gtc acc gac ctg ega ctg aai gac aat gag gta 1632 His Leu Pro Glu Tvr Val Thr Asp Leu Arg Leu Asn Asp Asn Glu Val 530 535 540 tet gtt ctg gag gee act ggc ate ttc aag aag ttg ccc aac ctg egg 1680 Ser Va丄 Leu Gin A丄a rhr G丄y i丄e Phe Lys i^s Leu Pro Asn Leu Arg 545 550 ' 55a 560 aaa ata aat ctg agt aac aat aag ate aag gag gtg ega gag gga get 1728 Lys lie Asn Leu Ser Asn Asn Lys lie Lys Glu Yal Arg Glu Glv Ala 565 570 575 ttc Rat gga gca gee age gtg cag gag ctg atR ctg aca ggg aac cag 1776 Phe Asp G1Y Ala Ser Val Gin Glu i.eu Met i烈i 丁hr Gly /Lsn filn 580 585 590 ctg gag acc gtg cac ggg ege gtg ttc cgt ggc etc agt ggc etc aaa 1824 Leu Glu Thr Val His Gly Arg Val Phe Arg Gly Leu Ser Gly Leu Lvs 595 600 605 acc ttg atg ctg agg agt aac ttg ate ggc tgt gtg agt aat gac acc 1872 Thr Leu Met Leu Arg Ser Asn Leu lie Gly Cys Val Ser Asn Asp Thr 610 615 ' 620 ttt gee ggc ctg agt teg gtg aga ctg ctg tee etc tat gac aat egg 1920 Phe Ala Gly Leu Ser Ser Val Arg Leu Leu Ser Leu Tvr Asp Asn Arg 625 ^ 630 635 ~ 640 ale acc acc ate acc eel ggg gee lie acc aeg ell gtc lee ctg lee 1968 lie Thr Thr lie Thr Pro Gly Ala Phe Thr Thr Leu Val Ser Leu Ser 645 650 655 acc ata aac etc ctg tee aac ccc ttc aac tgc aac tgc cac ctg gee 2016
[0008] Thr lie Asn Leu Leu Ser Asn Pro Phe Asn Cys Asn €ys His Leu Ala 660 665 * " 670 Lgg etc ggc aag Igg tAg agg Hag agg egg aLc gic agt ggg aac ccl 2064 Trp Leu Gly Lys Trp Leu Arg Lys Arg Arg He Val Ser Gly Asn Pro 675 680 685 agg tgc cag aag cca ttt ttc etc aag gag att ccc ate cag gat gtg 2112 Arg Cys Gin Lys Pro Phe Phe Leu Lys Glu lie Pro lie Gin Asp Val 690 ' 695 ' 700 gcc ate cag gac ttc acc tgt. gat ggc aac gag gag agt age tgc cag 2160 Ala lie Gin Asp Phe Thr Cys Asp Glv Asn Glu Glu Ser Ser Cys Gin 705 710 715 720 ctg age ccg ege tgc ccg gag cag tgc acc tgt atg gag aca gtg gtg 2208 Leu Ser Pro Arg Cys Pro Glu Gin Cys Thr Cys Met Glu Thr Val Val 725 * 730 735 ega tgc age aac aag ggg etc ege gcc etc ccc aga ggc atg ccc aag 2256 Arg Cys Ser Asn Lys Gly Leu Arg Ala Leu Pro Arg Gly Met Pro Lys 740 745 750 gat gtg acc gag ctg tac ctg gaa gga aac cac eta aca gcc gtg ccc 2304 Asp Vai Thr Giu Leu IVr Leu G_Ui G_Ly Asn ilis Leu Thr Aia Vai Pro 755 ~ 760 765 aga gag ctg tee gee etc ega cac ctg aeg ett att gac ctg age aac 2352 Arg Glu Leu Ser Ala Leu Arg His Leu Thr Leu lie Asp Leu Ser Asn 770 775 780 aac age ate age atg ctg acc aat tac acc ttc agt aac atg tet cac 2400 Asn Ser lie Ser Met Leu Thr Asn Tvr Thr Phe Ser Asn Met Ser His 785 790 t 795 800 etc tee act ctg ate ctg age tac aac egg ctg agg tgc ate ccc gto 21 Leu Ser Thr Leu lie Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Arg Cys lie Pro Val 805 810 815 cac gcc ttc aac ggg ctg egg tee ctg ega gtg eta acc etc cat ggc 2496 His Ala Phe Asn Gly Leu Arg Ser Leu Arg Yal Leu Thr Leu His Gly 820 825 830 aat gac att tee age gtt cct gaa ggc tee ttc aac gac etc aca tet 2544 Asn Asp lie Ser Ser Val Pro Glu Glv Ser Phe Asn Asp Leu Thr Ser 835 840 ' 845 cit lee cal clg geg clg gga acc aac cca etc cac Igl gac tgc agl 2592 Leu Ser His Leu Ala Leu Gly Thr Asn Pro Leu His Cvs Asp Cys Ser 850 855 860 ct.t egg tgg ctg teg gag igg gtg aag geg ggg tac aag gag cct ggc 2640 Leu Arg Trp Leu Ser Glu Trp Val Lys Ala Gly Tyr Lys Glu Pro Gly 865 870 " 875 ^ 880 ate gcc ege tgc agt age cct gag ccc atg get gac agg etc ctg etc 2688 lie Ala Arg Cys Ser Ser Pro Glu Pro Met Ala Asp Arg Leu Leu Leu 885 890 895 acc acc cca acc cac ege ttc cag tgc aaa ggg cca gtg gac ate aac 2736 Thr Thr Pro Thr His Arg Phe Gin Cys Lys Gly Pro Val Asp He Asn 900 905 910 att gtg gcc aaa tgc aat gcc tgc etc tee age ccg tgc aag aat aac 2784 lie Val Ala Lys Cys Asn Ala Cys Leu Ser Ser Pro Cvs Lys Asn Asn 915 920 925 ggg aca tgc acc cag gac cct gtg gag ctg tac ege tgt gcc tgc ccc 2832 Gly Thr Cys Thr Gin Asp Fro Val Giu Leu Tyr Arg Cys Aia Cys Pro 930 935 940 tac age tac aag ggc aag gac tgc act gtg ccc ate aac acc tgc ate 2880 Tyr Ser Tvr Lys Gly Lvs Asp Cys Thr Val Pro lie Asn Thr Cys He 945 950 955 960 cag aac ccc tgt cag cat gga ggc acc tgc cac ctg agt gac age cac 2928 Gin Asn Pro Cys Gin His Gly Gly Thr Cys His Leu Ser Asp Ser His '965 ' 970 975 aag gat ggg ttc age tgc tee tgc cct ctg ggc ttt gag ggg cag egg 2976 Lys Asp Gly Phe Ser Cvs Ser Cys Pro Leu Gly Phe Glu Gly Gin Arg 980 985 990 tgt gag ate aac cca gat gac tgt gag gac aac gac tgc gaa aac aat 3024 Cys Glu lie Asn Pro Asp Asp Cys Glu Asp Asn Asp Cys Glu Asn Asn 995 1000 1005 gcc acc tgc gtg gac ggg ate aac aac tac gtg tgt ate tgt ccg 3069 Ala Thr Cvs Val Aso Glv lie Asn Asn Tvr Val Cys lie Cys Pro 1010 1015 ' 1020 '
[0009] ccl aac lac aca ggt gag cta tgc gac gag gig all gac cac igi 3114 Pro Asn Tyr Tlir Gly Glu Leu Cys Asp Glu Val lie Asp His Cys 1025 1030 1035 gtg cct gag ctg aac etc tgt cag cat gag gcc aag tgc ate ccc 3159 Val Pro Glu Leu Asn Leu Cys Gin His Glu Ala Lts Cts lie Pro 1040 1045 1050 ctg gac aaa gga ttc age tgc gag tgt gtc cct ggc tac age ggg 3204 Lou Asp Lye Gly Phe Scr Cys Glu Cys Val Pro Glv Τυγ Scr Gly 1055 1060 1065 aag etc tgt gag aca gac aat gat gac tgt gtg gcc cac aag tgc 3249 Lys Leu Cys Glu Thr Asp Asn Asp Asp Cvs Val Ala His Lvs Cys ' 1070 1075 ' 1080 ^ ' ege cac ggg gcc cag tgc gtg gac aca. ate aat ggc tac aca tgc 3294 Arg His Gly Ala Gin Cys Val Asp Thr lie Asn Glv Tyr Thr Cys 1085 1090 1095 acc tgc ccc cag ggc ttc agt gga ccc t.tc tgt gaa cac ccc cca 3λΗ9 Thr Cys Pro Gin Gly Phe Ser Gly Pro Phe Cys Glu His Pro Pro 1100 。 1105 ' 1110 ccc a.tg gtc eta ctg cag acc age cca. tgc gac cag tac gag tgc 3384 Pro Met Vai Leu Leu Gin Thr Ser Pro Cys Asp Gin Tyr Glu Cys Π15 1120 Π25 cag aac ggg gcc cag tgc ate gtg gtg cag cag gag ccc acc tgc 3429 Gin Asn Gly Ala Gin Cys Tie VbI Val Gin Gin Glu Pro Thr Cys 1130 ' _ 1135 1140 ' ege tgc cca cca ggc ttc gcc ggc ccc aga. tgc gag aag etc ate 3474 Arg Cys Pro Pro Gl? Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu Lys Leu lie 1145 ' 1150 ' ' 1155 act gtc aac ttc gtg ggc aaa gac tee tac gtg gaa ctg gcc tee 3519 Thr Val Asn Phe Val Gly Lys Asp Ser Tyr Val Glu Leu Ala Ser 1160 1165 1170 gcc aag gtc ega ccc cag gcc aac ate tee ctg cag gtg gcc act 3561 Ala Lys ￥al Arg Pro Gin Ala Asa He Ser Leu Gla Val Ala Thr 1175 1180 1185 gac aag gac aac ggc ale cli cLc lac aaa gga gac ttal gac ccc 3609 Asp Lys Asp Asn Glv He Leu Leu Tyr Lvs G1y Asp Asn Asp Pro 1190 1195 1200 ctg gca ctg gag ctg tac cag ggc cac gtg egg ctg gtc tat gac 3654 Leu Ala Leu Glu Leu Tyr Gin GIt His Val krg Leu Val Tyr Asp 1205 ' 1210 ' 1215 ' age ctg agt tee cct cca acc aca gtg tac agt gtg gag aca gtg 3699 Scr Lou Scr Scr Pro Pro Thr Thr Val Tyr Scr Val Glu Thr Val 1220 1225 1230 aat gat ggg cag 111 cac agt gtg gag ctg gtg aeg eta aac cag 37 H Asn Asp Gly Gin Phe His Ser Val Glu Leu Val Thr Leu Asn Gin 1235 ' 1210 1245 acc ctg aac eta gta gtg gac aaa gga act cca aag age ctg ggg 3789 Thr Leu Asn Leu Val Vai Asp Lvs Glv Thr Pro Lys Ser Leu Gly 1250 1255 1280 aag etc cag aag cag cca gca gtg ggc ate aac age ccc etc tac 3834 Lys Leu Gin Lys Gin Pro Ala Val Gly lie Asn Ser Pro Leu Tyr ' 1265 ' 1270 ^ 1275 ' ett gga ggc ate ccc acc tee acc ggc etc tet gcc ttg ege cag 3879 Leu Gly Gly lie Pro Thr Ser Thr Gly Leu Ser Ala Leu Arg Gin T2BD ^ 1285 1290 _ ggc aeg gac egg cct eta ggc 職c ttc cac Rga tgc ate cat gag 3924 Gly Thr Asp Arg Pro i,eo Gly Gly Phe His Gly Cys Tie His Glu 1295 1300 1305 gtg ege ate aac aac gag ctg rag gar. ttc eag gcc cca cca 3969 Val Arg lie Asn Asn Glu Leu Gin Asp Phe Lys Ala Leu Pro Pro 1310 1315 1320 cag tee ctg ggg gtg tea cca ggc tgc aag tee tgc acc gtg tgc 4014 Gin Ser Leu Gly Val Ser Pro Gly Cys Lvs Ser Cys Thr Yal Cys 1325 1330 1335 aag cac ggc ctg tgc ege tee gtg gag aag gac age gtg gtg tgc 4059 Lys His Glv Lea Cys Arg Ser Val Glu Lvs Asp Ser Val Yal Cys 1340 1345 1350 gag Lgc ege cca ggc Igg acc ggc cca etc tgc gal cag gag gcc 1104 Glu Cys Arg Pro Gly Trp Thr Gly Pio Leu Cys Asp Gin Glu Ala
[0010] 1355 1360 1365 egg gac ccc tgc etc ggc cac aga tgc cac cat gga aaa tgt gtg 1149 Arg Asp Pro Cys Leu Gly His Arg Cys His His Gly Lvs Cvs ￥al 1370 ' 1375 ' 1380 ^ gca act ggg acc tea tac atg tgc aag tgt gee gag ggc tat gga 4194 Ala Thr Gly Thr Ser Tyr Met Cys Lys Cvs Ala Glu Gly Tyr Gly 1385 1390 1395 ' ggg gac ttg tgt gac aac aag aat gac tet- gee aat gee tgc tea 4239 Gly Asp Leu Cvs Asd Asn Lys Asn Asp Ser Ala Asn Ala Cys Ser 1400 ' * 1405 1410 gee ttc aag tgt cac cat ggg cag tgc cac ate tea gac caa ggg 4284 Ala Phe Lys Cys His His Gly Gin Cys His lie Ser Asp Gin Gly 1415 1420 1425 gag ccc tac tgc ctg tgc cag ccc ggc ttt age ggc gag cac tgc 1329 Glu Pro Tyr Cys Leu Cys Gin Fro Gly Fhe Ser Gly Glu His Cys 1430 1435 1440 caa caa gag aat ccg tgc ctg gga caa gta gtc ega gag gtg ate 4374 Gin Gin Glu Asn Pro Cys Leu Gly Gin Val Val Arg Glu Val lie 1445 1450 1455 ege ege cag aaa ggt tat gca tea tgt gee aca gee tee aag gtg 4419 Arg Arg Gin I,ys G1 v Tyr Ale Ser Cys Ala. Thr Ala Ser i.ys Val" 1460 ' ' ' 1465 ' 1470 ' ccc ate atg gaa tgt cgt ggg ggc tgt ggg ccc cag tgc tgc cag 4464 Pro lie Met Glu Cys Arg Gly Gly Cys Gly Pro Gin Cys Cys Gin 1475 1480 1485 ccc acc ege age aag egg egg aaa tac gtc ttc cag tgc aeg gac 4509 Pro Thr Arg Ser Lys Arg Arg Lvs Tyr Val Phe Gin Cys Thr Asp 1490 1495 1500 ggc tee teg ttt gta gaa gag gtg gag aga cac tta gag tgc ggc 4554 Glv Ser Ser Phe Val Glu Glu Val Glu Arg His Leu Glu Cvs Gly 1505 1510 1515 " · tgc cIc geg igi tee laa 4572 Cys Leu Ala Cys Ser 1520 <210> 15 <211> 1523 <212> PRT <2i3> 智人（Homo sapiens) <400> 15 Mot Ala Pro Gly Trp Ala Gly Val Gly Ala Ala Val Arg Ala Arg Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ser Val Leu Ser Gly Pro Pro Ala Val 20 25 30 Ala Cys Pro Thr Lys Cvs Thr Cys Ser Ala Ala Ser Val Asp Cys His 35 40 45 Gly Leu Gly Leu Arg Ala Val Pro Arg Gly lie Pro Arg Asn Ala Glu 50 55 60 Arg L^u Asp Leu Asp Arg Asn Asn lie Thr Arg lie Thr Lys Met Asp 65 70 75 80 Phe Ala Gly Leu Lys Asn Leu Arg Yal Leu His Leu Glu Asp Asn Gin 85 90 95 Val Ser Val lie Glu Arg Gly Ala Phe Gin Asp Leu Lys Gin Leu Glu 100 . 105 110 Arg Leu Arg Leu Asn Lvs Asn Lys Leu Gin Val Leu Pro Glu Leu Leu 115 120 125 Phe Gin Ser Thr Pro Lvs L冊 Thr Arg Leu Asp Leu Ser Glu Asn Glsi 130 135 140 lie Gin Gly lie Pro Arg Lys Ala Phe Arg Gly lie Thr Asp Val Lvs 145 150 15o 160 Asn Leu Gin Leu Asp Asn Asn His lie Ser Cys He Glu Asp Gly Ala 165 170 175 Phe Arg Ala Leu Arg Asp Leu Glu lie Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn 180 185 190 lie Ser Arg lie Leu Val Thr Ser Phe Asn His Mel Pro Lys lie Arg 195 200 205
[0011] Tlxr Leu Arg Leu His Ser Asn His Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Ala 210 215 220 Trp Leu Ser Asp Trp Leu Arg Gin Arg Arg Thr Val Gly Gin Plie Thr 22b 230 235 240 Leu Cys Mel Ala Pro Val His Leu Arg Gly Phe Asn Val Ala Asp Val ' 245 250 255 Gin Lys Lys Glu Tyr Val Cys Pro Ala Pro His Ser Glu Pro Pro Ser ' 260 ' 265 270 Cys Asn Ala Asn Ser lie Ser Cys Pro Ser Pro Cys Thr Cvs Ser Asn ' 275 280 ' 285 Asn lie Val Asp Cys Arg Gly Lys Gly Leu Met Glu He Pro Ala Asn 290 ' 295 300 Leu Pi'o Glu Gly lie Val Glu lie Arg Leu Glu Gin Asn Ser lie Lys 305 310 315 320 Ala lie Pro Ala Gly Ala Phe Thr Gin Tyr Lys Lys Leu Lys Arg lie 325 330 335 Asp ile Ser Lys Asn Gin lie Ser Asp lie Ala Fro Asp Ala Phe Gin 340 345 350 Gly Leu Lys Ser Leo Thr Ser Leu Val Leu Tyr Giy Asn Lws lie Thr ' 355 360 ' 365 Glu Ile Ala Lys Glv Leu Phe Asp G1y Leu Yal Ser Leu Gin Leu Len 370 375 ~ 380 Leu Leu Asn Ala Asn Lys Ile Asn Cys Leu Arg Val Asn Thr Phe Gin 385 390 395 100 Asp Leu Gin Asn Leu Asn Leu Len Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Len Gin 405 410 415 Thr Tie Ser Lys Gly Leu Phe Ala Pro Leu Gin Ser Tie Gin Thr Leu 420 ' 425 430 His Leu Ala Gin Asn Pro Phe Val Cys Asd Cys His Leu Lvs Trp Len 4.35 440 * 445 Ala Asp Tyr Leu Gin Asp Asn Pro lie Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys 450 455 460 Ser Ser Pro Arg Arg Leu Ala Asn Lys Arg Ile Ser Gin Ile Lvs Ser 465 470 475 480 Lys Lys Phe Arg Cys Ser Glv Ser Glu Asp Tyr Arg Ser i\rg Phe Ser 485 490 495 Ser Glu Cys Phe Met Asp Leu Val Cys Pro Glu Lys Cys Arg Cys Glu 500 505 510 Glv Thr Ile Val Asp Cys Ser Asn Gin Lvs Leu Val Arg Ile Pro Ser 515 520 525 His Leu Pro Glu Tvr Val Thr Asp Leu Arg Leu Asn Asp Asn Glu Yal 530 535 540 Ser Yal Leu Glu Ala Thr Gly Ile Phe Lys Lvs Leu Pro Asn Leu Arg 545 550 555 560 Lys lie Asn Leu Ser Asn Asn Lys lie Lys Glu Val Arg Glu Glv Ala 565 570 575 Phe Asp Gly Ala Ala Scr Val Gin Glu Lou Met Leu Thr Glv Asn Gin 580 585 590 Leu Glu Thr Val His Gly Ai'g Yal Phe Arg Gly Leu Ser Gly Leu Lys 595 600 605 Thr Leu Met Leu Arg Ser Asn Leu lie Glv Cys Val Ser Asn Asp Thr 610 til5 620 Phe Ala Gly Leu Ser Ser Val Arg Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Arg 625 630 635 640 Ile Thr Thr Ile Thr Pro Gly Ala Phe Thr Thr Leu Val Ser Leu Ser 645 650 655 Thr Ile Asn Leu Leu Ser Asn Pro Phe Asn Cys Asn Cys His Leu Ala 660 665 670 Trp Leu Gly Lys Trp Leu Arg Lys Arg Arg Ile Val Ser Gly Asn Pro 675 680 685 Arg Cys Gin Lys Pro Phe Phe Leu L?s Glu Ile Pro lie Gin Asp Val 690 695 700 Ala Ile Gin Asp Phe Thr Cys Asp Gly Asn Glu Glu Ser Ser Cvs Gin 705 710 ' 715 ' 720 Leu Ser Pro Arg Cys Pro Glu Gin Cys Thr Cys Met Glu Thr Val Val 725 730 735 Arg Cys Ser Asn Lvs Glv Leu Arg Ala Leu Pro Arg Glv Met Pro Lvs 740 ' ' 745 750 "
[0012] Asp ￥al Thr Glu Leu Tyr Leu Glu Gly Asn His Leu Thr Ala Yal Pro 755 · 760 · 765 Arg Glu Leu Ser Ala Leu Arg His Leu Thr Leu lie Asp Leu Ser Asn 770 775 780 Asn. Ser lie Ser Met Leu Thr Asn Ivr Thr Phe Ser Asn Met Ser His 785 790 ~ 795 800 Leu Ser Thr Leu lie Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Arg Cys lie Pro Val 805 ' 810 815 His Ala Phe Asn Gly Leu Arg Ser Leu Arg Val Leu Thr Leu His Gly 820 ' 、 825 830 ' Asn Asp lie Ser Ser Val Pro Glu Gly Ser Phe Asn Asp Leu Thr Ser 835 840 t 845 Leu Ser His Leu Ala Leu Gly Thr Asn Pro Leu His Cys Asp Cys Ser 850 855 860 ^ Leu Ai'g Trp Leu Ser Glu Trp Val Lts Ala GIt Tyr Lys Glu Pro G1t 865 870 ' 875 880 lie Ala Arg Cys Ser Ser Pro Glu Fro Met Ala Asp Arg Leu Leu Leu ^ 885 890 B95 Thr Thr Pro Thr Ills Arg Phe Gin Cvs Lys Gly Pro Val Asp lie Asn 900 905 910 lie Val Ala Lys Cys Asn Ala Cys Leu Ser Ser Pro Cvs Lys Asn Asn 915 ^ 920 925 Glv Thr Cys Thr Gin Asp Pro Val Glu Leu Tvr Arg Cvs Ala Cys Pro 930 935 940 ' T^rr Ser Tvr Lys Gly Lys Asp Cys Thr Val Pro lie Asn Thr Cys lie 945 ^ 950 ^ 955 960 Gin Asn Pro Cys Gin His Gly Glv Thr Cys His T,eu Ser Asp Ser His 965 ^ ' 970 975 Asp Γτ〗γ H Ser 〇s Ser Os Pro Len GW Phe ftlu GW Gin Arg ' 980 ' ' 985 ' 990 Cys Glu lie Asn Pro Asp Asp Cvs Glu Asp Asn Asp Cys Glu Asn Asn 995 1000 1005 Ala Thr Cys Val Asp Gly lie Asn Asn Tyr Val Cvs lie Cvs Pro 1010 1015 1020 Pro Asn Tyr Thr Gly Glu Leu Cys Asp Glu Yal lie Asp His Cys 1025 1030 1035 Val Pro Glu Leu Asn Leu Cvs Gin His Glu Ala Lvs Cvs lie Pro 1040 1045 1050 Leu Asp Lys Gly Phe Ser Cys Glu Cys Val Pro Cly Tyr Ser €ly 1055 1060 1065 Lys Leu Cys Glu Thr Asp Asn Asp Asp Cvs Yal Ala His Lvs Cys 1070 1075 1080 Arg His Gly Ala Gin Cvs Val Asp Thr lie Asn Gly Tyr Thr Cys 1085 1090 1095 Till' Cvs Pro Gin Gly Pho Ser Gly Pro Phe Cys Glu His Pro Pro 1100 1105 1110 Pro Met. Val Leu Lou Gin Thr Scr Pro Cys Asp Gin Tyr Glu Cys 1115 1120 1125 Gin Asn Gly Ala Gin Cys lie Val Val Gin Gin Glu Pro Thr Cys 1130 1135 1140 Arg Cys Pro Pro Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu Lys Leu lie 1145 1150 1155 Thr Yal Asn Phe Val Gly Lys Asp Ser Tvr Yal Glu Leu Ala Ser 1160 1165 1170 Ala Lys Val Arg Pro Gin Ala Asn lie Ser Leu Gin Val Ala Thr 1175 1180 1185 Asp Lys Asp Asn Gly lie Leu Leu Tyr Lys Gly Asp Asn Asp Pro 1190 1195 1200 Leu Ala Leu Glu Leu Tyr Gin Glv His Val Arg Leu Val Tyr Asp 1205 ' 1210 1215 Ser Leu Ser Ser Pro Pro Thr Thr Val Tyr Ser Val Glu Thr Yal 1220 1225 1230 Asn Asp Gly Gin Phe His Ser Val Glu Leu Yal Thr Leu Asn Gin 1235 ' 1240 1245 Thr Leu Asn Leu Val Val Asp Lys Gly Thr Pro Lys Ser Leu Gly 1250 1255 1260 ' Lvs I.eu Gin Lys Gin Pro Ala. Val Glv lie Asn Ser Pro Leu Tyr 1265 1270 1275
[0013] Leu Glv Gly lie Pro Thr Ser Thr Glv Leu Ser Ala Leu Arg Gin 1280 1285 1290 Glv Thr Asp Arg Pro Leu Glv Gly Phe His Gly Cys lie His Glu 1295 1300 1305 ￥al Arg lie Asn Asn Glu Leu Gin Asp Phe Lys Ala Leu Pro Pro 1310 1315 1320 Gin Ser Leu Gly Val Ser Pro Gly Cys Lys Ser Cys Thr Val Cys 1325 ' 1330 t ^ 1335 ' Lys His Gly Leu Cys Arg Ser Val Glu Lys Asp Ser Val ￥al Cys 1340 1345 1350 Glu Cys Arg Pro Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Asp Gin Glu Ala 1355 ' 1360 ' - 1365 Arg Asp Pro Cys Leu Gly His Arg Cys His His Gly Lys Cys Val 1370 1375 t 1380^ Ala Thr Gly Thr Ser Tyr Met Cys Lys Cys Ala Glu Glv Tyr Glv 1385 1390 1395 Gly Asp Leu Cys Asp Asn Lys Asn Asp Ser Ala Asn Ala Cys Ser MOO 1405 1410 ' Ala Phe Lys Cys His His Gly Gin Cys His lie Ser Asd Gin Gly 1415 1420 ~ 1425 ^ Glu Pro Tyr Cys Leu Cys Gin Pro Gly Phe .Ser Glv Glu His Cys 1430 ' ' 1435 ' 1440 ^ Gin Gin G丄u Asn Pro Ofs Leu Giy Gin Vai Val Arg Giu Val lie 1445 1450 1455 Arg Arg Gin Lys Gly Tyr Ala Ser Cys Ala Thr Ala Ser Lys Val 1460 ^ ' ' 1465 ^ 1470 Pro He Met Glu Cys Arg Glv Gly Cvs Glv Pro Gin Cvs Cys Gin 1475 1480 1485 Pro Thr Arg Ser Lys Arg Arg Lys Tyr Val Phe Gin Cvs Thr Asp 1490 1495 1500 Glv Ser Ser Phe Val Glu Glu Val Glu Arg His Leu Gl'i Cys Gly 1505 1510 1515 Cys Leu Ala Cvs Ser ' 1520 - <210> 16 <211> 99 <212> DNA <213> 智人（Homo sap iens) <220> <22?> CDS <222> (1).. (99) <400> 16 aig gcc ccc ggg tgg gca ggg gtc ggc gcc gcc gtg cgc gcc cgc ctg 48 Met Ala Pro Gly Trp Ala Gly Val Gly Ala Ala Val Arg Ala Arg Leu 1 5 ^ ^ 10 15 gcg ctg gcc ttg gcg ctg gcg age gtc ctg agt ggg ect cca gr.r. gtc 96 Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ser Val Leu Ser Glv Pro Ρ-- Ala Val 20 25 3Q gcc 99 Ala <210> 17 <211> 33 FKT <213> 智人（Homo sapiens) <400> 17 Met Ala Pro Gly Trp Ala Glv Val GW Ala Ala Val Arg Ala Arg Leu 1 5 ~ ~ 10 15 A.【a Leu Aia Leu A丄a Leu Aia Ser Vai Leu Ser Gly Fro Pro Ala Vai 20 25 30 Ala
【權(quán)利要求】
1. 一種融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白自N端至C端具有式la或lb所述的結(jié) 構(gòu)： A-X-E-Y1-Y2 式 la ; A-Y2-Υ1-Ε-X 式 lb ; 其中， A為任選的分泌信號(hào)肽； X為Slit3蛋白的富含亮氨酸的重復(fù)序列2 (leucine-rich repeat2, LRR2)元件； E為酶切位點(diǎn)； Y1為第一標(biāo)簽多肽元件； Y2為第二標(biāo)簽短肽元件，所述第二標(biāo)簽短肽元件為His標(biāo)簽元件； "一"表示連接上述元件的肽鍵或肽接頭。
2. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的Y1包括SEQ ID NO. : 2所示的改 良型親和素標(biāo)簽（Strap II標(biāo)簽）、鏈親和素（Strepavidin)標(biāo)簽。
3. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的Y1為Strap II標(biāo)簽，而Y2為 8XHis標(biāo)簽元件。
4. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的S1U3LRR2的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 5 所示。
5. -種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的融合蛋 白。
6. -種表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求5所述的多核苷酸。
7. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體或轉(zhuǎn) 染了權(quán)利要求5所述的多核苷酸。
8. 如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞；較 佳地包括CH0細(xì)胞、293細(xì)胞。
9. 一種制備S1U3LRR2蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟： (i) 在合適的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)權(quán)利要求1所 述的融合蛋白； (ii) 從培養(yǎng)體系中分離純化出權(quán)利要求1所述的融合蛋白； (iii) 對所述的融合蛋白，用針對元件E的蛋白酶進(jìn)行酶解，從而制得S1U3LRR2。
10. -種制備S1U3LRR2蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟： 對權(quán)利要求1所述的融合蛋白，用針對元件E的蛋白酶進(jìn)行酶解，從而制得S1U3LRR2。
11. 一種純化的S1U3LRR2蛋白，其特征在于，是通過權(quán)利要求9或10所述的方法生產(chǎn) 制備的。
【文檔編號(hào)】C12P21/02GK104119448SQ201310151609
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月26日
【發(fā)明者】李華順 申請人:李華順