改善的tnf結合蛋白的制作方法
【專利說明】改善的TNF結合蛋白
[OOCM] 相關申請
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請系列號U.S. 61/788, 113的優(yōu) 先權，其通過引用W其整體并入本文。
[0003] 該申請也涉及2013年1月22日提交的美國臨時申請系列號61/755, 288,2012年 12月28日提交的美國臨時申請系列號61/746, 616,和2012年12月28日提交的美國臨時 申請系列號61/746, 617,其每一篇通過引用W它們的整體并入本文。
[0004] 背景
[0005] 治療性組織壞死因子a(TNFa)結合蛋白的使用，比如英夫利昔單抗、阿達木單 抗、依郝西普、戈利木單抗和賽巧珠單抗已經(jīng)徹底改革了許多慢性炎性疾病，包括炎性腸炎 (IBD)、強直性脊柱炎、多發(fā)性硬化、牛皮癖和風濕性關節(jié)炎（RA)的治療。盡管它們成功改 善了患者的生命質(zhì)量，但是用治療性TNF結合蛋白的長期治療引起強的免疫原性應答，其 使得產(chǎn)生抗藥物抗體（ADA)。送樣的ADA應答可影響治療性TNF結合蛋白的安全性和藥物 動力學，其接著可影響送些藥物的用途和效力。因此，本領域需要新的TNF結合蛋白，用作 在患者中較少免疫原性的療法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本公開提供了新的TNF結合蛋白和使用其治療的方法。也提供了編碼結合蛋白的 核酸和制備送樣的結合蛋白的重組表達載體和宿主細胞。本公開至少部分基于下述發(fā)現(xiàn)： 二價TNF結合蛋白（例如，抗TNF單克隆抗體）可結合抗原呈遞細胞的細胞表面上的TNF 并且內(nèi)化。本文公開的結合蛋白一般展示單價結合細胞-表面TNFa(即，每個結合蛋白僅 能夠結合抗原呈遞的表面上的一個TNF分子）。
[0007] 因此，在一個方面中，本公開提供特異性結合人TNF的結合蛋白，其中結合蛋白 包括抗體可變區(qū)和Fc區(qū)域，和其中和結合蛋白當結合細胞表面人TNF時展示的細胞內(nèi)化的 數(shù)量小于抗人TNF參考抗體（例如，英夫利昔單抗，阿達木單抗，或戈利木單抗）展示的細 胞內(nèi)化的數(shù)量。在某些實施方式中，結合蛋白單價結合抗原呈遞細胞上的細胞表面人TNF。
[0008] 在某些實施方式中，結合蛋白包括第一多膚鏈和第二多膚鏈，
[0009] 其中第一多膚鏈包括VDH-狂1)n-C-Y1，其中
[0010] VDH是重鏈可變區(qū)，
[0011] XI是連接體，條件是其不是CH1，
[001引C是CH1結構域，
[001引Y1是Fc區(qū)域，
[0014]n是0或 1;
[001引 和
[0016] 其中第二多膚鏈包括VDka3)m-C，其中
[0017] VDL是輕鏈可變區(qū)，
[0018] X3是連接體，條件是其不是CH1,
[001引C是化1，
[0020] m是 0 或 1 ;
[0021] 其中X2包括抑制Y1的同源二聚化的至少一個突變。在一個具體的實施方式中， Y1包括選自表3中提出的組的氨基酸序列。在一個具體的實施方式中，XI和/或X3包括 表1中提出的氨基酸序列。在一個具體的實施方式中，VDH包括英夫利昔單抗、阿達木單 抗、培化賽巧珠單抗或戈利木單抗的重鏈CDR或全部的VH結構域氨基酸序列。在一個具體 的實施方式中，VDL包括英夫利昔單抗、阿達木單抗、培化賽巧珠單抗或戈利木單抗的輕鏈 CDR或全部的化結構域氨基酸序列。
[0022] 在某些實施方式中，結合蛋白包括第一多膚鏈和第二多膚鏈，其中第一多膚鏈包 括VDH1-狂1)n-VD肥-X2-狂3)m-Yl，其中：
[0023]V畑1是第一重鏈可變區(qū)；
[0024]XI是連接體，條件是XI不是CH1;
[0025]V畑2是第二重鏈可變區(qū)；
[0026]X2 是CH1;
[0027]X3是連接體；
[0028]Y1 是Fc區(qū)域；
[0029]n是0 或l，m是0 或 1;
[0030]和
[0031] 其中第二多膚鏈包括VDL1-狂4)m-VDL2-X5,其中：
[0032]VDL1是第一輕鏈可變區(qū)；
[003引X4是連接體，條件是X4不是CH1;
[0034]VDL2是第二輕鏈可變區(qū)；
[0035]X5 是化1;
[0036]m是 0 或 1，
[0037] 其中Y1包括抑制Y1的同源二聚化的至少一個突變。在一個具體的實施方式中， XI、X2和/或X4包括表1中提出的氨基酸序列。在一個具體的實施方式中，Y1包括表3中 提出的氨基酸序列。在一個具體的實施方式中，VDH1和/或VDH2包括英夫利昔單抗、阿達 木單抗、培化賽巧珠單抗或戈利木單抗的重鏈CDR或全部的VH結構域氨基酸序列。在一個 具體的實施方式中，VDL1和/或VDL2包括英夫利昔單抗、阿達木單抗、培化賽巧珠單抗或 戈利木單抗的輕鏈CDR或全部的化結構域氨基酸序列。
[0038] 在某些實施方式中，結合蛋白包括四條多膚鏈，
[0039] 其中所述四條多膚鏈的兩條包括VDH-狂l)n-C-Yl，其中
[0040]VDH是重鏈可變區(qū)，
[0041]XI是連接體，條件是其不是CH1，
[004引C是CH1結構域，
[0043]Y1 是Fc區(qū)域，
[0044] n是 0 或 1;
[0045]和
[0046]其中所述四條多膚鏈的兩條包括VDk狂2)m-X3，其中
[0047]VDL是輕鏈可變區(qū)，
[0048]X2是連接體，條件是其不是CH1，
[004引X3是化結構域，
[0050]m是 0 或 1;
[0051] 其中所述四條多膚鏈的至少一條包括突變，所述突變位于可變區(qū)中，其中所述突 變抑制特定的抗原和突變體結合結構域之間的祀向結合。在一個具體的實施方式中，Y1包 括增強異源二聚化的突變。在一個具體的實施方式中，Y1包括表3中提出的氨基酸序列。 在一個具體的實施方式中，XI和/或X2包括表1提出的氨基酸序列。在一個具體的實施 方式中，VDH包括英夫利昔單抗、阿達木單抗、培化賽巧珠單抗或戈利木單抗的重鏈CDR或 全部的VH結構域氨基酸序列。在一個具體的實施方式中，VDL包括英夫利昔單抗、阿達木 單抗、培化賽巧珠單抗或戈利木單抗的輕鏈CDR或全部的VL結構域氨基酸序列。
[0052] 在某些實施方式中，結合蛋白包括四條多膚鏈，
[0053] 其中所述四條多膚鏈的兩條包括V畑1-狂l)n-VD肥-C-Y1，其中
[0054]V畑1是第一重鏈可變區(qū)，
[0055]V畑2是第二重鏈可變區(qū)，
[0056] C是重鏈恒定結構域，
[0057] XI是連接體，條件是其不是CH1，
[0058]Y1 是Fc區(qū)域，
[0059]n是 0 或 1;
[0060]和
[0061] 其中所述四條多膚鏈的兩條包括VDL1-狂2)m-VDL2-X3,其中
[0062]VDL1是第一輕鏈可變區(qū)，
[0063]VDL2是第二輕鏈可變區(qū)，
[0064]X2是連接體，條件是其不是CH1，
[00財 X3是化結構域，
[0066]m是 0 或 1;
[0067] 其中所述四條多膚鏈的至少一條包括突變，所述突變位于第一可變區(qū)或第二可變 區(qū)中，其中所述突變抑制特定的抗原和突變體結合結構域之間的祀向結合。在一個具體的 實施方式中，突變位于VDH1和/或VD肥中。在一個具體的實施方式中，突變位于VDL1和 /或VDL2中。在一個具體的實施方式中，Y1包括增強異源二聚化的突變。在一個具體的實 施方式中，Y1包括表3中提出的氨基酸序列。在一個具體的實施方式中，XI和/或X2包 括和表1中提出的氨基酸序列。在一個具體的實施方式中，VDH1和/或VD肥包括英夫利 昔單抗、阿達木單抗、培化賽巧珠單抗或戈利木單抗的重鏈CDR或全部的VH結構域氨基酸 序列。在一個具體的實施方式中，VDL1和/或VDL2包括英夫利昔單抗、阿達木單抗、培化 賽巧珠單抗或戈利木單抗的輕鏈CDR或全部的VL結構域氨基酸序列。
[0068] 在某些實施方式中，結合蛋白包括第一多膚鏈和第二多膚鏈，所述第一多膚鏈包 括VDH-狂l)n-X2-狂3)m-Yl，其中：
[0069] VDH是重鏈可變區(qū)；
[0070]XI是連接體，條件是XI不是CH1;
[0071]X2是CHI;
[007引X3是連接體；
[007引Y1是F區(qū)域；
[0074]n是0或l，m是0或1;
[00巧]并且所述第二多膚包括VDka4)n-X5-狂6)m-Y2,其中：
[0076] VDL是輕鏈可變區(qū)；
[0077] X4是連接體，條件是X4不是CH1;
[0078] X5是化1;
[007引X6是連接體；
[0080]Y2是F區(qū)域；
[008。n是0或l，m是0或1 ;其中Y1和Y2每個包括突變，其中Y1和Y2上的突變增強Y1和Y2之間的相互作用。在一個具體的實施方式中，Y1和/或Y2包括表3中提出的氨基 酸序列。在一個具體的實施方式中，XI，X3，X4,和/或X6包括和表1中提出的氨基酸序列。 在一個具體的實施方式中，VDH包括英夫利昔單抗、阿達木單抗、培化賽巧珠單抗或戈利木 單抗的重鏈CDR或全部的VH結構域氨基酸序列。在一個具體的實施方式中，VDL包括英夫 利昔單抗、阿達木單抗、培化賽巧珠單抗或戈利木單抗的輕鏈CDR或全部的化結構域氨基 酸序列。
[0082] 在某些實施方式中，結合蛋白包括第一多膚鏈和第二多膚鏈，所述第一多膚鏈包 括VDH1-狂1) n-VD肥-X2-狂3)m-Yl，其中：
[0083] V畑1是第一重鏈可變區(qū)；
[0084] XI是連接體，條件是XI不是CH1;
[0085] V畑2是第二重鏈可變區(qū)；
[0086] X2是CH1;
[0087] X3是連接體；
[008引Y1是F區(qū)域；
[0089] n是0或l，m是0或1;
[0090] 并且所述第二多膚包括VDL1-狂4)n-VDL2-X5-狂6)m-Y2,其中：
[0091] VDL1是第一輕鏈可變區(qū)；
[009引X4是連接體，條件是X4不是CH1;
[0093] VDL2是第二輕鏈可變區(qū)；
[0094] X5是化1;
[009引X6是連接體；
[009引Y2是F區(qū)域；
[0097]n是0或1，m是0或1，其中Y1和Y2每個包括突變，其中Y1和Y2上的突變增強Y1和Y2之間的異源二聚化。在一個具體的實施方式中，Y1和/或Y2包括表3中提出的氨 基酸序列。在一個具體的實施方式中，XI和/或X3,包括和表1中提出的氨基酸序列。在 一個具體的實施方式中，VDH1和/或VD肥包括英夫利昔單抗、阿達木單抗、培化賽巧珠單抗 或戈利木單抗的重鏈CDR或全部的VH結構域氨基酸序列。在一個具體的實施方式中，VDL1 和/或VDL2包括英夫利昔單抗、阿達木單抗、培化賽巧珠單抗或戈利木單抗的輕鏈CDR或 全部的化結構域氨基酸序列。
[0098] 在某些實施方式中，結合蛋白包括第一、第二、第H和第四多膚鏈，
[0099] 其中所述第一多膚鏈包括VD1-狂l)n-VD2-CH-狂2)n，其中VD1是第一重鏈可變 區(qū)，VD2是第二重鏈可變區(qū)，C是CH1結構域，XI是連接體，條件是其不是恒定結構域，和X2 是化區(qū)域；
[0100] 其中所述第二多膚鏈包括VD1-狂l)n-VD2-a-狂2)n，其中VD1是第一輕鏈可變 區(qū)，VD2是第二輕鏈可變區(qū)，CL是輕鏈恒定結構域，XI是連接體，條件是其不是恒定結構域， 和X2不包括Fc區(qū)域；其中所述第H多膚鏈包括VD3-狂3)n-VD4-化-狂4)n，其中VD3是第 H重鏈可變區(qū)，VD4是第四重鏈可變區(qū)，化是輕鏈恒定結構域，X3是連接體，條件是其不是 恒定結構域，和X4是Fc區(qū)域；其中所述第四多膚鏈包括VD3-狂3)n-VD4-CH-狂4)n，其中 VD3是第H輕鏈可變區(qū)，VD4是第四輕鏈可變區(qū)，CH是CH1結構域，X3是連接體，條件是其 不是恒定結構域，和X4不包括Fc區(qū)域；其中n是0或1，和其中第一和第二多膚鏈上的VD1 結構域形成第一抗原的一個功能結合位點，第一和第二多膚鏈上的VD2結構域形成第二抗 原的一個功能結合位點，第H和第四多膚鏈上的VD3結構域形成一個第H抗原的功能結合 位點，和第H和第四多膚鏈上的VD4結構域形成第四抗原的一個功能結合位點。在一個具 體的實施方式中，第一、第二、第H或第四抗原的至少一個是人TNF。
[0101] 在一個具體的實施方式中，X2和/或X4包括增強X2和X4的異源二聚化的至少 一個突變。在一個具體的實施方式中，X2和/或X4包括表3中提出的氨基酸序列。在一 個具體的實施方式中，XI和/或X3,包括和表1中提出的氨基酸序列。在一個具體的實施 方式中，VD1、VD2、VD3和/或VD4包括英夫利昔單抗、阿達木單抗、培化賽巧珠單抗或戈利 木單抗的重鏈CDR、輕鏈CDR、全部的VH結構域，或全部的化結構域氨基酸序列。
[0102] 在某些實施方式中，結合蛋白包括多膚鏈，其中多膚鏈包括RD1-狂)n-VDH-C-Y或 VDH-狂)n-畑 1-C-Y，其中
[0103] 畑1包括受體的配體-結合結構域；
[0104] VDH是重鏈可變區(qū)；
[0105] C是重鏈恒定結構域；
[0106]X是連接體，條件是其不是CH1;
[0107]Y是Fc區(qū)域；和 [010引n是0或1。
[0109] 在一個具體的實施方式中，RD1包括結合人TNF的受體。在一個具體的實施方式 中，RD1包括依郝西普的TNF受體結合部分。在一個具體的實施方式中，VDH包括英夫利昔 單抗、阿達木單抗、培化賽巧珠單抗或戈利木單抗的重鏈CDR，或全部的VH結構域氨基酸序 列。
[0110] 在另一方面中，本公開提供了組合物，其包括前述權利要求任一項所述的結合多 膚和藥學上可接受的載體或賦形劑。
[0111] 在另一方面中，本公開提供了在需要其的對象中治療TNF相關不適的方法，包括 向?qū)ο笫┯糜行Я康谋疚墓_的組合物。
[0112] 在另一方面中，本公開提供了編碼本文公開的結合多膚的分離的多核巧酸。
[0113] 在另一方面中，本公開提供了包括本文公開的多核巧酸的載體。
[0114] 在另一方面中，本公開提供了包括本文公開的多核巧酸或載體的宿主細胞。
【附圖說明】
[0115] 圖1描繪了測量TNFa在LI^S刺激的外周血單核細胞上的表面表達實驗的結果。
[0116] 圖2描繪了測量TNFa在LI^S刺激的外周血單核細胞和T細胞上的表面表達實驗 的結果。
[0117] 圖3描繪了測量通過LPS刺激的外周血單核細胞抗TNFa抗體的內(nèi)化的實驗的結 果。
[0118] 圖4描繪了測量在LPS處理的人單核細胞上TNFa表面表達的實驗的結果。
[0119] 圖5描繪了測量在GM-CSF和LI^S刺激的外周血單核細胞上TNFa的表面表達的 實驗的結果。
[0120] 圖6描繪了測量LPS刺激的細胞上TNFa表面表達的實驗的結果。
[0121] 圖7描繪了測量TNFa在LI^S刺激的源自人單核細胞的樹突細胞表面表達的實驗 的結果。
[0122] 圖8描繪了測量抗TNFa抗體通過LI^S刺激的源自單核細胞的樹突細胞的內(nèi)化實 驗的結果。
[0123] 圖9描繪了測量通過LI^S刺激的外周血單核細胞的抗TNFa抗體的內(nèi)化動力學的 實驗的結果。
[0124] 圖10描繪了如本文公開的示例性半體單價抗TNF抗體和DVD-Ig分子。
[0125] 圖11描繪了如本文公開的示例性AbbmAb單價抗TNF抗體或DVD-Ig分子。
[0126] 圖12描繪了如本文公開的示例性單價免疫球蛋白（M體）分子。
[0127] 圖13描繪了如本文公開的示例性多可變、單價抗TNF多Ig分子。
[012引發(fā)明詳述
[0129] 本公開提供了新的TNF結合蛋白和使用其治療的方法。也提供了編碼結合蛋白的 核酸和制備送樣的結合蛋白的重組表達載體和宿主細胞。本公開至少部分基于下述發(fā)現(xiàn)： 二價TNF結合蛋白（例如，抗TNF單克隆抗體）可結合抗原呈遞細胞的細胞表面上的TNF 并且內(nèi)化。就細胞表面TNF結合而言，本文公開的結合蛋白一般是單價的（即，每個結合蛋 白僅能夠結合抗原呈遞的表面上的一個TNF分子）。 陽130] I.定父
[0131] 除非本文另外定義，結合本發(fā)明使用的科學和技術術語應具有本領域技術人員通 常理解的意思。術語的意思和范圍應是清楚的，但是，萬一任何潛在的不清楚的情況下，W 本文提供的定義為準，而不考慮任何詞典或外部定義。此外，除非上下文另外需要，單數(shù)術 語應包括多個并且復數(shù)術語應包括單數(shù)。一般而言，本文描述的結合細胞和組織培養(yǎng)、分子 生物學、免疫學、微生物學、遺傳學和蛋白質(zhì)和核酸化學和雜交使用的命名，和技術是現(xiàn)有 技術熟知和常用的郝些。
[0132] 為了本發(fā)明可更容易理解，首次定義了某些術語。
[0133] 如本文所使用，術語"單體（monobody)DVD"或"血VD"指單價DVD-Ig分子，如美 國臨時申請系列號61/755, 288中描述，其通過引用W其整體并入本文。
[0134] 如本文所使化術語"多價DVD"或"pDVD"指多價DVD-Ig分子，如在美國臨時申 請系列號61/746, 616中描述，其通過引用W其整體并入本文。
[0135] 如本文所使用，術語"受體DVD"或"rDVD"指受體-DVD-Ig分子，如在美國臨時 申請系列號61/746, 617中描述，其通過引用W其整體并入本文。
[0136] 如本文所使用，術語"英夫利昔單抗"指銷售為REMICADE?的抗TNF抗體，化學 文摘服務（CA巧命名為170277-31-3。
[0137] 如本文所使用，術語"戈利木單抗"指銷售為SIMP0NI?的抗TNF抗體，化學文摘 服務（CA巧命名為476181-74-5。
[0138] 如本文所使用，術語"賽巧珠單抗"指銷售為CIMZIA?的抗TNF抗體，化學文摘服 務（CA巧命名為428863-50-7。
[0139] 如本文所使用，術語"阿達木單抗"指銷售為HUMIRA?的抗TNF抗體，化學文摘服 務（CA巧命名為331731-18-1。
[0140] 如本文所使用，術語"英夫利昔單抗"指銷售為ENBREL?的抗TNF免疫粘合素，化 學文摘服務（CA巧命名為1094-08-2。
[0141]術語"人TNF-a"，如本文所使化旨在指人細胞因子，其展示為17kD分泌形式 和26kD膜結合形式，其生物活性形式由單價結合的17kD分子H聚體組成。人TNF-a的 結構進一步描述在，例如，化nnica,D.，等（1984)化 1:ure312 ;724-729 ;Davis,J.M.，等 (1987)Biochemist巧 26 ; 1322-1326 ;和化nes，E.Y.，等（1989)化Uire338 ;225-228。術 語人TNF-a旨在包括重組人TNF-a，其可通過標準重組表達方法by或商業(yè)上購買（R&D Systems,目錄No. 210-TA,Minneapolis,Minn.)。
[0142] 術語"抗體"，如本文所使用，通常指由四條多膚鏈組成的任何免疫球蛋白（Ig) 分子，兩條重（H)鏈和兩條輕（L)鏈，或任何功能片段、突變體、變體，或其衍生物，其保持Ig 分子的基本的抗原決定部位結合特征