專利名稱：分枝桿菌烯酰輔酶a水合酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥和工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶的重組酶、工程菌及其用途。
背景技術(shù)：
烯酰輔酶A水合酶不但參與脂肪酸代謝途徑，還參與很多氨基酸代謝途徑，如賴氨酸降解、異亮氨酸降解，色氨酸、β-丙氨酸代謝等，同時(shí)它還是細(xì)菌受到脅迫時(shí)的能源，在生物塑料降解中作用也很大。很多國(guó)家都在研究烯酰輔酶A水合酶在生物塑料降解中的作用，從而開發(fā)環(huán)境能源。
脂肪酸代謝酶也是醫(yī)藥界的研究熱點(diǎn)。美國(guó)Merck公司打破傳統(tǒng)的抗生素設(shè)計(jì)模式，以靶向細(xì)菌脂肪酸合成過程中起關(guān)鍵作用的酶進(jìn)去篩選抗生素，進(jìn)而遏制細(xì)菌的抗藥性，而且還可有效地殺死革蘭氏陽性細(xì)菌中葡萄球菌和腸球菌等具有廣泛抗藥性的致病菌。利用這種阻斷“乒乓”反應(yīng)的模式發(fā)現(xiàn)了一種致病菌將不會(huì)產(chǎn)生耐藥型的抗生素-平板霉素。
烯酰輔酶A水合酶(enoyl-coA hydratase，EchA)也是枝菌酸代謝的一個(gè)酶。目前該酶的序列已經(jīng)測(cè)定，共含有213個(gè)氨基酸殘基。使用NCBI BLAST程序分析顯示在HRv37的全基因組中，烯酰輔酶A水合酶/異構(gòu)酶超家族有21個(gè)同源分子，經(jīng)預(yù)測(cè)分析這些酶在細(xì)胞質(zhì)中合成(Pfam000378；http://Pfam.wustl.edu/)。目前，對(duì)分枝桿菌，尤其是結(jié)核菌烯酰輔酶A水合酶的研究甚少。
固定化細(xì)胞技術(shù)是比較成熟的一種生物技術(shù)。其應(yīng)用已涉及到食品、化學(xué)、醫(yī)藥、化學(xué)分析、環(huán)境保護(hù)和能源開發(fā)等領(lǐng)域，顯示出廣闊的發(fā)展前景用于生產(chǎn)各種胞外產(chǎn)物，包括酒精酒類、氨基酸、有機(jī)酸、酶和輔酶，抗生素，還可以用于甾體轉(zhuǎn)化、廢水處理，以及用于制造微生物傳感器。該技術(shù)將用物理或化學(xué)的手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持催化活性、反復(fù)使用。該技術(shù)不需要把酶從細(xì)胞中提取出來，酶活力損失少，酶活回收率較高，因此該技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)超過固定化酶的應(yīng)用。細(xì)胞被固定化后細(xì)胞密度高、反應(yīng)速度快、耐毒害能力強(qiáng)、產(chǎn)物分離容易、能實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，可以大大提高生產(chǎn)能力等優(yōu)勢(shì)，因此在近幾十年來固定化細(xì)胞技術(shù)得到了迅速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。固定化細(xì)胞方法按照固定化載體與作用方式的不同，可分為吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法。吸附法吸附法又叫載體結(jié)合法，是依據(jù)帶電的微生物細(xì)胞和載體之間的靜電、表面張力和粘附力的作用，而使微生物細(xì)胞固定在載體表面和內(nèi)部形成生物膜的方法，可分為物理吸附法和離子吸附法兩種。此法交為簡(jiǎn)便，活力損失較小，但細(xì)胞與載體作用力小，易脫落。包埋法是將微生物細(xì)胞包埋在凝膠的微小空格內(nèi)或埋于半透膜聚合物的超濾膜內(nèi)。根據(jù)載體材料和方法的不同，包埋法可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法兩種。凝膠包埋法是將細(xì)胞包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中而使細(xì)胞固定的方法；半透膜包埋法是將細(xì)胞包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)而使細(xì)胞固定的方法。此法簡(jiǎn)單，條件溫和，穩(wěn)定性好，包埋細(xì)胞容量高。共價(jià)結(jié)合法是細(xì)胞表面上功能團(tuán)和固相支持物表面的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價(jià)鍵連接，從而成為固定化細(xì)胞。此法的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞與載體結(jié)合緊密，不易脫落，但制備較難，且活力損失較大。交聯(lián)法是利用雙功能或多功能試劑，直接與細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)如氨基酸、羥基、硫基、咪唑基發(fā)生反應(yīng)，使其彼此交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化細(xì)胞，其結(jié)合力是共價(jià)鍵。此法制備麻煩，活力損失較大，但細(xì)胞與載體結(jié)合較緊。天然高分子載體包括海藻酸鹽、明膠、卡拉膠、海綿等。海藻酸鹽載體海藻酸鹽如海藻酸鈉、海藻酸鈣、海藻酸錳是一種廣泛應(yīng)用的固定化介質(zhì)，具有化學(xué)穩(wěn)定性好、無毒、包埋效率高且價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。天然高分子載體，雖然無毒性，傳質(zhì)性能好，但機(jī)械強(qiáng)度低，在厭氧條件下易被微生物分解，壽命短。因此可以利用合成高分子載體，常見的載體有聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等。聚乙烯醇凝膠是目前國(guó)內(nèi)外研究最為廣泛的一種包埋固定化載體，它具有強(qiáng)度高、化學(xué)穩(wěn)定性好、抗微生物分解性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞無毒且價(jià)格低廉等一系列優(yōu)點(diǎn)，因而具有很大的利用價(jià)值。以聚乙烯醇為載體主要成分，適量添加少量海藻酸鈉和活性炭等物質(zhì)。其優(yōu)點(diǎn)是可克服兩顆粒之間的粘連現(xiàn)象，有助于顆粒成型，改善通透性、增加固定化顆粒的孔隙，達(dá)到吸附和包埋的雙重效果。無機(jī)載體如多孔陶珠、氧化鋁、活性炭等，具有機(jī)械強(qiáng)度大、對(duì)微生物無毒性、不易被微生物分解、耐酸堿、成本低、壽命長(zhǎng)等特性，因而也是一類重要的載體材料。
固定化細(xì)胞用于手性分子的致病。對(duì)映體在合成手性藥物中非常重要，其方法包括了化學(xué)不對(duì)稱合成、外消旋體的生物拆分和生物催化不對(duì)稱還原。化學(xué)不對(duì)稱合成所需的化學(xué)催化劑價(jià)格昂貴，設(shè)備要求苛刻；生物拆分的缺點(diǎn)是對(duì)映體選擇性不夠理想，理論收率不高于50％。而生物催化不對(duì)稱還原具有高效率、高立體選擇性、反應(yīng)條件溫和以及經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益好等優(yōu)點(diǎn)，因此，利用微生物細(xì)胞或酶作為催化劑來催化不對(duì)稱還原制備具有光學(xué)活性的對(duì)映體的方法最具吸引力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供，1.一種基于分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶的藥物篩選細(xì)胞模型；2.一種利用分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶的藥物篩選細(xì)胞模型進(jìn)行藥物篩選的方法；3.利用分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶或者含有該酶的工程菌的固定化產(chǎn)物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
實(shí)現(xiàn)上述目的的基本技術(shù)路線為總體技術(shù)方案是克隆包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、恥垢分枝桿菌等分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶的編碼基因，利用合適的載體和限制性內(nèi)切酶片段，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，將烯酰輔酶A水合酶基因克隆到合適的宿主細(xì)胞，包括但不限于大腸桿菌、酵母、CHO細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等。
1.基因模板提取將待克隆烯酰輔酶A水合酶基因的菌株在LB培養(yǎng)基或YE培養(yǎng)基或者M(jìn)iddlebrook 7H9、sauton等分枝桿菌能夠生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到合適的菌體濃度，按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法提取菌體DNA，作為基因擴(kuò)增的模板。
2.烯酰輔酶A水合酶基因的克隆根據(jù)出發(fā)菌株的堿基特征和烯酰輔酶A水合酶基因的保守序列，設(shè)計(jì)引物，按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法，通過PCR擴(kuò)增烯酰輔酶A水合酶基因。
3.轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑、完全可以從商業(yè)途徑獲得的載體、限制性內(nèi)切酶和方法，將目標(biāo)基因克隆到載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子。
4.固定化細(xì)胞的制備包埋法固定化細(xì)胞卡拉膠包埋、海藻酸鈣(CA)包埋、聚乙烯醇(PVA)-海藻酸鈉(CA)包埋、聚乙烯醇(PVA)凍結(jié)包埋。
吸附法固定化細(xì)胞將陶粒、磁粒、活性氧化鋁、硅膠、甲殼素、多孔玻璃、大孔吸附樹脂、大孔陰離子交換樹脂等吸附載體加入培養(yǎng)基中，接種后搖瓶培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，過濾出固定化細(xì)胞，用無菌水沖洗數(shù)次。
固定化條件的選擇在制備固定化細(xì)胞的過程中，包埋菌體量、海藻酸鹽的濃度、CaCl2的濃度以及鈣化時(shí)間是制備固定化細(xì)胞的主要影響因素。為了確定上述4種因素對(duì)固定化過程所產(chǎn)生的綜合影響，確定重組菌固定化的條件，采用正交實(shí)驗(yàn)法，以長(zhǎng)鏈枝菌酸合成為指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
發(fā)明效果利用本技術(shù)方案涉及的方法，構(gòu)建了基于烯酰輔酶A水合酶的藥物篩選細(xì)胞模型并篩選到了陽性分子，純化了重組酶，固定化了重組酶和工程菌，進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化。


圖1.PCR產(chǎn)物的1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析。1，2EchA18 PCR產(chǎn)物，3對(duì)照4DNA分子量標(biāo)記(DL2000)圖2.SDS-PAGE分析。1，2純化的重組EchA18，3pET32a(+)，4分子量標(biāo)記圖3.烯酰輔酶A水合酶的系統(tǒng)進(jìn)化。利用已有的烯酰輔酶A水合酶序列和軟件clustalx1.83的TreeTop程序(www.genebee.msu.su/genebee.html)進(jìn)行比對(duì)。分支距離(X軸)代表利用BLOSUM62取代矩陣獲得的親緣關(guān)系。
具體實(shí)施例方式
1.1試劑和材料試驗(yàn)菌株和載體結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv(重慶市肺科醫(yī)院提供)、或者牛分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌；大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH-5α、BL21，pET32a(+)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存(均可以通過商業(yè)途徑購(gòu)得)。
試驗(yàn)試劑Taq DNAPolymerase，DNA marker IV和marker DL2000購(gòu)自北京天為時(shí)代科技有限公司；DNA純化試劑盒購(gòu)自北京賽百勝基因技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶(EcoRI和HindIII)，T4DNA連接酶和dNTP購(gòu)自TaKaRa公司；IPTG購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；氨芐西林購(gòu)自BBI公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。Buffer A50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM mmol/l imidazole PH7.4.
1.2方法質(zhì)粒提取，感受態(tài)細(xì)胞的制備，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，酶切反應(yīng)，連接反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳SDS-PAGE等常規(guī)分子生物學(xué)操作參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(科學(xué)出版社，2002)1.2.1 MTB H37Rv或者其他分枝桿菌基因組抽提通過堿法或者酶法裂解細(xì)菌之后，可以將胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)全釋放出來。DNA溶于1mol/L的NaCl中，不溶于0.14mol/L的NaCl，而RNA溶于0.14mol/L的NaCl不溶于1mol/L的NaCl中，通過溶液中鹽濃度的變化可以將DNA和RNA分開。氯仿-異戊醇法除去蛋白，2倍體積乙醇將DNA沉淀出來。
1.2.2目的基因ECH編碼序列的擴(kuò)增根據(jù)GenBank登錄的MTB H37RvECH18編碼序列(GeneID888123)設(shè)計(jì)一對(duì)引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)-----P1、P2，序列以及酶切位點(diǎn)如下P15’-ATAGAATTCATGAGGCGGCGTGCA-3’(下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn))P25’-CCCAAGCTTTGCACCAATCACCAG-3’(下劃線為HindIII酶切位點(diǎn))PCR反應(yīng)體系及條件PCR反應(yīng)體系(25μl)10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μl，dNTP 2μl，引物P1(10μM)、P2各2μl，模板2μl，Taq 0.5μl。
PCR反應(yīng)條件95℃ 5min；95℃ 1min，57.5℃ 45s，72℃ 2min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。1.5％瓊脂糖電泳檢測(cè)及純化PCR產(chǎn)物。
1.2.3目的基因的克隆與鑒定用EcoI和HindIII雙酶切PCR產(chǎn)物和pET32a(+)載體，瓊脂糖電泳純化，回收酶切的基因片段和載體，然后用T4DNA連接酶16℃連接過夜，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(CaCl2法)，涂布于LB平板(含100μg/ml氨芐青霉素)上，37℃培養(yǎng)。挑取陽性克隆培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定重組質(zhì)粒。將獲得的重組質(zhì)粒pECH-pET32a(+)送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
1.2.4重組ECH的表達(dá)挑取重組菌BL21(pECH-pET32a(+))接種于含有氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物接種于新鮮的含有氨芐西林的LB中，接種量4％，振蕩培養(yǎng)OD600＝0.6。30℃下IPTG誘導(dǎo)(終濃度為0.4mM)，2h后離心收集細(xì)胞；Buffer A重懸細(xì)胞，超聲破菌，離心分別收集上清和沉淀。SDS-PAGE分析菌體，上清和沉淀。帶有pET32a(+)空載體的BL21作為陰性對(duì)照。
1.2.5重組蛋白的純化按照優(yōu)化的表達(dá)條件，培養(yǎng)600ml的ECH表達(dá)菌液；離心(10000rpm，5分鐘)收集菌體；Buffer A重懸細(xì)胞沉淀，冰浴中超聲波破碎菌體，4℃離心(10000rpm，10min)，收集上清。上清液上樣于預(yù)先Buffer A平用衡的Ni sepherose上，流速0.5ml/min；BufferA沖洗柱子，收集雜蛋白；Buffer B和Buffer C梯度洗脫并收集目的蛋白，4℃保存；取經(jīng)SDS-PAGE分離得到的重組ECH條帶，-20℃保存。
2.結(jié)果2.1用熱啟動(dòng)PCR方法獲得ECH編碼序列根據(jù)結(jié)核分枝桿菌ECH的編碼序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，以MTB的基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到約650bp大小的DNA片段(Fig.1)，結(jié)果與理論(642bp)相符。
2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定pET32a(+)是一個(gè)T7表達(dá)載體，大小為5.9kb，含有抗氨芐基因Ampr。pET32a(+)經(jīng)EcoRI/HindIII雙酶切后，取大片段與EcoRI/HindIII雙酶切的PCR產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，37℃培養(yǎng)過夜。挑選能在含有氨芐青霉素的LB平板上生長(zhǎng)的菌株，抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和PCR檢測(cè)，均得到一個(gè)650bp左右的片段。由于構(gòu)建重組質(zhì)粒采用的是兩個(gè)不同的酶切位點(diǎn)，所以不需要進(jìn)行克隆插入方向的驗(yàn)證。由此得到了插入片段大小和方向均正確的重組克隆。以pET32a(+)載體的測(cè)序通用引物對(duì)pECH-pET32a(+)的插入片段進(jìn)行測(cè)序(由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成)。經(jīng)分析軟件Vector NTI 9.0比較，重組質(zhì)粒pECH-pET32a(+)的測(cè)序結(jié)果與GenBank中的結(jié)核分枝桿菌ECH編碼序列完全一致，未發(fā)生堿基突變，說明重組質(zhì)粒pECH-pET32a(+)構(gòu)建成功。
2.3重組蛋白的表達(dá)及其純化重組質(zhì)粒pECH-pET32a(+)在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳，在大約43kDa處出現(xiàn)清晰的蛋白條帶(Fig.2)，即為重組ECH；誘導(dǎo)后的菌體經(jīng)超聲波破碎后取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，可見該重組蛋白在上清存在。用Buffer A重懸收集的適當(dāng)培養(yǎng)的重組菌，經(jīng)超聲波破碎后，離心收集上清液，用Ni sepharose對(duì)上清中的重組蛋白進(jìn)行純化，收集到與Ni sepharose特異結(jié)合的蛋白。對(duì)純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，單一的43kDa重組蛋白條帶(Fig.2)。
細(xì)胞固定化將重組菌接入液體培養(yǎng)基，在30℃或者37℃和適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)到適當(dāng)?shù)木鷿舛?，離心，取一定量的濕菌體，無菌水洗滌后，與20ml一定濃度的海藻酸鹽溶液于常溫下混合，充分?jǐn)嚢璩删鶆蚓鷳乙汉螅玫喂芑蛘咦⑸淦鞯稳?00ml一定濃度的CaCl2水溶液中，于4℃硬化交聯(lián)，得到直徑3～4mm的海藻酸鈣凝膠小球，用無菌水充分洗滌后，用定性濾紙吸干表面水分，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1.基于分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶及含有分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶的工程菌及其用途，其特征是將分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶基因的克隆到合適的宿主細(xì)胞，構(gòu)建含有分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶的基因工程細(xì)胞模型或純化的重組分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶篩選烯酰輔酶A水合酶的抑制劑或者激活劑，或者用固定化的重組酶或工程菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
2.權(quán)利要求1所述的烯酰輔酶A水合酶，其特征是包括來自分枝桿菌屬的菌烯酰輔酶A水合酶，尤其是來自結(jié)核分枝桿菌的菌烯酰輔酶A水合酶。
3.權(quán)利要求1所述的宿主細(xì)胞包括但不限于細(xì)菌、真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3所述的細(xì)菌包括大腸桿菌。
5.固定化分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶及含有分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶的工程菌及其用途，其特征是用可以固定化的介質(zhì)包埋分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶及含有分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶的工程菌。
6.權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化，其特征是利用重組的分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶及含有分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶的工程菌轉(zhuǎn)化相關(guān)物質(zhì)。
7.權(quán)利要求6所述的生物轉(zhuǎn)化，其特征是將短鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)鏈脂肪酸。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥和工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶的重組酶、工程菌及其用途，特別是分枝桿菌烯酰輔酶A水合酶的重組酶、工程菌在酶抑制劑、激活劑和生物轉(zhuǎn)化長(zhǎng)鏈脂肪酸，獲得特定生物活性的對(duì)映體。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1995341SQ200610095338
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月25日
發(fā)明者謝建平, 王翠平, 陳宏玲, 王洪海 申請(qǐng)人:西南大學(xué)