專利名稱：一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑及其測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血漿樣本纖維蛋白原(FIB)含量的測定試劑及其測定方法，屬于臨床檢測試劑及檢測方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血漿纖維蛋白原(FIB)定量測定是臨床上廣泛進行的血凝四項之一(即PT、TT、FIB和APTT)。馮·克勞斯(von Clauss)FIB測定方法屬于功能法測定，是美國國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)推薦的方法。該法的原理是，高濃度凝血酶與低濃度FIB血漿反應(yīng)，F(xiàn)IB含量與血凝時間成反比。通過在雙對數(shù)坐標紙上所做的標準曲線可以查出待測血漿的FIB含量。然而該法存在兩個缺點一、必須使用高濃度的凝血酶，通常為100～200單位/毫升；二、待測血漿必須提前稀釋5～30倍，降低其中的FIB含量。所以，該法成本較高，操作繁瑣，特別是稀釋血漿過程容易產(chǎn)生誤差。美國專利5,292,664和6,448,024通過在高濃度凝血酶溶液中添加凝血酶抑制劑，制成凝血活性降低了的FIB試劑，從而達到直接測定樣本中FIB含量的目的。但該法仍未解決FIB試劑的高成本問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，而提供一種測定方法簡便、測量準確度高、成本低的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑及其測定方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案一、本發(fā)明的試劑的技術(shù)方案，配制本試劑的原料組成及其含量如下凝血酶每毫升本試劑含2-20單位緩沖劑每升本試劑含5-100毫摩爾穩(wěn)定劑每100毫升本試劑含0.05-10克去離子水余量。
所述的凝血酶采用用生化手段從動物血或人血中提取的凝血酶，或者采用基因重組或化學修飾的凝血酶制品。
所述的緩沖劑選自下述中的任一種；HEPES 中文名為N-2-羥乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸TRIS中文名為三(羥甲基)氨基甲烷PB 中文名為磷酸緩沖液MOPSO 中文名為3-(N-嗎啉)-2-羥基丙磺酸。
所述的穩(wěn)定劑選自下述中的一種或幾種無機鹽、有機酸及其鹽類、多羥基化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)；各種穩(wěn)定劑的含量如下無機鹽 每100毫升本試劑含0.1-2克有機酸及其鹽類 每100毫升本試劑含0.1-5克多羥基化合物每100毫升本試劑含0.1-10克氨基酸 每100毫升本試劑含0.5-10克蛋白質(zhì) 每100毫升本試劑含0.05-2克。
所述的無機鹽選自下述中的一種氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、溴化鈣、溴化鈉、溴化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀；所述的有機酸及其鹽類選自下述中的一種乙酸、丙酸、酒石酸、檸檬酸、山梨酸、乙酸鈉、丙酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉、山梨酸鉀；所述的多羥基化合物選自下述中的一種蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；所述的氨基酸選自下述中的一種甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；所述的蛋白質(zhì)選自下述中的一種牛血清白蛋白、明膠。
本試劑(以下簡稱FIB試劑)的理論根據(jù)如下本申請人在試驗中發(fā)現(xiàn)，由低濃度凝血酶組成的FIB試劑(每毫升含2～20個單位的凝血酶)與高濃度FIB血漿(即未經(jīng)稀釋的正常血漿)反應(yīng)，F(xiàn)IB含量仍與血凝時間成反比；用低濃度凝血酶配制FIB試劑和高濃度FIB血漿所制作的標準曲線與用高濃度凝血酶配制的FIB試劑與低濃度FIB血漿所制作的標準曲線具有同樣好的線性相關(guān)(相關(guān)系數(shù)R2大于0.98)。所以用低濃度凝血酶配制的FIB試劑，無需稀釋血漿即可直接測定樣本的FIB含量。
二、本發(fā)明的測定方法的技術(shù)方案如下(1)用含穩(wěn)定劑的緩沖液配制每毫升含2-20單位凝血酶的本試劑；本試劑的PH值范圍為PH7.0-8.0；(2)用配制好的本試劑按常規(guī)方法繪制標準曲線；(3)測定方法a、將本試劑及血漿樣本分別于37℃溫育后，按1∶1的體積比混合；b、記錄血凝時間；c、通過標準曲線求出血漿樣本的纖維蛋白原含量。
所述的凝血酶采用用生化手段從動物血或人血中提取的凝血酶，或者采用基因重組或化學修飾的凝血酶制品。
所述的緩沖劑選自下述中的任一種；HEPES 中文名為N-2-羥乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸TRIS中文名為三(羥甲基)氨基甲烷PB 中文名為磷酸緩沖液MOPSO 中文名為3-(N-嗎啉)-2-羥基丙磺酸。
所述的穩(wěn)定劑選自下述中的一種或幾種無機鹽、有機酸及其鹽類、多羥基化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)；所述的各種穩(wěn)定劑的含量如下無機鹽 每100毫升本試劑含0.1-2克有機酸及其鹽類 每100毫升本試劑含0.1-5克多羥基化合物每100毫升本試劑含0.1-10克氨基酸 每100毫升本試劑含0.5-10克蛋白質(zhì) 每100毫升本試劑含0.05-2克。
所述的無機鹽選自下述中的一種氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、溴化鈣、溴化鈉、溴化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀；所述的有機酸及其鹽類選自下述中的一種乙酸、丙酸、酒石酸、檸檬酸、山梨酸、乙酸鈉、丙酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉、山梨酸鉀；
所述的多羥基化合物選自下述中的一種蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；所述的氨基酸選自下述中的一種甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；所述的蛋白質(zhì)選自下述中的一種牛血清白蛋白、明膠。
本發(fā)明的測定方法的具體方案如下FIB試劑用前先于37℃溫育5分鐘，使本試劑達到所需溫度。將50μl血漿加入血凝儀的比色杯中，37℃溫育1分鐘，立即添加50μl已預(yù)熱至37℃的FIB試劑，記錄血凝時間，改變FIB試劑中的凝血酶濃度使正常樣本(FIB含量為200～400mg/dl)的血凝時間達到6～80秒，更好是10～50秒，最好是15～30秒。
標準曲線制作將參比血漿用咪唑緩沖液進行對倍稀釋，使FIB含量分別達到適宜的濃度梯度，如600mg/dl，300mg/dl、150mg/dl和100mg/dl，分別取此不同濃度的參比血漿50μl于血凝儀的比色杯中，37℃溫育1分鐘，立即添加50μl預(yù)熱至37℃的FIB試劑，記錄血凝時間(s)。以參比血漿的FIB含量(mg/dl)為縱坐標，以相應(yīng)的血凝時間(s)為橫坐標，在雙對數(shù)坐標紙上作標準曲線；或用excel軟件進行線性回歸處理和作圖(見圖1)。
在同樣條件下，待測血漿樣本直接與FIB試劑反應(yīng)，根據(jù)其血凝時間(s)，即可在標準曲線上查出相應(yīng)的FIB含量(mg/dl)。如果將定標點的FIB含量和對應(yīng)的血凝時間(s)依次輸入全自動或半自動血凝儀，測定結(jié)束時，儀器將自動給出待測血漿樣本的FIB含量(mg/dl)。
本發(fā)明的有益效果如下(1)測定時不用稀釋血漿樣本，使測定方法簡便。
(2)與臨床常用的clauss FIB試劑相比(其凝血酶濃度通常為每毫升含100～200個單位)大大降低了凝血酶用量，從而降低了本試劑的制造成本。
(3)提高了測量的準確度，減少了操作誤差。這一優(yōu)點體現(xiàn)在以下3個方面a、使用液體試劑，無需復(fù)溶，不存在瓶間差問題；b、省去了測定過程中的血漿樣本稀釋步驟，避免了稀釋過程產(chǎn)生的誤差；c、制作標準曲線所用定標點的FIB含量涵蓋了正常血漿FIB含量范圍(200～400mg/dl)，避免了稀釋血漿引起的生理環(huán)境變化，因而更符合功能測定方法的要求。


圖1為用本發(fā)明的FIB試劑所作的FIB標準曲線。
具體實施例方式
一、本發(fā)明試劑的實施例如下表

注(1)上表中的凝血酶采用用生化手段從動物血或人血中提取的凝血酶，或者采用基因重組或化學修飾的凝血酶制品。
(2)上表中的緩沖劑選自下述中的任一種；HEPES 中文名為N-2-羥乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸TRIS中文名為三(羥甲基)氨基甲烷PB 中文名為磷酸緩沖液MOPSO 中文名為3-(N-嗎啉)-2-羥基丙磺酸。
(3)上表中的穩(wěn)定劑選自下述中的一種或幾種無機鹽、有機酸及其鹽類、多羥基化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)；各種穩(wěn)定劑的含量如下無機鹽 每100毫升本試劑含0.1-2克有機酸及其鹽類 每100毫升本試劑含0.1-5克多羥基化合物每100毫升本試劑含0.1-10克氨基酸 每100毫升本試劑含0.5-10克蛋白質(zhì) 每100毫升本試劑含0.05-2克。
在實施例1中，用1種穩(wěn)定劑；在實施例2中，用2種穩(wěn)定劑；
在實施例3中，用3種穩(wěn)定劑；在實施例4中，用4種穩(wěn)定劑；(4)在上表中，所述的無機鹽選自下述中的一種氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、溴化鈣、溴化鈉、溴化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀；所述的有機酸及其鹽類選自下述中的一種乙酸、丙酸、酒石酸、檸檬酸、山梨酸、乙酸鈉、丙酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉、山梨酸鉀；所述的多羥基化合物選自下述中的一種蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；所述的氨基酸選自下述中的一種甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；所述的蛋白質(zhì)選自下述中的一種牛血清白蛋白、明膠。
二、本發(fā)明測定方法的實施例實施例5本實施例的測定方法如下(1)按上述實施例1要求稱取0.61克的TRIS(5mmol/L相當?shù)目藬?shù))；然后用800毫升去離子水溶解，調(diào)PH7.35，最后用去離子水定容1立升。
(2)將上述溶液轉(zhuǎn)入1立升燒杯中，向該溶液表面均勻添撒0.5克牛血清白蛋白和2000單位的牛凝血酶凍干粉，靜置不動，待干粉全部進入溶液中，緩慢攪勻，并經(jīng)細菌漏斗過濾除菌。此濾液即為FIB試劑(TRIS 5mmol/L，牛凝血酶2單位/毫升)，2～8冰箱內(nèi)放置，臨用前于37℃溫育5分鐘。
(3)向血凝儀比色杯中添加37℃快速融化的市售血漿50μl，37℃溫育1分鐘，立即加入50μl已預(yù)熱至37℃的FIB試劑，計時，血凝時間為26.6s。血漿用咪唑緩沖液稀釋2和4倍，其血凝時間分別為27.2s和28.0s。用excel軟件進行線性回歸處理，R2＝0.9944。
實施例6本實施例的測定方法如下(1)按上述實施例2要求稱取4.8克HEPES(相當于含HEPES 20mmol/L)，15克氯化鈉，15克山梨酸鉀；然后用800毫升去離子水溶解，調(diào)PH7.0，定容到1立升。
(2)將上述溶液轉(zhuǎn)入1立升燒杯中，向該溶液表面均勻添撒5000單位凝血酶凍干粉，靜置不動，待干粉全部進入溶液中，緩慢攪勻，并經(jīng)細菌漏斗過濾除菌。此濾液即為FIB試劑(含HEPES 20mml/L，人凝血酶5單位/毫升)，2～8℃冰箱內(nèi)放置，臨用前于37℃溫育5分鐘。
(3)向血凝儀比色杯中添加37℃快速融化的市售血漿50μl，37℃溫育1分鐘，立即加入50μl已預(yù)熱至37℃的FIB試劑，計時，血凝時間為12.1s。血漿用咪唑緩沖液稀釋2和4倍，其血凝時間分別為15.0s和18.3s。用excel軟件進行線性回歸處理，R2＝0.9995。
實施例7本實施例的測定方法如下(1)按上述實施例3要求稱取14.4克磷酸氫二鈉(PB)，2.4克磷酸二氫鉀(PB)，9克硫酸鈉，50克甘氨酸；然后用800毫升去離子水溶解，調(diào)PH7.35，定容到1立升。
(2)將上述溶液轉(zhuǎn)入1立升燒杯中，向該溶液表面均勻添撒1克明膠和10000單位重組人凝血凍干粉，靜置不動，待干粉全部進入溶液中，緩慢攪勻，過濾除菌。此濾液即為FIB試劑(含PB 60mmol/L，重組人凝血酶10單位/毫升)，2～8冰箱內(nèi)放置，臨用前于37℃溫育5分鐘。
(3)向凝血儀比色杯中添加于37℃快速融化的市售血漿50μl，37℃溫育1分鐘，立即加入50μl已預(yù)熱至37℃的FIB試劑，計時，血凝時間為13.7s。血漿用咪唑緩沖液稀釋2和4倍，其血凝時間分別為18.7s和26.3s。用excel軟件進行線性回歸處理，R2＝0.9993。
實施例8本實施例的測定方法如下(1)按上述實施例4要求稱取22.5克MOPSO(相當于100mmol/L)，25克溴化鈉，10克賴氨酸，15克丙酸鈉，50克甘油；然后用800毫升去離子水溶解，調(diào)PH8.0，最后用去離子水定容1立升。
(2)將上述溶液轉(zhuǎn)入1立升燒杯中，向該溶液表面均勻添撒20000單位豬凝血凍干粉，靜置不動，待干粉全部進入溶液中，緩慢攪勻，過濾除菌。此濾液即為FIB試劑(含MOPSO 100mmol/L，豬凝血酶20單位/毫升)，2～8冰箱內(nèi)放置，臨用前于37℃溫育5分鐘。
(3)向凝血儀比色杯中添加于37℃快速融化的市售血漿50μl，37℃溫育1分鐘，立即加入50μl已預(yù)熱至37℃的FIB試劑，計時，血凝時間為7.3s。血漿用咪唑緩沖液稀釋2和4倍，其血凝時間分別為11.1s和18.0s。用excel軟件進行線性回歸處理，R2＝0.9983。
權(quán)利要求
1.一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑，其特征在于配制本試劑的原料組成及其含量如下凝血酶每毫升本試劑含2-20單位緩沖劑每升本試劑含5-100毫摩爾穩(wěn)定劑每100毫升本試劑含0.05-10克去離子水余量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑，其特征在于所述的凝血酶采用用生化手段從動物血或人血中提取的凝血酶，或者采用基因重組或化學修飾的凝血酶制品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑，其特征在于所述的緩沖劑選自下述中的任一種；HEPES 中文名為N-2-羥乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸TRIS中文名為三(羥甲基)氨基甲烷PB 中文名為磷酸緩沖液MOPSO 中文名為3-(N-嗎啉)-2-羥基丙磺酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑，其特征在于所述的穩(wěn)定劑選自下述中的一種或幾種無機鹽、有機酸及其鹽類、多羥基化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)；各種穩(wěn)定劑的含量如下無機鹽每100毫升本試劑含0.1-2克有機酸及其鹽類每100毫升本試劑含0.1-5克多羥基化合物 每100毫升本試劑含0.1-10克氨基酸每100毫升本試劑含0.5-10克蛋白質(zhì)每100毫升本試劑含0.05-2克。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑，其特征在于無機鹽選自下述中的一種氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、溴化鈣、溴化鈉、溴化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀；有機酸及其鹽類選自下述中的一種乙酸、丙酸、酒石酸、檸檬酸、山梨酸、乙酸鈉、丙酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉、山梨酸鉀；多羥基化合物選自下述中的一種蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸選自下述中的一種甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；蛋白質(zhì)選自下述中的一種牛血清白蛋白、明膠。
6.一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的方法，其特征在于(1)用含穩(wěn)定劑的緩沖液配制每毫升含2-20單位凝血酶的本試劑；本試劑的PH值范圍為PH7.0-8.0；(2)用配制好的本試劑按常規(guī)方法繪制標準曲線；(3)測定方法a、將本試劑及血漿樣本分別于37℃溫育后，按1∶1的體積比混合；b、記錄血凝時間；c、通過標準曲線求出血漿樣本的纖維蛋白原含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的方法，其特征在于所述的凝血酶采用用生化手段從動物血或人血中提取的凝血酶，或者采用基因重組或化學修飾的凝血酶制品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的方法，所述的緩沖劑選自下述中的任一種；HEPES 中文名為N-2-羥乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸TRIS中文名為三(羥甲基)氨基甲烷PB 中文名為磷酸緩沖液MOPSO 中文名為3-(N-嗎啉)-2-羥基丙磺酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的方法，其特征在于所述的穩(wěn)定劑選自下述中的一種或幾種無機鹽、有機酸及其鹽類、多羥基化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)；各種穩(wěn)定劑的含量如下無機鹽每100毫升本試劑含0.1-2克有機酸及其鹽類每100毫升本試劑含0.1-5克多羥基化合物 每100毫升本試劑含0.1-10克氨基酸每100毫升本試劑含0.5-10克蛋白質(zhì)每100毫升本試劑含0.05-2克。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的方法，其特征在于無機鹽選自下述中的一種氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀、溴化鈣、溴化鈉、溴化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀；有機酸及其鹽類選自下述中的一種乙酸、丙酸、酒石酸、檸檬酸、山梨酸、乙酸鈉、丙酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉、山梨酸鉀；多羥基化合物選項自下述中的一種蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸選自下述中的一種甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；蛋白質(zhì)選自下述中的一種牛血清白蛋白、明膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無需稀釋血漿樣本測定纖維蛋白原含量的試劑及其測定方法，配制本試劑的原料組成及其含量如下凝血酶每毫升本試劑含2－20單位；緩沖劑每升本試劑含5－100毫摩爾；穩(wěn)定劑每100毫升本試劑含0.05－10克；去離子水余量。本發(fā)明的測定方法如下(1)用含穩(wěn)定劑的緩沖液配制每毫升含2－20單位凝血酶的本試劑；(2)測定方法a.將本試劑及血漿樣本分別于37℃溫育后，按1∶1的體積比混合；b.記錄血凝時間；c.通過標準曲線求出血漿樣本的纖維蛋白原含量。本發(fā)明的有益效果是測定時不用稀釋血漿樣本，使測定方法簡便；降低了本試劑的制造成本；提高了測量的準確度，減少了操作誤差。
文檔編號G01N33/86GK101059521SQ200710062020
公開日2007年10月24日 申請日期2007年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月30日
發(fā)明者靜天玉 申請人:保定天岳生物工程有限公司