專利名稱：由血漿生產(chǎn)間-α-抑制蛋白(IAIP)的制作方法
由血漿生產(chǎn)間-Ct-抑制蛋白(IAIP)申請案的交叉引用本申請要求2010年7月23日提交的美國臨時專利申請序列號61/367，331的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容據(jù)此通過弓I用整體并入本文用于所有目的。
背景技術(shù)：
與通過在宿主細(xì)胞系中重組表達DNA載體生成的其它生物制品不同，從人血和血漿捐贈品中分離血漿源性蛋白質(zhì)。因此，僅僅増加生產(chǎn)體積不能增加對這些產(chǎn)品的供給量。更確切地說，市場上可買到的血液制品的水平受血液和血漿捐贈品的可用供給量限制。這動態(tài)導(dǎo)致用于生產(chǎn)血漿源性新血液因子的原料人血漿的可用性存在建立的商業(yè)市場較少的缺點，包括間-a -抑制蛋白(Ialp, Inter-alpha-1nhibitor)，例如間-a -抑制劑(IaI)和前-a -抑制劑(Pal, Pre-alpha-1nhibitor)，和因子 H。間-a胰蛋白酶抑制劑(IaI)是ー種屬于對敗血癥、癌癥轉(zhuǎn)移和炎癥有作用的蛋白酶抑制劑家族的血衆(zhòng)蛋白(間-Ct-抑制蛋白；lalp)(參考,見，Salier, J等，BiochemJ315:1-9 (1996))。IaI的近似分子量為225kDa并且由兩條重鏈(Hl和H2)和一條輕鏈(bikunin)多肽通過硫酸軟骨素共價連接組成(

圖1)。前-a -抑制劑(PaI)是由一條重鏈(H3)和一條小鏈(bikunin)多肽再次通過硫酸軟骨素共價連接組成的有關(guān)間_ a _抑制劑(圖1)。間- a -抑制蛋白(IaIp)以約600-1200mg/L的水平存在于成人血漿中(Lim等，J Chromatogr A.(2005 年)2 月 11 日；1065 (I): 39-43)。敗血癥是特征為全身炎癥，稱為全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)并存在已知或懷疑感染的身體狀況。敗血癥中出 現(xiàn)的全身炎癥一般由免疫系統(tǒng)對經(jīng)血流遍布生物體的細(xì)菌、病毒或真菌感染的反應(yīng)引起。這些感染一般在肺部(肺炎)、膀胱和腎臟(尿路感染)、皮膚(蜂窩織炎)、腹部(例如闌尾炎)和其它區(qū)域(例如腦膜炎)開始。在過去20年，敗血癥病例的數(shù)量顯著增加。這種增加部分由于對用削弱免疫系統(tǒng)的藥物治療癌癥和器官移植患者的依賴性增加。平均壽命増加和世界人ロ老齡化也促成了敗血癥發(fā)病率增加。此外,抗抗生素細(xì)菌的發(fā)展促成敗血癥病例的數(shù)量。研究已經(jīng)證實了 IaIp血漿水平下降與嚴(yán)重敗血癥患者的死亡率之間的相關(guān)性(Lim 等，J Infect Dis.(2003 年)9 月 15 日;188 (6): 919-26 和 Opal 等，Crit Care Med.(2007年)2月；35 (2):387-92)。此外，幾項研究已經(jīng)證實，施用IaIp降低了與敗血癥和敗血性休克相關(guān)的死亡率(Jourdain等，Am J Respir Crit Care Med.(1997年)12月；156 (6):1825-33 ;Yang 等，Crit Care Med.(2002 年)3 月;30 (3): 617-22 ;Lim 等，JInfect Dis.(2003 年)9 月 15 日;188 (6): 919-26 ;和 Wu 等，Crit Care Med.(2004 年)8月；32(8):1747-52;其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文用于所有目的)。雖然已經(jīng)表征了IaIp和敗血癥之間的關(guān)系，但是迄今尚未鑒定基于這種關(guān)系的藥劑。部分由于全球需求增加和血漿源性血液制品(例如免疫球蛋白產(chǎn)品)的可用供給量波動，幾個國家，包括澳大利亞和英國，已經(jīng)執(zhí)行了需求管理程序以保護產(chǎn)品短缺期間為最高需求患者供給這些產(chǎn)品。
例如，已經(jīng)報道2007年分離了 26，500，000L血漿，生成了 75.2公噸IVIG，平均產(chǎn)率為2.8g/L(Robert P.，見上文)。相同報道估計，2012年全球IVIG產(chǎn)率有望增加至約
3.43g/L。然而，盡管預(yù)期IVIG總體產(chǎn)率提高，但是由于全球?qū)VIG的需求不斷增長，計劃從現(xiàn)在到2015年之間每年增長約7%至13%，所以將需要更多原料血漿奉獻于免疫球蛋白純化以滿足需求。這種需要將限制血漿用于生產(chǎn)血漿源性新血液制品的可用性。由于缺乏可用于生產(chǎn)血漿源性新產(chǎn)品的血漿，必需將其生產(chǎn)并入血漿源性產(chǎn)品(例如免疫球蛋白和白蛋白)已建立的生產(chǎn)過程的現(xiàn)有框架中。作為敗血癥等病狀的潛力治療劑牽連的間-a -抑制劑是得到醫(yī)生注意的此類血漿源性血液制品。然而，由于將資源專用于(例如)IgGY球蛋白生產(chǎn)，所以需要生產(chǎn)可引入現(xiàn)有生產(chǎn)方案中的IaIp的方法。為達到這一目的已經(jīng)建議了幾種方法，然而，這些方法依賴于從純化必需產(chǎn)品(例如IVIG)有高需求的原材料中吸附IaIp0例如，Michalski等(Vox Sang.1994; 67 (4):329-36)和Mizon 等(J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 1997 年 5 月 9 日；692(2): 281-91)描述了通過連續(xù)的陰離子交換富集步驟，接著通過肝素親和色譜法從cryo-poor血楽;中吸附IaIp的方法。Josic (美國專利申請公布N0.2003/0190732)描述了通過尺寸排阻色譜法和任選吸附步驟從原料血衆(zhòng)、冷沉淀血衆(zhòng)成分或cryo-poor血楽;分離IaIp的方法。最后，Lim等(‘365 ;美國專利 N0.7，932，365)和 Lim 等(‘695 ;W0 2009/154695)描述了通過固相萃取從冷上清液或cryo-poor血漿吸附IaIp的方法(分別見，Lim等‘365和‘695的圖8和圖1)。因此，Michalski等、Mizon等、Josic和Lim等提供的純化方案(其公開內(nèi)容據(jù)此通過引用整體并入用于所有目的)消耗昂貴原材料，將需要對已建立產(chǎn)品的新的監(jiān)管部門批準(zhǔn)，和/或甚至可能導(dǎo)致已建立產(chǎn)品的特性改變。同樣地，在本領(lǐng)域中仍需要生產(chǎn)IaIp組合物的方法，所述方法不需要使用額外輸入血漿或重新設(shè)計和監(jiān)管部門重新批準(zhǔn)有商業(yè)重要性的血漿源性血液制品，例如用于靜脈內(nèi)(IVIG)或皮下施用的白蛋白和IgGY球蛋白的現(xiàn)有生產(chǎn)過程。有利的是，本發(fā)明通過提供完全依賴于先前未使用過的生產(chǎn)成分生產(chǎn)間-a-抑制蛋白(IaIp)的方法滿足了這些和其它需要。在其它方面中，本發(fā)明還提供了用`于治療與IaIp功能障礙或調(diào)節(jié)異常相關(guān)的疾病和病癥的新型IaIp組合物和方法。最后，本發(fā)明提供了由生產(chǎn)在其它血液因子組合物期間丟棄的其它血漿成分聯(lián)合生產(chǎn)IaIp和因子H的方法。發(fā)明概述在其它方面中，本發(fā)明提供了用于制備血漿源性IaIp的富集組合物的方法。有利的是，本文提供的方法允許由通過血漿分離制備其它有商業(yè)重要性的血液制品期間丟棄的其它材料エ業(yè)規(guī)?；苽銲aIp組合物。在某些實施方案中，本文提供的IaIp組合物將由單條IaIp多肽，例如IaI或PaI組成。在其它實施方案中，本文提供的IaIp組合物將包含兩種或更多種間-a -抑制蛋白(例如IaI和PaI)的混合物。如本文所使用，IaIp將指單ー間-a -抑制蛋白的組合物和兩種或更多種間-a -抑制蛋白的混合物。一方面，本發(fā)明提供了由血漿制備富含IaIp的組合物的方法，所述方法包括步驟:(a)提供cryo-poor血楽;成分；(b)在至少第一こ醇沉淀反應(yīng)中使IaIp從所述cryo-poor血楽;成分中沉淀以形成含IaIp的沉淀物；和(C)從所述含IaIp的沉淀物中萃取IaIp,從而形成富含IaIp的組合物；其中所述IaIp-沉淀物選自成分II+III濾餅、成分I沉淀物、成分I+II+III沉淀物、成分II+III沉淀物、成分IV-1、Kistler-Nitschmann沉淀物 A 和 Kistler-Nitschmann 沉淀物 B。一方面，本發(fā)明提供了通過從懸浮成分II+III濾餅萃取Ialp，由血漿制備富含IaIp的組合物的方法。在一個實施方案中，所述方法牽涉由懸浮成分II+III沉淀物吸附IaIp并從所得上清液中分離。第二方面，本發(fā)明提供了通過使IaIp從血漿樣品中沉淀以獲得沉底物并且從所述沉底物萃取Ialp，由血漿制備富含IaIp的組合物的方法。在某些實施方案中，所述沉底物為成分1、成分11+111、成分IV-1、沉淀物A或沉淀物B沉淀物。在另外其它實施方案中，提供了通過從血漿分離期間形成的ー種以上沉淀物中萃取Ialp，由血漿制備富含IaIp的組合物的方法。第三方面，本發(fā)明提供了由經(jīng)血漿分離生產(chǎn)其它有商業(yè)重要性的血液制品期間丟棄的其它材料制備的血漿源性IaIp的含水組合物。第四方面，本發(fā)明提供了由經(jīng)血漿分離生產(chǎn)其它有商業(yè)重要性的血液制品期間丟棄的其它材料制備的血漿源性IaIp的藥物組合物。第五方面，本發(fā)明提供了通過施用治療有效劑量的由經(jīng)血分離制備其它有商業(yè)重要性的血液制品期間丟棄的其它材料制備的IaIp組合物治療有需要的受試者與IaIp功能障礙或調(diào)節(jié)異常相關(guān)的疾病、病癥或病狀的方法。與IaIp功能障礙相關(guān)的疾病和病癥包括但不限于敗血癥、敗血性休克、內(nèi)毒素性休克、彌散性血管內(nèi)凝血和纖維增生。第六方面，本發(fā)明提供了通過施用治療有效劑量的經(jīng)血漿分離制備其它有商業(yè)重要性的血液制品期間丟棄的其它材料制備的IaIp組合物促進有需要的受試者的上皮修復(fù)的方法。第七方面，本發(fā)明提供了通過從經(jīng)血漿分離生產(chǎn)其它有商業(yè)重要性的血液制品期間丟棄的ー種或多種成分萃取兩種因子聯(lián)合生產(chǎn)IaIp和因子H的方法。在某些實施方案中，從成分I沉淀物、成分II+III沉淀物、成分II+III濾餅、沉淀物A和沉淀物B沉淀物回收IaIp和因子H。附圖簡述圖1.間-a -胰蛋白酶抑制劑(IaI)和前-a -抑制劑(PaI)蛋白的亞單位組成和結(jié)構(gòu)不意圖。圖2.示例性血漿分離方案的概述。采用自Zhuo等，JBC 279(2004): 38079-38082。圖3.使用示例性血漿分離方案生產(chǎn)(A)IgGy球蛋白和⑶白蛋白期間產(chǎn)生的中間血衆(zhòng)成分的IaIp內(nèi)容物的蛋白質(zhì)印跡分析。圖4.(A)利用改性成分II+III濾餅作為原材料的IaIp純化工藝的DEAE-瓊脂糖富集步驟的色譜。(B)使用抗Bikunin抗體對DEAE-瓊脂糖色譜法進行的蛋白質(zhì)印跡分析。圖5.(A)利用改性成分II+III濾餅作為原材料的IaIp純化工藝的肝素_瓊脂糖富集步驟的色譜。(B)使用抗Bikunin抗體對肝素-瓊脂糖色譜法進行的蛋白質(zhì)印跡分析。圖6.由改性成分I I+III濾餅制備的富含IaIp的組合物的SDS-Page分析。泳道1:分子量標(biāo)記(250、150、100、75、50、37、25和201^^標(biāo)記);泳道 2:lu I IaIp 組合物；泳道3:5iil IaIp組合物。圖7.通過逐步洗脫從改性成分II+III濾餅萃取的IaIp溶液進行的DEAE色譜法的(A)色譜、(B) SDS-Page分析和(C)蛋白質(zhì)印跡分析。泳道I含有標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；泳道2含有負(fù)載至DEAE樹脂上的IaIp溶液樣品；泳道3和4含有流過DEAE負(fù)載的樣品；泳道5含有IOOmM洗脫峰的樣品；泳道6含有IOOmM洗脫肩的樣品；泳道7含有155mM洗脫峰的樣品；泳道8含有230mM洗脫峰的樣品；而泳道9含有商用因子H標(biāo)準(zhǔn)品。圖8.通過逐步洗脫經(jīng)DEAE色譜法富集的峰值IaIp成分進行的肝素-瓊脂糖色譜法的(A)色譜、(B) SDS-Page分析和(C)蛋白質(zhì)印跡分析。泳道I含有標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；泳道2含有負(fù)載至肝素樹脂上的IaIp溶液樣品；泳道3、4和5含有流過肝素負(fù)載的樣品；泳道6含有80mM洗脫峰的樣品；泳道7含有80mM洗脫肩的樣品；而泳道8含有107mM洗脫峰的樣品。發(fā)明詳述I 簡介IaIp已經(jīng)作為潛カ治療劑牽連于幾種人類病狀和疾病狀態(tài)，包括敗血癥、敗血性休克、內(nèi)毒素性休克、彌散性血管內(nèi)凝血和纖維增生。IaI和PaI的bikunin亞單位是抑制在血液中發(fā)現(xiàn)的許多絲氨酸蛋白酶的絲氨酸蛋白酶，包括胰蛋白酶、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、激肽釋放酶、纖溶酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶、因子1乂&、乂&、乂1&和乂11&。因此，許多IaIp蛋白的bikunin亞單位在促進炎癥級聯(lián)反應(yīng)期間起到調(diào)節(jié)這些絲氨酸蛋白酶的活性的作用，發(fā)現(xiàn)感染期間(特別是敗血癥期間)、炭疽中毒、癌癥轉(zhuǎn)移、手術(shù)期間的組織損傷、腎病、血管疾病、凝血病、糖尿病和全身炎癥也如此(Pugia等，Adv Clin Chem.2007;44:223-45)。顯著地，含有重鏈和bikunin亞單位的IaIp家族成員的血管半衰期比單獨的bikunin亞單位長。IaIp是相對豐富的血楽;蛋白(0.6-1.2mg/mL血楽;)，然而,這些蛋白質(zhì)當(dāng)前從專攻于人血漿分離的各種生產(chǎn)操作中丟棄。在其它方面中，本發(fā)明提供了從各種分離ェ藝，例如Cohn、Oncley、Cohn-OncIey> Deutsch、Nitschmann、Kistler 和相似分離エ藝的丟棄成分中分離Ialp，無需影響、破壞或改變用于生產(chǎn)其它血漿源性產(chǎn)品的血漿的正?；虼_定加工的方法。因此，一方面，本發(fā) 明利用丟棄的血漿成分生產(chǎn)用于治療敗血癥和其它病癥的有用藥齊U。因此，在某些方面，本發(fā)明的目的是提供由血漿源，例如混合血漿生產(chǎn)IaIp的含水、凍干和藥物組合物的方法。有利的是，本文提供了由生產(chǎn)其它血液制品，例如IgGY球蛋白和白蛋白期間產(chǎn)生的未使用過的血漿成分制備IaIp組合物的方法。在一個實施方案中，提供了由血漿制備富含間- a -抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟:(i)由血漿樣品形成成分II+III沉淀物；(ii)使所述成分II+III沉淀物再懸浮以形成成分II+III懸浮液；(iii)使所述成分II+III懸浮液與固相接觸以從所述成分II+III懸浮液中去除所述IaIp ;和(iv)從所述固相中萃取所述IaIp,從而制備富含IaIp的組合物。在ー個具體實施方案中，所述固相包含ニ氧化硅細(xì)粉(SiO2)。在另一具體實施方案中，所述固相包含助濾劑。在一個實施方案中，提供了由血漿制備富含間- a -抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟:(a)在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下，用約6%至約10%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血楽;成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液；(b)在第二沉淀步驟中，在介于約6.7和約7.3之間的pH下，用約20%至約25%的醇使IaIp從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物；(c)使所述第二沉淀物再懸浮以形成懸浮液；(d)使ニ氧化硅細(xì)粉(SiO2)與來自步驟(C)的所述懸浮液混合；(e)用壓濾機過濾所述懸浮液，從而形成濾餅和上清液；和(f)用IaIp萃取緩沖液從所述濾餅中萃取Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。在另ー實施方案中，提供了由血漿制備富含間-a-抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟:(a)使IaIp從血漿樣品中沉淀以獲得沉淀物；(b)用IaIp萃取緩沖液從所述沉淀物中萃取Ialp，從而制備富含IaIp的組合物，其中所述沉淀物為成分1、成分I+II+II1、成分11+111、成分IV-1、沉淀物A或沉淀物B沉淀物。在用于制備富含間- a -抑制劑(IaIp)的組合物的方法的ー個具體實施方案中，形成成分I沉淀物的步驟包括在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下，用約6%至約10%的醇使IaIp從cryo-poor血衆(zhòng)成分中沉淀以獲得成分I沉淀物。在用于制備富含間- a -抑制劑(IaIp)的組合物的方法的ー個具體實施方案中，其中從成分IV-1沉淀物萃取Ialp，所述方法包括步驟:(a)在第一沉淀步驟中，在介于約
7.0和約7.5之間的pH下,用約6%至約10%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血衆(zhòng)成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液；(b)在第二沉淀步驟中，在介于約6.7和約7.3之間的pH下，用約20%至約25%的醇使蛋白質(zhì)從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物和第二上清液；(c)在第三沉淀步驟中，在介于約5.0和約5.5之間的pH下，用約18%至約23%的醇使IaIp從所述第二上清液中沉淀以形成第三沉淀物和第三上清液；和(d)用IaIp萃取緩沖液從所述第三沉淀物中萃取Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。在用于制備富含間- a -抑制劑(IaIp)的組合物的方法的另一具體實施方案中，其中從成分IV-1沉淀物萃取Ialp，所述方法包括步驟:(a)在第一沉淀步驟中，在介于約
6.7和約7.2之間的pH下,用約18%至約23%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血衆(zhòng)成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清 液；(b)在第二沉淀步驟中，在介于約5.0和約5.5之間的pH下，用約18%至約25%的醇使IaIp從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物和第二上清液；和(C)用IaIp萃取緩沖液從所述第二沉淀物中萃取Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。在用于制備富含間- a -抑制劑(IaIp)的組合物的方法的一個實施方案中，從ー種以上的血漿成分中萃取Ialp。在某些實施方案中，所述血漿成分選自成分II+III濾餅、成分1、成分I+II+II1、成分11+111、成分IV-1、沉淀物A或沉淀物B沉淀物。在一個實施方案中，所述方法包括步驟:(a)分離單一等分試樣的血漿以獲得除IaIp外的至少兩種血液制品的富集組合物；(b)用一種或多種萃取緩沖液從血漿分離期間產(chǎn)生的至少兩種不同丟棄成分中萃取IaIp ;和(C)匯合萃取的IaIp成分,從而制備富含IaIp的組合物。在ー個實施方案中，另外兩種血液制品為IgGY球蛋白(例如，IVIG)和白蛋白。在另外其它實施方案中，分離血漿以獲得除IaIp外的至少3種血液制品?？稍谶@種方法中獲得的血液制品的非限制性實例包括但不限于IgG Y球蛋白(例如，IVIG)、白蛋白、因子VIII旁路活性抑制劑(FEIBA)、因子IX-復(fù)合物、因子VI1-濃縮物、抗凝血酶II1-復(fù)合物、因子VII1、凝血酶原(因子II)、凝血酶原復(fù)合物(有或無因子VII)、血管性血友病因子(von WillebrandFactor) (vWF)、補體因子 H(CFH)等。在用于制備富含間- a -抑制劑(IaIp)的組合物的方法的一些實施方案中，通過使雜質(zhì)從萃取的IaIp組合物中沉淀出來進ー步富集Ialp。在一個實施方案中，在介于約6.0和約8.0之間的pH下，用約10%至約19%的醇(例如，こ醇)使雜質(zhì)沉淀。在其它實施方案中，通過使IaIp從萃取的IaIp組合物中沉淀進一歩富集Ialp。在一個實施方案中，在介于約6.0和約8.0之間的pH下，用約20%至約25%的醇使IaIp從萃取液中沉淀。在用于制備富含間-a -抑制劑(IaIp)的組合物的方法的某些實施方案中，可通過以下步驟進一步純化從血衆(zhòng)成分回收的IaIp:使來自富含IaIp的組合物的IaIp與陰離子交換樹脂結(jié)合；并且用洗脫緩沖液從陰離子交換樹脂洗脫Ialp，從而形成含有IaIp的第一洗脫液。在其它實施方案中，通過以下步驟進一步純化從血漿成分回收的IaIp:使IaIp與肝素親和樹脂結(jié)合；并且用洗脫緩沖液從所述肝素親和樹脂洗脫Ialp。在另外其它實施方案中，可通過陰離子交換和肝素親和色譜法進一歩富集Ialp。在一個實施方案中，首先使IaIp與陰離子交換樹脂結(jié)合，然后與肝素親和樹脂結(jié)合。在其它實施方案中，首先使IaIp與肝素親和樹脂結(jié)合，然后與陰離子交換樹脂結(jié)合。在另外其它實施方案中，本發(fā)明提供了由血漿制備富含間-a-抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟:(a)從cryo-poor血楽;分離期間形成的沉淀物中萃取Ialp，其中所述萃取物含有IaIp和因子H ; (b)使所述IaIp和因子H與陰離子交換樹脂結(jié)合；(C)用第一洗脫緩沖液從所述樹脂洗脫所述因子HjP (d)用第二洗脫緩沖液從所述樹脂洗脫所述Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。在一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供了由血漿制備富含間-a-抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟:(a)從cryo-poor血漿分離期間形成的沉淀物中萃取Ialp，其中所述萃取物含有IaIp和因子H ;
(b)在因子H不與陰離子交換樹脂結(jié)合的條件下，使所述IaIp與陰離子交換樹脂結(jié)合；和(C)用洗脫緩沖液從所述樹脂洗脫所述Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。在某些實施方案中，通過肝素親和色譜法進一步富集IaIp組合物。在某些實施方案中，用于生產(chǎn)IaIp組合物的方法包括分離單ー間- a -抑制蛋白(IaIp)種類。在一個實施方案中，IaIp種類為間-a-胰蛋白酶抑制劑(IaI)。在另ー實施方案中，IaIp種類為前-a-抑 制劑(Pal)。在某些實施方案中，通過親和步驟，例如抗體或適體親和法分離單ー IaIp種類。其它方面，本發(fā)明的目的是提供由血漿來源，例如混合血漿，根據(jù)本文提供的方法制備的IaIp的含水、凍干和藥物組合物。在另外其它方面，本發(fā)明的目的是提供通過施用治療有效量的本文提供的IaIp組合物治療與IaIp功能減弱或IaIp功能障礙相關(guān)的病癥和疾病的方法。在一個實施方案中，與IaIp功能減弱或IaIp功能障礙相關(guān)的疾病或病癥為敗血癥。另ー方面，本發(fā)明的目的是提供通過施用治療有效量的本文提供的IaIp組合物治療與血漿絲氨酸蛋白酶活性增強相關(guān)的疾病和病癥的方法。在一個實施方案中，與血漿絲氨酸蛋白酶活性增強相關(guān)的疾病或病癥選自敗血癥、敗血性休克、內(nèi)毒素性休克、彌散性血管內(nèi)凝血、纖維增生、炭疽中毒、癌癥轉(zhuǎn)移、手術(shù)期間的組織損傷、腎病、血管疾病、凝血病、糖尿病和全身炎癥。I1.定義如本文所使用，“間-a -抑制蛋白”或“ Ialp”指由a-1-微球蛋白/bikunin前體基因(AMBP ；UniGene ID: 231948，bikunin多肽)、間-a (球蛋白)抑制劑Hl基因(ITIH1 ；UniGene ID: 224173，Hl 多肽)、間-a (球蛋白)抑制劑 H2 基因(ITIH2 ；UnigeneID: 139782，H2 多肽)、間-a (球蛋白)抑制劑 H3 基因(ITIH3 ；UniGene ID: 140017，H3 多肽)或間- a (球蛋白)抑制劑H4(血漿激肽釋放酶敏感糖蛋白，H4多肽)基因(ITIH4 ；UniGene ID:3321613)中的一個或多個編碼的多肽組成的血漿蛋白酶抑制劑家族。示例性IaIp蛋白酶抑制劑包括但不限于IaI (bikunin,Hl和H2多肽)、PaI (bikunin和H3多肽)、IaLI (bikunin 和 H2 多妝)、IaIH4P (H4 多肽)和 bikunin (Salier, J 等，見上文)。如本文所使用，“cryo-poor血漿”指在接近冰點的溫度下，例如在低于約10° C的溫度下，冷沉淀(冷凍沉淀)血漿或混合血漿后形成的上清液。在本發(fā)明的上下文中，血漿可交替地指回收血漿(即，已經(jīng)在離體全血中分離的血漿)或原料血漿(即，通過血漿除去法收集的血漿)。例如，雖然也可使用新鮮血漿，但是通常通過解凍先前冷凍的已經(jīng)測定了其安全和質(zhì)量因素的混合血漿進行冷凍沉淀。在某些實施方案中，通常在不高于6°C的溫度下進行解凍。冷凍血漿在低溫下完全解凍后，進行冷離心(例如，<6°C)以將固體冷凍沉淀物與液體上清液分開?？蛇x地，可通過過濾，而不通過離心進行分離步驟。如本文所使用，“Cohn混合物”指用于分離血漿樣品或血漿樣品混合物的原材料。Cohn混合物包括全血衆(zhòng)、cryo-poor血衆(zhòng)樣品和可能已經(jīng)進行或未進行預(yù)加工步驟的cryo-poor血衆(zhòng)樣品混合物。在某些實施方案中，Cohn混合物為在預(yù)加工步驟,例如吸附至固相(例如，氫氧化鋁、ニ氧化硅細(xì)粉等)或色譜步驟(例如，離子交換或肝素親和色譜法)中已經(jīng)從中去除了ー種或多種血液因子的cryo-poor血衆(zhòng)樣品?？蓮腸ryo-poor血衆(zhòng)樣品分離各種血液因子，包括但不限于因子VIII旁路活性抑制劑(FEIBA)、因子IX-復(fù)合物、因子VI1-濃縮物或抗凝血酶II1-復(fù)合物，以形成Cohn混合物。如本文所使用，“成分II+III濾餅”指用吸附材料處理Cohn-Oncley或等效成分II+III懸浮液后回收的固相。通常，將用吸附材料，例如ニ氧化硅細(xì)粉處理成分II+III懸浮液，以去除雜質(zhì)，例如脂質(zhì)、纖維蛋白原、水解酰胺活性、前激肽釋放酶活性和脂蛋白。分離澄清的成分II+III懸浮上清液后，回收的固相物質(zhì)稱為成分II+III濾餅。如本文所使用，“ニ氧化硅細(xì)粉”或“硅石細(xì)粉”指以允許將IaIp吸附至其表面的方式生產(chǎn)的具有式SiO2的硅氧化物。`適合用于本發(fā)明方法中的ニ氧化硅細(xì)粉的示例性形式包括但不限于氣相ニ氧化硅、熱解硅石、Aerosir、Cab-0-Sil 、硅膠、硅藻土等。在一個優(yōu)選實施方案中，商用親水性氣相ニ氧化硅產(chǎn)品用于從血漿成分吸附Ialp。這些產(chǎn)品的非限制性實例包括由Evonik Industries以商品名稱AerosiT'.在市場上出售的產(chǎn)品(例如，Aerosil90>Aerosill30>Aerosill50>Aerosil200>Aerosil300>Aerosil380> Aerosil0X50、Aerosil EG50、Aerosil TT 600、Aerosil 200 SP、Aerosil 300 SP 和 Aerosil300/30)。如本文所使用，“與IaIp功能障礙或調(diào)節(jié)異常相關(guān)的疾病或病癥”指在受試者體內(nèi)，由受試者體內(nèi)IaIp活性水平降低引起、強化、以此為特征或?qū)е率茉囌唧w內(nèi)IaIp活性水平降低的任何疾病、病癥或病狀。在一些情況下，與IaIp功能障礙或調(diào)節(jié)異常相關(guān)的疾病或病癥包括由編碼IaIp亞單位的任何基因的突變和多態(tài)性引起或與之關(guān)聯(lián)的病狀。類似地，“與IaIp功能減弱相關(guān)的疾病或病癥”指在受試者體內(nèi)，由受試者體內(nèi)IaIp活性水平降低引起、強化、以此為特征或?qū)е率茉囌唧w內(nèi)IaIp活性水平降低的任何疾病、病癥或病狀。與IaIp功能障礙或IaIp功能減弱相關(guān)的疾病和病癥包括但不限于敗血癥、敗血性休克、內(nèi)毒素性休克、彌散性血管內(nèi)凝血和纖維增生。
如本文所使用，“與血漿絲氨酸蛋白酶活性增強相關(guān)的疾病或病癥”指在受試者體內(nèi)，由血液中存在的絲氨酸蛋白酶活性增強引起、強化、以此為特征或?qū)е卵褐写嬖诘慕z氨酸蛋白酶活性增強，并且施用bikunin或含bikunin的蛋白質(zhì)(即，IaIp蛋白)導(dǎo)致血漿絲氨酸蛋白酶活性降低的任何疾病、病癥或病狀。各種絲氨酸蛋白酶可促成血漿絲氨酸蛋白酶活性增強，包括但不限于胰蛋白酶、凝血酶、膜凝乳蛋白酶、激肽釋放酶、纖溶酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶、因子IXa、Xa、XIa和Xlla。與血漿絲氨酸蛋白酶活性增強相關(guān)的疾病和病癥包括但不限于敗血癥、敗血性休克、內(nèi)毒素性休克、彌散性血管內(nèi)凝血、纖維增生、炭疽中毒、癌癥轉(zhuǎn)移、手術(shù)期間的組織損傷、腎病、血管疾病、凝血病、糖尿病和全身炎癥。如本文所使用，術(shù)語“超濾(UF) ”包括多種膜過濾法，其中流體靜壓迫使液體緊靠半透膜。保留懸浮的固體和高分子量溶質(zhì)，而水和低分子量溶質(zhì)通過膜。這種分離法常用于純化和濃縮大分子(IO3-1O6Da)溶液，尤其是蛋白質(zhì)溶液。許多超濾膜可根據(jù)其保留的分子大小使用。超濾的特征通常在于，膜孔徑為1-1OOOkDa而操作壓カ為0.01-10巴，并且對從諸如糖和鹽的小分子分離諸如蛋白質(zhì)的膠體特別有用。如本文所使用，術(shù)語“滲濾”用與超濾相同的膜進行并且為切向流過濾。滲濾期間，在從單元操作中去除濾液的同時將緩沖液引入回收罐中。在產(chǎn)品處于滲余物(例如因子H)的エ藝中，滲濾將組分從產(chǎn)品中洗出至濾液中，從而交換了緩沖液并降低了不合需要的種類的濃度。如本文所使用，術(shù)語“約”指與指定值相差+或-10%的近似范圍。例如，語言“約20%”包括18-22%的范圍。如本文所使用，術(shù)語“混合”描述了通過任何形式的攪拌引起兩種或更多種不同化合物或物質(zhì)在溶液或懸浮液中均勻分布的動作。當(dāng)在本申請中使用所述術(shù)語時，由于“混合”而不需要所有成分在溶液或懸浮液中完全均勻分布。如本文所使用，術(shù)語“溶剤”包括能夠使ー種或多種其它物質(zhì)溶解或分散的任何液體物質(zhì)。實際上溶劑可為無機物，例如水，或可為有機液體，例如こ醇、丙酮、こ酸甲酷、こ酸こ酷、己烷、石油醚等。如在術(shù)語“溶劑洗滌劑處理”中所使用，溶劑指有機溶劑(例如，三-N- 丁基磷酸鹽)，其是用于滅活溶液中的脂包膜病毒的溶劑洗滌劑混合物的一部分。如本文所使用，術(shù)語“洗滌劑”在本申請中可與術(shù)語“表面活性剤”或“表面作用劑”交換使用。表面活性劑通常為兩親性，即含有疏水性基團(“尾”)和親水性基團(“頭”)的有機化合物，這致使表面活性劑可溶于有機溶劑和水中?？筛鶕?jù)其頭部中形式上帶電的基團的存在對表面活性劑分類。非離子表面活性劑在其頭部中無帶電基團，而離子表面活性劑在其頭部中攜帯凈電荷。兩性離子表面活性劑含有具有兩個帶相反電荷的基團的頭。常用表面活性劑的ー些實例包括:陰離子(基于硫酸鹽、磺酸鹽或羧酸鹽陰離子):全氟辛酸酷(PF0A或PF0)、全氟辛基磺酸鹽(PFOS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸銨和其它烷基磺酸鹽、月桂醇聚醚硫酸酯鈉(也稱為月桂基醚硫酸鈉或SLES)、烷基苯磺酸鹽；陽離子(基于季銨陽離子):鯨蠟 基三甲基溴化銨(CTAB)，也稱為十六烷基三甲基溴化銨和其它烷基三甲基銨鹽、氯化十六烷基吡啶(CPC)、聚こ氧基化牛脂胺(POEA)、苯扎氯銨(BAC)、芐素氯銨(BZT);長鏈脂肪酸及其鹽:包括辛酸鹽、辛酸、庚酸鹽(h印tanoat)、己酸、庚酸、壬酸、癸酸等；兩性離子(兩性):十二烷基甜菜堿、椰油酰胺丙基甜菜堿、可可兩性甘氨酸鹽；非離子:燒基聚(環(huán)氧こ烷)、烷基苯酚聚(環(huán)氧こ烷)、聚(環(huán)氧こ烷)和聚(環(huán)氧丙燒)的共聚物(商業(yè)上稱為泊洛沙姆(Poloxamer)或泊洛沙胺(Poloxamine))、燒基聚葡萄糖苷(包括辛基葡萄糖苷)、癸基麥芽糖苷、脂肪醇(例如，鯨蠟醇和油醇)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、聚山梨醇酯(吐溫(Tween) 20、吐溫80等)、Triton洗滌劑和十二烷基ニ甲
基胺氧化物。如本文所使用，術(shù)語“治療有效量或劑量”或“足夠/有效量或劑量”指對因為其施用產(chǎn)生效果的劑量。準(zhǔn)確劑量將取決于治療目的，并且可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用已知技術(shù)確定(見，例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms (第 1-3卷，1992年)；Lloyd,The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999) ；Pickar,Dosage Calculations(1999);和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,果20 版，2003, Gennaro 編輯，Lippincott, Williams &ffilkins)。如本申請中所使用，術(shù)語“噴霧(spray) ”指(例如)在醇沉淀步驟,例如改性Cohn成分I或II+III沉淀步驟期間，以液體物質(zhì)的細(xì)滴或薄霧形式將液體物質(zhì)遞送至體系內(nèi)的方式?？捎萌魏渭訅涸O(shè)備，例如具有噴頭或噴嘴并且手動或自動操作以由液體產(chǎn)生細(xì)薄霧的容器(例如，噴霧瓶)實現(xiàn)噴霧。通常，在不斷攪拌或混合接收液體物質(zhì)的體系的同時進行噴霧以確保體系內(nèi)的液體迅速均勻分布。II1.用于生產(chǎn)間-a-抑制劑(IaIp)的方法通常，可由任何適合原材料，例如回收血漿或原料血漿，制備根據(jù)本發(fā)明的IaIp制劑。在典型實例中，從健康 供體采集血液或血漿。通常，從與將對其施用IaIp制劑的受試者相同物種的動物采集血液(通常稱為“同源” Ialp)。通過適合程序，例如沉淀(醇分離或聚こニ醇分離)、色譜法(離子交換色譜法、親和色譜法、免疫親和色譜法等)、超速離心法和電泳制備法等從血液或血衆(zhòng)中分離IaIp0 (見，例如，Cohn等,J.Am.Chem.Soc.68:459-75 (1946) ；Deutsch 等，J.Biol.Chem.164:109-118 ；0ncley 等，J.Am.Chem.Soc.71:541-50(1949) ;Cohn 等，J.Am.Chem.Soc.72:465-474 (1950) ;Cohn 等，Blood Cellsand Plasma Proteins: Their State in Nature (J.L.Tullis 編輯)，第ト58 頁，AcademicPress, NewYork and London(1953) ;Nischmann 等，Helv.Chim.Acta 37:866-873 ；Kistler和 Nischmann, Vox Sang.7:414-424 (1962) ；Barundern 等，Vox Sang.7:157-74 (1962)；Koblet 等，Vox Sang.13:93-102(1967);美國專利 N0.5，122，373 和 5，177，194 ;其公開內(nèi)容據(jù)此通過引用整體并入用于所有目的)。在某些實施方案中，從通過血漿分離生產(chǎn)其它有商業(yè)重要性的血液制品期間丟棄的其它材料回收Ialp。例如，在示例性實施方案中，從Cohn成分I或成分IV-1沉淀物(Cohn 等(1946)見上文)、Cohn-Oncley 成分 II+III 沉淀物(Oncley 等，見上文)、Kistler和Nischmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物(Kistler和Nischmann見上文)萃取IaIp,或從エ業(yè)生產(chǎn)IgGy球蛋白期間形成的Cohn-Oncley成分II+III懸浮液(Oncley等,見上文)吸附Ialp。有利的是，根據(jù)本文提供的方法，無需額外輸入血漿或重新設(shè)計和監(jiān)管部門重新批準(zhǔn)其它有商業(yè)重要性的血漿源性血液制品，例如用于靜脈內(nèi)(IVIG)或皮下施用的IgGY球蛋白或白蛋白的現(xiàn)有生產(chǎn)過程，就可實現(xiàn)IaIp的エ業(yè)規(guī)模制備。一方面,本發(fā)明提供了通過在至少第一こ醇沉淀反應(yīng)中，使IaIp從cryo-poor血漿或源自其中的成分中沉淀以形成含IaIp的沉淀物；并且(C)從含IaIp的沉淀物萃取Ialp，從而形成富含IaIp的組合物制備富含IaIp的組合物的方法。在優(yōu)選實施方案中，含IaIp的沉淀物選自成分II+III濾餅、成分I沉淀物、成分I+II+III沉淀物、成分II+III沉淀物、成分 IV-1、Kistler-Nitschmann 沉淀物 A 和 Kistler-Nitschmann 沉淀物 B。在ー個具體實施方案中，所述方法包括在至少第一こ醇沉淀反應(yīng)中，使IaIp從cryo-poor血楽;或源自其中的成分中沉淀以形成成分II+III沉淀物并且從成分II+III沉淀物萃取Ialp。在一個實施方案中，所述方法進ー步包括通過使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀(即，在“IaIp沉淀物4”步驟中)并從含IaIp的上清液分離出沉淀的雜質(zhì)而富集IaIp組合物。在另ー實施方案中，所述方法進ー步包括通過使IaIp從組合物中沉淀(即，在“ IaIp沉淀物5”步驟中)而富集IaIp組合物。在ー個具體實施方案中,所述方法進ー步包括通過陰離子交換色譜法富集IaIp組合物。在另一具體實施方案中，所述方法進ー步包括通過肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中，所述方法進ー步包括通過陰離子交換色譜法和肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中，所述方法包括從成分II+III沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且使IaIp從所得上清液中沉淀。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過陰離子交換色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III沉淀物萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子 交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III沉淀物萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III沉淀物萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分II+III沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分II+III沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分II+III沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在ー個具體實施方案中，所述方法包括在至少第一こ醇沉淀反應(yīng)中，使IaIp從cryo-poor血楽;或源自其中的成分中沉淀以形成成分II+III濾餅并且從成分II+III濾餅萃取Ialp。在一個實施方案中，所述方法進ー步包括通過使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀(即，在“IaIp沉淀物4”步驟中)并從含IaIp的上清液分離出沉淀的雜質(zhì)而富集IaIp組合物。在另ー實施方案中，所述方法進ー步包括通過使IaIp從組合物中沉淀(S卩，在“IaIp沉淀物5”步驟中)而富集IaIp組合物。在ー個具體實施方案中，所述方法進ー步包括通過陰離子交換色譜法富集IaIp組合物。在另一具體實施方案中，所述方法進ー步包括通過肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中，所述方法進ー步包括通過陰離子交換色譜法和肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且使IaIp從所得上清液中沉淀。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過陰離子交換色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子 交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在ー個具體實施方案中，所述方法包括在至少第一こ醇沉淀反應(yīng)中，使IaIp從cryo-poor血楽;或源自其中的成分中沉淀以形成成分II+III濾餅并且從成分II+III濾餅萃取Ialp。在一個實施方案中，所述方法進ー步包括通過使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀(即，在“IaIp沉淀物4”步驟中)并從含IaIp的上清液分離出沉淀的雜質(zhì)而富集IaIp組合物。在另ー實施方案中，所述方法進ー步包括通過使IaIp從組合物中沉淀(S卩，在“IaIp沉淀物5”步驟中)而富集IaIp組合物。在ー個具體實施方案中，所述方法進ー步包括通過陰離子交換色譜法富集IaIp組合物。在另一具體實施方案中，所述方法進ー步包括通過肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中，所述方法進ー步包括通過陰離子交換色譜法和肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且使IaIp從所得上清液中沉淀。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過陰離子交換色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。
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在另ー實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分II+III濾餅萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在ー個具體實施方案中，所述方法包括在至少第一こ醇沉淀反應(yīng)中，使IaIp從cryo-poor血楽;或源自其中的成分中沉淀以形成成分I+II+II沉淀物并且從成分I+II+II沉淀物萃取Ialp。在一個實施方案中，所述方法進ー步包括通過使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀(即，在“IaIp沉淀物4”步驟中)并從含IaIp的上清液分離出沉淀的雜質(zhì)而富集IaIp組合物。在另ー實施方案中,所述方法進ー步包括通過使IaIp從組合物中沉淀(即，在“ IaIp沉淀物5”步驟中)而富集IaIp組合物。在ー個具體實施方案中，所述方法進ー步包括通過陰離子交換色譜法富集IaIp組合物。在另一具體實施方案中，所述方法進ー步包括通過肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中，所述方法進ー步包括通過陰離子交換色譜法和肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中，所述方法包括從成分I+II+II沉淀物萃取Ialp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且使IaIp從所得上清液中沉淀。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分I+II+II沉淀物萃取Ialp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過陰離子交換色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分I+II+II沉淀物萃取Ialp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分I+II+II沉淀物萃取Ialp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分I+II+II沉淀物萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。
在另ー實施方案中，所述方法包括從成分I+II+II沉淀物萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分I+II+II沉淀物萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分I+II+II沉淀物萃取Ialp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分I+II+II沉淀物萃取Ialp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分I+II+II沉淀物萃取Ialp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在ー個具體實施方案中，所述方法包括在至少第一こ醇沉淀反應(yīng)中，使IaIp從cryo-poor血楽;或源自其中的成分中沉淀以形成成分IV-1沉淀物并且從成分IV-1沉淀物萃取Ialp。在一個實施方案中，所述方法進ー步包括通過使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀(即，在“IaIp沉淀物4”步驟中)并從含IaIp的上清液分離出沉淀的雜質(zhì)而富集IaIp組合物。在另ー實施方案中，所述方法進ー步包括通過使IaIp從組合物中沉淀(S卩，在“IaIp沉淀物5”步驟中)而富集IaIp組合物。在ー個具體實施方案中，所述方法進ー步包括通過陰離子交換色譜法富集IaIp組合物。在另一具體實施方案中，所述方法進ー步包括通過肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中，所述方法進ー步包括通過陰離子交換色譜法和肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中 ，所述方法包括從成分IV-1沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且使IaIp從所得上清液中沉淀。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分IV-1沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過陰離子交換色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分IV-1沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分IV-1沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分IV-1沉淀物萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分IV-1沉淀物萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從成分IV-1沉淀物萃取IaIp，使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分IV-1沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。
在一個實施方案中，所述方法包括從成分IV-1沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從成分IV-1沉淀物萃取IaIp，使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在ー個具體實施方案中，所述方法包括在至少第一こ醇沉淀反應(yīng)中，使IaIp從cryo-poor血衆(zhòng)或源自其中的成分中沉淀以形成Kistler-Nitschmann沉淀物A并且從Kistler-Nitschmann沉淀物A萃取Ialp。在一個實施方案中,所述方法進ー步包括通過使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀(即，在“IaIp沉淀物4”步驟中)并從含IaIp的上清液分離出沉淀的雜質(zhì)而富集IaIp組合物。在另ー實施方案中,所述方法進ー步包括通過使IaIp從組合物中沉淀(即，在“IaIp沉淀物5”步驟中)而富集IaIp組合物。在ー個具體實施方案中，所述方法進ー步包括通過陰離子交換色譜法富集IaIp組合物。在另一具體實施方案中，所述方法進ー步包括通過肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中，所述方法進ー步包括通過陰離子交換色譜法和肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中,所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物A萃取IaIp,使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且使IaIp從所得上清液中沉淀。在另ー實施方案中,所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物A萃取IaIp,使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過陰離子交換色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物A萃取IaIp,使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得上清液富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物A萃取IaIp,使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀 并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得上清液富集ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物A萃取IaIp,使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物A萃取IaIp,使IaIp從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在另ー實施方案中，所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物A萃取IaIp,使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中,所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物A萃取IaIp,使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物A萃取IaIp,使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中,所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物A萃取IaIp,使至少ー種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。
在一個具體實施方案中，所述方法包括在至少第一乙醇沉淀反應(yīng)中，使IaIp從cryo-poor血衆(zhòng)或源自其中的成分中沉淀以形成Kistler-Nitschmann沉淀物B并且從Kistler-Nitschmann沉淀物B萃取Ialp。在一個實施方案中,所述方法進一步包括通過使至少一種雜質(zhì)從組合物中沉淀(即，在“Ialp沉淀物4”步驟中)并從含IaIp的上清液分離出沉淀的雜質(zhì)而富集IaIp組合物。在另一實施方案中,所述方法進一步包括通過使IaIp從組合物中沉淀(即，在“Ialp沉淀物5”步驟中)而富集IaIp組合物。在一個具體實施方案中，所述方法進一步包括通過陰離子交換色譜法富集IaIp組合物。在另一具體實施方案中，所述方法進一步包括通過肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中，所述方法進一步包括通過陰離子交換色譜法和肝素親和色譜法富集IaIp組合物。在一個實施方案中,所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物B萃取IaIp,使至少一種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且使IaIp從所得上清液中沉淀。在另一實施方案中，所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物B萃取IaIp,使至少一種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過陰離子交換色譜法從所得上清液富集Ialp。在另一實施方案中，所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物B萃取IaIp,使至少一種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得上清液富集Ialp。在另一實施方案中，所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物B萃取IaIp,使至少一種雜質(zhì)從組合物中沉淀并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得上清液富集IaIp0在另一實施方案中，所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物B萃取IaIp,使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在另一實施方案中，所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物B萃取IaIp,使IaIp從組合物中沉淀并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。
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在另一實施方案中，所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物B萃取IaIp,使IaIp從組合物中沉淀并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中，所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物B萃取IaIp,使至少一種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中,所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物B萃取IaIp,使至少一種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。在一個實施方案中,所述方法包括從Kistler-Nitschmann沉淀物B萃取IaIp,使至少一種雜質(zhì)從組合物中沉淀，使IaIp從所得上清液中沉淀，并且通過陰離子交換和肝素親和色譜法從所得沉淀物中富集Ialp。一方面，本發(fā)明提供了通過從成分1、成分IV-1、成分II+III或成分I+II+III沉淀物、Kistler和Nitschmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅萃取IaIp,由血漿制備富含IaIp的組合物的方法。在某些實施方案中，繼從成分1、成分IV-1、成分II+III或成分I+II+III沉淀物、Kistler和Nitschmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅萃取之后，可進一步純化富含IaIp的組合物。各種方法可用于進一步純化Ialp，包括但不限于附加沉淀步驟或分離、親和色譜法、離子交換色譜法、疏水作用色譜法、尺寸排阻色譜法、溶劑/洗滌劑(S/D)處理、納米過濾、超濾、滲濾等。在一個實施方案中,所述方法進一步包括使雜質(zhì)從富含IaIp的組合物中沉淀。在某些實施方案中，這一步驟包括使至少一種雜質(zhì)，例如脂質(zhì)或蛋白質(zhì)從組合物中沉淀，然后從含IaIp的上清液中分離出沉淀物。任選地，然后可在單獨沉淀中使IaIp從上清液中沉淀。有利的是，使IaIp從富集組合物中沉淀并隨后再懸浮允許在附加純化步驟，例如色譜法或納米過濾之前減小體積。在一個實施方案中，繼從成分1、成分IV-1、成分II+III或成分I+II+111沉淀物、Kistler和Nitschmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅萃取之后，可通過使IaIp從富集組合物中沉淀出來進一步純化富含IaIp的組合物。在某些實施方案中，富含IaIp的組合物可進行第一沉淀步驟以從如上所述的組合物中去除至少一種雜質(zhì)，然后進行第二沉淀步驟以沉淀并去除Ialp。在某些實施方案中，用于制備富含IaIp的組合物的方法進一步包括至少一個，優(yōu)選兩個色譜步驟，以進一步提高組合物的純度。通常，可采用任何適合色譜法以進一步富集從成分1、成分IV-1、成分II+III或成分I+II+III沉淀物、Kistler和Nitschmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅萃取的IaIp組合物。在某些實施方案中，在色譜富集之前，萃取的IaIp組 合物將進行一個或多個如上所述的附加沉淀步驟，以減少組合物中存在的雜質(zhì)，減小色譜步驟的負(fù)載體積，和/或交換組合物的緩沖液。在某些實施方案中，色譜步驟可包括陰離子交換色譜法(AEC)、陽離子交換色譜法(CEC)、肝素親和色譜法、疏水交換色譜法(HIC)、羥磷灰石色譜法(HAP)、免疫親和色譜法、尺寸排阻色譜法(即，凝膠過濾)或其它適合色譜步驟?？梢耘炕蛄心Ｊ竭M行色譜步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法包括使用陰離子交換色譜法和肝素親和色譜法。在某些實施方案中，本文提供的用于制備富含IaIp的組合物的方法將進一步包括至少I個，優(yōu)選至少2個，最優(yōu)選至少3個病毒滅活或去除步驟?？膳c本文提供的方法一起采用的病毒滅活或去除步驟的非限制性實例包括溶劑洗滌劑處理(HOTOWitZ等，Blood Coagul Fibrinolysis 1994(5 Suppl 3):S21-S28 和 Kreil 等，Transfusion2003(43):1023-1028, 二者均通過引用整體明確地并入本文用于所有目的)、納米過濾(Hamamoto 等，Vox Sang 1989 (56) 230-236 和 Yuasa 等，J Gen Virol.1991 (72 (pt8)): 2021-2024，二者均通過引用整體明確地并入本文用于所有目的)、在高溫下低pH孵育(Kempf 等，Transfusion 1991 (31) 423-427 和 Louie 等，Biologicals 1994 (22): 13-19)和熱處理凍干因子 H組合物(Piszkiewicz 等，Thromb Res.1987 年 7 月 15 日;47(2):235-41 ；Piszkiewicz 等，Curr Stud Hematol Blood Transfus.1989;(56):44-54 ；Epstein 和Fricke, Arch Pathol Lab Med.1990 年 3 月;114(3):335-40) 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了制備病毒安全性富含IaIp的組合物的方法，包括(i)從成分II+III濾餅萃取Ialp，(ii)進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀,和(iv)進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備病毒安全性富含IaIp的組合物。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了制備病毒安全性富含IaIp的組合物的方法，包括α)從成分I沉淀物萃取Ialp，(ii)進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，和(iv)進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備病毒安全性富含IaIp的組合物。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了制備病毒安全性富含IaIp的組合物的方法，包括(i)從成分II+III沉淀物萃取Ialp，(ii)進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀,和(iv)進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備病毒安全性富含IaIp的組合物。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了制備病毒安全性富含IaIp的組合物的方法，包括(i)從成分IV-1沉淀物萃取Ialp，(ii)進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀,和(iv)進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備病毒安全性富含IaIp的組合物。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了制備病毒安全性富含IaIp的組合物的方法，包括(i)從沉淀物A萃取Ialp，(ii)進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，和(iv)進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備病毒安全性富含IaIp的組合物。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了制備病毒安全性富含IaIp的組合物的方法，包括(i)從沉淀物B萃取Ialp，(ii)進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，和(iv)進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備病毒安全性富含IaIp的組合物。一方面，可通過色譜法和適合大規(guī)模生產(chǎn)過程的一系列步驟洗脫進一步富集從通過血漿分離生產(chǎn)其它有商業(yè)重要性的血液制品期間丟棄的其它材料，例如成分1、成分IV-1、沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅分離的Ialp。在一個實施方案中，DEAE-瓊脂糖和肝素-瓊脂糖色譜樹脂 與適合緩沖體系一起使用，例如含有25mM Tris和5mM EDTA(pH8)的緩沖體系?？尚薷腎aIp組合物的色譜富集以使用除pH 8.0的Tris/EDTA外的緩沖體系。可使這些過程適合于生物制藥的生產(chǎn)中常用的緩沖液和溶液。實例為使用PH7.0的磷酸鹽緩沖液的純化方案。成功純化的關(guān)鍵因素是操縱導(dǎo)電率或離子強度以實現(xiàn)所需化合物的分離。如果將緩沖體系的PH維持在pH8.0，洗脫緩沖液的導(dǎo)電率必需與此時所需的純化工藝相匹配。如果改變緩沖體系的PH，將需要用在色譜過程的優(yōu)化中使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對離子強度做一些調(diào)節(jié)。A.醇沉淀和色譜分離方法一方面，本發(fā)明提供了由第二血液因子的生產(chǎn)過程中丟棄的其它材料制備IaIp富集組合物的方法。在示例性實施方案中，可從血漿源性IgG組合物，例如配制用于靜脈內(nèi)(即，IVIG)、皮下和或肌肉內(nèi)施用的IgG組合物的生產(chǎn)過程產(chǎn)生的成分回收Ialp。在第二示例性實施方案中，可從血漿源性白蛋白的生產(chǎn)過程產(chǎn)生的成分回收Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了制備因子H的富集組合物的方法，所述方法包括
(i)從成分I沉淀物、成分II+III沉淀物、成分IV-1沉淀物、沉淀物A沉淀物、沉淀物B沉淀物、成分II+III懸浮液和/或成分II+III濾餅萃取因子H，(ii)任選進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)任選進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，(iv)任選進行至少一個離子交換色譜步驟，(V)任選進行至少一個肝素親和色譜步驟；和(vi)進行至少一個病毒滅活或去除步驟。在一個實施方案中，由IgG或白蛋白生產(chǎn)過程中丟棄的其它材料制備IaIp的富集組合物的方法包括下列一個或多個步驟。1.制備 Cryo-poor 血衆(zhòng)在某些實施方案中，用于制備Ialp、因子H和IgG組合物的原材料通常由回收血漿(即，已經(jīng)從離體全血中分離的血漿)或原料血漿(即，通過血漿除去法收集的血漿)。盡管也可使用新鮮血漿，但是純化工藝通常從解凍先前冷凍的已經(jīng)測定了其安全和質(zhì)量因素的混合血漿開始。在某些實施方案中，通常在不高于6°C或約6°C的溫度下進行解凍。冷凍血漿在低溫下完全解凍后，進行冷離心(例如，< 6°C )以將固體冷凍沉淀物與液體上清液分開。可選地，可通過過濾，而不通過離心進行分離步驟。然后在下一步驟中加工液體上清液(通過離心從新解凍的血漿中去除冷不溶性蛋白后，也稱為“cryo-poor血漿”)。在這關(guān)鍵時刻可進行各種附加步驟以分離其它凝血因子和抑制劑，例如因子VIII旁路活性抑制劑(FEIBA)、因子IX-復(fù)合物、因子VII或抗凝血酶II1-復(fù)合物。2.第一沉淀步驟-成分I沉淀制備cryo-poor血衆(zhòng)后,通常使溶液冷卻至0± 1°C或約0± 1°C并且將pH調(diào)節(jié)至介于7.0-7.5或約7.0-7.5之間，優(yōu)選至介于7.1-7.3或約7.1-7.3之間，最優(yōu)選約7.2。在一個實施方案中，將cryo-poor血漿的pH調(diào)節(jié)至7.2或約7.2的pH。然后在攪拌血漿的同時，添加預(yù)冷乙醇至介于6%-10%或約6%-10%之間的目標(biāo)濃度。在一個優(yōu)選實施方案中，添加乙醇至介于7%-9%或約7%-9%之間的目標(biāo)濃度。在一個更優(yōu)選實施方案中，添加乙醇至8%(v/v)或約8%(v/v)的目標(biāo)濃度。同時進一步降低溫度至介于-4° C 0° C或約-4° C 0° C之間。在一個優(yōu)選實施方案中，降低溫度至-2° C或約-2° C，以使組分(例如纖維蛋白原)沉淀。雖然也可采用更短或更長的維持時間，但是通常沉淀事件將包括至少為或約Ih的維持時間。隨后，再通過離心、過濾或另一適合方法從沉淀物(成分I沉淀物)中分離出理論上含有cryo-poor血漿中存在的全部IgG內(nèi)容物的上清液(上清液I)。 通常，在血漿源性血液因子，例如IgG和白蛋白的生產(chǎn)過程中進行成分I沉淀步驟以去除雜質(zhì)。有利的是，發(fā)現(xiàn)相當(dāng)大部分的IaIp存在于通常在生產(chǎn)過程中被丟棄的這種沉淀物中。因此，在一個實施方案中，從成分I沉淀物萃取Ialp。本文提供了從成分I沉淀物萃取IaIp的適合緩沖液和方法。與用作cryo-poor血衆(zhòng)的第一分離步驟的常規(guī)方法相比(Cohn等,見上文；0ncley等，見上文)，在幾個實施方案中，本發(fā)明提供了引起血漿因子(例如，Ialp、因子H、IgG,白蛋白等)的產(chǎn)量提高的方法。在一個實施方案中，以使醇在添加時細(xì)微分散或迅速分散的方式添加沉淀醇。在一個實施方案中，通過噴霧添加醇。在第二實施方案中，從攪拌裝置(例如，螺旋槳)的下方或直接與之相鄰添加醇。通過這些機制的任一種添加醇避免了(例如)在液態(tài)添加時出現(xiàn)醇的局部濃度過高并導(dǎo)致在上清液中回收的蛋白質(zhì)不可逆變性和/或蛋白質(zhì)沉淀。 在另一實施方案中，以使pH調(diào)節(jié)劑在添加時細(xì)微分散或迅速分散的方式添加一種或多種PH調(diào)節(jié)劑。在一個實施方案中，通過噴霧添加pH調(diào)節(jié)劑。在第二實施方案中，從攪拌裝置(例如，螺旋槳)的下方或直接與之相鄰添加PH調(diào)節(jié)劑。在第三實施方案中，通過將固體PH調(diào)節(jié)劑撒在離域區(qū)上添加pH調(diào)節(jié)劑。在又一實施方案中，在添加醇之后調(diào)節(jié)溶液的pH。在一個相關(guān)實施方案中，在添加醇期間調(diào)節(jié)溶液的pH。在一個實施方案中，在沉淀維持或孵育期間通過不斷調(diào)節(jié)溶液的pH將溶液的PH維持在所需pH。在一個優(yōu)選實施方案中，所述醇為乙醇。在某些實施方案中，在添加沉淀醇之后將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于7.0-7.5或約7.0-7.5之間。在其它實施方案中，在添加沉淀醇之后將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于7.1-7.3或約
7.1-7.3之間。在另外其它實施方案中，在添加沉淀醇之后將溶液的pH調(diào)節(jié)至(或約)7.0,或(或約)7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。在一個特殊實施方案中，在添加沉淀醇之后將溶液的PH調(diào)節(jié)至7.2或約7.2。同樣，在某些實施方案中，與在添加沉淀醇之前而不是之后調(diào)節(jié)溶液的PH的類似沉淀步驟相比，在第一沉淀步驟中由于蛋白質(zhì)變性，不可逆性丟失的血液因子的量減少。在某些其它實施方案中，通過噴霧，而非液態(tài)添加法添加沉淀醇和/或用于調(diào)節(jié)PH的溶液。同樣，在某些實施方案中，與通過液態(tài)添加法引入醇和/或用于調(diào)節(jié)pH的溶液的類似沉淀步驟相比，在第一沉淀步驟中由于蛋白質(zhì)變性，不可逆性丟失的血液因子的量減少。在其它實施方案中，在添加沉淀醇之后，通過噴霧，而非液態(tài)添加法添加沉淀醇和/或用于調(diào)節(jié)PH的溶液來調(diào)節(jié)溶液的pH。在一個特殊實施方案中，在添加沉淀醇之后，通過噴霧，而非通過液態(tài)添加法添加沉淀醇和/或用于調(diào)節(jié)PH的溶液將溶液的pH調(diào)節(jié)至7.2或約7.2。3.第二沉淀步驟-成分II+III沉淀為了提高成分I上清液中存在的相關(guān)血液因子(例如，Ialp、因子H、IgG、白蛋白)的含量和純度，使成分上清液I進行第二沉淀步驟，這是Cohn-Oncley成分II+III分離。通常，將溶液的PH調(diào)節(jié)至介于6.6-7.2或約6.6-7.2之間。在一個優(yōu)選實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于6.6-6.8或約6.6-6.8之間。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)為6.7或約6.7的pH。然后在攪拌的同時添加醇,優(yōu)選乙醇,至介于20%-257o(v/v)或約20%-25%(v/v)之間的最終濃度以使所述成分中存在的Ialp、因子H和IgG沉淀，同時保留上清液中的大部分白蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，添加醇至25%(v/v)或約25%(v/v)的最終濃度以使所述成分中存在的Ialp、因子H和IgG沉淀。有利的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，雖然大多數(shù)IgG存在于成分II+III沉淀物中，但是在這些條件下白蛋白未沉淀。因此，可加工成分II+III沉淀物用于生產(chǎn)IgGY球蛋白，而上清液可用于生產(chǎn)白蛋白。因為剩余IaIp血漿內(nèi)容物分布在成分II+III沉淀物和上清液之間，所有IaIp純化工藝在這一步分支。在第一條途徑(本文稱為IgG途徑)中加工成分II+III沉淀物，以致可從成分II+III懸浮液和/或成分II+III濾餅中回收Ialp。第二條途徑(本文稱為白蛋白途徑)牽涉加工成分II+III上清液并允許從成分IV-1沉淀物中回收Ialp。在向成分I上清液添加醇之前或同時，使溶液進一步冷卻至介于-5° C -9° C或約-5° C -9° C之間。在一個優(yōu)選實施方案中，使溶液冷卻至-7°C或約_7°C。完成醇添加之后，立即將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于6.6-7.2或約6.6-7.2之間。在一個優(yōu)選實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于6.6-6.8或約6.6-6.8之間。 在一個更優(yōu)選的實施方案中,將溶液的pH調(diào)節(jié)至6.9或約6.9。雖然也可采用更短或更長的維持時間，但是通常沉淀事件將包括至少為或約IOh的維持時間。隨后，通過離心、過濾或另一適合方法將含有cryo-poor血漿的大部分IaIp內(nèi)容物和大多數(shù)因子H和IgG內(nèi)容物的沉淀物(成分II+III)與上清液分離開并收集。與用作cryo-poor血楽;的第二分離步驟的常規(guī)方法相比(Cohn等,見上文；0ncley等，見上文)，在幾個實施方案中，本發(fā)明提供了引起改性成分II+III沉淀物中血液因子產(chǎn)量提高的方法。與用作cryo-poor血衆(zhòng)的第二分離步驟的常規(guī)方法相比(Cohn等,見上文；0ncley等，見上文)，在幾個實施方案中，本發(fā)明提供了引起改性成分II+III沉淀物中血液因子產(chǎn)量提高的方法。在一個實施方案中，以使醇在添加時細(xì)微分散或迅速分散的方式添加沉淀醇。在一個實施方案中，通過噴霧添加醇。在第二實施方案中，從攪拌裝置(例如，螺旋槳)的下方或直接與之相鄰添加醇。在另一實施方案中，以使pH調(diào)節(jié)劑在添加時細(xì)微分散或迅速分散的方式添加一種或多種PH調(diào)節(jié)劑。在一個實施方案中，通過噴霧添加pH調(diào)節(jié)劑。在第二實施方案中，從攪拌裝置(例如，螺旋槳)的下方或直接與之相鄰添加PH調(diào)節(jié)劑。在第三實施方案中，通過將固體PH調(diào)節(jié)劑撒在離域區(qū)上添加pH調(diào)節(jié)劑。在又一實施方案中，在添加醇之后調(diào)節(jié)溶液的pH。在一個相關(guān)實施方案中，在添加醇期間調(diào)節(jié)溶液的pH。在一個實施方案中，在沉淀維持或孵育期間通過不斷調(diào)節(jié)溶液的pH將溶液的PH維持在所需pH。在一個優(yōu)選實施方案中，所述醇為乙醇。在一個實施方案中，成分II+III沉淀步驟的溫度介于_7°C至_9°C或約_7°C至約_9°C之間。在一個相關(guān)實施方案中，成分II+III沉淀步驟中使用的醇(例如，乙醇)的濃度為25%(v/v)或約25%(v/v)并且溫度介于-7V至_9°C或約_7°C至約_9°C之間。相比之下，Cohn等和Oncley 等在_5°C下進行沉淀而Oncley等使用20%乙醇，以便降低沉淀物中污染物的水平。有利的是，本文提供的方法考慮到最高Ialp、因子H和/或IgG產(chǎn)量，而在最終產(chǎn)物中無高水平的污染物。在另一實施方案中，在介于-7V至_9°C或約_7°C至約-9°C之間的溫度下進行沉淀步驟。在一個實施方案中，在_7°C或約-7°C的溫度下進行沉淀步驟。在另一實施方案中，在_8°C或約_8°C的溫度下進行沉淀步驟。在另一實施方案中，在_9°C或約_9°C的溫度下進行沉淀步驟。在某些實施方案中，沉淀步驟的醇濃度介于20%_30%或約20%-約30%之間，優(yōu)選介于23%-27%或約23%-約27%之間。在一個優(yōu)選實施方案中，醇濃度介于24%_26%或約24%-約26%之間。在另一優(yōu)選實施方案中，醇濃度為25%或約25%。在其它實施方案中，醇濃度可為(或約)20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29% 或 30%。在一個優(yōu)選實施方案中，在-7° C或約-7°C的溫度和25%或約25%的醇濃度下進行第二沉淀步驟。在一個實施方案中，所述醇為乙醇。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在添加沉淀醇之前將溶液的pH調(diào)節(jié)至約6.9的pH時，部分由于蛋白質(zhì)沉淀，溶液的PH從6.9變化為介于約7.4與約7.7之間。當(dāng)溶液的pH從6.9變化時，IgG的沉淀變得不太順利而某些污染物的沉淀變得更加順利。有利的是，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過在添加沉淀醇之后調(diào)節(jié)溶液的pH，在成分II+III沉淀物中回收更高百分比的IgG。在一個實施方案中，在沉淀維持或孵育期間通過不斷調(diào)節(jié)溶液的PH將溶液的pH維持在所需pH。在一個優(yōu)選實施方案中，所述醇為乙醇。在某些實施方案中，在添加沉淀醇之后立即或期間將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于
6.6-7.2或約6.6-7.2之間。在另一實施方案中，在沉淀孵育期間不斷將溶液的pH維持在介于6.6-7.2或約6.6-7.2之間。在其它實施方案中，在添加沉淀醇之后立即或期間將溶液的PH調(diào)節(jié)至介于6.8-7.0或約6.8-7.0之間，或在添加沉淀醇之后立即或期間將溶液的pH調(diào)節(jié)至(或約)6.7,6.8,6.9,7.0或7.1的pH。在一個特殊實施方案中，在添加沉淀醇之后立即或期間將溶液的pH調(diào)節(jié)至6.9或約6.9。在某些實施方案中，在沉淀孵育期間不斷將溶液的PH維持在介于6.8-7.0或約6.8-7.0之間，或在沉淀孵育期間不斷將溶液的pH維持在6.9或約6.9的pH。在另一實施方案中，通過噴霧，而非通過液態(tài)添加法添加沉淀醇和用于調(diào)節(jié)PH的溶液。在另一實施方案中，在添加沉淀醇之后立即或期間，通過噴霧添加醇和pH調(diào)節(jié)劑的任一種或兩種將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于6.7-7.1或約6.7-7.1之間，或為6.9或約6.9。在一個實施方案中，在沉淀孵育期間通過噴霧，而非通過液態(tài)添加法添加沉淀醇和/或用于調(diào)節(jié)PH的溶液不斷調(diào)節(jié)pH，將溶液的pH維持在介于6.7-7.1或約6.7-7.1之間，或為6.9或約6.9。在另一特殊實施方案中，在介于-7V至_9°C或約-7V至約_9°C之間，或為-7V或約-7 V的溫度和介于23%-27%或約23%-27%之 間，或為25%或約25%的醇濃度下進行沉淀步驟。在一個實施方案中，在為_7°C或約-7°C的溫度下用通過噴霧添加的25%或約25%乙醇進行沉淀，其中在添加沉淀醇之后將溶液的PH調(diào)節(jié)至6.9或約6.9。在又一實施方案中，在整個沉淀孵育或維持時間將溶液的pH維持在6.9或約6.9。4.1gG 途徑a)萃取成分II+III沉淀物為了使成分II+III沉淀物的Ialp、因子H和IgG內(nèi)容物溶解，使用冷萃取緩沖液使成分II+III沉淀物再懸浮，典型比例為或約為I份沉淀物:約15份萃取緩沖液。另一方面，使用冷萃取緩沖液使成分II+III沉淀物再懸浮，典型比例為或約為I份沉淀物:約20份萃取緩沖液。可使用其它適合再懸浮比例，例如介于(或約)1:4與1:40之間，或介于(或約)1:8與1:30之間，或介于(或約)1:10與1:20之間，或介于(或約)1:12與1:18之間，或介于(或約)1:13與1:17之間，或介于(或約)1:14與1:16之間的范圍。在某些實施方案中，再懸浮比例可為(或約)1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40 或更高。在一個優(yōu)選實施方案中，按I份沉淀物:15份萃取緩沖液或約I份沉淀物:15份萃取緩沖液的比例使成分II+III糊劑再懸浮。在另一優(yōu)選實施方案中，按I份沉淀物:20份萃取緩沖液或約I份沉淀物:20份萃取緩沖液的比例使成分II+III糊劑再懸浮。用于萃取II+III沉淀物的適合溶液通常pH介于4.0-5.5或約4.0-5.5之間。在某些實施方案中，溶液的PH介于4.3-4.7或約4.3-4.7之間，在其它實施方案中，萃取溶液的 pH 為或約為 4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4 或5.5。在一個優(yōu)選實施方案中，萃取緩沖液的pH將為4.3或約4.3。在另一優(yōu)選實施方案中，萃取緩沖液的PH將為4.5或約4.5。在另一優(yōu)選實施方案中，萃取緩沖液的pH將為4.7或約4.7。通常，可使用選自(例如)醋酸鹽、檸檬酸鹽、一堿式磷酸鹽、二堿式磷酸鹽、其混合物等的緩沖劑滿足這些PH要求。適合緩沖液濃度范圍通常為約2.5至約IOOmM,或約
5至約 50mM,或約 2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或IOOmM緩沖劑。萃取緩沖液的導(dǎo)電率將優(yōu)選為介于0.5mS *cm-l至2.0mS *cm-l或約0.5mS *cm-l至2.0mS.cm-1之間。例如，在某些實施方案中，萃取緩沖液的導(dǎo)電率將為(或約)0.5mS.cm-1,或(或約)0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1、1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8、
1.9或(或約)2.0mS -Cm-10本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將知道如何產(chǎn)生具有適當(dāng)導(dǎo)電率的萃取緩沖液。在一個特殊實施方案中，示例性萃取緩沖液可含有5mM或約5mM磷酸二氫鈉和5mM或約5mM醋酸鹽，pH為4.5±0.2或約4.5±0.2并且導(dǎo)電率為0.7-0.9mS/cm或約
0.7-0.9mS/cm。通常，在0° C_20° C 或約 0° C_20° C之間，優(yōu)選在 2° C_8° C或約 2° C_8° C之間進行萃取。在某些實施方案中，可在(或約)0°〇、11:、21:、31:、41:、51:、61:、71:、81:、9°C、10°C、11°C、12°C、13°C、14°C、15°C、16°C、17°C、18°C、19°C或 20°C下進行萃取。在一個特殊實施方案中，在2° C-1O0 C或約2° C-1O0 C之間進行萃取。通常，在不斷攪拌下進行萃取過程，直至使II+III糊劑的所有可溶性組分進入溶液。在某些實施方案中，在不斷攪拌懸浮液的同時，萃取將進行60-300min或約60_300min，或120_240min或約120_240min，或150-210min或約150_210min。在某些實施方案中，萃取過程將進行(或約)60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或(或約)300min。在一個優(yōu)選實施方案中，在不斷攪拌下萃取過程將進行至少60mino
在一個實施方案中，萃取緩沖液將含有5mM或約5mM磷酸二氫鈉、5mM或約5mM醋酸鹽和0.051%-0.06%或約0.051%-0.06%冰醋酸(v/v)。在一個優(yōu)選實施方案中，在
4.5 ± 0.2或約4.5 ± 0.2的pH下，以1:15或約1:15的糊劑:緩沖液比例萃取成分II+III沉淀物。在一個實施方案中，在萃取過程持續(xù)期間維持溶液的pH。在一個實施方案中，在萃取過程持續(xù)期間將溶液的PH維持在介于4.1-4.9或約4.1-4.9之間。在一個優(yōu)選實施方案中，在萃取過程持續(xù)期間將溶液的pH維持在介于4.2-4.8或約4.2-4.8之間。在一個更優(yōu)選實施方案中，在萃取過程持續(xù)期間將溶液的PH維持在介于4.3-4.7或約4.3-4.7之間。在另一優(yōu)選實施方案中，在萃取過程持續(xù)期間將溶液的PH維持在介于4.4-4.6或約
4.4-4.6之間。在又一優(yōu)選實施方案中，在萃取過程持續(xù)期間將溶液的pH維持在4.5或約
4.5。b)預(yù)處理和回收來自II+III懸浮液的IaIp有利的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用二氧化硅細(xì)粉(SiO2)預(yù)處理溶解的成分II+III沉淀物使雜質(zhì)從IgG生產(chǎn)過程中顯著減少，例如脂質(zhì)、纖維蛋白原、水解酰胺活性、前激肽釋放酶活性和脂蛋白。出乎意料地，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，成分II+III懸浮液中存在的大部分IaIp被吸至成分Π+ΙΙΙ濾餅中。例如，實施例1證明在二氧化硅處理后，在成分II+III沉淀物和濾餅中可檢測到IaI和Pal，但是在澄清的成分II+III懸浮液中不存在(圖3)。此外，實施例2證明在二氧化硅處理后IaIp并未不可逆性丟失并且可從成分II+III濾餅中萃取。
因此,在一個實施方案中，用二氧化娃細(xì)粉(例如，Aerosilx )處理成分II+III懸浮液后，從成分II+III濾餅萃取Ialp。在某些實施方案中，將用每克懸浮成分II+III沉淀物介于5mg_100mg或約5mg-100mg之間的二氧化硅細(xì)粉處理已經(jīng)用適合溶解緩沖液萃取的成分II+III沉淀物。在一個優(yōu)選實施方案中，將用每克懸浮成分II+III沉淀物介于20mg-80mg或約20mg-80mg之間的二氧化硅細(xì)粉處理成分II+III懸浮液。在一個更優(yōu)選實施方案中，將用每克懸浮成分II+III沉淀物介于40mg-60mg或約40mg-60mg之間的二氧化娃細(xì)粉處理成分II+III懸浮液。在另一優(yōu)選實施方案中，將用每克懸浮成分II+III沉淀物50mg或約50mg的二氧化硅細(xì)粉處理成分II+III懸浮液。在某些實施方案中，按介于20g/kg II+III糊劑至100g/kgII+III糊劑或約20g/kg II+III糊劑至100g/kg II+III糊劑之間的濃度添加二氧化硅細(xì)粉(即，對于按1:15的比例萃取的成分II+III沉淀物而言，應(yīng)按介于20g/16kg II+III懸浮液至 100g/16kg II+III 懸浮液或約 20g/16kg II+III 懸浮液至 100g/16kg II+III 懸浮液之間的濃度，或按介于 0.125%(w/w)-0.625%(w/w)或約 0.125%(w/w)-0.625%(w/w)之間的最終濃度添加二氧化硅細(xì)粉)。在某些實施方案中，可按5g/kg II+III糊劑或約5g/kgII+III 糊劑，或(或約)10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或100g/kg II+III糊劑的濃度添加二氧化硅細(xì)粉。在一個具體實施方案中，向成分II+III懸浮液添加二氧化硅細(xì)粉至最終濃度為40g/16kg II+III懸浮液或約40g/16kg II+III懸浮液。在一個優(yōu)選實施方案中，所用二氧化硅細(xì)粉為Aerosil 380或其同等物。通常在O。C_20° C 或約 O。C_20° C 之間，優(yōu)選在 2° C~8° C 或約 2° C~8° C之間進行二氧化硅細(xì)粉處理。在某些實施方案中，可在(或約)(TC、I °C、2°C、3°C、4°C、5°C、
6°C、7 °C、8 °C、9 °C、10 °C、11 °C、12 °C、13 °C、14 °C、15 °C、16 °C、17 °C、18 °C、19 °C 或 20 °C 下進行處理。通常，成分II+III懸浮液將與二氧化硅細(xì)粉一起攪拌至少15min。在某些實施方案中，成分Π+ΙΙΙ懸浮液將與二氧化硅細(xì)粉一起攪拌至少10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110min，或至少1、2、3、4、5、6小時或更多小時。在一個優(yōu)選實施方案中，成分II+III懸浮液將與二氧化硅細(xì)粉一起攪拌30-60min或約30_60min。在另一優(yōu)選實施方案中，成分Π+ΙΙΙ懸浮液將與二氧化硅細(xì)粉一起攪拌至少30min。在某些實施方案中，將添加助濾劑，例如Celpure C300 (Celpure)或Hyflo-Supper-Cel (World Minerals)，以促進深層過濾?？砂醇s 0.lkg/kg 成分 II+III 沉淀物至約0.7kg/kg成分II+III沉淀物，或約0.2kg/kg成分II+III沉淀物至約0.6kg/kg成分II+III沉淀物，或約0.3kg/kg成分II+III沉淀物至約0.5kg/kg成分II+III沉淀物的最終濃度添加助濾劑。在某些實施方案中，將按約0.lkg/kg成分II+III沉淀物，或約
0.2,0.3,0.4,0.5,0.6或0.7kg/kg成分II+III沉淀物的最終濃度添加助濾劑。為了在二氧化硅處理后去除成分II+III沉淀物的未溶解和吸附成分(即，成分II+III濾餅)，通常使用深層過濾法過濾懸浮液?？捎糜诒疚奶峁┑姆椒ǖ纳顚舆^濾器包括金屬、玻璃、陶瓷、有機(例如硅藻土)深層過濾器等。適合過濾器的實例包括但不限于Cuno 50SA、Cuno 90SA和Cuno VR06過濾器(Cuno)?？蛇x地，可通過離心，而非過濾進行分離步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，通過置于壓濾機內(nèi)的深層過濾器過濾經(jīng)二氧化硅細(xì)粉處理的成分II+III糊劑懸浮液。5.白蛋白途徑
a)第三沉淀步驟-成分IV-1沉淀為了從成分II+III上清液中回收Ialp，通常使溶液冷卻至介于-1° C -9° C或約-1° C -9° C之間，將pH調(diào)節(jié)至5.0-5.5或約5.0-5.5，并且將醇濃度調(diào)節(jié)至18%-25%(v/v)或約18%-25%(v/v)。然后將溶液維持在介于_1°C _9°C或約_1°C _9°C之間至少4h或約4h以允許完全沉淀。在一個優(yōu)選實施方案中，在整個沉淀過程中將溶液的溫度維持在介于_3°C _7°C或約_3°C _7°C之間。在另一優(yōu)選實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至5.2-5.3或約5.2-5.3。在又一優(yōu)選實施方案中，將醇濃度調(diào)節(jié)至20%±1%(ν/ν)或約20%±1% (v/v)。在一個優(yōu)選實施方案中，使沉淀進行至少8h或約8h。在一個實施方案中，通過使溶液冷卻至介于-3 V -7 V或約-3 V -7 °C之間，將溶液的pH調(diào)節(jié)至5.2-5.3或約5.2-5.3，將醇濃度調(diào)節(jié)至20%± 1%(ν/ν)或約20%± 1%(ν/V)，并且維持溶液的溫度至少8h或約8h形成成分IV-1沉淀物。然后通過適合方法，例如離心或過濾分離成分IV-1上清液和沉淀物。在一個優(yōu)選實施方案中，在分離過程中將成分IV-1上清液的溫度維持在介于-l°c -7°c或約-1°C -7°C之間。當(dāng)使用過濾分離沉淀物和上清液時，優(yōu)選在過濾之前添加助濾劑(例如，Celpure 300、Celite 501、Celite 505 或同等助劑)。與形成成分IV-1沉淀物的常規(guī)方法(Cohn等，見上文)相比，在幾個實施方案中，本發(fā)明提供了引起血液因子產(chǎn)量提高的方法。在一個實施方案中，以使醇在添加時細(xì)微分散或迅速分散的方式添加沉淀醇。在一個實施方案中，通過噴霧添加醇。在第二實施方案中，從攪拌裝置(例如，螺旋槳)的下方或直接與之相鄰添加醇。在另一實施方案中，以使pH調(diào)節(jié)劑在添加時細(xì)微分散或迅速分散的方式添加一種或多種PH調(diào)節(jié)劑。在一個實施方案中，通過噴霧添加pH調(diào)節(jié)劑。在第二實施方案中，從攪拌裝置(例如，螺旋槳)的下方或直接與之相鄰添加PH調(diào)節(jié)劑。在第三實施方案中，通過將固體PH調(diào)節(jié)劑撒在離域區(qū)上添加pH調(diào)節(jié)劑。

在又一實施方案中，以使pH調(diào)節(jié)劑在添加時細(xì)微分散或迅速分散的方式添加沉淀醇和用于調(diào)節(jié)PH的溶液。在一個實施方案中，通過噴霧，而非通過液態(tài)添加法添加沉淀醇和用于調(diào)節(jié)PH的溶液。在又一實施方案中，在添加醇之后調(diào)節(jié)溶液的pH。在一個相關(guān)實施方案中，在添加醇期間調(diào)節(jié)溶液的pH。在一個實施方案中，在沉淀維持或孵育期間通過不斷調(diào)節(jié)溶液的pH將溶液的PH維持在所需pH。在一個優(yōu)選實施方案中，所述醇為乙醇。在某些實施方案中，在調(diào)節(jié)沉淀醇濃度之后立即或期間將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于
5.2-5.3或約5.2-5.3之間。在另一實施方案中，通過在沉淀孵育期間不斷將溶液的pH維持在介于5.2-5.3或約5.2-5.3之間實現(xiàn)工藝改進。在其它實施方案中，在調(diào)節(jié)沉淀醇濃度之后立即或期間將溶液的PH調(diào)節(jié)至介于5.2-5.3或約5.2-5.3之間，或在調(diào)節(jié)沉淀醇濃度之后立即或期間將溶液的pH調(diào)節(jié)至(或約)4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3、
5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9,6.0或更高的pH。在一個特殊實施方案中，在調(diào)節(jié)沉淀醇濃度之后立即或期間將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于5.2-5.3或約5.2-5.3之間。在某些實施方案中，在調(diào)節(jié)沉淀醇濃度期間不斷將溶液的PH維持在介于5.2-5.3或約5.2-5.3之間。在一個實施方案中，在沉淀維持或孵育期間通過不斷調(diào)節(jié)溶液的PH將pH維持在所需pH。在一個實施方案中，所述醇為乙醇。
b)替代性白蛋白途徑-成分I+II+III沉淀可選地，可由不同血漿成分，例如成分I+II+III上清液形成成分IV-1沉淀物。通常，通過將cryo-poor血衆(zhòng)成分的pH調(diào)節(jié)至介于6.5-7.5或約6.5-7.5之間,將所述成分的溫度調(diào)節(jié)至介于-1° C -9° C或約-1° C -9° C之間，并添加醇至介于15%-25%(v/v)或約15%-25%(v/v)之間的最終濃度進行成分I+II+III沉淀。在一個優(yōu)選實施方案中，將cryo-poor血衆(zhòng)成分的pH調(diào)節(jié)至介于6.7-7.1或約6.7-7.1之間，或6.9 ±0.2。在另一優(yōu)選實施方案中，將血漿成分的溫度調(diào)節(jié)至介于-3° C -7° C或約-3° C -7° C之間。在又一優(yōu)選實施方案中，添加醇(優(yōu)選為乙醇)至介于20%-25%(v/v)或約20%-25%(v/v)之間的最終濃度。在一個特殊實施方案中，添加醇(優(yōu)選為乙醇)至20% (v/v)或約20%(v/V)的最終濃度。在一個實施方案中，在混合溶液的同時，使沉淀進行至少2h或約2h，或至少(或約)4、6、8、10或12h。在一個優(yōu)選實施方案中，混合溶液2h或約2h，檢查溶液的pH并且如有需要進行調(diào)節(jié)，并且在調(diào)節(jié)PH后使沉淀進行至少IOh或約10h。在一個優(yōu)選實施方案中，通過將cryo-poor血衆(zhòng)成分的pH調(diào)節(jié)至介于6.7-7.1或約6.7-7.1之間，將所述成分的溫度調(diào)節(jié)至介于-3° C -7° C或約-3° C -7° C之間，并添加醇至介于20%-25%(v/v)或約20%-25%(v/v)之間的最終濃度進行成分I+II+III沉淀。然后通過適合方法，例如離心或過濾分離成分I+II+III上清液和沉淀物。當(dāng)使用過濾分離沉淀物和上清液時，優(yōu)選在過濾之前添加助濾劑(例如，Celpure 300、Celite501、Celite 505或同等助劑)。然后加工回收的成分I+II+III上清液以(例如)通過成分IV-1沉淀回收Ialp。與形成成分I+II+III沉淀物的常規(guī)方法(Newman等，J Biol Chem.(1955年)11月；217(1):31-41)相比，在幾個實施方案中，本發(fā)明提供了引起血液因子產(chǎn)量提高的方法。在一個實施方案中，以使醇在添加時細(xì)微分散 或迅速分散的方式添加沉淀醇。在一個實施方案中，通過噴霧添加醇。在第二實施方案中，從攪拌裝置(例如，螺旋槳)的下方或直接與之相鄰添加醇。在另一實施方案中，以使pH調(diào)節(jié)劑在添加時細(xì)微分散或迅速分散的方式添加一種或多種PH調(diào)節(jié)劑。在一個實施方案中，通過噴霧添加pH調(diào)節(jié)劑。在第二實施方案中，從攪拌裝置(例如，螺旋槳)的下方或直接與之相鄰添加PH調(diào)節(jié)劑。在第三實施方案中，通過將固體PH調(diào)節(jié)劑撒在離域區(qū)上添加pH調(diào)節(jié)劑。在又一實施方案中，以使pH調(diào)節(jié)劑在添加時細(xì)微分散或迅速分散的方式添加沉淀醇和用于調(diào)節(jié)PH的溶液。在一個實施方案中，通過噴霧，而非通過液態(tài)添加法添加沉淀醇和用于調(diào)節(jié)PH的溶液。在又一實施方案中，在添加醇之后調(diào)節(jié)溶液的pH。在一個相關(guān)實施方案中，在添加醇期間調(diào)節(jié)溶液的pH。在一個實施方案中，在沉淀維持或孵育期間通過不斷調(diào)節(jié)溶液的pH將溶液的PH維持在所需pH。在一個優(yōu)選實施方案中，所述醇為乙醇。在某些實施方案中，在添加沉淀醇之后將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于6.5-7.5或約
6.5-7.5之間。在其它實施方案中，在添加沉淀醇之后將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于6.7-7.1或約
6.7-7.1之間。在另外其它實施方案中，在添加沉淀醇之后將溶液的pH調(diào)節(jié)至(或約)6.5或(或約)6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4或7.5。在一個特殊實施方案中，在添加沉淀醇之后將溶液的PH調(diào)節(jié)至6.9或約6.9。同樣，在某些實施方案中，與在添加沉淀醇之前而不是之后調(diào)節(jié)溶液的PH的類似沉淀步驟相比，在沉淀物成分中由于蛋白質(zhì)變性，不可逆性丟失的血液因子的量減少。在一個實施方案中，在沉淀維持或孵育期間通過不斷調(diào)節(jié)溶液的PH將pH維持在所需pH。在一個優(yōu)選實施方案中，所述醇為乙醇。6.萃取 IaIp可通過按介于1:1至1:40或約1:1至1:40之間的比例(沉淀物份數(shù):萃取緩沖液份數(shù))添加可用于使沉淀物或濾餅再懸浮的IaIp萃取緩沖液，從適合血漿分離沉淀物，例如上述成分1、成分II+III和成分IV-1沉淀物、Kistler和Nischmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅中萃取Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，通過按介于1:20-1:30或約1:20-1:30之間的比例添加萃取緩沖液萃取Ialp。例如，在一個優(yōu)選實施方案中，通過按1:20或約1:20的比例添加萃取緩沖液萃取Ialp。在第二優(yōu)選實施方案中，通過按1:25或約1:25的比例添加萃取緩沖液萃取Ialp。在第三優(yōu)選實施方案中，通過按1:30或約1:30的比例添加萃取緩沖液萃取Ialp。可使用其它適合再懸浮比例，例如(或約)1:1或1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:28、1:39、1:40 或更高。在一個實施方案中，可通過使沉淀物或濾餅再懸浮于萃取緩沖液中從沉淀物或濾餅萃取Ialp。在某些實施方案中，例如按1:25或約1:25或1:30或約1:30，使沉淀物或濾餅再懸浮于一定體積的萃取緩沖液中，并且攪拌懸浮液足夠長的時間，以使沉淀物或濾餅的IaIp內(nèi)容物溶解。在另一實施方案中，可通過使IaIp萃取緩沖液循環(huán)通過沉淀物或濾餅或顆粒從沉淀物或濾餅萃取Ialp。在通過于壓濾機中過濾從上清液分離沉淀物或濾餅的一個優(yōu)選實施方案中，使萃取緩沖液再循環(huán)通過壓濾機足以從沉淀物中萃取IaIp的時間。例如，在一個實施方案中`，按I份沉淀物:30份萃取緩沖液的比例使用IaIp萃取緩沖液再懸浮或再循環(huán)通過成分I沉淀物(例如，成分I濾餅或離心顆粒)。可使用其它適合再懸浮比例，例如約 1:1，或 1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:28、1:39、1:40 等。在一個優(yōu)選實施方案中，在萃取過程中成分I濾餅將留在用于從上清液中過濾沉淀物的壓濾機中。在另一實施方案中，按I份沉淀物:30份萃取緩沖液的比例使用IaIp萃取緩沖液再懸浮或再循環(huán)通過成分II+III沉淀物(例如，成分II+III沉淀物濾餅或離心顆粒)。可使用其它適合再懸浮比例，例如約1:1，或1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:28、1:39、1:40 等。在一個優(yōu)選實施方案中，在萃取過程中成分II+III濾餅將留在用于從上清液中過濾沉淀物的壓濾機中。在另一實施方案中，按I份沉淀物:30份萃取緩沖液的比例使用IaIp萃取緩沖液再懸浮或再循環(huán)通過成分II+III懸浮液濾餅?？墒褂闷渌m合再懸浮比例，例如約1:1，或1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:28、1:39、1:40等。在一個優(yōu)選實施方案中，在萃取過程中成分II+III濾餅將留在用于從上清液中過濾沉淀物的壓濾機中。在另一實施方案中，按I份沉淀物:30份萃取緩沖液的比例使用IaIp萃取緩沖液再懸浮或再循環(huán)通過成分IV-1沉淀物(例如，成分IV-1沉淀物濾餅或離心顆粒)?？墒褂闷渌m合再懸浮比例，例如約 1:1，或1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:28、1:39、1:40 等。在一個優(yōu)選實施方案中，在萃取過程中成分IV-1濾餅將留在用于從上清液中過濾沉淀物的壓濾機中。在另一實施方案中，按I份沉淀物:30份萃取緩沖液的比例使用IaIp萃取緩沖液再懸浮或再循環(huán)通過Kistler和Nischmann沉淀物A沉淀物(例如，沉淀物A沉淀物濾餅或離心顆粒)。可使用其它適合再懸浮比例，例如約1:1，或1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:28、1:39、1:40等。在一個優(yōu)選實施方案中，在萃取過程中沉淀物A濾餅將留在用于從上清液中過濾沉淀物的壓濾機中。在另一實施方案中，按I份沉淀物:30份萃取緩沖液的比例使用IaIp萃取緩沖液再懸浮或再循環(huán)通過Kistler和Nischmann沉淀物B沉淀物(例如，沉淀物B沉淀物濾餅或離心顆粒)。可使用其它適合再懸浮比例，例如約1:1，或1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:28、1:39、1:40等。在一個優(yōu)選實施方案中，在萃取過程中沉淀物B濾餅將留在用于從上清液中過濾沉淀物的壓濾機中。在一個優(yōu)選實施 方案中，從濾餅或沉淀劑萃取IaIp的步驟包括使IaIp萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有IaIp濾餅或沉淀劑的壓濾機。在一個實施方案中，從濾餅或沉淀劑萃取IaIp的步驟包括使IaIp萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有IaIp濾餅的壓濾機至少lOmin。在其它實施方案中，從濾餅或沉淀劑萃取IaIp的步驟包括使IaIp萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有IaIp濾餅的壓濾機至少10-60min或約10_60min。在一個優(yōu)選實施方案中，從濾餅或沉淀劑萃取IaIp的步驟包括使IaIp萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有IaIp濾餅的壓濾機至少20-40min或約20_40min。在另外其它實施方案中，從濾餅或沉淀劑萃取IaIp的步驟包括使IaIp萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有IaIp濾餅的壓濾機至少(或約)lOmin，或至少(或約)15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 或 90min 或更長時間(例如，至少(或約)2、3、4、5 或 6h)。通常，在0° C_20° C 或約 0° C~20° C之間，優(yōu)選在 2° C_8° C或約 2° C_8° C之間進行萃取。在某些實施方案中，可在(或約)0°〇、11:、21:、31:、41:、51:、61:、71:、81:、9°C、10°C、11°C、12°C、13°C、14V、15°C、16°C、17°C、18°C、19°C或 20°C下進行萃取。在一個特殊實施方案中，在2° C-1O0 C或約2° C-1O0 C之間進行萃取。任何適合緩沖液均可用于從沉淀物或濾餅萃取Ialp。典型萃取緩沖液將至少含有緩沖劑和鹽。在某些實施方案中，萃取緩沖液將含有介于10-250mM或約10_250mM之間的緩沖劑。在某些實施方案中，緩沖劑將以(或約)10mM，或20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250mM 或更高緩沖劑濃度存在。在某些實施方案中，萃取緩沖液的離子強度將介于5-lOOmS/cm或約5-lOOmS/cm之間。在一個具體實施方案中，萃取緩沖液將含有介于50-500mM或約50-500mM之間的鹽。在某些實施方案中，鹽將以(或約)50mM，或(或約)75、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500mM或更高鹽濃度存在。IaIp萃取緩沖液的pH通常將介于6.0-9.0或約6.0-9.0之間。在某些實施方案中，因子H萃取緩沖液的pH將為(或約)6.0，或(或約)6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6、
6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、
8.6,8.7,8.8,8.9或9.0。在一個優(yōu)選實施方案中，IaIp緩沖液的pH將介于7.0-8.0或約
7.0-8.0之間。在一個具體實施方案中，萃取緩沖液的pH將為7.0或約7.0。在另一具體實施方案中，萃取緩沖液的PH將為7.5或約7.5。在另一具體實施方案中，萃取緩沖液的pH將為8.0或約8.0?？捎糜谂渲艻aIp萃取緩沖液的緩沖劑的非限制性實例包括磷酸鉀、磷酸鈉、醋酸鈉、檸檬酸鈉、醋酸銨、二甲基胂酸、咪唑、硼酸、N-二(羥乙基)甘氨酸(bicine)、ACES、BES, BIS-Tris、BIS-Tris-丙烷、CAPS、CHES、甘氨酰胺、雙甘氨肽、MES、MOPS、PIPES、HEPES、TAPS、TES、三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)、三乙醇胺和Tris。在一個優(yōu)選實施方案中，IaIp萃取緩沖液將包括或由25mM Tris (pH8.0)、5mMEDTA、200mM NaCl組成。在一個更優(yōu)選的實施方案中，IaIp萃取緩沖液將包括或由IOOmM磷酸鈉(pH 7.5)、150mM氯化鈉組成。7.第四沉淀步驟-去除雜質(zhì)在一個實施方案中，所述方法進一步包括使雜質(zhì)從富含IaIp的組合物中沉淀以形成沉淀物(本文稱為“Ialp沉淀物4”)和上清液(本文稱為“Ialp上清液4”)。在某些實施方案中，這個步驟包括使至少一種雜質(zhì)，例如脂質(zhì)或蛋白質(zhì)從組合物中沉淀，然后將沉淀物與含有IaIp的上清液分離開。適合使雜質(zhì)從血漿源性成分中沉淀的沉淀劑在本領(lǐng)域中眾所周知并且包括但不限于醇(例如，乙醇、甲醇等)、水溶性聚合物(例如，PEG、葡聚糖等)、鹽(例如，磷酸銨、硫酸銨、檸檬酸鈉等)、短鏈脂肪酸(例如，己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸等)等。在某些實施方案中，可通過使溶液的PH與目標(biāo)組分的等電點匹配促進沉淀，SP，等電點沉淀。在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法包括在介于7.0-9.0或約7.0-9.0之間的pH下，用介于10%-20%或約10%-20%之間的乙醇使至少一種雜質(zhì)從富含IaIp的組合物中沉淀的步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法包括在介于7.3-8.7或約7.3-8.7之間的pH下，用介于12%-18%或約12%-18%之間的乙醇使至少一種雜質(zhì)從富含IaIp的組合物中沉淀的步驟。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括在介于7.5-8.5或約7.5-8.5之間的pH下，用介于14%-16%或約14%-16%之間的乙醇使至少一種雜質(zhì)從富含IaIp的組合物中沉淀的步驟。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述 方法包括在介于7.8-8.2或約7.8-8.2之間的pH下，用介于14%-16%或約14%-16%之間的乙醇使至少一種雜質(zhì)從富含IaIp的組合物中沉淀的步驟。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括在8.0或約8.0的pH下，用15%或約15%的乙醇使至少一種雜質(zhì)從富含IaIp的組合物中沉淀的步驟。
可調(diào)節(jié)沉淀劑(例如，乙醇)的濃度以使一種或多種雜質(zhì)的沉淀增加到最大限度和/或使因子H的沉淀減到最少。在某些實施方案中，可通過添加(或約)10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%乙醇進行沉淀。在一個優(yōu)選實施方案中，可通過添加介于12%-18%或約12%-18%之間的乙醇進行沉淀。在一個更優(yōu)選的實施方案中，可用介于13%-17%或約13%-17%之間的乙醇進行沉淀。在一個更優(yōu)選的實施方案中，可用介于14%-16%或約14%-16%之間的乙醇進行沉淀。在一個最優(yōu)選的實施方案中，可用15%或約15%的乙醇進行沉淀?？烧{(diào)節(jié)溶液的pH以使一種或多種雜質(zhì)的沉淀增加到最大限度和/或使IaIp的沉淀減到最少。在某些實施方案中，將溶液的PH調(diào)節(jié)至(或約)7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、
7.6,7.7,7.8,7.9,8.0,8.1,8.2,8.3,8.4,8.5,8.6,8.7,8.8,8.9 或 9.0。在一個優(yōu)選實施方案中，將溶液的PH調(diào)節(jié)至介于7.2-8.8或約7.2-8.8之間。在另一優(yōu)選實施方案中，將溶液的PH調(diào)節(jié)至介于7.3-8.7或約7.3-8.7之間。在另一優(yōu)選實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于7.4-8.6或約7.4-8.6之間。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于7.5-8.5或約7.5-8.5之間。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于
7.6-8.4或約7.6-8.4之間。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于7.7-8.3或約7.7-8.3之間。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于7.8-8.2或約
7.8-8.2之間。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于7.9-8.1或約7.9-8.1之間。在一個最優(yōu)選的·實施方案中，將溶液的PH調(diào)節(jié)至8.0或約8.0。8.第五沉淀步驟-1aIp沉淀在一個實施方案中，在從成分I沉淀物、成分II+III沉淀物、成分IV-1沉淀物、沉淀物A沉淀物、沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅萃取之后，可通過使IaIp從富集組合物中沉淀出來以形成沉淀物(本文稱為“Ialp沉淀物5”)和上清液(本文稱為“Ialp上清液5”)來進一步純化富含IaIp的組合物。在某些實施方案中，可使富含IaIp的組合物進行如上所述的第三沉淀步驟，以從如上所述的組合物中去除至少一種雜質(zhì)，然后進行第四沉淀步驟以沉淀并回收Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，使IaIp從富集組合物中沉淀包括在介于5.0-7.0或約5.0-7.0之間的pH下，添加介于20%-30%或約20%_30%之間的乙醇。在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法包括在介于5.5-6.5或約5.5-6.5之間的pH下，用介于22%_28%或約22%-28%之間的乙醇使IaIp沉淀的步驟。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括在介于5.8-6.2或約5.8-6.2之間的pH下，用介于24%_26%或約24%_26%之間的乙醇使IaIp沉淀的步驟。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括在6.0或約6.0的pH下，用介于25%或約25%的乙醇使IaIp沉淀的步驟?？烧{(diào)節(jié)沉淀劑(例如，乙醇)的濃度以使IaIp的沉淀增加到最大限度和/或使一種或多種雜質(zhì)的沉淀減到最少。在某些實施方案中，可通過添加(或約)20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%乙醇進行沉淀。在一個優(yōu)選實施方案中，可通過添加介于22%-28%或約22%-28%之間的乙醇進行沉淀。在一個更優(yōu)選的實施方案中，可用介于23%-27%或約23%-27%之間的乙醇進行沉淀。在一個更優(yōu)選的實施方案中，可用介于24%-26%或約24%-26%之間的乙醇進行沉淀。在一個最優(yōu)選的實施方案中，可用25%或約25%的乙醇進行沉淀。
可調(diào)節(jié)溶液的pH以使IaIp的沉淀增加到最大限度和/或使一種或多種雜質(zhì)的沉淀減到最少。在某些實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至(或約)5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6,5.7,5.8,5.9,6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9 或 7.0。在一個優(yōu)選實施方案中，將溶液的PH調(diào)節(jié)至介于5.2-6.8或約5.2-6.8之間。在另一優(yōu)選實施方案中，將溶液的PH調(diào)節(jié)至介于5.3-6.7或約5.3-6.7之間。在另一優(yōu)選實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于5.4-6.6或約5.4-6.6之間。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于5.5-6.5或約5.5-6.5之間。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于
5.6-6.4或約5.6-6.4之間。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于5.7-6.3或約5.7-6.3之間。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于5.8-6.2或約
5.8-6.2之間。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將溶液的pH調(diào)節(jié)至介于5.9-6.1或約5.9-6.1之間。在一個最優(yōu)選的實施方案中，將溶液的PH調(diào)節(jié)至6.0或約6.0。9.色譜法在某些實施方案中，用于制備富含IaIp的組合物的方法進一步包括至少一個，優(yōu)選兩個或更多個色譜步驟以進一步提高組合物的純度。通常，可采用任何適合色譜法以進一步富集從成分I沉淀物、成分II+III沉淀物、成分IV-1沉淀物、沉淀物A沉淀物、沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅萃取的IaIp組合物。在某些實施方案中，色譜步驟可包括陰離子交換色譜法(AEC)、陽離子交換色譜法(CEC)、肝素親和色譜法、疏水交換色譜法(HIC)、羥磷灰石色譜法(HAP)、免疫親和色譜法、尺寸排阻色譜法(即，凝膠過濾)或其它適合色譜步驟。可以批量或列模式進行色譜步驟在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法包括步驟:使IaIp與陰離子交換樹脂結(jié)合；用洗脫緩沖液從陰離子交換樹脂洗脫Ialp，從而形成含IaIp的第一洗脫液。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述方法進一步包括步驟:使來自陰離子交換洗脫液的IaIp與肝素親和樹脂結(jié)合；并且用洗脫緩沖液從肝素親和樹脂洗脫Ialp，從而形成含IaIp的第二洗脫液。在某些實施方案中，色譜法可進一步包括洗滌步驟以在洗脫IaIp之前從色譜樹脂中去除松散結(jié)合的雜質(zhì)。在某些實施方案中，可通過梯度洗脫(例如，用鹽梯度)或通過分步洗脫(例如，用離子強度遞增的緩沖液)從色譜樹脂中洗脫Ialp。通常，在使IaIp結(jié)合至色譜樹脂上之前將IaIp溶液的導(dǎo)電率調(diào)節(jié)至適當(dāng)離子強度。離子強度應(yīng)足夠低以促進IaIp與樹脂之間的相互作用，仍然足夠高以維持溶液中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。對溶液離子強度的要求將根據(jù)例如所用樹脂的特性(例如，與弱陰離子交換樹脂相比較強)和溶液的起始純度等因素變化?？刹捎酶鞣N方法降低IaIp組合物的離子強度，包括但不限于用離子強度低的溶液稀釋組合物，使IaIp從起始組合物中沉淀并且再懸浮于離子強度低的緩沖液中，超濾/滲濾、脫鹽和/或緩沖液交換色譜法、透析等。a)陰離子交換在本文提供的方法中可使用任何適合陰離子交換樹脂。適合使用的陰離子交換樹脂的非限制性實例包括二乙氨基乙基(DEAE)、季氨基乙基(QAE)和季銨(Q)樹脂。在一個優(yōu)選實施方案中，使用的陰離子交換樹脂為DEAE-瓊脂糖(二乙氨基乙基-瓊脂糖)。

在一個優(yōu)選實施方案中，在低離子強度上樣緩沖液的存在下，使IaIp與DEAE-瓊脂糖樹脂結(jié)合。通常，將用相同上樣緩沖液或離子強度與上樣緩沖液相似的相容緩沖液使柱平衡。在某些實施方案中，上樣和/或平衡緩沖液的離子強度將小于12mS/cm或約12mS/cm。在一個優(yōu)選實施方案中，上樣和/或平衡緩沖液的離子強度將小于10mS/cm或約IOmS/cm。在一個最優(yōu)選的實施方案中，上樣和/或平衡緩沖液的離子強度將為9mS/cm或約9mS/cm。在一個優(yōu)選實施方案中，上樣和/或平衡緩沖液的鹽濃度將小于IOOmM NaCl或約IOOmMNaCl，或相應(yīng)的離子強度小于IOOmM NaCl溶液的離子強度。在一個更優(yōu)選的實施方案中，上樣和/或平衡緩沖液的鹽濃度或相應(yīng)的離子強度將小于75mM NaCl或約75mM NaCl。在一個更優(yōu)選的實施方案中，鹽濃度或相應(yīng)離子強度將介于30-70mM NaCl或約30-70mM NaCl之間。在一個最優(yōu)選的實施方案中，鹽濃度或相應(yīng)離子強度將為50mM NaCl或約50mM NaCl。任選地，使IaIp結(jié)合之后，可用離子強度介于上樣緩沖液和洗脫緩沖液之間的一種或多種緩沖液洗滌陰離子交換樹脂。在某些實施方案中，洗滌緩沖液的離子強度可介于3mS/cm-20mS/cm或約3mS/cm-20mS/cm之間。在一個優(yōu)選實施方案中，洗漆緩沖液的離子強度可介于5mS/cm-20mS/cm或約5mS/cm-20mS/cm之間。在另一優(yōu)選實施方案中，洗漆緩沖液的離子強度可介于10mS/cm-20mS/cm或約10mS/cm-20mS/cm之間。在某些實施方案中，洗滌緩沖液的鹽濃度或相應(yīng)離子強度將介于30-200mM NaCl或約30_200mM NaCl之間。在一個優(yōu)選實施方案中，洗滌緩沖液的鹽濃度或相應(yīng)離子強度將介于70-200mM NaCl或約70-200mM NaCl之間。在某些實施方案中，洗滌緩沖液的鹽濃度或相應(yīng)離子強度將為(或約)30、35、40、45、50、55 、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210 或 220mM NaCl0在一個實施方案中，在從樹脂洗脫IaIp之前，將用離子強度足以從樹脂中洗脫因子H的第一緩沖液和離子強度足以從樹脂中洗脫雜質(zhì)(例如補體組分3(C3))的第二緩沖液洗滌陰離子交換樹脂。在另一實施方案中，在從樹脂洗脫IaIp之前，將至少用離子強度足以從樹脂中洗脫因子H和至少第二雜質(zhì)(例如，C3)的第一緩沖液洗滌陰離子交換樹脂-交換樹脂。在某些實施方案中，用具有適合離子強度以破壞樹脂和IaIp之間的相互作用的洗脫緩沖液從陰離子交換樹脂(例如，DEAE-瓊脂糖)洗脫Ialp。在一些實施方案中，洗脫緩沖液將不具有適合離子強度以破壞樹脂和以高于IaIp的親和力結(jié)合樹脂的污染物之間的相互作用。在某些實施方案中，洗脫緩沖液的離子強度將至少為18mS/cm或約ISmS/cm,優(yōu)選至少20mS/cm或約20mS/cm。在一個實施方案中，洗脫緩沖液的離子強度將至少為25mS/cm或約25mS/cm。在某些實施方案中，洗脫緩沖液的鹽濃度或相應(yīng)離子強度將至少為155mMNaCl或約155mM NaCl。在某些實施方案中，洗脫緩沖液的鹽濃度或相應(yīng)離子強度將至少為(或約)160mM NaCl，或至少為(或約)170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300 或更多 NaCl0b)肝素親和力在本文提供的方法中可使用任何適合肝素親和樹脂，例如，與肝素配體、肝素配體的衍生物或類似物或肝素樣配體(例如，硫酸化糖胺聚糖)偶聯(lián)的樹脂。在一個優(yōu)選實施方案中，使用的肝素親和樹脂為肝素-瓊脂糖。在一個實施方案中，可通過肝素親和色譜法進一步純化Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，可通過肝素親和色譜法，例如肝素瓊脂糖樹脂進一步純化來自陰離子交換色譜法步驟的洗脫液的Ialp。在一個實施方案中，通過適合方法，例如稀釋、緩沖液交換、透析等降低IaIp洗脫液的離子強度，并且使IaIp與肝素親和樹脂結(jié)合。在某些實施方案中，將陰離子交換洗脫液的離子強度降低至小于lOmS/cm或約10mS/cm。在一個優(yōu)選實施方案中，將離子強度降低至小于8mS/cm或約8mS/cm。在另一實施方案中，將離子強度降低至小于6mS/cm或約6mS/cm。在某些實施方案中，將離子強度降低至小于(或約)4mS/cm，或小于(或約)5、6、7、8、9、10、11或12mS/cm。在某些實施方案中，將陰離子交換洗脫液的鹽濃度或相應(yīng)離子強度降低至小于80mM NaCl或約80mM NaCl。在一個優(yōu)選實施方案中，將鹽濃度或相應(yīng)離子強度降低至小于70mM NaCl或約70mM NaCl。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將鹽濃度或相應(yīng)離子強度降低至小于50mMNaCl或約50mM NaCl。在某些實施方案中，將鹽濃度或相應(yīng)離子強度降低至小于(或約)20mM NaCl，或小于(或約)25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80mM NaCl。任選地，使IaIp結(jié)合之后，可用離子強度介于上樣緩沖液和洗脫緩沖液之間的一種或多種緩沖液洗滌肝素親和樹脂。在某些實施方案中，洗滌緩沖液的離子強度可介于4mS/cm-1OmS/cm或約4mS/cm-10mS/cm之間。在一個優(yōu)選實施方案中，洗漆緩沖液的離子強度可介于6mS/cm-8mS/cm或約6mS/cm-8mS/cm之間。在某些實施方案中，洗漆緩沖液的鹽濃度或相應(yīng)離子強度將介于40-80mM NaCl或約40-80mM NaCl之間。在一個優(yōu)選實施方案中，洗滌緩沖液的鹽濃度或相應(yīng)離子強度將介于50-70mM NaCl或約50-70mM NaCl之間。在某些實施方案中，洗滌緩沖液的鹽濃度或相應(yīng)離子強度將為(或約)25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80mM NaCl。在某些實施方案中，用具有適合離子強度以破壞樹脂和IaIp之間的相互作用的洗脫緩沖液從肝素親和樹脂(例如，DEAE-瓊脂糖)洗脫Ialp。在一些實施方案中，洗脫緩沖液將不具有適合離子強度以破壞樹脂和以高于IaIp的親和力結(jié)合樹脂的污染物之間的相互作用。在某些實施方案中，洗脫緩沖液的離子強度將至少為8mS/cm或約8mS/cm，或至少為9mS/cm或約9mS/cm,或至少為10mS/cm或約10mS/cm。在某些實施方案中，洗脫緩沖液的鹽濃度或相應(yīng)離子強度將至少為80mM NaCl或約80mM NaCl。在另一實施方案中，洗脫緩沖液的鹽濃度或相應(yīng)離子強度將至少為IOOmM NaCl或約IOOmM NaCl。在某些實施方案中，洗脫緩沖液的鹽濃度或相應(yīng)離子強度將至少為(或約)70mM NaCl，或至少為(或約)75、80、85、90、95、100、105、1 10、120、130、140、150、160、170、180、190、200mM 或更多 NaCl0c)另外的樹脂在某些實施方案中，本文提供的用于純化血漿源性IaIp的方法可進一步包括使用附加色譜步驟，包括但不限于陽離子色譜法、羥磷灰石色譜法、疏水作用色譜法、免疫親和色譜法等。在本文提供的方法中可使用任何適合陽離子交換樹脂。適合使用的陽離子交換樹脂的非限制性實例包括羧甲基(CM)、磺丙基(SP)、甲磺酸酯(S)樹脂。在本文提供的方法中可使用任何適合羥磷灰石或其它基于鈣的樹脂。適合樹脂的非限制性實例包括羥磷灰石樹脂、氟磷灰石樹脂、氟羥磷灰石樹脂等。在本文提供的方法中可使用任何適合疏水作用色譜樹脂。適合樹脂的非限制性實例包括苯基樹脂、甲基樹脂、丁基樹脂、羊基樹脂等。在某些實施方案中，可通過免疫親和色譜法，例如用與抗體、適體或?qū)σ环N或多種IaIp蛋白(例如，IaI或PaI)有高度特異性的其它結(jié)合分子進一步純化Ialp。d)緩沖體系
在某些實施方案中，個別或全部色譜步驟將依賴于常用緩沖體系，其中僅鹽濃度在平衡、洗滌和洗脫緩沖液之間不同?？墒褂萌魏芜m合緩沖液，例如Tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液等。在一個實施方案中，上樣緩沖液的PH范圍將介于6.0-9.0或約
6.0-約9.0之間。在一個優(yōu)選實施方案中，緩沖體系的pH將介于7.0-9.0或約7.0-約9.0之間。在一個更優(yōu)選的實施方案中，緩沖體系的pH將介于7.5-8.5或約7.5-約8.5之間。在一個優(yōu)選實施方案中，緩沖體系的PH將為8.0或約8.0。10.病毒滅活和去除在某些實施方案中，本文提供的用于制備富含IaIp的組合物的方法將進一步包括至少I個，優(yōu)選至少2個，最優(yōu)選至少3個病毒滅活或去除步驟。可與本文提供的方法一起采用的病毒滅活或去除步驟的非限制性實例包括溶劑洗滌劑處理(HOTOWitZ等，Blood Coagul Fibrinolysis 1994(5 Suppl 3):S21-S28 和 Kreil 等，Transfusion2003(43):1023-1028, 二者均通過引用整體明確地并入本文用于所有目的)、納米過濾(Hamamoto 等，Vox Sangl989 (56) 230-236 和 Yuasa 等，J Gen Virol.1991 (72 (pt8)):2021-2024, 二者均通過引用整體明確地并入本文用于所有目的)和在高溫下低pH孵育(Kempf 等，Transfusion 1991 (31) 423-427 和 Louie 等，Biologicals 1994 (22): 13-19)。可對生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的任何中間IaIp成分進行病毒滅活或去除步驟。例如，在一個實施方案中，可對成分I上清液、成分II+III懸浮液、成分II+III濾餅萃取液、上清液3、沉淀物4懸浮液、成分II+III上清液、成分IV-1懸浮液、Kistler和Nitschmann沉淀物A懸浮液、Kistler和Nitschmann沉淀物B懸浮液、陰離子交換洗脫液、肝素親和洗脫液等進行病毒滅活或去除步驟。在一個實施方案中，對成分II+III濾餅萃取液進行病毒滅活或去除步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，使成分II+III濾餅萃取液進行溶劑和洗滌劑(S/D)處理。在第二個實 施方案中，對成分II+III上清液進行病毒滅活或去除步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，使成分II+III上清液進行溶劑和洗滌劑(S/D)處理。在第三個實施方案中，對成分IV-1懸浮液進行病毒滅活或去除步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，使成分IV-1懸浮液進行溶劑和洗滌劑(S/D)處理。在第四個實施方案中，對Kistler和Nitschmann沉淀物A懸浮液進行病毒滅活或去除步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，使Kistler和Nitschmann沉淀物A懸浮液進行溶劑和洗滌劑(S/D)處理。在第五個實施方案中，對Kistler和Nitschmann沉淀物B懸浮液進行病毒滅活或去除步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，使Kistler和Nitschmann沉淀物B懸浮液進行溶劑和洗滌劑(S/D)處理。在第六個實施方案中，對沉淀3上清液(上清液3)進行病毒滅活或去除步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，使沉淀3上清液進行溶劑和洗滌劑(S/D)處理。在第七個實施方案中，對沉淀物4懸浮液進行病毒滅活或去除步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，使沉淀物4懸浮液進行溶劑和洗滌劑(S/D)處理。在第八個實施方案中，對陰離子交換洗脫液進行病毒滅活或去除步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，使陰離子交換洗脫液進行溶劑和洗滌劑(S/D)處理。在另一優(yōu)選實施方案中，使陰離子交換洗脫液進行納米過濾。
在第九個實施方案中，對肝素親和洗脫液進行病毒滅活或去除步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，使肝素親和洗脫液進行溶劑和洗滌劑(S/D)處理。在另一優(yōu)選實施方案中，使肝素親和洗脫液進行納米過濾。在第十個實施方案中，對富含IaIp的本體溶液進行病毒滅活或去除步驟。在一個優(yōu)選實施方案中，使富含IaIp的本體溶液進行納米過濾。在另一優(yōu)選實施方案中，使富含IaIp的本體溶液進行在低pH和/或高溫下孵育。在第十一個實施方案中，熱處理凍干的IaIp組合物以滅活病毒。在一個實施方案中，提供的血漿源性IaIp的生產(chǎn)過程含兩個病毒滅活或去除步驟。在另一實施方案中，所述過程含用于滅活并去除病毒顆粒的溶劑和洗滌劑處理和納米過濾步驟。在又一實施方案中，生產(chǎn)過程包括使沉淀物3上清液進行S/D處理并且使肝素洗脫液進行納米過濾。在一個實施方案中，生產(chǎn)過程包括使沉淀物4懸浮液或其澄清濾液進行S/D處理并且使肝素洗脫液進行納米過濾。在另一實施方案中，生產(chǎn)過程包括病毒滅活步驟，所述病毒滅活步驟包括在低PH下孵育最終的總IaIp組合物更長時間。a)溶劑和洗滌劑(S/D)處理為了滅活血漿源性產(chǎn)品中可能存在的各種病毒污染物，可使一種或多種IaIp中間溶液進行溶劑洗滌劑(S/D)處理。用于洗滌劑處理血漿源性成分的方法在本領(lǐng)域眾所周知(參考，見，Pelletier JP 等,Best Pract Res Clin Haematol.2006; 19 (I): 205-42)。通常，任何標(biāo)準(zhǔn)S/D處理均可連同本文提供的方法使用。例如，以下提供了 S/D處理的示例性方法。在一個實施 方案中，向IaIp中間溶液添加Triton X_100、吐溫-20和三(正丁基)磷酸鹽(TNBP)，最終濃度分別為約1.0%、0.3%和0.3%。然后在介于約18° C至約25° C之間的溫度下攪拌混合物至少約Ih。在一個實施方案中，通過噴霧，而非通過液態(tài)添加法添加S/D試劑(例如，TritonX-100、吐溫-20和TNBP)實現(xiàn)工藝改進。在其它實施方案中，可向IaIp中間溶液添加呈固體的洗滌試劑，同時攪拌以確保S/D組分迅速分布。在某些實施方案中，更可取的是通過將固體撒在濾液的離域表面區(qū)域上添加固體試劑，以致例如在液態(tài)添加中，不會出現(xiàn)局部濃度過高。在另一實施方案中，通過將含IaIp的溶液泵入已經(jīng)存在呈濃縮或稀釋形式的SD試劑的罐中實現(xiàn)工藝改進。b)納米過濾和超濾/滲濾為了進一步減少本文提供的IaIp組合物的病毒載量，可使用適合納米過濾裝置納米過濾IaIp成分，例如肝素親和洗脫液。在某些實施方案中，納米過濾裝置的平均孔徑將介于15nm-200nm或約15nm-200nm之間。適合這種用途的納米過濾器的實例包括但不限于 DVD、DV50、DV20(Pall)、Viresolve NFP,Viresolve NFR(Millipore)、Planoval5N、20N、35N和75N(Planova)。在一個具體實施方案中，納米過濾器的平均孔徑將介于15nm_72nm或約 15nm_72nm之間，或介于 19nm_35nm 或約 19nm_135nm之間，或為(或約)15nm、19nm、35nm或72nm。在一個優(yōu)選實施方案中，納米過濾器的平均孔徑將為35nm或約35nm,例如AsahiPLAN0VA35N過濾器或其同等物。任選地，可進行超濾/滲濾以進一步濃縮納米濾液。在一個實施方案中，在快結(jié)束時開放式通道膜與經(jīng)特殊設(shè)計的洗后處理和制劑一起使用，所述生產(chǎn)過程產(chǎn)生高濃度的IaIp組合物。繼納米過濾之后，可通過超濾和/或通過滲濾調(diào)節(jié)的緩沖液組合物進一步濃縮濾液。在一個實施方案中，可通過超濾將納米濾液將濃縮至蛋白質(zhì)濃度介于0.5%-10%(w/v)或約0.5%-10%(w/v)之間。在某些實施方案中，可在具有開放式通道篩的盒中進行超濾并且超濾膜的標(biāo)稱截留分子量(NMWCO)小于150kDa或約150kDa，或小于(或約)140、130、120、100、90、80、70、60、50、40、30kDa或更小。在一個實施方案中，超濾膜的NMWCO不大于50kDa。完成超濾步驟之后，可通過對適合靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、皮下或其它恰當(dāng)施用方式的溶液進行滲濾來執(zhí)行緩沖液交換。在某些實施方案中，滲濾溶液可包含穩(wěn)定劑和/或緩沖劑，例如鹽、糖和/或非離子洗滌劑(例如，聚山梨醇酯80)。通常，最小交換體積為原濃縮物體積的至少約3倍，或為原濃縮物體積的至少(或約)4、5、6、7、8、9或更多倍數(shù)。可將IaIp溶液濃縮至最終蛋白質(zhì)濃度介于0.5%-25%(w/v)或約 0.5%-25%(w/v)之間，或介于 1%_25%(w/v)或約 1%_25%(w/v)之間，或介于 2%_20%(w/V)或約 2%-20%(w/v)之間，或介于 3%-15%(w/v)或約 3%_15%(w/v)之間，或介于 5%-10%(w/V)或約 5%-10%(w/v)之間，或介于 9%-12%(w/v)或約 9%_12%(w/v)之間，或介于 3%_7%(w/V)或約 3%_7% (w/V)之間，或介于 8%-14% (w/V)或約 8%-14% (w/v)之間，或介于 4%_6% (w/v)或約4%-6%(w/v)之間，或濃縮至最終濃度為(或約)0.1%、0.25%,0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、or6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%或更聞。c)在低pH下孵育在某些實施方案中，可處理含IaIp的溶液以減少或滅活所述組合物的病毒載量。在一個實施方案中，這可通過將組合物的pH調(diào)節(jié)至低pH，例如小于6.0或約6.0，并且在釋放組合物之前孵育至少約I周實現(xiàn)。在一個優(yōu)選實施方案中，在孵育之前將本體溶液的PH調(diào)節(jié)至小于5.5或約5.5。在一個更優(yōu)選的實施方案中，在孵育之前降低溶液的pH至小于5.0或約5.0。在某些實施方案中，在孵育之前降低溶液的pH至小于(或約)6.0或小于(或約)5.9,5.8,5.7,5.6,5.5,5.4,5.3,5.2,5.1,5.0,4.9,4.8,4.7,4.6,4.5,4.4,4.3、
4.2,4.1,4.0 或更低。在某些實施方案中，然后孵育溶液至少(或約)I周，或至少(或約)2、3、4周或更多周數(shù)，或至少(或約)1、2、3周或更多周數(shù)。在優(yōu)選實施方案中，在高于20° C或約20°C，或高于25°C或約25°C，或高于30° C或約30° C的溫度下孵育組合物。在特殊實施方案中，在20。C或約 20。C，或在(或約)21°〇、221:、231:、241:、251:、261:、271:、281:、291:、30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C、37°C、38°C、39°C、40°C 或更高溫度下孵育組合物。d)凍干和熱處理在另外其它實施方案中，本發(fā)明提供了凍干IaIp組合物。可通過熱處理凍干組合物(即，因子H凍干餅子)進一步降低先前已經(jīng)進行其它病毒滅活或去除步驟，例如S/D處理或納米過濾的這些凍干組合物的病毒活性。用于滅活血液因子中的病毒載量的熱處理在本 領(lǐng)域中眾所周知(例如，見，Piszkiewicz等，ThrombRes.1987 年 7 月 15 日；47 (2): 235-41 ;Piszkiewicz 等，Curr Stud Hematol BloodTransfus.1989;(56):44-54 ；Epstein 和 Fricke, Arch Pathol Lab Med.1990 年 3月;114(3):335-40)。11.配制完成IaIp富集過程后，例如，在最后滲濾步驟之后，可用緩沖液，例如滲濾緩沖液將溶液的蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)至最終濃度介于0.1%-20%(w/v)或約0.1%-20%(w/v)之間，介于 1%-25%(w/v)或約 1%-25%(w/v)之間，介于 2%-20%(w/v)或約 2%-20%(w/v)之間，介于 3%-15% (w/v)或約 3%-15% (w/v)之間，介于 5%-10% (w/v)或約 5%-10% (w/v)之間，介于 9%-12%(w/v)或約 9%-12%(w/v)之間，介于 3%-7%(w/v)或約 3%-7%(w/v)之間，介于8%-14% (w/V)或約 8%-14% (w/V)之間，介于 4%_6% (w/v)或約 4%_6% (w/v)之間，或調(diào)節(jié)至最終濃度為(或約)0.1%、0.25%,0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%,20% 或更高。在某些實施方案中，可通過濾過絕對孔徑不大于(或約)0.22μπι，例如為(或約)0.1或0.2μπι的膜過濾器進一步對配制的本體溶液滅菌。在某些實施方案中，可將溶液無菌分配至最終容器中以便適當(dāng)密封，取樣進行試驗。B.醇添加有利的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，為了從血漿中分離血液制品(例如，Ialp、因子H、IgG、白蛋白)的目的，通過使醇在添加時細(xì)微分散或迅速分散的方法添加醇導(dǎo)致IgG產(chǎn)量損失減少。不受理論約束，在向血漿成分液態(tài)添加期間，流體入口處的瞬時局部濃度過高可導(dǎo)致在血液因子應(yīng)留在上清液中的步驟期間，蛋白質(zhì)變性和血液因子的不可逆丟失和/或沉淀。此夕卜，當(dāng)需要添加較大體積的醇時，例如在牽涉分離至少100L混合血漿的工業(yè)規(guī)模的純化中，這些影響可擴大。在一個實施方案中，在一個或多個沉淀步驟中通過使醇細(xì)微分散在離域區(qū)上的方法添加醇。例如，可通過噴霧至裝有血漿成分的器皿或罐的表面向分離步驟添加醇。因此，在本文提供的方法的一方面，可通過噴霧添加醇進行一個或多個沉淀步驟。在某些實施方案中，可使用任何加壓設(shè)備，例如具有噴頭噴或嘴并且手動或自動操作以由液體產(chǎn)生細(xì)薄霧的容器(例如，噴霧瓶)進行噴霧添加。在某些實施方案中，在不斷攪拌或混合體系的同時進行噴霧添加以確保體系內(nèi)的液體迅速均勻分布。在另一實施方案中，在一個或多個沉淀步驟中通過使醇在添加時迅速分散的方法添加醇。例如，可從裝有血漿成分的器皿或罐的下面，直接與攪拌裝置(例如，螺旋槳)相鄰添加醇。在某些實施方案中，在不斷攪拌或混合體系的同時，在與攪拌裝置直接相鄰的入口處液態(tài)添加以確保體系內(nèi)的液體迅速均勻分布。C.調(diào)節(jié) pH血漿成分的蛋白質(zhì)沉淀性質(zhì)高度取決于從中沉淀出血漿蛋白質(zhì)的溶液的pH。自1946年和1949年分別引入Cohn和Oncley方法以來,這一事實已經(jīng)收到受到分離血衆(zhòng)蛋白質(zhì)的科學(xué)家充分利用。傳統(tǒng)上，在添加醇之前調(diào)節(jié)血漿成分的PH以利于目標(biāo)組分的最高回收產(chǎn)量。有利的是，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，直接在添加醇之后或與醇添加同時調(diào)節(jié)溶液的PH導(dǎo)致沉淀更明確且可重現(xiàn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，向血漿成分添加醇導(dǎo)致溶液的PH波動，通常使溶液的pH升高。同樣，通過在添加醇之前而非之后，將血漿成分的PH調(diào)節(jié)至預(yù)定pH，在非最佳pH下將出現(xiàn)沉淀反應(yīng)。同樣，蛋白質(zhì)從血漿成分中沉淀將影響靜電環(huán)境并且因此將改變?nèi)芤旱膒H。因此，當(dāng)允許進行沉淀事件時，溶液的pH將開始偏離允許最大限度回收目標(biāo)蛋白質(zhì)種類的預(yù)定PH值。這對于其中沉淀大部分蛋白質(zhì)的沉淀事件，其中使用高醇含量的沉淀事件和需要較長孵育時間的沉淀事件而言尤其如此。因此，在本文提供的方法的一方面，直接在添加醇之后調(diào)節(jié)血漿成分的pH。在一個相關(guān)實施方案中，可在醇添加之前和之后，或在醇添加期間和之后，或在醇添加之前、期間和之后調(diào)節(jié)pH。在一個相關(guān)實施方案中，在一個或多個醇沉淀事件或孵育期間不斷調(diào)節(jié)溶液的pH。在某些實施方案中，在不斷攪拌或混合體系的同時，不斷調(diào)節(jié)或維持溶液的pH以確保體系內(nèi)的pH調(diào)節(jié)劑迅速均勻分布。與液態(tài)醇添加的情況相似，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，液態(tài)添加大體積的pH調(diào)節(jié)劑可引起瞬時局部PH改變，導(dǎo)致不必要的蛋白質(zhì)變性或沉淀。因此，在本文提供的方法的一個實施方案中，可通過使醇在添加時細(xì)微分散或迅速分散的方法將PH調(diào)節(jié)劑引入一個或多個血漿分離步驟中。在一個實施方案中，在一個或多個步驟中，通過使pH調(diào)節(jié)劑細(xì)微分散在離域區(qū)上的方法添加PH調(diào)節(jié)劑。例如，可通過噴霧至裝有血漿成分的器皿或罐的表面向一個步驟添加pH調(diào)節(jié)劑。在本文提供的方法的另一實施方案中，可通過噴霧添加pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)血漿成分或沉淀步驟的pH。在某些實施方案中，可使用任何加壓設(shè)備，例如具有噴頭或噴嘴并且手動或自動操作以由液體產(chǎn)生細(xì)薄霧的容器(例如，噴霧瓶)進行噴霧添加。在某些實施方案中，在不斷攪拌或混合體系的同時進行噴霧添加以確保體系內(nèi)的液體迅速均勻分布。在另一實施方案中，在一個或多個步驟中通過使pH調(diào)節(jié)劑在添加時迅速分散的方法添加PH調(diào)節(jié)劑。例如，可從裝有血漿成分的器皿或罐的下面，直接與攪拌裝置(例如，螺旋槳)相鄰添加PH調(diào)節(jié)劑。在某些實施方案中，在不斷攪拌或混合體系的同時，在與攪拌裝置直接相鄰的入口處液態(tài)添加以確保體系內(nèi)的液體迅速均勻分布。在又一實施方案中，在一個或多個步驟中通過將固體pH調(diào)節(jié)劑撒在血漿成分表面上的離域區(qū)上添加PH調(diào)節(jié)劑。在某`些實施方案中，在不斷攪拌或混合體系的同時，通過這種方式進行添加以確保體系內(nèi)的PH調(diào)節(jié)劑迅速均勻分布。IV.間-α -抑制劑(IaIp)組合物一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本文所述方法制備的IaIp組合物。在一個實施方案中，由生產(chǎn)商用血漿源性血液制品(例如IgG或白蛋白)期間丟棄的其它材料制備Ialp。在一個實施方案中，提供了 IaIp組合物，其中從成分1、成分IV-1、成分II+III或成分I+II+III沉淀物、Kistler和Nitschmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅萃取IaIp0可將如本發(fā)明所述的IaIp配制成用于治療用的藥物制劑?？蓪⒓兓鞍兹苡谏韺W(xué)上相容的常規(guī)緩沖水溶液，可任選向其中添加藥物賦形劑以提供藥物組合物。此類藥物載體和賦形劑以及適合藥物制劑在本領(lǐng)域中眾所周知(見例如"Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins",Frokjaer 等，Taylor&Francis (2000)或〃Handbook of Pharmaceutical Excipients〃,第 3 版,Kibbe 等，Pharmaceutical Press (2000))。具體而言,可將包含本發(fā)明的多肽變體的藥物組合物配制成凍干或穩(wěn)定可溶性形式?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的多種方法凍干多肽變體。使用之前，通過添加一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑，例如注射用無菌水或無菌生理鹽水溶液使凍干制劑復(fù)原。可通過任何藥學(xué)上適合的施用方式將組合物的制劑遞送給個體。已知各種遞送系統(tǒng)并且可用于通過任何常規(guī)途徑施用組合物。在一個實施方案中，可全身施用本發(fā)明的組合物。對于全身使用而言，根據(jù)常規(guī)方法配制本發(fā)明的IaIp用于腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)、肺內(nèi)或鼻內(nèi))或腸內(nèi)(例如，口腔、陰道或直腸)遞送。在一個實施方案中，配制IaIp用于皮下貯庫遞送。在另外其它實施方案中，配制IaIp用于鼻內(nèi)施用或通過吸入施用。可通過輸注或彈丸注射不斷施用制劑。一些制劑包括緩釋系統(tǒng)。優(yōu)選施用途徑將取決于治療、控制或預(yù)防的適應(yīng)證。例如，在施用IaIp以治療敗血癥的一個實施方案中，優(yōu)選施用途徑將為腸胃外。在施用IaIp以治療敗血癥的一個特殊實施方案中，施用途徑將為靜脈內(nèi)。熟練醫(yī)師將能夠容易地確定對治療、控制或預(yù)防的特殊痛苦的優(yōu)選施用途徑。A.含水組合物一方面，本發(fā)明提供了由通過血漿分離制備其它有商業(yè)重要性的血液制品期間丟棄的其它材料制備的血漿源性IaIp的含水組合物。通過本文提供的方法制備的含水IaIp組合物將具有高IaIp含量和純度。例如，本文提供的IaIp組合物的蛋白質(zhì)濃度將為至少約3% (w/v)而IaIp含量將大于約90%純度。在一個實施方案中，提供了由成分II+III濾餅制備的IaIp的含水組合物。在一個實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp的含水組合物:(i)從成分II+III濾餅萃取Ialp ，(ii)任選進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)任選進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，(iv)任選進行至少一個離子交換色譜步驟，(V)任選進行至少一個肝素親和色譜步驟；和(vi)進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備含水IaIp組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp組合物:(a)在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下,用約6%至約10%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血楽;成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液；(b)在第二沉淀步驟中，在介于約6.7和約7.3之間的pH下，用約20%至約25%的醇使IaIp從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物；(c)使所述第二沉淀物再懸浮以形成懸浮液；(d)使二氧化硅細(xì)粉(SiO2)與來自步驟(c)的所述懸浮液混合；(e)用壓濾機過濾所述懸浮液，從而形成濾餅和上清液；和(f)用IaIp萃取緩沖液從所述濾餅中萃取Ialp，從而制備IaIp的含水組合物。在某些實施方案中，通過使萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有濾餅的壓濾機從濾餅中萃取Ialp。通常，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過濾餅約5min至約2h。在一個優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過濾餅約IOmin至約60min。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過濾餅約20min至約40min。在另一優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過濾餅約30min。在其它實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過濾餅至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120min 或更多分鐘數(shù)。在另一實施方案中，提供了由成分I沉淀物制備的IaIp的含水組合物。在一個實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp的含水組合物:(i)從成分I沉淀物萃取Ialp，(ii)任選進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)任選進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，(iv)任選進行至少一個離子交換色譜步驟，(V)任選進行至少一個肝素親和色譜步驟；和(vi)進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備含水IaIp組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了由成分I沉淀物制備的IaIp的含水組合物。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp組合物:(a)在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下,用約6%至約10%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血衆(zhòng)成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液；(b)用IaIp萃取緩沖液從所述沉淀物中萃取Ialp，從而制備IaIp的含水組合物。在某些實施方案中，通過使萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有成分I沉淀物的壓濾機，從成分I沉淀物中萃取Ialp。通常，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分I沉淀物約5min至約2h。在一個優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分I沉淀物約IOmin至約60min。在一個更優(yōu)選的實施方案中,將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分I沉淀物約20min至約40min。在另一優(yōu)選實施方案中,將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分I沉淀物約30min。在其它實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分I沉淀物至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120min 或更多分鐘數(shù)。在另一實施方案中，提供了由成分IV-1沉淀物制備的IaIp的含水組合物。在一個實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp的含水組合物:(i)從成分IV-1沉淀物萃取Ialp，(ii)任選進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)任選進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，(iv)任選進行至少一個離子交換色譜步驟，(V)任選進行至少一個肝素親和色譜步驟；和(vi)進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備含水IaIp組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了由成分IV-1沉淀物制備的IaIp的含水組合物。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp組合物:(a)在第一沉淀步驟中，在 介于約7.0和約7.5之間的pH下,用約6%至約10%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血楽;成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液；(b)在第二沉淀步驟中,在介于約6.7和約7.3之間的pH下，用約20%至約25%的醇使蛋白質(zhì)從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物和第二上清液；(c)在第三沉淀步驟中，在介于約5.0和約5.5之間的pH下，用約18%至約23%的醇使IaIp從第二上清液中沉淀以形成第三沉淀物和第三上清液；(d)用IaIp萃取緩沖液從第三沉淀物萃取Ialp，從而制備IaIp的含水組合物。在某些實施方案中，通過使萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有成分IV-1沉淀物的壓濾機，從成分IV-1沉淀物中萃取Ialp。通常，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分IV-ι沉淀物約5min至約2h。在一個優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分IV-1沉淀物約IOmin至約60min。在一個更優(yōu)選的實施方案中,將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分IV-1沉淀物約20min至約40min。在另一優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分IV-1沉淀物約30min。在其它實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分IV-1沉淀物至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120min或更多分鐘數(shù)。在一個實施方案中，提供了由成分II+III沉淀物制備的IaIp的含水組合物。在一個實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp的含水組合物:(i)從成分II+III沉淀物萃取Ialp，(ii)任選進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)任選進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，(iv)任選進行至少一個離子交換色譜步驟，(V)任選進行至少一個肝素親和色譜步驟；和(vi)進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備含水IaIp組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp組合物:(a)在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下,用約6%至約10%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血楽;成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液；(b)在第二沉淀步驟中，在介于約6.7和約7.3之間的pH下，用約20%至約25%的醇使IaIp從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物；和(C)用IaIp萃取緩沖液從第二沉淀物萃取Ialp，從而制備IaIp的含水組合物。在某些實施方案中，通過使萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有成分II+III沉淀物的壓濾機，從成分II+III沉淀物中萃取Ialp。通常，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分II+III沉淀物約5min至約2h。在一個優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分II+III沉淀物約IOmin至約60min。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分II+III沉淀物約20min至約40min。在另一優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分II+III沉淀物約30min。在其它實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分II+III沉淀物至少約 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120min或更多分鐘數(shù)。在一個實施方案中,提供了由Kistler和Nitschmann沉淀物A或B沉淀物制備的IaIp的含水組合物。在一個實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp的含水組合物:(i)從Kistler和Nitschmann沉淀物A或B沉淀物萃取Ialp, (ii)任選進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)任選進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，(iv)任選進行至少一個離子交換色譜步驟，(V)任選進行至少一個肝素親和色譜步驟；和(vi)任選進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備含水IaIp組合物。在某些實施方案中，通過按I份沉淀物:約25份至約30份萃取緩沖液的比例，添加可用于使成分1、成分IV-1或成分II+III沉淀物、Kistler和Nitschmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅再懸浮的IaIp萃取緩沖液，從成分1、成分IV_1、成分II+III或成分I+II+III沉淀物、Kistler和Nitschmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅中萃取Ialp。在其它實施方案中，再懸浮比例為(或約)1:4至約1:40，或約1:8至約1:30，或約1:10至約1:20，或約1:12至約1:18，或約1:13至約1:17，或約1:14至約1:16。在某些實施方案中，所述比例可為約1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1: 20、1: 21、1: 22、1: 23、1: 24、1:25、1: 26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40 或更高。在一個優(yōu)選實施方案中，通過使萃取緩沖液 再循環(huán)通過裝有成分1、成分IV-1、成分II+III或成分I+II+III沉淀物、KiStler和Nitschmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅的過濾器或壓濾機萃取Ialp。在某些實施方案中，提供了 IaIp的含水組合物，其中使用本文所述的純化方法制備IaIp組合物，其中所述方法包括添加一種或多種溶液，將通過液態(tài)添加法，通過使所述溶液在添加時細(xì)微分散或迅速分散的方法將所述溶液引入血漿成分中。例如，在某些實施方案中，所述方法將包括通過噴霧將醇(例如，乙醇)引入血漿成分中。在其它實施方案中，可通過噴霧添加到血漿成分中的溶液包括但不限于PH調(diào)節(jié)劑、溶劑溶液、洗滌劑溶液、稀釋緩沖液、導(dǎo)電率調(diào)節(jié)劑等。在一個實施方案中，可通過噴霧將醇添加到血漿成分中進行一個或多個醇沉淀步驟。在第二優(yōu)選實施方案中，可通過噴霧將PH調(diào)節(jié)劑添加到血漿成分中進行一個或多個PH調(diào)節(jié)步驟。在某些實施方案中，提供了通過本文所述的純化方法制備的含水IaIp組合物，其中所述方法包括在添加沉淀劑(例如，醇或聚乙二醇)之后和/或同時調(diào)節(jié)正在沉淀的血漿成分的pH。在一些實施方案中，在整個沉淀孵育或維持步驟中通過不斷監(jiān)測并調(diào)節(jié)pH維持活躍沉淀的血漿成分的pH。在一個實施方案中，通過噴霧添加pH調(diào)節(jié)劑進行對溶液pH的調(diào)節(jié)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含濃度介于約0.lg/L至約250g/L之間的蛋白質(zhì)的含水IaIp組合物。在某些實施方案中，IaIp組合物的蛋白質(zhì)濃度介于約0.lg/L至約50g/L之間，或介于約0.5g/L至約25g/L之間，或介于約lg/L至約10g/L之間，或介于約50g/L至約200g/L之間，·或介于約70g/L至約150g/L之間，或介于約90g/L至約120g/L之間，或介于約30g/L至約70g/L之間，或介于約40g/L至約60g/L之間，或這些范圍內(nèi)的任何適合濃度，例如約 0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、lOg/L,或約 15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、105g/L、I10g/L、115g/L、120g/L、125g/L、130g/L、135g/L、140g/L、145g/L、150g/L、155g/L、160g/L、165g/L、170g/L、175g/L、180g/L、185g/L、190g/L、195g/L、200g/L、205g/L、210g/L、215g/L、220g/L、225g/L、230g/L、235g/L、240g/L、245g/L、250g/L或更高。在一個優(yōu)選實施方案中，具有高蛋白質(zhì)濃度的IaIp組合物也將具有高純度水平。在一個實施方案中，組合物中至少90%的蛋白質(zhì)將為Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，組合物中至少95%的蛋白質(zhì)將為Ialp。本文提供的方法允許制備具有極高純度水平的IaIp組合物。在一個實施方案中，在本文提供的組合物中總蛋白質(zhì)的至少約90%將為Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，在本文提供的組合物中總蛋白質(zhì)的至少約95%將為Ialp。在其它實施方案中，組合物總蛋白質(zhì)的至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多將為 Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，組合物總蛋白質(zhì)的至少96%將為Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，組合物總蛋白質(zhì)的至少97%將為Ialp。在另一優(yōu)選實施方案中，組合物總蛋白質(zhì)的至少98%將為Ialp。在另一優(yōu)選實施方案中，組合物總蛋白質(zhì)的至少99%將為Ialp。B.藥物組合物—方面，本發(fā)明提供了由通過血漿分離制備其它有商業(yè)重要性的血液制品期間丟棄的其它材料制備的血漿源性IaIp的藥物組合物。通過本文提供的方法制備的IaIp藥物組合物將具有高IaIp含量和純度。例如，本文提供的IaIp組合物的蛋白質(zhì)濃度可為至少約l%(w/v)并且IaIp含量可大于約90%純度。這些高純度IaIp藥物組合物和制劑適合治療施用。在某些實施方案中，本文提供的藥物組合物將由配制用于治療施用的IaIp含水制劑組成。在其它實施方案中，本文提供的藥物組合物將由配制用于經(jīng)注射用水(WFI)或生物學(xué)相容的液體(例如，鹽水或緩沖溶液)復(fù)原后供治療施用的IaIp凍干制劑組成。在一個實施方案中，通過使用本文提供的方法配制分離的含水IaIp組合物制備本文提供的藥物組合物。通常，配制組合物的生產(chǎn)途徑將包括至少I個,優(yōu)選至少2個，最優(yōu)選至少3個病毒滅活或去除步驟?？膳c本文提供的方法一起采用的病毒滅活或去除步驟的非限制性實例包括溶劑洗漆劑處理(Horowitz等，Blood Coagul Fibrinolysis 1994(5Suppl 3):S21-S28 和 Kreil 等，Transfusion2003 (43): 1023-1028，二者均通過引用整體明確地并入本文用于所有目的)、納米過濾(Hamamoto等,Vox Sangl989 (56) 230-236和Yuasa等，J Gen Virol.1991 (72 (pt8)): 2021-2024，二者均通過引用整體明確地并入本文用于所有目的)和在高溫下低pH孵育(Kempf等，Transfusion 1991 (31) 423-427和Louie等,Biologicalsl994(22):13-19)。在一個實施方案中，提供了由成分II+III濾餅制備的IaIp的藥物組合物。在一個實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp的藥物組合物:(i)從成分II+III濾餅萃取Ialp，(ii)任選進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)任選進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，(iv)任選進行至少一個離子交換色譜步驟，(V)任選進行至少一個肝素親和色譜步驟；(vi)進行至少一個病毒滅活或去除步驟；和(vii)任選凍干IaIp組合物,從而制備IaIp藥物組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp組合物:(a)在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下,用約6%至約10%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血楽;成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液；(b)在第二沉淀步驟中，在介于約6.7和約7.3之間的pH下，用約20%至約25%的醇使IaIp從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物；(c)使所述第二沉淀物再懸浮以形成懸浮液；(d)使二氧化硅細(xì)粉(SiO2)與來自步驟(c)的所述懸浮液混合；(e)用壓濾機過濾所述懸浮液，從而形成濾餅和上清液；(f)用IaIp萃取緩沖液從所述濾餅中萃取IaIp ； (g)進行至少一個病毒滅活或去除步驟；和(h)任選凍干所述組合物，從而制備IaIp的藥物組合物。在某些實施方案中，通過使萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有濾餅的壓濾機從濾餅中萃取Ialp。通常，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過濾餅約5min至約2h。在一個優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過濾餅約IOmin至約60min。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過濾餅約20min至約40min。在另一優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過濾餅約30min。在其它實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過濾餅至少約5、10、
15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120min 或更多分鐘數(shù)。在其它實施方案中，提供了由成分I沉淀物制備的IaIp的藥物組合物。在一個實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp的藥物組合物:(i)從成分I沉淀物萃取Ialp，(ii)任選進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)任選進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，(iv)任選進行至少一個離子交換色譜步驟，(v)任選進行至少一個肝素親和色譜步驟；(vi)進行至少一個病毒滅活或去除步驟；和(vii)任選凍干IaIp組合物，從 而制備IaIp藥物組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了由成分I沉淀物制備的IaIp的藥物組合物。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp組合物:(a)在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下，用約6%至約10%的醇使IaIp從cryo-poor血楽;成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液；和(b)用IaIp萃取緩沖液從所述沉淀物中萃取IaIp ;和(C)進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備IaIp藥物組合物。在某些實施方案中，通過使萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有成分I沉淀物的壓濾機從成分I沉淀物中萃取Ialp。通常，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分I沉淀物約5min至約2h。在一個優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分I沉淀物約IOmin至約60min。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分I沉淀物約20min至約40min。在另一優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分I沉淀物約30min。在其它實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分I沉淀物至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120min 或更多分鐘數(shù)。在另一實施方案中，提供了由成分IV-1沉淀物制備的IaIp的藥物組合物。在一個實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp的藥物組合物:(i)從成分IV-1沉淀物萃取Ialp，(ii)任選進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，
(iii)任選進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，(iv)任選進行至少一個離子交換色譜步驟，(V)任選進行至少一個肝素親和色譜步驟；和(vi)進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備IaIp藥物組合物。

在一個優(yōu)選實施方案中，提供了由成分IV-1沉淀物制備的IaIp的藥物組合物。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp組合物:(a)在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下,用約6%至約10%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血楽;成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液；(b)在第二沉淀步驟中,在介于約6.7和約7.3之間的pH下，用約20%至約25%的醇使蛋白質(zhì)從所述第一上清液中沉淀以形成第二上清液；(c)在第三沉淀步驟中，在介于約5.0和約5.5之間的pH下，用約18%至約23%的醇使IaIp從第二上清液中沉淀以形成第三沉淀物和第三上清液；(d)用IaIp萃取緩沖液從第三沉淀物萃取Ialp，從而制備IaIp的藥物組合物。在某些實施方案中，通過使萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有成分IV-1沉淀物的壓濾機從成分IV-1沉淀物中萃取Ialp。通常，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分IV-ι沉淀物約5min至約2h。在一個優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分IV-1沉淀物約IOmin至約60min。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分IV-1沉淀物約20min至約40min。在另一優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分IV-1沉淀物約30min。在其它實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分IV-1沉淀物至少約5、
10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120min或更多分鐘數(shù)。在一個實施方案中，提供了由成分II+III沉淀物制備的IaIp的藥物組合物。在一個實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp的藥物組合物:(i)從成分II+III沉淀物萃取Ialp，(ii)任選進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)任選進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，(iv)任選進行至少一個離子交換色譜步驟，(V)任選進行至少一個肝素親和色譜步驟；和(vi)進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備IaIp藥物組合物。
在一個優(yōu)選實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp組合物:(a)在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下,用約6%至約10%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血楽;成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液；(b)在第二沉淀步驟中，在介于約6.7和約7.3之間的pH下，用約20%至約25%的醇使IaIp從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物；和(C)用IaIp萃取緩沖液從第二沉淀物萃取Ialp，從而制備IaIp的含水組合物。在某些實施方案中，通過使萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有成分II+III沉淀物的壓濾機從成分II+III沉淀物中萃取Ialp。通常，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分II+III沉淀物約5min至約2h。在一個優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分II+III沉淀物約IOmin至約60min。在一個更優(yōu)選的實施方案中,將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分II+III沉淀物約20min至約40min。在另一優(yōu)選實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分II+III沉淀物約30min。在其它實施方案中，將使萃取緩沖液再循環(huán)通過成分II+III沉淀物至少約 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120min或更多分鐘數(shù)。在一個實施方案中,提供了由Kistler和Nitschmann沉淀物A或B沉淀物制備的IaIp的藥物組合物。在一個實施方案中，提供了通過包括以下步驟的方法制備的IaIp的含水組合物:(i)從沉淀物A或B沉淀物萃取Ialp，(ii)任選進行第一沉淀步驟以使至少一種雜質(zhì)從IaIp組合物中沉淀，(iii)任選進行第二沉淀步驟以使IaIp從組合物中沉淀，
(iv)任選進行至少一個離子交換色譜步驟，(V)任選進行至少一個肝素親和色譜步驟；和(vi)任選進行至少一個病毒滅活或去除步驟，從而制備IaIp藥物組合物。在某些實施方案中，通過按I份沉淀物:約25份至約30份萃取緩沖液的典型比例，添加可用于使成分1、成分IV-ι或成分II+III沉淀物、Kistler和Nitschmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅再懸浮的因子H萃取緩沖液，從成分1、成分IV-1、成分II+III或成分I+ II+III沉淀物、Kistler和Nitschmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅中萃取Ialp。在其它實施方案中，再懸浮比例為(或約)1:4至約1:40，或約1:8至約1:30，或約1:10至約1:20，或約1:12至約1:18，或約1:13至約1:17，或約1:14至約1:16。在某些實施方案中，所述比例可為約1:4、1: 5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40 或更高。在一個優(yōu)選實施方案中，通過使萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有成分1、成分iv-ι或成分II+III沉淀物、Kistler和Nitschmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅的過濾器或壓濾機萃取Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，通過使萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有成分1、成分IV-1或成分II+III沉淀物、Kistler和Nitschmann沉淀物A或沉淀物B沉淀物或成分II+III濾餅的過濾器或壓濾機萃取Ialp。在某些實施方案中，提供了 IaIp的藥物組合物，其中使用本文所述的純化方法制備IaIp組合物，其中所述方法包括添加一種或多種溶液，將通過液態(tài)添加法，通過使所述溶液在添加時細(xì)微分散或迅速分散的方法將所述溶液引入血漿成分中。例如，在某些實施方案中，所述方法將包括通過噴霧將醇(例如，乙醇)引入血漿成分中。在其它實施方案中，可通過噴霧添加到血漿成分中的溶液包括但不限于PH調(diào)節(jié)劑、溶劑溶液、洗滌劑溶液、稀釋緩沖液、導(dǎo)電率調(diào)節(jié)劑等。在一個優(yōu)選實施方案中，可通過噴霧將醇添加到血漿成分中進行一個或多個醇沉淀步驟。在第二優(yōu)選實施方案中，可通過噴霧將PH調(diào)節(jié)劑添加到血漿成分中進行一個或多個PH調(diào)節(jié)步驟。在某些實施方案中，提供了通過本文所述的純化方法制備的IaIp藥物組合物，其中所述方法包括在添加沉淀劑(例如，醇或聚乙二醇)之后和/或同時調(diào)節(jié)正在沉淀的血漿成分的pH。在一些實施方案中，在整個沉淀孵育或維持步驟中通過不斷監(jiān)測并調(diào)節(jié)pH維持活躍沉淀的血漿成分的pH。在一個實施方案中，通過噴霧添加pH調(diào)節(jié)劑進行對溶液pH的調(diào)節(jié)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含濃度介于約10g/L至約250g/L之間的蛋白質(zhì)的IaIp藥物組合物。在某些實施方案中，IaIp組合物的蛋白質(zhì)濃度介于約50g/L至約200g/L之間，或介于約70g/L至約150g/L之間，或介于約90g/L至約120g/L之間，或介于約30g/L至約70g/L之間，或介于約40g/L至約60g/L之間，或這些范圍內(nèi)的任何適合濃度,例如約 10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、105g/L、I10g/L、115g/L、120g/L、125g/L、130g/L、135g/L、140g/L、145g/L、150g/L、155g/L、160g/L、165g/L、170g/L、175g/L、180g/L、185g/L、190g/L、195g/L、200g/L、205g/L、210g/L、215g/L、220g/L、225g/L、230g/L、235g/L、240g/L、245g/L、250g/L或更高。在一個優(yōu)選實施方案中，具有高蛋白質(zhì)濃度的IaIp組合物也將具有高純度水平。在一個實施方案中，組合物中至少90%的蛋白質(zhì)將為Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，組合物中至少95%的蛋白質(zhì)將為Ialp。本文提供的方法允許制備具有極高純度水平的IaIp組合物。在一個實施方案中，在本文提供的組合物中總蛋白質(zhì)的至少約90%將為Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，在本文提供的組合物中總蛋白質(zhì)的至少約95%將為Ialp。在其它實施方案中，組合物總蛋白質(zhì)的至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多將為 Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，組合物總蛋白質(zhì)的至少96%將為Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，組合物總蛋白質(zhì)的至少97%將為Ialp。在另一優(yōu)選實施方案中，組合物總蛋白質(zhì)的至少98%將為Ialp。在另一優(yōu)選實施方案中，組合物總蛋白質(zhì)的至少99%將為Ialp。本文提供的藥物組合物通常將包含適合靜脈內(nèi)、皮下和/或肌肉內(nèi)施用的一種或多種緩沖劑或PH穩(wěn)定劑。適合配制本文提供的IaIp組合物的緩沖劑的非限制性實例包括甘氨酸、組氨酸或其它氨基酸，鹽如檸檬酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、谷氨酸鹽、酒石酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、葡糖酸鹽、蘋果酸鹽、琥珀酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、碳酸鹽或其調(diào)節(jié)至適當(dāng)PH的任何組合。通常，緩沖劑將足以使制劑中的適合PH維持更長時間。在一些實施方案中，制劑中緩沖液的濃度將介于約5mM至約500mM之間。在某些實施方案中，制劑中緩沖液的濃度將為約5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500mM 或更高。在某些實施方案中，制劑的pH將介于約pH4.0至pH8.0之間。在一些實施方案中，本文提供的藥物組合物可任選進一步包含用于調(diào)節(jié)組合物滲透壓的試劑。滲透壓試劑的非限制性實例包括甘露醇、山梨糖醇、甘油、蔗糖、葡萄糖、右旋糖、左旋糖、果糖、乳糖、聚乙二醇、磷酸鹽、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、葡庚糖酸鈣、二甲基砜等ο
在一些實施方案中，本文提供的制劑將具有比得上生理滲透壓的滲透壓，約285_295m0smol/kg(Lacy 等，Drug Information Handbook - Lex1-Comp 1999:1254)。在某些實施方案中，制劑的滲透壓將介于約200m0smol/kg與約350m0smol/kg之間，優(yōu)選介于約240m0smol/kg與約300m0smol/kg之間。在特殊實施方案中，制劑的滲透壓將為約200m0smol/kg 或 210m0smol/kg、220m0smol/kg、230m0smol/kg、240m0smol/kg、245m0smol/kg、250m0smo1/kg、255m0smo1/kg、26OmOsmoI/kg、265m0smol/kg、270m0smo1/kg、275m0smol/kg、280m0smol/kg、285m0smol/kg、290m0smol/kg、295m0smol/kg、300m0smol/kg、310m0smol/kg、320m0smol/kg、330m0smol/kg、340m0smol/kg、340m0smol/kg 或350m0smol/kg。在另外其它實施方案中，制劑的滲透壓將更高,例如介于約200m0smol/kg至 1000m0smol/kg 之間，或約 400m0smol/kg、450m0smol/kg、500m0smol/kg、550m0smol/kg、600m0smol/kg、650m0smol/kg、700m0smol/kg、750m0smol/kg、800m0smol/kg、850m0smol/kg、900m0smol/kg、950m0smol/kg、1000m0smol/kg 或更高。呈液體形式的本文提供的IaIp制劑通常穩(wěn)定更長的時間。在某些實施方案中，所述制劑在室溫下穩(wěn)定至少約3個月，或在室溫下穩(wěn)定至少約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48個月或更長時間。制劑在冷藏條件下(通常介于約2° C至約8°C之間)通常也將穩(wěn)定至少約18個月，或在冷藏條件下將穩(wěn)定至少約21、24、27、30、
33、36、39、42、45、48、51、54、57、60個月或更長時間。在其它實施方案中，呈凍干形式的本文提供的IaIp制劑通常穩(wěn)定更長的時間。在某些實施方案中，所述制劑在室溫下穩(wěn)定至少約3個月，或在室溫下穩(wěn)定至少約4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、
34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48個月或更長時間。制劑在冷藏條件下(通常介于約2°C至約8°C 之間)通常也將穩(wěn)定至少約18個月，或在冷藏條件下將穩(wěn)定至少約 21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57 或 60 個月?！矫妫景l(fā)明還涉及向有需要的哺乳動物施用供全身或局部眼內(nèi)施用的含有根據(jù)本發(fā)明純化的IaIp和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。所述組合物可進一步包含在敗血癥的治療中可能有用的附加治療化合物，例如抗生素。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法配制治療組合物用于所需特殊施用途徑。根據(jù)本發(fā)明的方法，向有需要的哺乳動物施用供全身或局部施用的包含根據(jù)本文所述方法純化的IaIp和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。V.治療方法在另外其它方面，本發(fā)明的目的是提供通過施用治療有效量的本文提供的IaIp組合物治療與IaIp功能減弱或IaIp功能障礙相關(guān)的病癥和疾病的方法。在一個實施方案中，與IaIp功能減弱或IaIp功能障礙相關(guān)的疾病或病癥為敗血癥。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過本文公開的方法制備的用于治療有需要的受試者與IaIp功能減弱或IaIp功能障礙相關(guān)的疾病或病癥的IaIp組合物的治療有效劑量。在一個實施方案中，與IaIp功能減弱或IaIp功能障礙相關(guān)的疾病或病癥為敗血癥。另一方面，本發(fā)明的目的是提供通過施用治療有效量的本文提供的IaIp組合物治療與血漿絲氨酸蛋白酶活性增強相關(guān)的疾病和病癥的方法。在一個實施方案中，與血漿絲氨酸蛋白酶活性增強相關(guān)的疾病或病癥選自敗血癥、敗血性休克、內(nèi)毒素性休克、彌散性血管內(nèi)凝血、纖維增生、炭疽中毒、癌癥轉(zhuǎn)移、手術(shù)期間的組織損傷、腎病、血管疾病、凝血病、糖尿病和全身炎癥。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過本文公開的方法制備的用于治療有需要的受試者與血漿絲氨酸蛋白酶活性增強相關(guān)的疾病或病癥的方法的IaIp組合物的治療有效劑量。在一個實施方案中，與血漿絲氨酸蛋白酶活性增強相關(guān)的疾病或病癥選自敗血癥、敗血性休克、內(nèi)毒素性休克、彌散性血管內(nèi)凝血、纖維增生、炭疽中毒、癌癥轉(zhuǎn)移、手術(shù)期間的組織損傷、腎病、血管疾病、凝血病、糖尿病和全身炎癥。A.施用根據(jù)本發(fā)明，完成一個療程所需的時間可由醫(yī)師確定并且范圍可能為短至I天至一個月以上。在某些實施方案中，療程可為1-6個月?？赏ㄟ^任何適合方式向受試者施用有效量的IaIp制劑以治療所述疾病或病癥。例如，在某些實施方案中，可通過靜脈、皮下和/或肌肉方式施用Ialp。在一個優(yōu)選實施方案中，提供了治療有需要的受試者的敗血癥的方法，包括向患者靜脈(IV)施用IaIp組合物。在某些實施方案中，可全身或局部施用本文提供的IaIp組合物。全身施用包括:口服、真皮下、腹膜內(nèi)、皮下、經(jīng)鼻、舌下或直腸施用途徑。局部施用包括:局部、皮下、肌肉和腹膜內(nèi)施用途徑。在某些實施方案中，術(shù)語“有效量”指導(dǎo)致受試者的疾病或病狀改善或矯正的IaIp制劑的量?？捎舍t(yī)師考慮在年齡、體重、受治疾病或病狀、疾病嚴(yán)重程度和對治療的反應(yīng)方面的個體差異確定向受試者施用的有效量。在某些實施方案中，可按每次施用約5mg/kg至約2000mg/kg的劑量向受試者施用IaIp制劑。在某些實施方案中，劑量可為至少約5mg/kg,或至少約 10mg/kg,或至少約 20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg、1000mg/kg、I100mg/kg、1200mg/kg>1300mg/kg、1400mg/kg、1500mg/kg、1600mg/kg、1700mg/kg、1800mg/kg、1900mg/kg 或至少約2000mg/kg。IaIp治療的劑量和頻率將取決于受治療的疾病或病狀和患者疾病或病狀的嚴(yán)重程度及其它因素。V1.具體實施方案一方面，本發(fā)明提供了由血漿制備富含IaIp的組合物的方法，所述方法包括步驟:(a)提供cryo-poor血楽;成分；(b)在至少第一乙醇沉淀反應(yīng)中使IaIp從所述cryo-poor血楽;成分中沉淀以形成含IaIp的沉淀物；和(C)從所述含IaIp的沉淀物中萃取Ialp，從而形成富含IaIp的組合物；其中IaIp-沉淀物選自成分II+III濾餅、成分I沉淀物、成分I+II+III沉淀物、成分II+III沉淀物、成分IV-1、Kistler-Nitschmann沉淀物A 和 Kistler-Nitschmann 沉淀物 B。一方面，本發(fā)明提供了由血漿制備富含間- α -抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟:(i)由血漿樣品形成成分II+III沉淀物；(ii)使所述成分II+III沉淀物再懸浮以形成成分II+III懸浮液；(iii)使所述成分II+III懸浮液與固相接觸以從所述成分II+III懸浮液中去除所述IaIp ;和(iv)從所述固相中萃取所述Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述固相包含二氧化硅細(xì)粉(SiO2)。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述方法包括步驟:(a)在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下,用約6%至約10%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血漿成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液；(b)在第二沉淀步驟中，在介于約6.7和約
7.3之間的pH下，用約20%至約25%的醇使IaIp從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物；(c)使所述第二沉淀物再懸浮以形成懸浮液；(d)使二氧化硅細(xì)粉(SiO2)與來自步驟(C)的所述懸浮液混合；(e)用壓濾機過濾所述懸浮液，從而形成濾餅和上清液；和(f)用IaIp萃取緩沖液從所述濾餅中萃取Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。一方面，本發(fā)明提供了由血漿制備富含間- α -抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟:(a)使IaIp從血漿樣品中沉淀以獲得沉淀物；(b)用IaIp萃取緩沖液從所述沉淀物中萃取Ialp，從而制備富含IaIp的組合物，其中所述沉淀物為成分1、成分I+II+II1、成分11+111、成分IV-1、沉淀物A或沉淀物B沉淀物。在以上提供的方法的一個實施方案中，形成成分I沉淀物的步驟包括在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下,用約6%至約10%的醇使IaIp從cryo-poor血漿成分中沉淀以獲得 成分I沉淀物。在以上提供的方法的一個實施方案中，其中從成分IV-1沉淀物萃取Ialp，所述方法包括步驟:(a)在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下，用約6%至約10%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血衆(zhòng)成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液；(b)在第二沉淀步驟中，在介于約6.7和約7.3之間的pH下，用約20%至約25%的醇使蛋白質(zhì)從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物和第二上清液；(c)在第三沉淀步驟中，在介于約5.0和約5.5之間的pH下，用約18%至約23%的醇使IaIp從所述第二上清液中沉淀以形成第三沉淀物和第三上清液；和(d)用IaIp萃取緩沖液從所述第三沉淀物中萃取Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。在以上提供的方法的一個實施方案中，其中從成分IV-1沉淀物萃取Ialp，所述方法包括步驟:(a)在第一沉淀步驟中，在介于約6.7和約7.2之間的pH下，用約18%至約23%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血衆(zhòng)成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液；(b)在第二沉淀步驟中，在介于約5.0和約5.5之間的pH下,用約18%至約25%的醇使IaIp從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物和第二上清液；和(c)用IaIp萃取緩沖液從所述第二沉淀物中萃取Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。在以上提供的方法的一個實施方案中，從一種以上的沉淀物成分萃取Ialp。一方面，本發(fā)明提供了由血漿制備富含間- α -抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟:(a)分離單一等分試樣的血漿以獲得除IaIp外的至少兩種血液制品的富集組合物；(b)用一種或多種萃取緩沖液從血漿分離期間產(chǎn)生的至少兩種不同丟棄成分中萃取IaIp ;和(C)匯合萃取的IaIp成分,從而制備富含IaIp的組合物。在以上提供的方法的一個實施方案中，分離血漿以獲得IgG免疫球蛋白和白蛋白的富集組合物。在以上提供的方法的一個實施方案中，分離所述血漿以獲得除IaIp外的至少3種血液制品。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述方法進一步包括步驟:(g)在附加沉淀步驟中，使雜質(zhì)從所述富含IaIp的組合物中沉淀，從而形成含IaIp的上清液。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述附加沉淀步驟包括在介于約6.0和約
8.0之間的pH下，用約10%至約19%的醇沉淀。一方面，本發(fā)明提供了一種由血漿制備富含IaIp的組合物的方法，所述方法包括步驟:(a)從選自成分II+III濾餅、成分I沉淀物、成分I+II+III沉淀物、成分II+III沉淀物、成分IV-1沉淀物、沉淀物A沉淀物或沉淀物B沉淀物的血漿成分萃取IaIp ;和(b)在附加沉淀步驟中，使雜質(zhì)從所述富含IaIp的組合物中沉淀，從而制備富含IaIp的組合物。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述方法進一步包括步驟:(h)在附加沉淀步驟中，使IaIp沉淀。在以上提供的方法的一個實施方案中，在介于約6.0和約8.0之間的pH下，用約20%至約25%的醇沉淀Ialp。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述方法進一步包括步驟:(g)使來自所述富含IaIp的組合物的IaIp與陰離子交換樹脂結(jié)合；和(h)用洗脫緩沖液從所述陰離子交換樹脂洗脫所述Ialp，從而形成含有IaIp的第一洗脫液。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述方法進一步包括步驟:(i)使來自所述第一洗脫液的IaIp與肝素親和樹脂結(jié)合；和(j)用洗脫緩沖液從所述肝素親和樹脂洗脫所述Ialp，從而形成含有IaIp的第二洗脫液。在以上提供的方法 的一個實施方案中，進一步富集所述第一或第二洗脫液中存在的 IaIp0在以上提供的方法的一個實施方案中，至少一個沉淀步驟包括噴霧添加醇。在以上提供的方法的一個實施方案中，所有沉淀步驟均包括噴霧添加醇。在以上提供的方法的一個實施方案中，在第一沉淀步驟、第二沉淀步驟或第三沉淀步驟的至少一步中添加醇之后，通過添加pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)所述溶液的pH。在以上提供的方法的一個實施方案中，在所有沉淀步驟中添加醇之后，通過添加pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)所述溶液的pH。在以上提供的方法的一個實施方案中，添加pH調(diào)節(jié)劑包括噴霧添加pH調(diào)節(jié)劑。在以上提供的方法的一個實施方案中，在添加醇之前和之后，在添加醇期間和之后，或在添加醇之前、期間和之后調(diào)節(jié)沉淀步驟的pH。在以上提供的方法的一個實施方案中，對于整個沉淀步驟而言，通過不斷調(diào)節(jié)pH維持沉淀步驟的pH。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述萃取IaIp的步驟包括使IaIp萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有選自以下的血漿成分的壓濾機:成分II+III濾餅、成分1、成分I+II+II1、成分11+111、成分IV-1、沉淀物A或沉淀物B沉淀物。在以上提供的方法的一個實施方案中，使所述IaIp萃取緩沖液再循環(huán)通過壓濾機至少約IOmin。在以上提供的方法的一個實施方案中，使所述IaIp萃取緩沖液再循環(huán)通過壓濾機至少約30min。
在以上提供的方法的一個實施方案中，所述IaIp萃取緩沖液的pH與至少一種IaIp蛋白的等電點相差至少約0.3個單位。一方面，本發(fā)明提供了一種由血漿制備富含間-α-抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟:(a)從cryo-poor血衆(zhòng)分離期間形成的沉淀物中萃取IaIp,其中所述萃取物含有IaIp和因子H ； (b)使所述IaIp和因子H與陰離子交換樹脂結(jié)合；(c)用第一洗脫緩沖液從所述樹脂洗脫因子H ;和(d)用第二洗脫緩沖液從所述樹脂洗脫Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。一方面，本發(fā)明提供了一種由血漿制備富含間-α -抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟:(a)從cryo-poor血衆(zhòng)分離期間形成的沉淀物中萃取IaIp,其中所述萃取物含有IaIp和因子H ; (b)在因子H不與陰離子交換樹脂結(jié)合的條件下，使IaIp與陰離子交換樹脂結(jié)合；和(C)用洗脫緩沖液從所述樹脂洗脫Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述方法進一步包括步驟:(e)使所述富含IaIp的組合物中的IaIp與肝素親和柱結(jié)合；和(f)從所述肝素親和柱洗脫Ialp。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述富含IaIp的組合物進一步進行至少一個病毒滅活步驟。在以上提供的方法的 一個實施方案中，所述病毒滅活步驟包括用溶劑和/或洗滌劑處理、納米過濾、熱處理或在低pH下孵育。在以上提供的方法的一個實施方案中，分離單一間- α -抑制蛋白(IaIp)種類。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述IaIp種類為間_ α _胰蛋白酶抑制劑(IaI)。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述IaIp種類為前_α -抑制劑(PaI)。在以上提供的方法的一個實施方案中，通過抗體親和法分離所述IaIp種類。—方面，本發(fā)明提供了一種通過根據(jù)權(quán)利要求1-40中任一項的方法制備的IaIp水溶液。在以上提供的IaIp溶液的一個實施方案中，所述溶液的至少90%的蛋白質(zhì)含量為IaIp0一方面，本發(fā)明提供了一種通過根據(jù)權(quán)利要求1-40中任一項的方法制備的IaIp藥物組合物。在以上提供的IaIp藥物組合物的一個實施方案中，所述溶液的至少95%的蛋白質(zhì)含量為Ialp。在以上提供的IaIp藥物組合物的一個實施方案中，配制所述組合物用于靜脈內(nèi)施用。在以上提供的IaIp藥物組合物的一個實施方案中，所述組合物包含IaIp的凍干制劑。一方面，本發(fā)明提供了一種治療有需要的受試者與IaIp功能障礙相關(guān)的疾病或病癥的方法，所述方法包括施用治療有效劑量的通過根據(jù)權(quán)利要求1-40中任一項的方法制備的IaIp組合物。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述與IaIp功能障礙相關(guān)的疾病或病癥為敗血癥。—方面，本發(fā)明提供了一種治療有需要的受試者與血漿絲氨酸蛋白酶活性增強相關(guān)的疾病或病癥的方法，所述方法包括施用治療有效劑量的通過根據(jù)權(quán)利要求1-40中任一項的方法制備的IaIp組合物。在以上提供的方法的一個實施方案中，所述與血漿絲氨酸蛋白酶活性增強相關(guān)的疾病或病癥選自敗血癥、敗血性休克、內(nèi)毒素性休克、彌散性血管內(nèi)凝血、纖維增生、炭疽中毒、癌癥轉(zhuǎn)移、手術(shù)期間的組織損傷、腎病、血管疾病、凝血病、糖尿病和全身炎癥。VI1.實施例僅通過說明的方式而不通過限制的方式提供下列實施例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將易于認(rèn)識到可改變或修改以獲得基本上相同或相似的結(jié)果的多種非關(guān)鍵參數(shù)。實施例1為確定由血漿樣品生產(chǎn)間- α -抑制劑(IaIp)的經(jīng)濟上有益的方案，所述方案允許從相同血漿樣品中回收另外的血液因子，根據(jù)圖2所示流程圖中概述的方案使大量人混合血漿進行工業(yè)分離。工業(yè)分離過程中IaIp之后的命運是使用對小亞單位bikunin有特異性的抗體進行蛋白質(zhì)印跡。由于IaI和PaI之間的大小差異，抗bikunin抗體允許鑒定分離過程中的兩種蛋白質(zhì)，基于其在SDS-PAGE凝膠上的遷移對兩種蛋白質(zhì)進行區(qū)分(圖3)。如圖3所見，將混合血漿樣品中存在的大部分IaIp分為3個主要成分，成分I沉淀物、成分II+III沉淀物濾餅和成分IV-1沉淀物。有利的是，在IgG(成分I沉淀物和成分II+III濾餅)和白蛋白(成分I和成分IV-1沉淀物)生產(chǎn)期間通常將這3種成分全部丟棄。同樣，假定可從這些成分中純化IaI和Pal，無需修改IgG和白蛋白生產(chǎn)過程。實施例2`本實施例描述了為確定從成分II+III濾餅萃取IaIp的可行性進行的實驗。簡言之，按25:1的比例(緩沖液mL:濾餅g)將來自實施例1中進行的血漿分離的成分II+III濾餅溶于IaIp萃取緩沖液(25mM Tris (pH8.0) ；5mM EDTA ；200mM NaCl)中。通過離心并濾過0.45μπι過濾器使溶解的蛋白質(zhì)溶液澄清。然后通過用低鹽萃取緩沖液(25mMTris (pH8.0) ；5mM EDTA)按3:1稀釋溶液調(diào)節(jié)所得懸浮液的導(dǎo)電率。然后將澄清的成分II+III濾餅懸浮液載至用低鹽緩沖液(25mM Tris ；5mM EDTA ；50mM NaCl ；pH8.0)平衡的DEAE-瓊脂糖色譜柱上。然后使用從50mM NaCl至500mMNaCl (25mM Tris ；5mM EDTA ；NaCl ；pH8.0)的線性梯度從DEAE-瓊脂糖柱洗脫 Ialp，如圖 4A所示通過色譜法略微收集其洗脫液。通過蛋白質(zhì)印跡分析對洗脫液成分的樣品進行分析(圖4B和4C)以確定在3個主峰的第3個峰值中IaIp從陰離子交換柱洗脫?；谶M行的色譜法和凝膠分析匯合來自DEAE-瓊脂糖色譜洗脫的含有IaIp的第三洗脫峰成分，濃縮并且通過緩沖液交換降低導(dǎo)電率。然后將IaIp溶液負(fù)載至用低鹽緩沖液(25mM Tris (pH8.0) ；5mMEDTA ；50mM NaCl)平衡的肝素-瓊脂糖色譜柱上。然后使用50mMNaCl 至 500mM NaCl (25mM Tris (pH8.0) ；5mM EDTA ;NaCI)的線性梯度從 DEAE-瓊脂糖柱洗脫Ialp，如圖5A所示通過色譜法略微收集其洗脫液。通過蛋白質(zhì)印跡分析對洗脫液成分的樣品進行分析。如圖5B中可見，在單峰中IaIp從肝素-瓊脂糖柱中洗脫，從而提供了純凈IaIp組合物。實施例3
為了在萃取后通過工業(yè)規(guī)模擴大幫助IaIp純化，設(shè)計了替代純化方案以用更適合大規(guī)模生產(chǎn)過程的一系列步驟洗脫代替色譜柱的鹽梯度洗脫。簡言之，將從如實施例2中所述的成分Π+ΙΙΙ濾餅萃取的IaIp組合物負(fù)載至用低鹽緩沖液(25mM Tris ；5mM EDTA ；65mMNaCl ;pH8.0)平衡的DEAE-瓊脂糖色譜柱上。負(fù)載的導(dǎo)電率與平衡緩沖液相似(約9mS/cm)。負(fù)載之后，用含有5個柱體積(CV)的65mMNaCl的緩沖液洗滌所述柱以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。如圖7C中的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果所示，流過成分含有極少Ialp。在第一步洗脫中，將5CV的緩沖液(25mM Tris (pH8.0) ；5mM EDTA ；NaCl)的鹽濃度升高至IOOmM NaCl(導(dǎo)電率12.6mS/cm)以洗脫與所述柱結(jié)合的因子H。然后將6CV的緩沖液的鹽濃度升高至155mM NaCl (導(dǎo)電率18mS/cm)以從所述柱洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，這種中間洗滌成分含很少IaIp(圖7C)。然后通過將所述柱的鹽濃度升高至230mM NaCl (導(dǎo)電率為約25mS/cm)從所述柱中洗脫出Ialp。如圖7A中提供的色譜所見，在肩后的尖峰中IaIp脫離所述柱。相應(yīng)考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠(圖7B)和蛋白質(zhì)印跡(圖7C)顯示，大部分因子H處于峰值。將來自230mM NaCl洗脫液的大部分IaIp成分匯合在一起。為降低匯合IaIp成分的鹽濃度，用低鹽緩沖液透析樣品以將導(dǎo)電率降低至約8mS/cm(大約50mM NaCl)。然后使樣品通過0.45 μ m過濾器以去除任何微粒。然后將濾過樣品負(fù)載至用低鹽緩沖液(25mMTris(pH8.0) ；5mM EDTA ；50mM NaCl)平衡的肝素-瓊脂糖色譜柱上。負(fù)載之后，用含有5個柱體積(CV)的50mM NaCl的緩沖液洗滌所述柱以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。如圖8C中的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果所示，流過成分含有極少Ialp。在第一步洗脫中，將緩沖液(25mM Tris ；5mM EDTA ；NaCl ；pH8.0)的鹽濃度升高至80mM NaCl從所述柱洗脫Ialp。SDS-PAGE(圖8B)和蛋白質(zhì)印跡(圖8C)分析顯示，所得IaIp混合物含有一些可通過尺寸排阻色譜法、超濾/滲濾和本領(lǐng)域眾所周知的其它方法去除的低分子量雜質(zhì)。用含有107mM NaCl的緩沖液進行第二洗脫步驟并且從所述柱洗脫另一 IaIp峰值成分。這種成分未檢測到任何雜質(zhì)?？尚薷倪@種方法以優(yōu)化所述過程。在一個實施方案中，例如用含有高于80mM NaCl的緩沖液單次洗脫，可一步洗脫所有Ialp。仍可在50mMNaCl下進行負(fù)載和洗滌，并且例如可用含有107mM NaCl的緩沖液進行因子H洗脫。負(fù)載之后增加在50mM NaCl或低于80mM NaCl的鹽濃度下的延時洗滌以試圖從IaIp混合物中去除更弱結(jié)合的雜質(zhì)?？尚薷囊陨仙V步驟以使用除pH8的Tris/EDTA外的緩沖體系?？墒惯@些過程適合于生物制藥的生產(chǎn)中常用的緩沖液和溶液。實例為使用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液的純化方案。成功純化的關(guān)鍵因素是操縱導(dǎo)電率或離子強度以實現(xiàn)所需化合物的分離。如果將緩沖體系的PH維持在pH8.0，那么洗脫緩沖液的導(dǎo)電率必須與此時所需的純化工藝相匹配。如果改變緩沖體系的PH，將需要對離子強度做一些調(diào)節(jié)，這可用用于優(yōu)化色譜過程的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行。應(yīng)理解，本文所述的實施例和實施方案僅僅是為了說明的目的，并且將對本領(lǐng)域的技術(shù)人員建議根據(jù)實施例和實施方案的各種修改或改變并且將包括在本申請的精神和范圍以及所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。 本文引用的所有出版物、專利和專利申請據(jù)此通過引用整體并入用于所有目的。
權(quán)利要求
1.一種由血漿制備富含IaIp的組合物的方法，所述方法包括步驟: (a)提供cryo-poor血楽;成分； (b)在至少第一こ醇沉淀反應(yīng)中使IaIp從所述cryo-poor血楽;成分中沉淀以形成含IaIp的沉淀物；和 (C)從所述含IaIp的沉淀物中萃取IaIp,從而形成富含IaIp的組合物； 其中IaIp-沉淀物選自成分II+III濾餅、成分I沉淀物、成分I+II+III沉淀物、成分II+III 沉淀物、成分 IV-1、Kistler-Nitschmann 沉淀物 A 和 Kistler-Nitschmann 沉淀物B0
2.—種由血漿制備富含間-a-抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟: (i)由血漿樣品形成成分II+III沉淀物； (ii)使所述成分II+III沉淀物再懸浮以形成成分II+III懸浮液； (iii)使所述成分II+III懸浮液與固相接觸以從所述成分II+III懸浮液中去除所述IaIp ;和 (iv)從所述固相中萃取所述IaIp,從而制備富含IaIp的組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述固相包含ニ氧化硅細(xì)粉(SiO2)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述方法包括步驟: (a)在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下,用約6%至約10%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血楽;成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液； (b)在第二沉淀步驟中，在介于約6.7和約7.3之間的pH下，用約20%至約25%的醇使IaIp從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物； (C)使所述第二沉淀物再懸浮以形成懸浮液； (d)使ニ氧化硅細(xì)粉(SiO2)與來自步驟(C)的所述懸浮液混合； (e)用壓濾機過濾所述懸浮液，從而形成濾餅和上清液；和 (f)用IaIp萃取緩沖液從所述濾餅中萃取Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。
5.一種由血漿制備富含間-a-抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟: (a)使IaIp從血漿樣品中沉淀以獲得沉淀物； (b)用IaIp萃取緩沖液從所述沉淀物中萃取Ialp，從而制備富含IaIp的組合物， 其中所述沉淀物為成分1、成分I+II+II1、成分11+111、成分IV-1、沉淀物A或沉淀物B沉淀物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中形成成分I沉淀物的步驟包括在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下,用約6%至約10%的醇使IaIp從cryo-poor血衆(zhòng)成分中沉淀以獲得成分I沉淀物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中從成分IV-1沉淀物中萃取Ialp，所述方法包括步驟: (a)在第一沉淀步驟中，在介于約7.0和約7.5之間的pH下,用約6%至約10%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血楽;成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液； (b)在第二沉淀步驟中，在介于約6.7和約7.3之間的pH下，用約20%至約25%的醇使蛋白質(zhì)從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物和第二上清液； (c)在第三沉淀步驟中，在介于約5.0和約5.5之間的pH下，用約18%至約23%的醇使IaIp從所述第二上清液中沉淀以形成第三沉淀物和第三上清液； (d)用IaIp萃取緩沖液從所述第三沉淀物中萃取Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中從成分IV-1沉淀物中萃取Ialp，所述方法包括步驟: (a)在第一沉淀步驟中，在介于約6.7和約7.2之間的pH下，用約18%至約23%的醇使蛋白質(zhì)從cryo-poor血楽;成分中沉淀以獲得第一沉淀物和第一上清液； (b)在第二沉淀步驟中，在介于約5.0和約5.5之間的pH下，用約18%至約25%的醇使IaIp從所述第一上清液中沉淀以形成第二沉淀物和第二上清液；和 (C)用IaIp萃取緩沖液從所述第二沉淀物中萃取Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中從ー種以上的沉淀物成分中萃取ialp。
10.一種由血漿制備富含間-a-抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟: (a)分離單一等分試樣的血漿以獲得除IaIp外的至少兩種血液制品的富集組合物； (b)用一種或多種萃取緩沖液從血漿分離期間產(chǎn)生的至少兩種不同丟棄成分中萃取IaIp ;和 (C)匯合萃取的IaIp成分，從而制備富含IaIp的組合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中分離所述血漿以獲得IgG免疫球蛋白和白蛋白的富集組合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其中分離所述血漿以獲得除IaIp外的至少3種血液制品。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，進ー步包括步驟: (g)在附加沉淀步驟中，使雜質(zhì)從所述富含IaIp的組合物中沉淀，從而形成含IaIp的上清液。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述附加沉淀步驟包括在介于約6.0和約8.0之間的pH下，用約10%至約19%的醇沉淀。
15.一種由血漿制備富含IaIp的組合物的方法，所述方法包括步驟: (a)從選自成分II+III濾餅、成分1、成分I+II+II1、成分11+111、成分IV-1、沉淀物A或沉淀物B沉淀物的血漿成分萃取IaIp ;和 (b)在附加沉淀步驟中，使雜質(zhì)從所述富含IaIp的組合物中沉淀,從而制備富含IaIp的組合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的方法，進ー步包括步驟: (h)在附加沉淀步驟中，使IaIp沉淀。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中在介于約6.0和約8.0之間的pH下，用約20%至約25%的醇沉淀Ialp。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項所述的方法，進ー步包括步驟: (g)使來自所述富含IaIp的組合物的IaIp與陰離子交換樹脂結(jié)合；和 (h)用洗脫緩沖液從所述陰離子交換樹脂洗脫所述Ialp，從而形成含有IaIp的第一洗脫液。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，進ー步包括步驟:(i)使來自所述第一洗脫液的IaIp與肝素親和樹脂結(jié)合；和 (j)用洗脫緩沖液從所述肝素親和樹脂洗脫所述Ialp，從而形成含有IaIp的第二洗脫液。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中進ー步富集所述第一或第二洗脫液中存在的所述Ialp。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的方法，其中至少ー個沉淀步驟包括噴霧添加醇。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所有沉淀步驟均包括噴霧添加醇。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項所述的方法，其中在第一沉淀步驟、第二沉淀步驟或第三沉淀步驟的至少ー步中添加醇之后，通過添加PH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)所述溶液的pH。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中在所有沉淀步驟中添加醇之后，通過添加pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)所述溶液的pH。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中添加pH調(diào)節(jié)劑包括噴霧添加pH調(diào)節(jié)劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項所述的方法，其中在添加醇之前和之后，在添加醇期間和之后，或在添加醇之前、期間和之后調(diào)節(jié)沉淀步驟的pH。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項所述的方法，其中對于整個沉淀步驟而言，通過不斷調(diào)節(jié)pH維持沉淀步驟的pH。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項所述的方法，其中所述萃取IaIp的步驟包括使IaIp萃取緩沖液再循環(huán)通過裝有選自以下的血漿成分的壓濾機:成分II+III濾餅、成分1、成分I+II+II1、成分11+111、成分IV-1、沉淀物A或沉淀物B沉淀物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中使所述IaIp萃取緩沖液再循環(huán)通過壓濾機至少約 IOmin。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中使所述IaIp萃取緩沖液再循環(huán)通過壓濾機至少約 30min。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項所述的方法，其中所述IaIp萃取緩沖液的pH與至少ー種IaIp蛋白的等電點相差至少約0.3個單位。
32.—種由血漿制備富含間-a-抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟: (a)從cryo-poor血楽;分離期間形成的沉淀物中萃取IaIp,其中所述萃取物含有IaIp和因子H; (b)使所述IaIp和因子H與陰離子交換樹脂結(jié)合； (C)用第一洗脫緩沖液從所述樹脂洗脫所述因子H ;和 (d)用第二洗脫緩沖液從所述樹脂洗脫所述Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。
33.一種由血漿制備富含間-a-抑制劑(IaIp)的組合物的方法，所述方法包括步驟: (a)從cryo-poor血楽;分離期間形成的沉淀物中萃取IaIp,其中所述萃取物含有IaIp和因子H; (b)在因子H不與陰離子交換樹脂結(jié)合的條件下，使所述IaIp與陰離子交換樹脂結(jié)合；和 (C)用洗脫緩沖液從所述樹脂洗脫所述Ialp，從而制備富含IaIp的組合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的方法，其中所述方法進ー步包括步驟:(e)使所述富含IaIp的組合物中的所述IaIp與肝素親和柱結(jié)合；和 (f)從所述肝素親和柱洗脫所述Ialp。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-34中任一項所述的方法，其中所述富含IaIp的組合物進ー步進行至少ー個病毒滅活步驟。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述病毒滅活步驟包括用溶劑和/或洗滌劑處理、納米過濾、熱處理或在低PH下孵育。
37.根據(jù)權(quán)利要求1-36中任一項所述的方法，其中分離單ー間-a -抑制蛋白(IaIp)種類。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述IaIp種類為間-a-胰蛋白酶抑制劑(IaI)。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述IaIp種類為前-a-抑制劑(Pal)。
40.根據(jù)權(quán)利要求37-39中任一項所述的方法，其中通過抗體親和法分離所述IaIp種類。
41.一種通過根據(jù)權(quán)利要求1-40中任ー項的方法制備的IaIp水溶液。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的水溶液，其中所述溶液的至少90%的蛋白質(zhì)含量為Ialp。
43.一種通過根據(jù)權(quán)利要求1-40中任ー項的方法制備的IaIp藥物組合物。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中所述溶液的至少95%的蛋白質(zhì)含量為ialp。
45.根據(jù)權(quán)利要求43或44所述的藥物組合物，其中配制所述組合物用于靜脈內(nèi)施用。
46.根據(jù)權(quán)利要求43或44所述的藥物組合物，其中所述組合物包含IaIp的凍干制劑。
47.一種治療有需要的受試者與IaIp功能障礙相關(guān)的疾病或病癥的方法，所述方法包括施用治療有效劑量的通過根據(jù)權(quán)利要求1-40中任ー項的方法制備的IaIp組合物。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述與IaIp功能障礙相關(guān)的疾病或病癥為敗血癥。
49.一種治療有需要的受試者與血漿絲氨酸蛋白酶活性增強相關(guān)的疾病或病癥的方法，所述方法包括施用治療有效劑量的通過根據(jù)權(quán)利要求1-40中任ー項的方法制備的IaIp組合物。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述與血漿絲氨酸蛋白酶活性增強相關(guān)的疾病或病癥選自敗血癥、敗血性休克、內(nèi)毒素性休克、彌散性血管內(nèi)凝血、纖維增生、炭疽中毒、癌癥轉(zhuǎn)移、手術(shù)期間的組織損傷、腎病、血管疾病、凝血病、糖尿病和全身炎癥。
全文摘要
本發(fā)明提供了源自血漿的IaIp的組合物和藥物制劑。還提供了生產(chǎn)IaIp組合物和制劑的方法，以及治療與IaIp功能障礙相關(guān)的疾病的方法。
文檔編號C07K14/81GK103119058SQ201180045767
公開日2013年5月22日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者S·F·貝爾斯托, J·哈策爾, S·拉馬錢德蘭 申請人:巴克斯特國際公司, 巴克斯特保健股份有限公司