修復(fù)酮古龍酸菌輔因子代謝缺陷提高2-酮基-l-古龍酸生產(chǎn)能力的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種在維生素C二步混菌發(fā)酵過程中，通過添加輔因子—泛醌（CoQ10）、甲基萘醌（VK2）（氧化型及還原型）及它們前體，包括對(duì)羥基苯甲酸、分支酸、異分支酸，從而改善小菌呼吸鏈電子傳遞水平，增加菌體代謝效率的方法。通過對(duì)小菌呼吸功能的增強(qiáng)，一方面可以提高小菌的基礎(chǔ)代謝率，顯著增加菌體數(shù)量；另一方面由于小菌產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸（2-KGA）過程與呼吸鏈電子傳遞過程相偶聯(lián)，故可提高小菌產(chǎn)2-KGA速率，在5L發(fā)酵罐中最高可降低發(fā)酵周期15.38%。該發(fā)明生產(chǎn)工藝先進(jìn)，原料成本低，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，是對(duì)我國將近四十年生物發(fā)酵法制備維生素C工藝的改造和提升。而且生產(chǎn)過程中無有害物質(zhì)的排放，對(duì)周圍環(huán)境無污染、無公害、符合環(huán)保要求。
【專利說明】修復(fù)酮古龍酸菌輔因子代謝缺陷提高2-酮基-L-古龍酸生 產(chǎn)能力的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，涉及一種通過對(duì)微生物生長因子的選擇與優(yōu)化，使 酮古龍酸菌產(chǎn)2-KGA(2-酮基-L-古龍酸）能力提高的方法，以及改造維生素C發(fā)酵工藝。

【背景技術(shù)】：
[0002] 維生素C(VC)是人體必需的一種維生素，在抗氧化和維持新陳代謝平衡等方面具 有廣泛的生理作用，在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、飼料行業(yè)以及化妝品行業(yè)上均有重要用途。其 應(yīng)用范圍廣闊，市場(chǎng)規(guī)模巨大。
[0003] 目前，全球90%以上的VC生產(chǎn)，均利用我國發(fā)明的"二步發(fā)酵法"。其第一步發(fā)酵 是在氧化葡萄糖酸桿菌作用下將D-山梨醇氧化為L-山梨糖。第二步是在一種混合菌系的 作用下將L-山梨糖進(jìn)一步氧化成VC的重要中間體2-酮基-L-古龍酸（2-KGA)。最后經(jīng)過 化學(xué)轉(zhuǎn)化使2-KGA生成VC。
[0004] "二步發(fā)酵法"的主要特點(diǎn)是在第二步發(fā)酵過程中，由于芽孢桿菌Bacillus sp.(俗稱大菌）的伴生作用，酮古龍酸菌Ketogulonigeniumsp.(俗稱小菌）的生長和 2-KGA的產(chǎn)率得到很大提高，但大菌沒有任何產(chǎn)生2-KGA的能力，其主要作用是輔助小菌生 長。故小菌作為2-KGA產(chǎn)生菌，對(duì)其代謝能力的增強(qiáng)一直是學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明前期分別完成了維生素C二步發(fā)酵工業(yè)菌株大菌與小菌的基因組測(cè)序及 其代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建工作，進(jìn)一步通過對(duì)大小菌代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行交互分析發(fā)現(xiàn)，小菌的泛醌 (CoQltl)及甲基萘醌（VK2)合成途徑存在代謝缺陷，而大菌體內(nèi)存在小菌缺陷的功能基因， 故認(rèn)為大菌在形成芽孢釋放胞內(nèi)內(nèi)容物的過程中，可以通過為小菌提供CoQltl前體對(duì)羥基 苯甲酸、VK2及VK2前體分支酸和異分支酸等物質(zhì)促進(jìn)小菌生長代謝。
[0006] 雖然大部分革蘭氏陰性菌中泛醌（CoQ)存在形式為CoQ8，但是亦有部分以輔酶吡 咯喹啉醌（PQQ)存在為代表的革蘭氏陰性菌，如副球菌屬（Paracoccussp.)、葡糖桿菌屬 (Gluconobactersp.)及紅桿菌屬（Rhodobactersp.)等，其泛醌形式以CoQltl的形式存 在，并且該泛醌的結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)存在的CoQltl相同。由于小菌體內(nèi)存在PQQ，亦屬于紅桿菌 科（Rhodobacteraceae)，并且泛醌代謝途徑相關(guān)酶基因均與紅桿菌對(duì)應(yīng)酶基因具有較高的 同源性，故認(rèn)為小菌體內(nèi)泛醌形式亦為CoQ1(l。
[0007] 基于小菌代謝網(wǎng)絡(luò)分析及大小菌代謝交互分析發(fā)現(xiàn)，小菌CoQltl的前體來源于對(duì) 氨基苯甲酸與聚丙烯二磷酸（Polyprenyldiphosphate),但是由于小菌不能獨(dú)立合成對(duì)氨 基苯甲酸，故認(rèn)為大菌可通過為小菌提供對(duì)氨基苯甲酸，滿足小菌自身CoQltl的合成。
[0008] 另一方面，小菌體內(nèi)缺乏VK2合成的部分酶系統(tǒng)，但大菌可以將分支酸轉(zhuǎn)化為異分 支酸進(jìn)而完整的合成VK2，故認(rèn)為在混菌發(fā)酵體系中，通過補(bǔ)充分支酸（異分支酸）可以提 高大菌VK2的積累，進(jìn)一步滿足小菌的代謝需求。
[0009] 由于CoQltl在小菌體內(nèi)作為呼吸鏈中NADH氧化酶與琥珀酸脫氫酶的電子受體參與 電子傳遞；VK2亦作為小菌細(xì)胞膜中的重要組成成份，參與多種電子傳遞過程，例如作為琥 珀酸脫氫酶的電子傳遞體，故通過對(duì)上述物質(zhì)的補(bǔ)充，將對(duì)提高小菌的基礎(chǔ)代謝水平，提高 菌體數(shù)量起到關(guān)鍵的作用。同時(shí)，小菌在利用以PQQ為輔酶的山梨糖脫氫酶（SDH)將底物 L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-KGA的過程中，L-山梨糖脫氫釋放的電子亦經(jīng)過呼吸鏈與氧氣結(jié)合，故 上述物質(zhì)的補(bǔ)充，在增強(qiáng)小菌呼吸鏈呼吸功能的同時(shí)，亦可促進(jìn)其產(chǎn)2-KGA的速率。
[0010] 本發(fā)明基于大、小菌的生理代謝基礎(chǔ)研究，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了上述物質(zhì)在產(chǎn)2-KGA發(fā) 酵過程中，可以增強(qiáng)小菌菌體數(shù)量并明顯降低發(fā)酵周期。同時(shí)本發(fā)明公開前，未見有將上述 物質(zhì)應(yīng)用于維生素C二步發(fā)酵產(chǎn)2-KGA過程中的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0011]本發(fā)明的目的在于利用微量的小菌代謝缺陷物，添加到常規(guī)的產(chǎn)2-KGA種液及發(fā) 酵培養(yǎng)基中，用以增強(qiáng)小菌代謝能力，降低發(fā)酵周期，從而提高酮古龍酸菌產(chǎn)2-KGA能力。
[0012] 實(shí)際上，本發(fā)明涉及一種通過對(duì)小菌代謝缺陷途徑的修復(fù)，使酮古龍酸菌產(chǎn)2-KGA 能力提高的方法。
[0013] 進(jìn)一步說，對(duì)小菌代謝缺陷途徑的修復(fù)，既為在產(chǎn)2-KGA種液及發(fā)酵培養(yǎng)基中添 加小菌不能直接合成的物質(zhì)，包括：C〇Q1(l、VK2 (包括氧化型及還原型）、對(duì)羥基苯甲酸及分 支酸、異分支酸中的一種或幾種。
[0014] 本發(fā)明還提供了用于制備種液的培養(yǎng)基及用于發(fā)酵的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括制備 種液及發(fā)酵液的常規(guī)培養(yǎng)基，其特征在于：培養(yǎng)基中包括所述小菌代謝缺陷物質(zhì)的至少一 種物質(zhì)，所述的小菌代謝缺陷物質(zhì)在培養(yǎng)基中出現(xiàn)的方式包括直接加入也包括以其它混合 物形式間接加入。
[0015] 上述培養(yǎng)基中，所述小菌代謝缺陷物質(zhì)加入量分別為：20 μ g/L-500 μ g/L CoQltl, 10μg/L-35μg/L VK2, 5μg/L-30μg/L 對(duì)輕基苯甲酸，5μg/L-50μg/L 分支酸及異分支 酸。當(dāng)添加量低于下限對(duì)代謝促進(jìn)作用不明顯，當(dāng)添加量高于上限時(shí)，對(duì)產(chǎn)2-KGA出現(xiàn)抑 制，亦造成原料的浪費(fèi)。確定的加入常規(guī)種液培養(yǎng)基中的最佳缺陷代謝物組合為：50yg/L CoQ ltl, 10μg/L VK2, 5μg/L對(duì)輕基苯甲酸及10μg/L分支酸；確定的加入常規(guī)發(fā)酵液中的 最佳缺陷代謝物組合為：10 μ g/L VK2, 25 μ g/L對(duì)羥基苯甲酸及10 μ g/L分支酸。
[0016] 上述常規(guī)種液及發(fā)酵培養(yǎng)基一般來講，既為目前VC二步發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中使用的 培養(yǎng)基，具體由下列成份組成：
[0017] 1.常規(guī)種液培養(yǎng)基：1-3%L-山梨糖，0.3-1 %玉米漿，0.1-0. 5 %葡萄糖， 0· 05-0. 3%尿素，0· 1-0. 3%碳酸鈣，pH6. 7-7. 0,121°C滅菌 20min。
[0018] 2.常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基：8-12%L-山梨糖、0.3-3 %玉米漿、0.05-0. 2 %磷酸二氫 鉀，0· 05-0. 5%尿素，0· 005-0. 02%硫酸鎂，0· 1-0. 5%碳酸鈣，ρΗ6· 7-7. 0,其中碳源（L-山 梨糖）和氮源分開滅菌，滅菌條件為12rC，20min。
[0019] 在常規(guī)種液培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基中加入上述至少一種小菌代謝缺陷物質(zhì)是本發(fā) 明的重點(diǎn)。這些物質(zhì)既可以在培養(yǎng)基配制的時(shí)候添加，也可以在發(fā)酵開始后以補(bǔ)料方式加 入。
[0020] 小菌代謝缺陷物質(zhì)的加入方法如下：
[0021]I.CoQltl :以丙酮為溶劑，制成5%溶液，過濾除菌后加入滅菌后的培養(yǎng)基；
[0022] 2.VK2 :以無水乙醇為溶劑，制成1 %溶液，直接加入滅菌后的培養(yǎng)基；
[0023] 3.對(duì)羥基苯甲酸：方法同VK2;
[0024] 4.分支酸：與培養(yǎng)基中其它組分同時(shí)加入，滅菌備用。
[0025] 5.異分支酸：與培養(yǎng)基中其它組分同時(shí)加入，滅菌備用。
[0026] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0027] 方案1.常規(guī)種液培養(yǎng)基中添加小菌代謝缺陷物質(zhì)，提高發(fā)酵過程中2-KGA產(chǎn)率
[0028] 將常規(guī)方法制備的大小菌混合培養(yǎng)的斜面（混菌斜面），接種于添加了不同小菌 代謝缺陷物質(zhì)的常規(guī)種液培養(yǎng)基中，28-341：培養(yǎng)16-2811制成種液，5-15%接種于常規(guī)發(fā) 酵培養(yǎng)基中，28-34 °C培養(yǎng)至底物L(fēng)-山梨糖小于lmg/L。
[0029] 方案2.發(fā)酵液中添加小菌代謝缺陷物質(zhì)，提高發(fā)酵過程中2-KGA產(chǎn)率
[0030] 混菌斜面接種于常規(guī)種液培養(yǎng)基中，28-34°C培養(yǎng)16-28h制成種液，5-15%接種 于添加了不同小菌代謝缺陷物質(zhì)的基礎(chǔ)常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28-34°C培養(yǎng)至底物L(fēng)-山梨糖 小于lmg/L。
[0031] 方案3.在種液及發(fā)酵液中均添加小菌代謝缺陷物質(zhì)提高發(fā)酵過程中2-KGA產(chǎn)率
[0032] 參見方案1與方案2。
[0033] 在種液中添加小菌代謝缺陷物質(zhì)能明顯提高種液中小菌的數(shù)量，并在進(jìn)一步的發(fā) 酵過程中降低發(fā)酵周期，但轉(zhuǎn)化率較對(duì)照組相比提升不大。
[0034] 在發(fā)酵液中添加小菌代謝缺陷物質(zhì)亦可提高小菌數(shù)量，且發(fā)酵周期與方案1相比 進(jìn)一步降低，但轉(zhuǎn)化率相較對(duì)照組提升不大。
[0035] 在種液及發(fā)酵液中均添加小菌代謝缺陷物質(zhì)，與方案2相比周期進(jìn)一步縮短，且 轉(zhuǎn)化率與對(duì)照組持平。
[0036] 本發(fā)明揭示了在添加小菌代謝缺陷物質(zhì)后，可以增強(qiáng)菌體的代謝效率，明顯提高 菌體生長及產(chǎn)2-KGA速率，該發(fā)明將對(duì)工業(yè)水平上進(jìn)一步提高產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本起到積 極的作用。通過修復(fù)酮古龍酸菌（小菌）輔因子代謝缺陷，改善呼吸鏈電子傳遞效率，提高 菌體代謝水平，增加維生素C二步發(fā)酵中2-KGA產(chǎn)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 下面結(jié)合圖1及【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明：
[0038] 圖1是基于大小菌代謝交互分析構(gòu)建的大小菌泛醌及萜類醌生合成代謝網(wǎng)絡(luò)交 互圖。其中實(shí)線框里的物質(zhì)代表本發(fā)明涉及到的小菌缺陷代謝物，虛線框里的物質(zhì)代表小 菌上游存在的代謝途徑，實(shí)線細(xì)箭頭代表小菌存在的代謝反應(yīng)，實(shí)線粗箭頭代表小菌缺陷 而大菌存在的代謝反應(yīng)，虛線細(xì)箭頭代表省略的小菌體內(nèi)存在的代謝步驟，虛線粗箭頭代 表省略的大菌存在而小菌缺陷的代謝步驟，箭頭上的數(shù)字代表該反應(yīng)酶的EC編號(hào)。

【具體實(shí)施方式】：
[0039] 為了更好的闡明通過對(duì)小菌代謝缺陷功能的修復(fù)提高產(chǎn)2-KGA效率的應(yīng)用，下面 將描述本發(fā)明的四個(gè)實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容包括但不局限于此。
[0040] 實(shí)施實(shí)例1 :單因素條件下考察種液中添加小菌代謝缺陷物質(zhì)對(duì)產(chǎn)2-KGA能力的 影響
[0041] 常規(guī)種子培養(yǎng)基為：2% L-山梨糖，0.5%玉米漿，0.2%葡萄糖，0. 1%尿素0.2% 碳酸鈣，PH6.7-7.0。
[0042] 常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基為：8% L-山梨糖，I. 5 %玉米漿，0. I %磷酸二氫鉀，0. I %尿素， 0.01%硫酸鎂，0.5%碳酸鈣，？冊(cè).7-7.0。
[0043] 培養(yǎng)條件：混菌培養(yǎng)的斜面接種于常規(guī)種液培養(yǎng)基中，30°C220轉(zhuǎn)/分，搖瓶培 養(yǎng)20h制成種液，10%接種于分別添加了不同小菌代謝缺陷物質(zhì)的常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基中， 30°C220轉(zhuǎn)/分，搖瓶培養(yǎng)至底物L(fēng)-山梨糖小于lmg/L發(fā)酵結(jié)束。
[0044] 在常規(guī)種液培養(yǎng)基中分別添加的小菌代謝缺陷物質(zhì)的濃度及發(fā)酵結(jié)果見表1.
[0045]表1.單因素條件下種液中添加小菌代謝缺陷物質(zhì)對(duì)發(fā)酵的影響.
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 修復(fù)酮古龍酸菌輔因子代謝缺陷提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)能力的方法，其特征 在于，在產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸種液培養(yǎng)基和/或發(fā)酵培養(yǎng)基中添加小菌不能直接合成的物 質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的小菌不能直接合成的物質(zhì)為C〇Q1(l、 VK2、對(duì)輕基苯甲酸、分支酸、異分支酸中的一種或幾種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的種液培養(yǎng)基為：1-3% L-山 梨糖，0? 3-1% 玉米漿，0? 1-0. 5% 葡萄糖，0? 05-0. 3% 尿素，0? 1-0. 3% 碳酸鈣，pH 6. 7-7. 0， 121°C滅菌 20 min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為：8-12% L-山 梨糖、0.3-3%玉米漿、0.05-0. 2%磷酸二氫鉀，0.05-0. 5%尿素，0.005-0. 02%硫酸鎂， 0. 1-0. 5%碳酸鈣，pH6. 7-7. 0,其中碳源（L-山梨糖）和氮源分開滅菌，滅菌條件為121°C， 20min〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的小菌不能直接合成的 物質(zhì)的加入量為〇? 5 y g/L-5mg/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的小菌不能直接合成的物質(zhì)為C〇Q1(l時(shí)，其加入量為：20 y g/L -500 y g/L，為VK2時(shí)，加入量為10 y g/L -35 y g/L，為對(duì)羥基苯 甲酸時(shí)，加入量為5 ii g/L -30 ii g/L,為分支酸或異分支酸時(shí)，加入量為5 ii g/L -50 ii g/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的小菌不能直接合成的 物質(zhì)在培養(yǎng)基配制的時(shí)候添加，或在發(fā)酵開始后以補(bǔ)料方式加入。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的小菌不能直接合成的 物質(zhì)為C〇Q1(l或VK2。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，種液培養(yǎng)基中的小菌不能合 成的 物質(zhì)組合物為：50y g/L C〇Q1Q，10ii g/L VK2,5 y g/L對(duì)羥基苯甲酸及10 y g/L分支 酸。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，發(fā)酵液中的小菌不能合成的 組合物為：l〇U g/L VK2,25 y g/L對(duì)羥基苯甲酸及10 y g/L分支酸。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104357530SQ201410546538
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】張怡軒, 付陽, 于哲, 張盛, 李野, 韓立濤, 張海宏 申請(qǐng)人:沈陽藥科大學(xué)