專(zhuān)利名稱(chēng)：在植物中賦予脅迫耐受性的基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般地，本發(fā)明涉及用于對(duì)植物賦予脅迫(stress)耐受性的組合物和方法，包括多核苷酸、多肽、載體和宿主細(xì)胞。一般地，本發(fā)明還涉及通過(guò)前述組合物和方法轉(zhuǎn)化的植物。發(fā)明背景
遍及全世界的大多數(shù)作物物種暴露于對(duì)其生長(zhǎng)和生產(chǎn)力引起不利影響的各種非生物脅迫，并且干旱、鹽和低溫是最顯著的。鹽脅迫擾亂離子和滲透穩(wěn)態(tài)，而低溫導(dǎo)致機(jī)械損害、大分子活性變化和細(xì)胞中降低的滲透勢(shì)。在暴露于非生物脅迫后，植物激活脅迫耐受性信號(hào)傳導(dǎo)中牽涉的多種多樣的基因。這些脅迫誘導(dǎo)的基因可以分成效應(yīng)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白，其中的后一種包括轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的變化通常導(dǎo)致植物的顯著變化，并且許多轉(zhuǎn)錄因子基因的過(guò)表達(dá)在轉(zhuǎn)基因擬南芥屬(Arabidopsis)植物中賦予脅迫耐受性。因而，多種轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和遺傳操作已經(jīng)受到很多關(guān)注。已經(jīng)鑒定并研究的轉(zhuǎn)錄因子家族之一是WRKY家族，其以其成員共同的WRKY域命名。此域的長(zhǎng)度為約60個(gè)氨基酸，并且含有在其N(xiāo)端的高度保守的WRKYGQK七肽及在其C端的鋅指樣基序。WRKY家族含有擬南芥屬中的74名成員和稻中的超過(guò)100名成員。WRKY基因也已經(jīng)在許多其它物種，包括高等植物諸如甘薯(甘薯(Ipomoea batatas))、大麥(大麥(Hordeum vulgare))、石炭酸灌木(creosote bush) (Larrea tridentata)和大豆(大豆(Glycine max))、低等植物諸如蕨類(lèi)(fern)(水蕨(Ceratopteris richardii))和蘚類(lèi)(moss)(小立碗蘚(Physcomitrella patens))、和非植物物種諸如綠藻類(lèi)(萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))、雙滴蟲(chóng)類(lèi)(diplomonads)(蘭伯賈第蟲(chóng)(GiardiaIamblia))和變形蟲(chóng)門(mén)(amoebozoa)(盤(pán)基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium discoideum))中得到鑒定。所有鑒定的WRKY蛋白含有一個(gè)或兩個(gè)WRKY域。含有單個(gè)WRKY域的蛋白質(zhì)與含有兩個(gè)WRKY域的蛋白質(zhì)的C端比與N端在序列和DNA結(jié)合活性方面具有更多相似性。大多數(shù)具有WRKYGQK序列的鑒定的WRKY蛋白可以結(jié)合W框(TTGAC[C/T])以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，而一些其它具有突變WRKYGKK基序的WRKY蛋白可以結(jié)合WK框(TTTTCCAC)，而非W框元件。在WRKY域外，一些其它WRKY蛋白擁有核定位信號(hào)、亮氨酸拉鏈、富含絲氨酸-蘇氨酸的區(qū)域、富含谷氨酰胺的區(qū)域、富含脯氨酸的區(qū)域、酸性區(qū)或TIR-NBS-LRR域，并且這些多種多樣的結(jié)構(gòu)反映其多功能性質(zhì)。許多WRKY基因在植物對(duì)水楊酸和生物脅迫，諸如病原性細(xì)菌、真菌和病毒的應(yīng)答中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。還報(bào)告了 WRKY基因在種子發(fā)育和萌發(fā)、衰老和次生代謝中發(fā)揮作用。此夕卜，積累的事例表明WRKY基因牽涉植物中對(duì)非生物脅迫和ABA信號(hào)傳導(dǎo)的響應(yīng)。稻W(wǎng)RKY基因0sWRKY24、-45、-72和-77牽涉ABA信號(hào)傳導(dǎo)。擬南芥屬WRKY基因可以由干旱和冷脅迫(cold stress)誘導(dǎo)。幾個(gè)報(bào)告也已經(jīng)顯示了 WRKY基因在其它植物中響應(yīng)非生物脅迫和ABA信號(hào)傳導(dǎo)，并且最近報(bào)告了三種大豆WRKY基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物中賦予非生物脅迫耐受性。解決前述非生物脅迫在提供可持續(xù)的作物生產(chǎn)以供應(yīng)嚴(yán)重依賴(lài)作物物種(例如，稻、小麥)來(lái)滿(mǎn)足其飲食需要的不斷增長(zhǎng)的世界人口中不斷提供重大挑戰(zhàn)。因此，不斷需要鑒定并遺傳操作非生物脅迫耐受性中牽涉的其它基因以創(chuàng)建改良的作物栽培種。發(fā)明概述本發(fā)明涉及能夠?qū)χ参镔x予脅迫耐受性(特別是干旱/滲透脅迫、鹽脅迫和冷/冷凍脅迫)的分離的小麥WRKY多核苷酸、多肽、載體和表達(dá)分離的WRKY多核苷酸的宿主細(xì)胞。本文中提供的分離的WRKY多核苷酸包括如下的核酸，其包含(a) SEQ ID NO: I和3中任一項(xiàng)的核苷酸序列；(b)與(a)至少70%相同的核苷酸序列；(C)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)的互補(bǔ)物特異性雜交的核苷酸序列；(d)編碼WRKY蛋白的可讀框，所述WRKY蛋白包含SEQ ID N0:2和4中任一項(xiàng)的多肽序列；(e)編碼WRKY蛋白的可讀框，所述WRKY蛋白包·含與(d)至少70%相同，并且擁有至少一個(gè)WRKY域的多肽序列；及(f)作為(a)-(e)中任一項(xiàng)的互補(bǔ)物的核苷酸序列。本文中提供的分離的WRKY多肽包含(a)SEQ ID NO: 2和4中任一項(xiàng)的氨基酸序列；和(b)與(a)至少70%相同且包含至少一個(gè)WRY域的氨基酸序列。本文中提供的宿主細(xì)胞包括那些包含本發(fā)明的分離的多核苷酸和載體的。宿主細(xì)胞可以來(lái)自動(dòng)物、植物、或微生物，諸如大腸桿菌(E.coli)。特別涵蓋植物細(xì)胞。可以將宿主細(xì)胞分離、切出或培養(yǎng)。宿主細(xì)胞也可以是植物的部分。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含本發(fā)明的宿主細(xì)胞的植物或植物部分。特別涵蓋單子葉植物諸如諸如小麥、大麥、稻、玉米、高粱、燕麥、和黑麥。本發(fā)明還涉及植物的轉(zhuǎn)基因種子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于生成植物的方法，包括自本發(fā)明的宿主細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，或者將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物與另一種非轉(zhuǎn)基因植物雜交。本發(fā)明也涵蓋通過(guò)這些方法生成的植物，并且特別涵蓋對(duì)干旱/滲透脅迫、鹽脅迫和冷/冷凍脅迫具有改善的脅迫耐受性的植物，其是作物植物，諸如小麥、大麥、稻、玉米、高粱、燕麥、和黑麥。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用本發(fā)明的分離的多核苷酸、多肽、構(gòu)建體和載體改變植物或植物部分中性狀的方法。這些性狀包括對(duì)干旱/滲透脅迫、鹽脅迫和冷/冷凍脅迫的耐受性。優(yōu)選地，改變前述性狀，使得將它們提高或以其它方式改善。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在植物中表達(dá)分離的核酸來(lái)改變植物的一種或多種性狀，所述分離的核酸諸如(a) SEQ IDNO: I和3中任一項(xiàng)的核苷酸序列；(b)與(a)至少70%相同的核苷酸序列；(c)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)的互補(bǔ)物特異性雜交的核苷酸序列；(d)編碼WRKY蛋白的可讀框，所述WRKY蛋白包含SEQ ID NO: 2和4中任一項(xiàng)的多肽序列；(e)編碼WRKY蛋白的可讀框，所述WRKY蛋白包含與(d)至少70%相同，并且擁有至少一個(gè)WRKY域的多肽序列；及(f)作為(a)-(e)中任一項(xiàng)的互補(bǔ)物的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在植物中表達(dá)分離的超等位基因WRKY等位基因改變植物的一種或多種性狀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在植物中提高WRKY核酸或多肽的表達(dá)改變植物的一種或多種性狀。在又一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在植物中改變WRKY多肽的功能改變植物的一種或多種性狀。本發(fā)明進(jìn)一步涉及經(jīng)由改變植物中性狀的前述方法創(chuàng)建的植物、植物部分和轉(zhuǎn)基因種子?？梢宰郧笆龇椒ㄖ苯觿?chuàng)建此類(lèi)涵蓋的植物、植物部分和轉(zhuǎn)基因種子。或者，涵蓋的植物、植物部分和轉(zhuǎn)基因種子可以源自宿主細(xì)胞(例如，自宿主細(xì)胞再生)或者通過(guò)將具有一種或多種改變的性狀的轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物雜交來(lái)生成。本發(fā)明進(jìn)一步涉及改變選自下組的脅迫相關(guān)基因的表達(dá)的方法DREB2A、RD29A、RD29、C0R15A、STZ和C0R6. 6。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)在宿主細(xì)胞、植物或植物部分中提高一種或多種WRKY多肽的表達(dá)提高一種或多種這些脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，通過(guò)在宿主細(xì)胞、植物或植物部分中降低一種或多種WRKY多肽的表達(dá)降低一種或多種這些脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定WRKY結(jié)合劑和抑制劑的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括(a)提供分離的WRKY蛋白；(b)在足以結(jié)合的條件下使分離的WRKY蛋白與藥劑/劑(agent)接觸；(c)測(cè)定藥劑對(duì)分離的WRKY蛋白的結(jié)合；并(d)選擇表明對(duì)分離的WRKY蛋白的特異性結(jié)合的藥劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括(a)提供表達(dá)WRKY蛋白的宿主細(xì)胞；(b)使宿主細(xì)胞與藥劑接觸；(c)測(cè)定WRKY蛋白的表達(dá)；并(d)選擇誘導(dǎo)WRKY蛋白的表達(dá)改變的藥劑。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括(a)提供表達(dá)WRKY蛋白的植物或植物部分；(b)使植物或植物部分與藥劑接觸；(c)測(cè)定植物或植物部分的性狀改變；并
(d)選擇改變性狀的藥劑。要測(cè)定的性狀是那些已知受到WRKY表達(dá)影響的性狀(例如，干旱/滲透脅迫耐受性、鹽耐受性、和冷/冷凍耐受性)。優(yōu)選地，選擇提高或以其它方式改善這些性狀的藥劑。然而，也涵蓋負(fù)面影響性狀的藥劑。本發(fā)明還涉及抑制植物中WRKY的方法，其使用通過(guò)本文中的方法鑒定的結(jié)合劑和抑制劑進(jìn)行。附圖簡(jiǎn)述圖I顯示了響應(yīng)各種脅迫和ABA處理的TaWRKY基因表達(dá)。(a)用干旱、250mMNaCl、4° C或受傷(wounding)處理的15天齡小麥(栽培種Xifeng 20,抗干旱)幼苗中TaffRKY2和-19基因的表達(dá)，如通過(guò)RT-PCR揭示的。擴(kuò)增Taactin基因作為內(nèi)部對(duì)照。(b)用ΙΟΟμΜ ABA處理的小麥幼苗中TaWRKY基因的表達(dá)。其它與在(a)中一樣。(c) 20天齡小麥幼苗的不同器官中TaWRKY基因的表達(dá)，如通過(guò)RT-PCR揭示的。擴(kuò)增Taactin基因作為內(nèi)部對(duì)照。圖2顯示了 TaWRKY2過(guò)表達(dá)植物的滲透(干旱)脅迫耐受性。(a)不同轉(zhuǎn)基因系中TaWRKY2的表達(dá)。(b)在山梨糖醇處理下三種轉(zhuǎn)基因系(2-12、2-1和2_2)與Col-O植物的生長(zhǎng)比較。將來(lái)自MS板的7天齡植物在含有300mM山梨糖醇的O. 5xMS上轉(zhuǎn)移，并維持20天。(c)在正常條件(CK)下和滲透脅迫后植物的生長(zhǎng)。將來(lái)自(b)的幼苗在盆中轉(zhuǎn)移，并維持20天。(d)脅迫恢復(fù)后(c)中植物的存活率。(e)脅迫恢復(fù)后(c)中植物的抽苔(bolting)率。(f) (c)中脅迫恢復(fù)后植物高度的比較。對(duì)于(d)、(e)和(f)，數(shù)值是三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)(每次實(shí)驗(yàn)為36個(gè)植物)的平均值土SD。星號(hào)標(biāo)示轉(zhuǎn)基因植物與Col-O間·的顯著差異(*P〈0.05;#P〈0.01)。(g)山梨糖醇處理后植物中可溶性糖含量。(h)來(lái)自山梨糖醇處理后的植物的葉中的相對(duì)電解質(zhì)滲漏(leakage)。將7天齡幼苗轉(zhuǎn)移到含有山梨糖醇的O. 5xMS板上，并維持5天。對(duì)于(g)和(h)，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表來(lái)自代表三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的一次的來(lái)自三次重復(fù)的均值土SD。星號(hào)標(biāo)示轉(zhuǎn)基因植物與Col-O植物間的顯著差異(*Ρ〈0·05;**Ρ〈0· 01)。圖3顯示了 TaWRKY2過(guò)表達(dá)植物的鹽脅迫耐受性。(a)經(jīng)NaCl處理的轉(zhuǎn)基因系(2-12,2-1和2-2)與Col-O的表型。(b)來(lái)自(a)的植物在盆中生長(zhǎng)恢復(fù)10天。(c)來(lái)自(a)的植物在盆中生長(zhǎng)恢復(fù)25天。(d)來(lái)自(b)的植物的存活率。(e)來(lái)自(C)的植物的抽苔率。(f) (C)中Col-O和轉(zhuǎn)基因植物的植物高度。對(duì)于(d)、(e)和(f)，數(shù)值指示三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)(每次實(shí)驗(yàn)為36個(gè)植物)的平均值土SD。(g)鹽脅迫后植物中可溶性糖含量。(h)鹽脅迫后植物中MDA含量。(i)來(lái)自經(jīng)鹽處理的植物的葉中的相對(duì)電解質(zhì)滲漏。對(duì)于(g)、(h)和⑴，將7天齡幼苗轉(zhuǎn)移到含有NaCl的O. 5XMS板上，并且維持5天。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是來(lái)自代表三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的一次的來(lái)自三次重復(fù)的均值土SD。從(d)至(i)，星號(hào)標(biāo)示轉(zhuǎn)基因植物與Col-O植物間的顯著差異(*P〈0. 05;**P〈0. 01)。圖4顯示了 TaWRKY19過(guò)表達(dá)植物的滲透(干旱)脅迫耐受性。(a)TaWRKY19在Col-O和轉(zhuǎn)基因系中的表達(dá)。(b)在山梨糖醇處理下轉(zhuǎn)基因系(19-1、19-4、和19-5)與Col-O植物的生長(zhǎng)比較。(c)經(jīng)山梨糖醇脅迫的幼苗在盆中的生長(zhǎng)恢復(fù)。(d)正常(CK)或脅迫條件下植物的存活率。(e)植物抽苔率的比較。(f)山梨糖醇處理后植物高度的比較。
(g)來(lái)自經(jīng)山梨糖醇處理的Col-O和轉(zhuǎn)基因植物的葉中的相對(duì)電解質(zhì)滲漏。將7天齡幼苗轉(zhuǎn)移到含有300mM山梨糖醇的O. 5XMS板上，并維持5天，然后用于(g)中的分析。其它與在圖3中一樣。圖5顯示了 TaWRKY19過(guò)表達(dá)植物在鹽脅迫下的性能。(a)經(jīng)NaCl處理的Col-O和轉(zhuǎn)基因系(19-1、19-4和19-5)的表型比較。(b)經(jīng)鹽脅迫的植物在10天恢復(fù)后的生長(zhǎng)。
(c)經(jīng)鹽處理的植物在恢復(fù)25天后的生長(zhǎng)。(d)經(jīng)鹽脅迫的植物在恢復(fù)10天后的存活率。
(e)經(jīng)鹽脅迫的植物在25天恢復(fù)后的抽苔率。(f)經(jīng)鹽脅迫的植物在25天恢復(fù)后的植物高度。(g)經(jīng)鹽處理的植物中可溶性糖含量。(h)經(jīng)鹽處理的植物中MDA含量。(i)來(lái)自經(jīng)鹽處理的植物的葉的相對(duì)電解質(zhì)滲漏。其它與在圖2中一樣。星號(hào)標(biāo)示轉(zhuǎn)基因植物與Col-O間的顯著差異(*P〈0. 05;#P〈0. 01)。圖6顯示了 TaWRKY19過(guò)表達(dá)植物的冷凍耐受性。(a)經(jīng)冷凍處理的Col-O和轉(zhuǎn)基因系(19-1、19-4和19-5)的表型比較。(b)經(jīng)冷凍處理的植物的存活率。(c)自冷凍恢復(fù)后植物的抽苔率。(d)自冷凍恢復(fù)后Col-O和轉(zhuǎn)基因植物的植物高度。(e)在正常條件(CK)下和在冷凍后植物中的可溶性糖含量。(f)在正常條件(CK)下和在冷凍后植物中的MDA含量。(g)來(lái)自經(jīng)冷凍處理的Col-O和轉(zhuǎn)基因系的葉中的相對(duì)電解質(zhì)滲漏。其它與在圖2中一樣。星號(hào)標(biāo)示轉(zhuǎn)基因植物與Col-O植物間的顯著差異(*P〈0. 05;**P〈0. 01)。圖7顯示了 TaWRKY蛋白的亞細(xì)胞定位和DNA結(jié)合能力。(a) TaWRKY蛋白在擬南芥屬原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位。將單獨(dú)的GFP蛋白(CK)或TaWRKY-GFP融合物在CaMV 35S啟動(dòng)子控制下在擬南芥屬原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)。照片是暗視場(chǎng)(左)(對(duì)于綠色熒光)和明視場(chǎng)(右)(對(duì)于細(xì)胞形態(tài)學(xué))。箭指向核。(b)融合有MBP的TaWRKY蛋白的SDS-PAGE。在左側(cè)標(biāo)不蛋白質(zhì)標(biāo)志物的大小。箭標(biāo)不相應(yīng)的蛋白質(zhì)條帶。(c)TaWRKY蛋白的DNA結(jié)合能力。將蛋白質(zhì)在存在(+)或沒(méi)有(-)10倍摩爾過(guò)量的未標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)物的情況中與經(jīng)Y-32P標(biāo)記的W框(Wb)或突變的W框(mWb)元件一起溫育。蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合物以箭標(biāo)示。Wb和mffb兩者均為三重串聯(lián)重復(fù)。W框核心序列加下劃線(xiàn)，且星號(hào)標(biāo)示W(wǎng)框元件中的突變堿基。使用MBP作為陰性對(duì)照。圖8顯示了 TaWRKY蛋白的轉(zhuǎn)錄激活和反式激活能力。(a)TaWRKY2和TaWRKY19蛋白的轉(zhuǎn)錄激活。將TaWRKY基因與GAL4DBD融合以生成pBD_TaWRKY。pBD是陰性對(duì)照，而PGAL4是陽(yáng)性對(duì)照。含有測(cè)試基因的酵母細(xì)胞在SD/-His上的生長(zhǎng)和在β -半乳糖苷酶測(cè)定法中在存在X-gal的情況中的藍(lán)色指示相應(yīng)的蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)錄激活能力。所有轉(zhuǎn)化體在YPAD上在正常條件下良好生長(zhǎng)?！?+ ”標(biāo)示蛋白質(zhì)具有反式激活能力，而標(biāo)示蛋白質(zhì)沒(méi)有此類(lèi)能力。(b)根據(jù)雙重螢光素酶報(bào)告物測(cè)定法在擬南芥屬原生質(zhì)體中TaWRKY蛋白的反式激活活性。GAL4DBD是陰性對(duì)照，而VP16是陽(yáng)性對(duì)照。星號(hào)標(biāo)示與陰性對(duì)照GAL4DBD相比的顯著差異(*P〈0. 05;#P〈0. 01)。圖9顯示了脅迫相關(guān)基因在TaWRKY轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。(a) STZ和RD29B在TaffRKY2 過(guò)表達(dá)植物(2-12、2-1 和 2_2)中的表達(dá)。(b)DREB2A、RD29A、RD29B 和 Cor6. 6 在TaWRKY2過(guò)表達(dá)植物(19-1、19-4和19_5)中的表達(dá)。“rRNA”標(biāo)示18S和28S rRNA作為加載對(duì)照。

圖10顯示了 TaWRKY蛋白對(duì)下游基因的啟動(dòng)子區(qū)中順式DNA元件的結(jié)合。(a)各種W框元件在6種基因的I. 5kb啟動(dòng)子區(qū)中的分布。(b)用于DNA結(jié)合分析的推定的W 框。STZ-I和STZ-2片段標(biāo)示在STZ啟動(dòng)子區(qū)中分別在位置-1131至-1168和位置-334至-303處的DNA序列。來(lái)自Corl5A、Cor6. 6、RD29A和RD29B的啟動(dòng)子區(qū)的序列中包含I至3個(gè)預(yù)測(cè)的W框(加下劃線(xiàn))。(C)TaWRKY蛋白結(jié)合下游基因的啟動(dòng)子區(qū)中的順式DNA元件。將TaWRKY蛋白在存在(+)或沒(méi)有(-)10倍摩爾過(guò)量的非標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)物的情況中與經(jīng)[Y -32P]-dATP標(biāo)記的探針一起溫育，并且特異性經(jīng)[Y -32P]-標(biāo)記的DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物通過(guò)箭標(biāo)示。發(fā)明詳述WRKY核酸和蛋白質(zhì)如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”及復(fù)數(shù)變型可互換使用，指極其多種分子，包括單鏈和雙鏈DNA和RNA分子、cDNA序列、外顯子和內(nèi)含子的基因組DNA序列、化學(xué)合成的DNA和RNA序列、和有義鏈和相應(yīng)的反義鏈。本發(fā)明的多核苷酸還可以包含與參照天然核酸具有相似特性的天然核苷酸的已知類(lèi)似物。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“多肽”、“蛋白質(zhì)”及復(fù)數(shù)變型可互換使用，指由通過(guò)肽鍵連接的氨基酸的單鏈構(gòu)成的化合物。本發(fā)明的多肽可以包含天然存在的氨基酸、合成的氨基酸、遺傳編碼的氨基酸、非遺傳編碼的氨基酸及其組合。多肽可以包含L型和D型氨基酸兩者。代表性的非遺傳編碼的氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸；3-氨基己二酸；β -氨基丙酸；2_氨基丁酸；4_氨基丁酸(哌唳酸(piperidinic acid)) ;6_氨基己酸；2-氨基庚酸；2_氨基異丁酸；3_氨基異丁酸；2_氨基庚二酸；2，4- 二氨基丁酸；鎖鏈素；2，2’ - 二氨基庚二酸；2，3- 二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羥賴(lài)氨酸；別羥脯氨酸；3_羥脯氨酸；4_羥脯氨酸；異鎖鏈素；別異亮氨酸；N-甲基甘氨酸(肌氨酸)；N-甲基異亮氨酸；N-甲基纈氨酸；正纈氨酸；正亮氨酸；和鳥(niǎo)氨酸。代表性的衍生化氨基酸包括例如那些其中的游離氨基基團(tuán)已經(jīng)衍生化成形成胺氫氯酸鹽、對(duì)甲苯磺?；鶊F(tuán)、芐氧羰基基團(tuán)、叔丁氧羰基基團(tuán)、氯乙?；鶊F(tuán)或甲酰基團(tuán)的分子。游離的羧基基團(tuán)可以衍生化為形成鹽、甲酯和乙酯或其它類(lèi)型的酯或酰肼。游離的羥基基團(tuán)可以衍生化為形成O-?；騉-烴基衍生物。組氨酸的咪唑氮可以衍生化為形成N-im-芐基組氨酸。
如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“分離的”指要不是至少一種人為作用，不以其存在的無(wú)論何種形式或量存在的多核苷酸和多肽。例示性的實(shí)施方案包括與其它分子種類(lèi)部分、基本上或完全純化的多核苷酸和多肽；對(duì)于特定細(xì)胞、生物體或生物體的部分而言異源的多核苷酸和多肽；對(duì)于特定細(xì)胞、生物體或生物體的部分而言不是異源的，但是由于至少一種人為作用而以改變的水平表達(dá)的多核苷酸和多肽；和在受到至少一種人為作用的細(xì)胞、生物體或生物體的部分的后代或其它下游產(chǎn)物(例如，果實(shí))中表達(dá)的多核苷酸和多肽。本發(fā)明的例示性WRKY多核苷酸以SEQ ID NO: I和3及編碼能夠改變植物的性狀，例如，干旱/滲透脅迫耐受性、鹽脅迫耐受性和冷/冷凍脅迫耐受性的WRKY蛋白的基本上相同的序列列出。本發(fā)明的例示性WRKY多肽以SEQ ID NO: 2和4及能夠改變植物的性狀，例如，干旱/滲透脅迫耐受性、鹽脅迫耐受性和冷/冷凍脅迫耐受性的基本上相同的蛋白質(zhì)列出。
基本上相同的序列是那些在使用序列比較算法或者通過(guò)目視檢查為了最大對(duì)應(yīng)而比較和比對(duì)時(shí)具有至少60%，優(yōu)選地至少80%，優(yōu)選地至少85%，更優(yōu)選地至少90%，甚至更·優(yōu)選地至少95%，且最優(yōu)選地至少99%核苷酸或氨基酸殘基同一性的。優(yōu)選地，實(shí)質(zhì)性同一性存在于長(zhǎng)度為至少約50個(gè)殘基的序列區(qū)里，更優(yōu)選地在至少約100個(gè)殘基的區(qū)域里，且最優(yōu)選地，序列在至少約150個(gè)殘基里是基本上相同的。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，序列在編碼區(qū)的整個(gè)長(zhǎng)度里是基本上相同的。此外，基本上相同的核酸或蛋白質(zhì)執(zhí)行基本上相同的功能。基本上相同的序列可以是多態(tài)性序列，即群體中的備選序列或等位基因。等位差異可以小到一個(gè)堿基對(duì)?；旧舷嗤男蛄幸部梢园T變的序列，包括包含沉默突變的序列。突變可以包含一處或多處殘基變化、一個(gè)或多個(gè)殘基的刪除、或一個(gè)或多個(gè)額外殘基的插入?；旧舷嗤暮怂嵋茶b定為與參照序列核酸(例如，SEQ ID NO: I)特異性雜交或?qū)嵸|(zhì)性雜交的核酸。對(duì)于序列比較，通常一個(gè)序列充當(dāng)測(cè)試序列比較的參照序列。在使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參照序列輸入計(jì)算機(jī)中，若必要的話(huà)，指定亞序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)。然后，序列比較算法基于指定的程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參照序列的百分比序列同一性?？梢赃M(jìn)行比較序列的最佳比對(duì)，例如通過(guò)Smith和Waterman, Adv.Appl. Math. , 2:482 (1981)的局部同源性算法，通過(guò) Needleman 和 Wunsch, J. Mol.Biol, 48:443 (1970)的同源性比對(duì)算法，通過(guò) Pearson 和 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 85:2444(1988)相似性搜索方法，通過(guò)這些算法(威斯康星遺傳學(xué)軟件包(WisconsinGenetics Software Package), Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行，或者通過(guò)目視檢查(見(jiàn)Ausubel等，下文)來(lái)進(jìn)行。適合于測(cè)定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一個(gè)例子是BLAST算法，其記載于Altschul等，J. Mol Biol, 215:403-410(1990)。用于實(shí)施BLAST分析的軟件經(jīng)由國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi. nlm. nih. gov/)公開(kāi)可獲得。此算法牽涉首先通過(guò)鑒定詢(xún)問(wèn)序列中在與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)匹配或滿(mǎn)足一些正取值的閾值得分T的長(zhǎng)度W的短字來(lái)鑒定高評(píng)分序列對(duì)(HSP)。T稱(chēng)為鄰域字得分閾值(Altschul等，1990)。這些初始鄰域字命中充當(dāng)啟動(dòng)搜索以尋找含有其的更長(zhǎng)HSP的種子。然后，將字命中以?xún)蓚€(gè)方向沿著每個(gè)序列延伸，直到累積的比對(duì)得分可以得到增加。對(duì)于核苷酸序列，使用參數(shù)M(匹配殘基對(duì)的獎(jiǎng)勵(lì)得分；總是大于O)和N(錯(cuò)配殘基的罰分得分；總是小于O)計(jì)算累積得分。對(duì)于氨基酸序列，使用評(píng)分矩陣來(lái)計(jì)算累積得分。在累積比對(duì)等分自其最大實(shí)現(xiàn)數(shù)值下降數(shù)量X，積累得分由于積累一個(gè)或多個(gè)負(fù)評(píng)分殘基比對(duì)而轉(zhuǎn)到O或之下，或達(dá)到任一序列的末端時(shí)，停止字命中以每個(gè)方向的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對(duì)的靈敏性和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)使用字長(zhǎng)(W)為11、期望(E)為10、截留為100、M=5、N=_4、和兩條鏈的比較作為缺省。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用字長(zhǎng)(W)為3、期望(E)為10、和BLOSUM62評(píng)分矩陣(見(jiàn) Henikoff 和 Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1989))作為缺省。在計(jì)算百分比序列同一性外，BLAST算法還實(shí)施對(duì)兩個(gè)序列間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(見(jiàn)例如 Karlin 和 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993))。由BLAST算法提供的一種相似性測(cè)量是最小和概率(smallest sum probability, P (N)),其 提供兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列間匹配偶然會(huì)發(fā)生的概率的指標(biāo)。例如，若測(cè)試核酸序列與參照核酸序列的比較中最小和概率小于約O. 1，更優(yōu)選地小于約O. 01，且最優(yōu)選地小于約O. 001，則認(rèn)為測(cè)試核酸序列與參照序列相似?；旧舷嗤男蛄锌梢允嵌鄳B(tài)性序列，S卩，群體中的備選序列或等位基因。等位差異可以小到一個(gè)堿基對(duì)。基本上相同的序列也可以包含誘變的序列，包括包含沉默突變的序列。突變可以包含一處或多處殘基變化、一個(gè)或多個(gè)殘基的刪除、或一個(gè)或多個(gè)額外殘基的插入。兩個(gè)核酸序列基本上相同的另一種指標(biāo)是兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下彼此雜交。嚴(yán)格條件是核酸探針通常會(huì)與其靶序列，而不是其它序列(在所述序列存在于復(fù)雜的核酸混合物(例如總細(xì)胞DNA或RNA)中時(shí))的那些條件。在核酸雜交實(shí)驗(yàn)諸如Southern和Northern印跡分析的上下文中的嚴(yán)格雜交條件和嚴(yán)格雜交清洗條件是序列和環(huán)境兩者依賴(lài)的。核酸雜交的廣泛指導(dǎo)參見(jiàn) Tssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,第 I 部分第 2 章，Elsevier, NewYork (1993)。一般地，高度嚴(yán)格雜交和清洗條件選擇為在限定的離子強(qiáng)度和pH比特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5° C。Tm是50%的靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在限定的離子強(qiáng)度和pH下)。非常嚴(yán)格的條件選擇為與特定探針的Tm相等。在Southern或Northern印跡中在濾膜上具有超過(guò)100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸的雜交的嚴(yán)格雜交條件的例子是于42° C具有Img肝素的50%甲酰胺，其中雜交實(shí)施過(guò)夜。高度嚴(yán)格清洗條件的例子是O. 15M NaCl于72° C持續(xù)約15分鐘。嚴(yán)格清洗條件的另一個(gè)例子是于65° C用O. 2X SSC清洗15分鐘(關(guān)于SSC緩沖液的描述，見(jiàn)Sambrook，下文)。經(jīng)常，高嚴(yán)格性清洗前面有低嚴(yán)格性清洗以除去背景探針信號(hào)。例如超過(guò)100個(gè)核苷酸的雙鏈體的例示性中等嚴(yán)格性清洗是IX SSC于45° C持續(xù)15分鐘。例如超過(guò)100個(gè)核苷酸的雙鏈體的低嚴(yán)格性清洗的例子是4X-6XSSC于40° C持續(xù)15分鐘。對(duì)于短探針(例如，約10至50個(gè)核苷酸)，嚴(yán)格條件通常牽涉于pH 7. O至
8.3的小于約I. OM鈉離子，通常約O. 01至I. OM鈉離子濃度(或其它鹽)的鹽濃度，且溫度通常是至少約30° C。嚴(yán)格條件也可以通過(guò)添加脫穩(wěn)定劑諸如甲酰胺來(lái)實(shí)現(xiàn)。一般地，在特定雜交測(cè)定法中對(duì)無(wú)關(guān)探針觀(guān)察到的信噪比的2x(或更高)的信噪比指示特異性雜交的檢出。若核酸編碼的蛋白質(zhì)是基本上相同的，則在嚴(yán)格條件下沒(méi)有彼此雜交的核酸仍然是基本上相同的。例如，這在使用由遺傳密碼容許的最大密碼子簡(jiǎn)并性創(chuàng)建核酸拷貝時(shí)發(fā)生。以下是雜交和清洗條件的例子，其可以用于鑒定與本發(fā)明的參照核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列?；旧舷嗤暮塑账嵝蛄性?%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4UmMEDTA中于50° C與參照核苷酸序列完全雜交，在2X SSC、0. 1%SDS中于50° C，更優(yōu)選地在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0· 5M NaPO4UmM EDTA 中于 50° C清洗，在 IX SSC,O. 1%SDS 中于50° C，仍更優(yōu)選地在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA中于50° C清洗，在O. 5X SSC, O. 1% SDS中于50。C，甚至更優(yōu)選地在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0· 5M NaPO4'ImM EDTA中于50° C清洗，在O. IX SSC, O. 1%SDS中于50° C，且最優(yōu)選地在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)，O. 5M NaPO4UmM EDTA 中于 50° C 清洗，在 O. IX SSC, O. 1% SDS 中于 65° C清洗。兩個(gè)核酸序列或蛋白質(zhì)基本上相同的又一個(gè)指標(biāo)是由核酸編碼的所述蛋白質(zhì)是 基本上相同的，共享總體三維結(jié)構(gòu)，是生物學(xué)功能性等同物，或者是彼此免疫學(xué)雜交反應(yīng)的或者特異性結(jié)合。若相應(yīng)的蛋白質(zhì)是基本上相同的，則在嚴(yán)格條件下沒(méi)有彼此雜交的核酸分子仍然是基本上相同的。例如，這可以在兩個(gè)核苷酸序列包含如由遺傳密碼容許的保守取代變體時(shí)發(fā)生。這還包括簡(jiǎn)并密碼子取代，其中一個(gè)或多個(gè)選定的(或所有)密碼子的第三位用混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(見(jiàn)Batzer等，Nucleic AcidsRes.，19:5081(1991) ;Ohtsuka 等，J. Biol. Chem.，260:2605-2608(1985);及 Rossolini 等Mol.Cell Probes, 8:91-98(1994)) ο然而，本發(fā)明的多核苷酸和多肽兩者可以在一個(gè)或多個(gè)殘基處保守取代。保守氨基酸取代的例子包括用一個(gè)非極性(疏水性)殘基諸如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一種；用一種極性(親水性)殘基取代另一種，諸如在精氨酸和賴(lài)氨酸間、在谷氨酰胺和天冬酰胺間、在甘氨酸和絲氨酸間；用一種堿性殘基，諸如賴(lài)氨酸、精氨酸或組氨酸取代另一種；或用一種酸性殘基諸如天冬氨酸或谷氨酸取代另一種。本發(fā)明的核酸還包括與SEQ ID NO: I和3互補(bǔ)的核酸和SEQ ID NO: I和3的亞序列和延長(zhǎng)的序列及其互補(bǔ)的序列。互補(bǔ)序列是包含能夠在堿基對(duì)間形成氫鍵后彼此配對(duì)的反平行核苷酸序列的兩個(gè)核苷酸序列。與依照本發(fā)明的其它多核苷酸一樣，互補(bǔ)序列可以是彼此基本上相似的，如先前所描述的?；パa(bǔ)核酸段的一個(gè)具體的例子是反義寡核苷酸。亞序列是核酸中包含較長(zhǎng)核酸序列的一部分的序列。一種例示性的亞序列是探針或引物。延長(zhǎng)的序列是其中將核苷酸(或其它類(lèi)似的分子)添加至核酸序列的。例如，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在核酸分子的3’端添加序列。另外，核苷酸序列可以與其它DNA序列，諸如啟動(dòng)子、啟動(dòng)子區(qū)、增強(qiáng)子、多聚腺苷酸化信號(hào)、內(nèi)含子、其它限制酶位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、和其它編碼段組合。如此，本發(fā)明還提供了包含公開(kāi)的核酸的載體，包括重組表達(dá)的載體，其中本發(fā)明的核酸與功能性啟動(dòng)子可操作連接。在與核酸可操作連接時(shí)，啟動(dòng)子與核酸處于功能性組合，使得核酸的轉(zhuǎn)錄受到啟動(dòng)子區(qū)控制和調(diào)節(jié)。載體指能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸，諸如質(zhì)粒、粘粒和病毒載體?？梢詫⒈景l(fā)明的多核苷酸克隆、合成、改變、誘變或其組合。用于分離核酸的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的。產(chǎn)生堿基對(duì)變化的定點(diǎn)誘變、刪除或小插入也是本領(lǐng)域中已知的(見(jiàn)例如 Sambrook等(編)Molecular Cloning:A Laboratory Manual1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York;Silhavy等，Experiments with Gene Fusions. 1984, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, New York;Glover & Hames, DNA Cloning:A Practical Approach. 2nded. , 1995, IRL Press at Oxford University Press, Oxford/New York;Ausubel (編)ShortProtocols in Molecular Biology.第 3 版，1995，Wiley, New York)。可以使用熟練技術(shù)人員已知的多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化并表征本發(fā)明的分離的多肽(見(jiàn)例如 Schroder 等，The Peptides. 1965, Academic Press, New York ;Bodanszky, Principlesof Peptide Synthesis.第 2 次修訂版 1993，Springer-Verlag, Berlin/NewYork; Ausubel (編)，Short Protocols in Molecular Biology.第 3 版，1995，Wiley, NewYork)。本發(fā)明還涵蓋用于檢測(cè)編碼WRKY蛋白的核酸分子的方法。可以使用此類(lèi)方法來(lái) 檢測(cè)WRKY基因變體或改變的基因表達(dá)。可以使用通常應(yīng)用于檢測(cè)特定DNA序列的任何方法通過(guò)本領(lǐng)域中公知的任何措施將通過(guò)本發(fā)明的方法檢測(cè)的序列檢出、亞克隆、測(cè)序，并進(jìn)一步評(píng)估。如此，可以使用本發(fā)明的核酸來(lái)克隆包含公開(kāi)的序列的基因和基因組DNA?；蛘?，可以使用本發(fā)明的核酸來(lái)克隆相關(guān)序列的基因和基因組DNA。例如，可以使用RT-PCR測(cè)定法測(cè)量 WRKY 核酸分子的水平(見(jiàn)例如 Chiang, J. Chromatog r. A. , 806:209-218 (1998)及其中應(yīng)用的參考文獻(xiàn))。本發(fā)明還涵蓋使用WRKY核酸進(jìn)行數(shù)量性狀基因座(QTL)分析及篩選遺傳變體，例如通過(guò)等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針?lè)治?Conner等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 80 (I) : 278-282 (1983))、寡核苷酸連接測(cè)定法(OLA) (Nickerson 等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 87 (22) : 8923-8927 (1990))、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析(Orita等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (8) : 2766-2770 (1989))、SSCP/ 異雙鏈體分析、酶錯(cuò)配切割、對(duì)擴(kuò)增外顯子的直接序列分析(Kestila等，Mol. Cell, 1(4) :575-582(1998) ;Yuan等，Hum. Mutat. , 14 (5) : 440-446 (1999))、等位基因特異性雜交(Stoneking 等，Am. J. Hum.Genet. ,48(2) : 370-382 (1991))、和對(duì)含有特定突變的擴(kuò)增基因組DNA的限制性分析進(jìn)行的遺傳測(cè)定法。自動(dòng)化方法也可以應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性的大規(guī)模表征(Wang等，Am.J.Physiol,1998, 274(4Pt 2) :H1132_1140 (1992);Brookes, Gene, 234(2):177-186(1999))。優(yōu)選的檢測(cè)方法是非電泳的，包括例如TAQMAN 等位辨別測(cè)定法、PCR-OLA、分子信標(biāo)、掛鎖(padlock)探針、和適當(dāng)?shù)耐还?見(jiàn) Landegren 等，Genome Res.，8:769-776 (1998)及其中應(yīng)用的參考文獻(xiàn))。本發(fā)明還涵蓋WRKY多肽的功能性片段，例如，具有與SEQ ID N0:2或4相似的改變植物性狀的能力的片段。也涵蓋比公開(kāi)的序列長(zhǎng)度的功能性多肽序列。例如，可以對(duì)抗體多肽的N端或C端添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸。此類(lèi)額外的氨基酸可以在多種應(yīng)用，包括但不限于純化應(yīng)用中采用。制備延長(zhǎng)的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域中公知的。本發(fā)明還涵蓋用于檢測(cè)WRKY多肽的方法?？梢允褂么祟?lèi)方法，例如來(lái)測(cè)定WRKY蛋白表達(dá)的水平，并將表達(dá)水平與表型、性狀或不同基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平的存在或變化聯(lián)系起來(lái)。在某些實(shí)施方案中，所述方法牽涉用特異性識(shí)別WRKY蛋白的抗體的免疫化學(xué)反應(yīng)。用于檢測(cè)此類(lèi)抗體-抗原綴合物或復(fù)合物的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的，并且包括但不限于離心、親和層析和其它免疫化學(xué)方法(見(jiàn)例如Ishikawa Ultrasensitiveand Rapid Enzyme Immunoassay. 1999, Elsevier, Amsterdam/New York, United Statesof America;Law, Immunoassay:A Practical Guide. 1996, Taylor & Francis, London/Bristol,Pennsylvania,United States of Ameri ca;Lidde 11 等,AntibodyTechnology. 1995, Bios Scientific Publishers, Oxford, United Kingdom;及其中應(yīng)用的參考文獻(xiàn))。WRKY表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)指包含異源核酸和由異源核酸編碼的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。例如，異源表達(dá)系統(tǒng)可以包含用包含編碼與啟動(dòng)子可操作連接的WRKY蛋白的WRKY核酸的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞或通過(guò)將WRKY核酸引入宿主細(xì)胞基因組中生成的細(xì)胞系。表達(dá)系統(tǒng)可以進(jìn)一步包含一種或多種與WRKY功能相關(guān)的其它異源核酸，諸如WRKY轉(zhuǎn)錄激活或阻抑活性的靶物。這些其它核酸可以以單一構(gòu)建體或多種構(gòu)建體表達(dá)。
用于表達(dá)WRKY蛋白的構(gòu)建體可以包含載體序列和WRKY核苷酸序列，其中WRKY核苷酸序列與啟動(dòng)子序列可操作連接。用于重組WRKY表達(dá)的構(gòu)建體還可以包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和核苷酸序列的正確翻譯需要的序列。表達(dá)構(gòu)建體的制備，包括添加翻譯和終止信號(hào)序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。啟動(dòng)子可以是在選定的植物細(xì)胞、植物部分或植物中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸序列。啟動(dòng)子對(duì)于植物宿主和/或?qū)τ诒景l(fā)明的DNA序列而言可以是天然的或類(lèi)似的，或者外來(lái)的或異源的。在啟動(dòng)子對(duì)于植物宿主是天然的或內(nèi)源的情況中，意圖啟動(dòng)子存在于接受啟動(dòng)子導(dǎo)入的天然植物中。在啟動(dòng)子對(duì)于本發(fā)明的DNA序列而言是外來(lái)的或異源的情況中，啟動(dòng)子不是可操作連接的本發(fā)明的DNA序列的天然的或天然存在的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型的或組成性的。它可以是天然存在的，可以由各種天然存在的啟動(dòng)子的各部分構(gòu)成，或者可以是部分或完全合成的。用于設(shè)計(jì)啟動(dòng)子的指導(dǎo)通過(guò)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的研究，諸如Harley等，Nucleic Acids Res.，15:2343-61 (1987)的研究提供。還有，可以?xún)?yōu)化啟動(dòng)子相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始的位置(見(jiàn)例如Roberts等，Proc. Natl Acad.Sci. USA，76:760-4(1979))。許多適合于用于植物中的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中公知的。例如，適合于用于植物中的組成性啟動(dòng)子包括來(lái)自植物病毒的啟動(dòng)子，諸如花生褪綠條紋病(chlorotic streak)花椰菜花葉病毒(PClSV)啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利No. 5，850, 019);來(lái)自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S和19S啟動(dòng)子(Odell等，Nature, 313:810-812(1985)和美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，352，605);小球藻(Chlorella)病毒甲基轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利No. 5，563，328)和來(lái)自玄參花葉病毒(FMV)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利No. 5，378，619);來(lái)自諸如稻肌動(dòng)蛋白的基因的啟動(dòng)子(McElroy等，Plant Cell, 2:163-171(1990));泛素(Binet 等，Plant Science, 79:87-94(1991))、玉米(Christensen 等,Plant Molec. Biol, 12:619-632 (1989))和擬南芥屬(Norris等，Plant Molec. Biol, 21:895-906 (1993);及 Christensen 等，Plant Mo I.Biol,18:675-689(1982)) ；pEMU(Last 等，Theor.Appl.Genet,81:581-588 (1991))；MAS (Velten 等，EMBO J, 3:2723-2730 (1984));玉米 H3 組蛋白(Lepetit 等，Mol. Gen.Genet, 1992，231:276-285(1992);及 Atanassova 等，Plant J.，2 (3) : 291-300 (1992));歐洲油菜(Brassica napus) ALS3 (PCT國(guó)際公開(kāi)文本No. WO 97/41228);和各種土壤桿菌屬(Agrobacterium)基因的啟動(dòng)子(例如,美國(guó)專(zhuān)利 No. 4，771，002; 5，102，796; 5, 182，200;和5，428，147)。合適于用于植物的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括響應(yīng)銅的來(lái)自ACEl系統(tǒng)的啟動(dòng)子(Mett等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:4567-4571 (1993));響應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑的玉米In2 基因的啟動(dòng)子(Hershey 等，Mol. Gen. Genetics, 227:229-237 (1991);及 Gatz 等，Mol.Gen. Genetics, 243:32-38 (1994));和來(lái)自 TnlO 的 Tet 阻抑物的啟動(dòng)子(Gatz 等，Mol. Gen.Genet.，227:229-237 (1991))。用于植物的另一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是響應(yīng)植物通常不響應(yīng)的誘導(dǎo)劑的。此類(lèi)的一種例示性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是在由雌二醇激活的基于雌激素受體的誘導(dǎo)型植物表達(dá)系統(tǒng)中使用的來(lái)自類(lèi)固醇激素基因(其轉(zhuǎn)錄活性受到糖皮質(zhì)類(lèi)固醇激素誘導(dǎo))(Schena 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10421 (1991))或最近應(yīng)用的嵌合轉(zhuǎn)錄激活物XVE誘導(dǎo))的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Zuo等，Plant J.，24:265-273 (2000))。其它用于植物的 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子記載于EP 332104、PCT國(guó)際公開(kāi)文本No. WO 93/21334和WO 97/06269。也可以使用由其它啟動(dòng)子的各部分構(gòu)成的啟動(dòng)子和部分或完全合成的啟動(dòng)子(見(jiàn)例如Ni等，PlantJ. ,7:661-676(1995)和PCT國(guó)際公開(kāi)文本No. WO 95/14098，其描述用于植物的此類(lèi)啟動(dòng)子)?？捎糜谠谥参镏斜磉_(dá)本發(fā)明的基因的組織特異性或組織優(yōu)先性啟動(dòng)子。此類(lèi)啟動(dòng)子披露于WO 93/07278?？捎糜诒景l(fā)明的其它組織特異性啟動(dòng)子包括美國(guó)專(zhuān)利No. 6，040，504中披露的棉r(nóng)ubisco啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利No. 5，604，121中披露的稻蔗糖合酶啟動(dòng)子；和PCT國(guó)際公開(kāi)文本No. WO 01/73087中披露的洋丁香屬黃葉卷曲(cestrumyellow leaf curling)病毒啟動(dòng)子?？捎糜谥笇?dǎo)新的密集的且直立的圓錐花序基因在植物中表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子披露于美國(guó)專(zhuān)利No. 5，614，395。啟動(dòng)子可以包含，或者修飾為包含一種或多種增強(qiáng)子元件，由此提供更高的轉(zhuǎn)錄水平。適合于用于植物的增強(qiáng)子元件包括PClSV增強(qiáng)子元件(美國(guó)專(zhuān)利No. 5，850，019)、CaMV 35S增強(qiáng)子元件(美國(guó)專(zhuān)利No. 5，106，739和5，164，316)和FMV增強(qiáng)子元件(Maiti等，Transgenic Res. , 6:143-156 (1997)) 還可見(jiàn) PCT 國(guó)際公開(kāi)文本 No. WO 96/23898。此類(lèi)構(gòu)建體可以含有“信號(hào)序列”或“前導(dǎo)序列”以便于感興趣的肽向某些細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)諸如葉綠體(或其它質(zhì)體)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、或高爾基體的共翻譯或翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)，或者被分泌。例如，構(gòu)建體可以工程化改造成含有信號(hào)肽以便于肽轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。已知或懷疑信號(hào)序列導(dǎo)致共翻譯或翻譯后肽轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)細(xì)胞膜。在真核生物中，這通常牽涉分泌入高爾基體中，伴隨一些所得的糖基化。前導(dǎo)序列指在翻譯時(shí)生成足以觸發(fā)肽鏈共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)至亞細(xì)胞細(xì)胞器的氨基酸序列的任何序列。如此,這包括通過(guò)通入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,通到液泡,質(zhì)體,包括葉綠體、線(xiàn)粒體等靶向轉(zhuǎn)運(yùn)和/或糖基化的前導(dǎo)序列。植物表達(dá)盒還可以含有內(nèi)含子，使得對(duì)內(nèi)含子的mRNA加工是表達(dá)需要的。此類(lèi)構(gòu)建體還可以含有5’和3’非翻譯區(qū)。3’非翻譯區(qū)是位于編碼序列下游的多核苷酸。多聚腺苷酸化信號(hào)序列和編碼能夠影響多腺苷酸束添加至mRNA前體3’端的調(diào)節(jié)信號(hào)的其它序列是3’非翻譯區(qū)。5’非翻譯區(qū)是位于編碼序列上游的多核苷酸。終止區(qū)可以與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)一起是天然的，可以與本發(fā)明的序列一起是天然的，或者可以源自另一種來(lái)源。常規(guī)的終止區(qū)可獲自根癌土壤桿菌(A. tumefaciens)的Ti質(zhì)粒，諸如章魚(yú)堿合酶和胭脂氨酸合酶終止區(qū)(見(jiàn)例如Guerineau等，Mol.Gen.Genet,262:141-144 (1991) ;Proudfoot,Cell,64:671-674 (1991) ;Sanfacon等，Genes Dev.,5:141-149 (1991);Mogen 等，Plant Cell,2:1261-1272(1990);Munroe等，Gene, 91:151-158 (1990) ;Ballas 等，Nucleic Acids Res.，17:7891-7903 (1989);及Joshi 等，Nucleic Acids Res.，15:9627-9639 (1987))。在適當(dāng)時(shí)，可以為了在經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中升高的表達(dá)而優(yōu)化載體和WRKY序列。也就是說(shuō)，序列可以使用宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子合成以改善表達(dá)，或者可以以宿主優(yōu)選的密碼子選擇頻率使用密碼子合成。一般地，會(huì)增加多核苷酸的GC含量(關(guān)于宿主優(yōu)選的密碼子選擇的討論，見(jiàn)例如Campbell等,Plant Physiol, 92:1-11 (1990))。用于合成宿主優(yōu)選的多核苷酸的方法是本領(lǐng)域中已知的(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No. 6，320，100; 6，075，185; 5，380，831;和 5，436，391，美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)文本 No. 20040005600 和 20010003849，及 Murray等，Nucleic Acids Res.，17:477-498 (1989)。在某些實(shí)施方案中，將感興趣的多核苷酸靶向至葉綠體以進(jìn)行表達(dá)。在此方式中，在感興趣的多核苷酸不直接插入葉綠體中的情況中，表達(dá)盒另外可以含 有編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽(transit peptide)的多核苷酸以將感興趣的多核苷酸引導(dǎo)至葉綠體。此類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域中已知的(見(jiàn)例如Von Hei jne等，Plant Mol. Biol.Rep.，9:104-126 (1991);Clark 等，J. Biol. Chem.，264:17544-17550 (1989);Della-Cioppa 等，Plant Physiol,84:965-968(1987) ;Romer 等，Biochem. Biophys. Res.Commun.，196:1414-1421(1993);及 Shah 等，Science, 233:478-481 (1986))。為了在葉綠體中表達(dá)可以?xún)?yōu)化要靶向至葉綠體的感興趣的多核苷酸，從而造成植物細(xì)胞核與此細(xì)胞器間的密碼子選擇的差異。在此方式中，可以使用葉綠體優(yōu)選的密碼子合成感興趣的多核苷酸(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No. 5，380，831)?？梢詫⒅参锉磉_(dá)盒(即，與啟動(dòng)子可操作連接的WRKY可讀框)插入植物轉(zhuǎn)化載體，其容許將DNA轉(zhuǎn)化入細(xì)胞中。此類(lèi)分子可以由一種或多種表達(dá)盒組成，并且可以組織成超過(guò)一種載體DNA分子。例如，二元載體是植物轉(zhuǎn)化載體，其利用兩種非連續(xù)DNA載體來(lái)編碼植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化所有必要的順式和反式作用功能(Hellens等，Trends in PlantScience, 5:446-451(2000))。植物轉(zhuǎn)化載體包含一種或多種DNA載體以實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化。例如，本領(lǐng)域中常見(jiàn)的實(shí)踐是利用包含超過(guò)一個(gè)連續(xù)的DNA段的植物轉(zhuǎn)化載體。這些載體在本領(lǐng)域中經(jīng)常成為二元載體。二元載體及具有輔助質(zhì)粒的載體最常用于土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化需要的DNA段的大小和復(fù)雜性是相當(dāng)大的，并且有利的是將功能分到不同DNA分子上。二元載體通常含有質(zhì)粒載體，其含有T-DNA轉(zhuǎn)移需要的順式作用序列(諸如左側(cè)邊界和右側(cè)邊界)、工程化改造成能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)的選擇標(biāo)志、和感興趣的多核苷酸(即，工程化改造成能夠在期望生成轉(zhuǎn)基因植物的植物細(xì)胞中表達(dá)的多核苷酸)。對(duì)于某些目標(biāo)物種，不同抗生素或除草劑選擇標(biāo)志可以是優(yōu)選的。轉(zhuǎn)化中常規(guī)使用的選擇標(biāo)志包括nptll基因(其賦予對(duì)卡那霉素及相關(guān)抗生素的抗性)(Messing和 Vierra, Gene, 19:259-268 (1982);及 Bevan 等，Nature, 304:184-187 (1983))、bar基因(其賦予對(duì)除草劑草胺膦(phosphinothricin)的抗性)(White等，Nucl.Acids Res. , 18:1062(1990),及 Spencer 等，Theor. Appl. Genet, 79:625-631 (1990))、hph基因(其賦予對(duì)抗生素潮霉素的抗性)(Blochinger和Diggelmann, Mol. Cell.Biol, 4:2929-2931 (1984))、dhfr 基因(其賦予對(duì)甲氨蝶呤的抗性)(Bourouis 等，EMBOJ，2 (7) :1099-1104 (1983))、EPSPS基因(其賦予對(duì)草甘膦(glyphosate)的抗性)(美國(guó)專(zhuān)利No. 4，940，935和5，188，642)、和甘露糖_6_磷酸異構(gòu)酶基因(其提供代謝甘露糖的能力)(美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，767，378 和 5，994，629)。也存在于此質(zhì)粒載體上的是細(xì)菌復(fù)制需要的序列。順式作用序列以如下的方式排列，以容許有效轉(zhuǎn)移入植物細(xì)胞中及在其中表達(dá)。例如，選擇標(biāo)志序列和感興趣的序列位于左側(cè)和右側(cè)邊界間。經(jīng)常，第二質(zhì)粒載體含有反式作用因子，其介導(dǎo)T-DNA自土壤桿菌屬轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞。此質(zhì)粒經(jīng)常含有毒力功能(Vir基因)，其容許植物細(xì)胞被土壤桿菌屬感染，及通過(guò)在邊界序列處的切割轉(zhuǎn)移DNA和vir介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移，如本領(lǐng)域中了解的(Hellens等，2000)。幾類(lèi)土壤桿菌屬菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105，等等)可以用于植物轉(zhuǎn)化。第二質(zhì)粒載體對(duì)于通過(guò)其它方法諸如例如顯微投射、微注射、電穿孔和聚乙二醇將多核苷酸導(dǎo)入植物中是不必要的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的核苷酸序列直接轉(zhuǎn)化入質(zhì)體基因組中。質(zhì)體轉(zhuǎn)化的主要優(yōu)點(diǎn)在于質(zhì)體一般能夠在沒(méi)有實(shí)質(zhì)性修飾的情況中表達(dá)細(xì)菌基因，而且質(zhì)體能夠 在單一啟動(dòng)子控制下表達(dá)多個(gè)可讀框。質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)廣泛記載于美國(guó)專(zhuān)利No. 5，451，513、5，545，817 和 5，545，818、PCT 國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)文本 WO 95/16783、及 McBride 等，Proc.NatI. Acad. Sci. USA, 91:7301-7305(1994)。用于葉綠體轉(zhuǎn)化的基本技術(shù)牽涉與感興趣的基因一起將克隆的質(zhì)體DNA中在選擇標(biāo)志側(cè)翼的區(qū)域?qū)牒线m的目標(biāo)組織中，例如使用生物射彈或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如，氯化鈣或PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)進(jìn)行。I至1.5kb側(cè)翼區(qū)(稱(chēng)作靶向序列)便于與質(zhì)體基因組的同源重組，并且如此容許替換或修飾質(zhì)體組(plastome)的特定區(qū)域。最初，利用葉綠體16S rRNA中的點(diǎn)突變和賦予對(duì)大觀(guān)霉素和/或鏈霉素的抗性的rpsl2基因作為轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)志(Svab等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 87:8526-8530(1990) ; Staub 等,Plant Cell, 4:39-45 (1992)) 這以每 100 次對(duì)目標(biāo)葉的轟擊為約I的頻率導(dǎo)致穩(wěn)定的同質(zhì)轉(zhuǎn)化體。這些標(biāo)志物間的克隆位點(diǎn)的存在容許創(chuàng)建質(zhì)體靶向載體以導(dǎo)入外來(lái)基因(Staub等，EMBO J，12:601-606 (1993))。通過(guò)用顯性選擇標(biāo)志，即編碼大觀(guān)霉素解毒酶氨基糖苷-3’ -腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(adenyltransferase)的細(xì)菌aadA基因替換隱性rRNA或r_蛋白抗生素抗性基因獲得轉(zhuǎn)化頻率的實(shí)質(zhì)性增加(Svab 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:913-917 (1993))。先前，此標(biāo)志物已經(jīng)成功用于綠藻萊茵衣藻的質(zhì)體基因組的高頻率轉(zhuǎn)化(Goldschmidt-Clermont, Nucl. AcidsRes.，19:4083-4089 (1991))?？捎糜谫|(zhì)體轉(zhuǎn)化的其它選擇標(biāo)志是本領(lǐng)域中已知的。通常，轉(zhuǎn)化后約15-20個(gè)細(xì)胞分裂周期是達(dá)到同質(zhì)狀態(tài)需要的。質(zhì)體表達(dá)(其中通過(guò)同源重組將基因插入每個(gè)植物細(xì)胞中存在的所有幾千拷貝的環(huán)狀質(zhì)體基因組中)利用與細(xì)胞核表達(dá)的基因相比大量的拷貝數(shù)優(yōu)點(diǎn)以容許可以容易地超過(guò)占總可溶性植物蛋白質(zhì)10%的表達(dá)水平。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的核苷酸序列插入質(zhì)體靶向載體中，并轉(zhuǎn)化入期望植物宿主的質(zhì)體基因組中。獲得在含有本發(fā)明的核苷酸序列的質(zhì)體基因組上同質(zhì)的植物，并且其優(yōu)先能夠高度表達(dá)該核苷酸序列。宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞是可以接受本發(fā)明的異源核酸分子導(dǎo)入的細(xì)胞。代表性的真核宿主細(xì)胞包括酵母和植物細(xì)胞，以及原核宿主諸如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(B. subtilis)。功能性測(cè)定法優(yōu)選的宿主細(xì)胞基本上或完全缺乏WRKY蛋白的內(nèi)源表達(dá)。
可以選擇如下的宿主細(xì)胞菌株，其調(diào)控重組序列的表達(dá)，或者以特定的方式修飾并加工基因產(chǎn)物。例如，不同宿主細(xì)胞具有用于翻譯和翻譯后加工和修飾(例如，甲基化、蛋白質(zhì)的磷酸化)的特征性且特定的機(jī)制。合適的細(xì)胞系或宿主細(xì)胞可以選擇為確保對(duì)表達(dá)的外來(lái)蛋白質(zhì)的期望的修飾和加工。例如，可以使用在細(xì)菌系統(tǒng)中的表達(dá)來(lái)生成非糖基化的核心蛋白產(chǎn)物，而在酵母中的表達(dá)會(huì)生成糖基化產(chǎn)物。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋WRKY蛋白在穩(wěn)定細(xì)胞系中的重組表達(dá)。在將異源構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞中后生成穩(wěn)定細(xì)胞系的方法是本領(lǐng)域中已知的(見(jiàn)例如Joyner, GeneTargeting:A Practical Approach. 1993, Oxford University Press,Oxford/New York)。如此，經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織和植物理解為不僅涵蓋轉(zhuǎn)化過(guò)程的終產(chǎn)物，而且還有其轉(zhuǎn)基因后代或增殖形式。WRKY敲除植物本發(fā)明還提供了包含WRKY基因座的破壞的WRKY敲除植物。破壞的基因可以導(dǎo)致全長(zhǎng)WRKY蛋白的水平改變的表達(dá)或突變的變體WRKY蛋白的表達(dá)。例如，可以通過(guò)在植物中表達(dá)無(wú)效(即無(wú)效突變)或下效WRKY等位基因生成WRKY基因完全或部分功能失活的植物。 也可以使用反義雙鏈RNA或核酶WRKY構(gòu)建體(其由通用或組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)以降低體細(xì)胞中WRKY基因表達(dá)的水平，如此實(shí)現(xiàn)敲低表型)制備依照本發(fā)明的敲除植物。本發(fā)明還提供了生成WRKY條件性或誘導(dǎo)型失活的植物。本發(fā)明還涵蓋在公開(kāi)的WRKY基因中具有特定的敲入(knock-in)修飾的轉(zhuǎn)基因植物。在某些實(shí)施方案中，敲入的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)反效(即顯性陰性)等位基因。在其它實(shí)施方案中，敲入的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)超效(即，功能獲得)等位基因。WRKY敲除植物may be prepared in單子葉或雙子葉植物，諸如玉米(maize)、小麥(wheat)、大麥(barley)、黑麥(rye)、甘薯(sweet potato)、豆(bean)、豌豆(pea)、菊苣(chicory)、萵苣、甘藍(lán)(cabbage)、花椰菜(cauliflower)、花莖甘藍(lán)(broccoli)、蕪菁(turnip)、蘿卜(radish)、菠菜(spinach)、石習(xí)柏(asparagus)、洋蔥(onion)、大蒜(garlic)、胡椒(pepper) ,ffM (celery)、西葫蘆(squash)、南瓜(pumpkin)、大麻(hemp)、小胡瓜(zucchini)、蘋(píng)果(apple)、梨(pear)、媼梓(quince)、甜瓜(melon)、李(plum)、樓桃(cherry)、桃(peach)、油桃(nectarine)、杏(apricot)、草莓(strawberry)、葡萄(grape)、樹(shù)莓(raspberry)、黑莓(blackberry)、鳳梨(pineapple)、鱷梨(avocado)、番木瓜(papaya)、芒果(mango)、香蕉(banana)、大 (soybean)、番爺(tomato)、高梁(sorghum)、甘鹿(sugarcane)、甜菜(sugar beet)、向日葵(sunflower)、油菜桿(rapeseed)、三葉草(clover)、煙草(tobacco)、胡蘿卜(carrot)、棉花(cotton)、苜猜(alfalfa)、稻(rice)、馬鈴薯(potato)、爺子(eggplant)、黃瓜(cucumber)、擬南芥屬、和木本植物諸如針葉和落葉樹(shù)。特別涵蓋稻、小麥、大麥、燕麥、大豆和黑麥。如本文中所使用的，植物指全植物、植物器官(例如，根、莖、葉、花芽、或胚)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚、其它植物部分(例如，原生質(zhì)體、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子)及其后代。植物細(xì)胞可以是分化的或未分化的(例如，愈傷組織(callus)、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉細(xì)胞、根細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞、花粉)?！?br> 為了制備WRKY敲除植物，通過(guò)本領(lǐng)域中已知的幾種技術(shù)之一，包括但不限于電穿孔或化學(xué)轉(zhuǎn)化(見(jiàn)例如Ausubel 編(1994) Current Protocols in Molecular Biology. JohnWiley and Sons, Inc. , Indianapolis, Indiana)實(shí)現(xiàn)多核苷酸對(duì)植物細(xì)胞的導(dǎo)入。賦予對(duì)毒性物質(zhì)的抗性的標(biāo)志物可用于鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(已經(jīng)攝取并表達(dá)測(cè)試多核苷酸序列)與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞(那些不含或不表達(dá)測(cè)試多核苷酸序列的)。在本發(fā)明的一方面，基因作為標(biāo)志物可用于幫助將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞中。轉(zhuǎn)基因植物、經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物、或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物、或任何前述物質(zhì)的細(xì)胞、組織或種子指已經(jīng)將外源多核苷酸摻入或整合入植物細(xì)胞中的植物。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化指將多核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物中，使得它整合入植物基因組中，并且能夠由其后代繼承。一般地，植物轉(zhuǎn)化方法牽涉將異源DNA轉(zhuǎn)移至目標(biāo)植物細(xì)胞(例如未成熟的或成熟的胚、懸浮培養(yǎng)物、未分化的愈傷組織、原生質(zhì)體等)中，接著應(yīng)用最大閾值水平的合適的選擇(取決于選擇標(biāo)志基因)以自一組未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)回收經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。通常將外植體轉(zhuǎn)移至新鮮供應(yīng)的相同培養(yǎng)基，并常規(guī)培養(yǎng)。隨后，在放置于補(bǔ)充有最大閾值水平的選擇劑(即，溫度和/或除草劑)的再生培養(yǎng)基后將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分化成枝條。然后，將枝條轉(zhuǎn)移至選擇性生根培養(yǎng)基以回收生根的枝條或小植株。然后，轉(zhuǎn)基因小植株 生長(zhǎng)成成熟的植物，并生成能育種子(見(jiàn)例如Hiei等，Plant J. , 6:271-282 (1994);及Ishida等，Nat. Biotechnol, 14:745-750(1996))。用于生成轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)和方法的一般性描述參見(jiàn) Ayres 等，CRC Crit. Rev. Plant Sci.，13: 219-239 (1994);及 Bommineni等，Maydica, 42:107-120 (1997)。因?yàn)榻?jīng)轉(zhuǎn)化的材料含有許多細(xì)胞，所以經(jīng)轉(zhuǎn)化的和非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞兩者存在于受試的目標(biāo)愈傷組織或組織或細(xì)胞組的任何部分中。殺死非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并容許經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞增殖的能力導(dǎo)致經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物培養(yǎng)物。經(jīng)常，除去非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力是快速回收經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞并成功生成轉(zhuǎn)基因植物的限制。然后，可以使用分子和生物化學(xué)方法來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)基因植物基因組中感興趣的整合核苷酸的存在?？梢酝ㄟ^(guò)幾種方法之一，包括但不限于通過(guò)土壤桿菌屬將異源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞中(土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)、用粘附于顆粒的外源外來(lái)DNA轟擊植物細(xì)胞、和轉(zhuǎn)移DNA的各種其它非顆粒直接介導(dǎo)的方法(見(jiàn)例如Hiei等，PlantJ. 6:271-282 (1994) ; Ishida等，Nat.Biotechnol.，14:745-750 (1996) ;Ayres 等,CRC Crit.Rev.PlantSet, 13:219-239 (1994);及 Bommineni 等，Maydica, 1997，42:107-120 (1997))實(shí)施轉(zhuǎn)基因植物的生成。存在著用土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的三種常見(jiàn)的方法。第一種方法是將土壤桿菌屬與培養(yǎng)的分離的原生質(zhì)體共培養(yǎng)。此方法需要建立的培養(yǎng)系統(tǒng)，其容許培養(yǎng)原生質(zhì)體和自培養(yǎng)的原生質(zhì)體的植物再生。第二種方法是用土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織。此方法需要(a)植物細(xì)胞或組織可以被土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化和(b)可以誘導(dǎo)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織以再生成全植物。第三種方法是用土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化種子、頂端(apices)或分生組織。此方法需要微增殖(micropropagation)?？梢酝ㄟ^(guò)使用本領(lǐng)域中已知的許多方法來(lái)增強(qiáng)土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化的效率。例如，已經(jīng)顯示了將天然傷口響應(yīng)分子諸如乙酰丁香酮(AS)納入土壤桿菌屬培養(yǎng)物增強(qiáng)用根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化效率(Shahla等，Plant Molec. Biol, 8:291-298 (1987))?；蛘?，可以通過(guò)使要轉(zhuǎn)化的目標(biāo)組織受傷增強(qiáng)轉(zhuǎn)化效率。例如，可以通過(guò)沖孔、浸潰、用微粒轟擊實(shí)現(xiàn)植物組織的受傷(見(jiàn)例如 Bidney 等，Plant Molec. Biol.，18:301-313 (1992)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)由顆粒轟擊(即，用基因槍)用載體轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞。顆粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法是本領(lǐng)域中已知的，是商品化的，并且包括但不限于記載于美國(guó)專(zhuān)利No. 5，584，807的氣體驅(qū)動(dòng)的基因遞送儀。此方法牽涉將感興趣的多核苷酸序列包被至重金屬顆粒上，并在壓縮氣體的壓力下加速包被顆粒假設(shè)以遞送至目標(biāo)組織。其它顆粒轟擊方法也可用于將異源多核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞中。一般地，這些方法牽涉將感興趣的多核苷酸序列沉積于材料諸如金、鉬、或鎢的小的密集的顆粒的表面上。然后，將包被的顆粒自身包被至剛性表面，諸如金屬板上，或者至由易碎材料諸如聚酯薄膜(mylar)制成的載體片上。然后，將包被片向目標(biāo)生物組織加速。平片的使用對(duì)加速顆粒產(chǎn)生一致的擴(kuò)散，其使在一致的條件下接受顆粒的細(xì)胞的數(shù)目最大化，導(dǎo)致將多核苷酸樣品導(dǎo)入目標(biāo)組織中。也可以使用特定的起始信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)編碼感興趣的多肽的序列的更有效的翻譯。 此類(lèi)信號(hào)包括ATG起始密碼子及相鄰序列。在將編碼感興趣的多肽的序列、其起始密碼子和上游序列插入合適的表達(dá)載體中的情況中，可以不需要其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號(hào)。然而，在僅插入編碼序列或其部分的情況中，應(yīng)當(dāng)提供外源翻譯控制信號(hào)，包括ATG起始密碼子。此外，起始密碼子應(yīng)當(dāng)在正確的閱讀框中以確保翻譯整個(gè)插入物。外源翻譯元件和起始密碼子可以是多種起源的(天然的和合成的兩者)?？梢酝ㄟ^(guò)納入適合于使用的特定細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子，諸如那些記載于文獻(xiàn)的(Scharf等，Results Probl. CellDiffer.，20:125(1994))來(lái)增強(qiáng)表達(dá)效率?？梢砸勒粘Ｒ?guī)方式將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)成植物(見(jiàn)例如McCormick等，PlantCell Rep. ,5:81-84(1986))。然后，可以培養(yǎng)這些植物，并用相同的經(jīng)轉(zhuǎn)化品系或不同品系傳粉，并鑒定具有期望的表型特征組成性表達(dá)的所得雜種。可以培養(yǎng)兩代或更多代以確保期望的表型特征的表達(dá)得到穩(wěn)定維持和遺傳，然后收獲種子以確保已經(jīng)實(shí)現(xiàn)期望的表型特征的表達(dá)。在此方式中，本發(fā)明提供了具有穩(wěn)定整合入其基因組中的本發(fā)明的多核苷酸，例如本發(fā)明的表達(dá)盒的經(jīng)轉(zhuǎn)化的種子(又稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因種子)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物在添加的多核苷酸方面可以是純合的；即，含有兩個(gè)添加的序列(在染色體對(duì)的每條染色體上的相同基因座處的一個(gè)序列)的轉(zhuǎn)基因植物?？梢匀缦芦@得純合轉(zhuǎn)基因植物，即將含有依照本發(fā)明的添加序列的獨(dú)立分離子轉(zhuǎn)基因植物有性交配(自交)，萌發(fā)生成的一些種子，并相對(duì)于對(duì)照(天然的、非轉(zhuǎn)基因的)或獨(dú)立分離子轉(zhuǎn)基因植物，對(duì)所生成的所得植物分析增強(qiáng)的酶活性(即，除草劑抗性)和/或升高的植物產(chǎn)量。應(yīng)當(dāng)理解，也可以將兩種不同轉(zhuǎn)基因植物交配以生成含有兩種獨(dú)立分離的添加的、外源多核苷酸的后代。合適的后代的自交可以生成在所有添加的編碼本發(fā)明的多肽的外源多核苷酸方面純合的植物。還涵蓋與親本植物的回交和與非轉(zhuǎn)基因植物的異型雜交。在將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞中后，通過(guò)多種方法，諸如分析與整合序列有關(guān)的多核苷酸、多肽和代謝物來(lái)確認(rèn)多核苷酸對(duì)植物基因組的轉(zhuǎn)化或整合。WRKY 抑制劑本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了鑒定WRKY結(jié)合配偶體和WRKY抑制劑的測(cè)定法。WRKY拮抗劑/抑制劑是例如通過(guò)改變化學(xué)和生物學(xué)活性或特性來(lái)改變WRKY蛋白功能的藥劑。鑒定抑制劑的方法牽涉在存在一種或多種藥劑的情況中測(cè)定WRKY功能的水平或質(zhì)量的降低。例示性的WRKY抑制劑包括小分子及生物抑制劑，如下文所描述的。
如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“藥劑”指與WRKY核酸或蛋白質(zhì)潛在相互作用的任何物質(zhì)，包括任何合成的、重組的、或天然的起源的?？梢允褂帽疚闹泄_(kāi)的方法對(duì)懷疑與蛋白質(zhì)相互作用的藥劑評(píng)估此類(lèi)相互作用。例示性的藥劑包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、核酸、小分子(例如，化學(xué)化合物)、抗體或其片段、核酸-蛋白質(zhì)融合物、任何其它親和劑、及其組合。要測(cè)試的藥劑可以是純化的分子、同質(zhì)樣品、或分子或化合物的混合物。小分子指具有小于約1，000道爾頓，更優(yōu)選地小于約750道爾頓，還更優(yōu)選地小于約600道爾頓，且還更優(yōu)選地小于約500道爾頓的分子量的化合物，例如有機(jī)化合物。優(yōu)選地，小分子還具有范圍為約-4至約+14，更優(yōu)選地范圍為約-2至約+7. 5的計(jì)算的對(duì)數(shù)辛醇-水分配系數(shù)。可以用于破壞WRKY功能的例示性核酸包括反義RNA和小干擾RNA(SiRNA)(見(jiàn)例如美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)文本No. 20060095987)。這些抑制性分子可以基于WRKY基因序列和抑制性核酸的已知特征制備(見(jiàn)例如 Van der Krol 等，Plant Cell, 2:291-299 (1990) ; Napoli等,Plant Cell, 2:279-289(1990);English 等,Plant CelI,8:179-188(1996);及Waterhouse 等，Nature Rev. Genet, 2003, 4:29-38(2003)。藥劑可以以分子文庫(kù)或集合獲得或制備。文庫(kù)可以含有幾種或大量不同分子，從約10種分子變化至幾十億種分子或更多。分子可以包括天然存在的分子、重組分子、或合成的分子?？梢酝瑫r(shí)測(cè)定文庫(kù)中的多種藥劑。任選地，可以合并源自不同文庫(kù)的藥劑以進(jìn)行同時(shí)評(píng)估。代表性的文庫(kù)包括但不限于肽文庫(kù)(美國(guó)專(zhuān)利No. 6，156，511，6，107，059，5，922，545和 5，223，409)、寡聚物文庫(kù)(美國(guó)專(zhuān)利No. 5，650，489和 5，858，670)、適體文庫(kù)(美國(guó)專(zhuān)利 No. 7，338，762; 7，329，742; 6，949，379; 6，180，348;及5，756，291)、小分子文庫(kù)(美國(guó)專(zhuān)利No. 6，168，912和5，738，996)、抗體或抗體片段的文庫(kù)(美國(guó)專(zhuān)利 No. 6，174，708，6，057，098，5，922，254，5，840，479，5，780，225，5，702，892 和5，667988)、核酸_蛋白質(zhì)融合物的文庫(kù)(美國(guó)專(zhuān)利No. 6，214，553)、和可以潛在結(jié)合WRKY蛋白的任何其它親和劑的文庫(kù)。文庫(kù)可以包含分子的隨機(jī)集合?；蛘?，例如，就抑制性核酸而言，文庫(kù)可以包含具有特定序列、結(jié)構(gòu)、或構(gòu)象偏愛(ài)的分子集合(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No. 5，264，563和5，824，483)。用于制備含有各類(lèi)分子的多樣群體的文庫(kù)的方法是本領(lǐng)域中已知的，例如如上文應(yīng)用的美國(guó)專(zhuān)利中所描述的。許多文庫(kù)也是商品化的。WRKY活性的對(duì)照水平或質(zhì)量指例如在使用包含SEQ ID NO:2表達(dá)的重組表達(dá)系統(tǒng)時(shí)野生型WRKY活性的水平或質(zhì)量。在評(píng)估藥劑的抑制性能時(shí)，WRKY活性的對(duì)照水平或質(zhì)量包含在沒(méi)有藥劑的情況中活性的水平或質(zhì)量。對(duì)照水平也可以通過(guò)表型或其它可測(cè)量性
狀建立。鑒定WRKY抑制劑的方法還需要測(cè)定藥劑的抑制性能。測(cè)定藥劑的抑制性能可以包括測(cè)定WRKY基因表達(dá)的水平；測(cè)定重組表達(dá)的WRKY蛋白的DNA結(jié)合活性；測(cè)定WRKY蛋白的活性構(gòu)象；或者測(cè)定響應(yīng)WRKY抑制劑結(jié)合的性狀變化(例如，干旱/滲透脅迫耐受性、鹽脅迫耐受性和冷/冷凍脅迫耐受性)。在具體的實(shí)施方案中，鑒定WRKY抑制劑的方法可以包括(a)提供表達(dá)WRKY蛋白的細(xì)胞、植物或植物部分；(b)使細(xì)胞、植物或植物部分與藥劑接觸；(C)與對(duì)照相比，對(duì)細(xì)胞、植物或植物部分檢查性狀變化；并(d)選擇與對(duì)照相比誘導(dǎo)性狀變化的藥劑。隨后，在期望時(shí)，可以將在公開(kāi)的抑制或結(jié)合測(cè)定法(見(jiàn)下文)中如此鑒定的任何藥劑應(yīng)用于細(xì)胞、植物或植物部分以實(shí)現(xiàn)所述細(xì)胞、植物或植物部分的變化。例如，WRKY基因(例如，SEQ ID NO: I)的破壞或?qū)RKY多核苷酸或多肽(例如，SEQ ID NO: 2)的抑制有可能會(huì)以非期望的方式改變一種或多種植物性狀(例如，降低脅迫耐受性)。本發(fā)明還涵蓋依賴(lài)于本文中所描述的方法的快速的且高通量的篩選方法。此篩選方法包括使WRKY蛋白分開(kāi)與多種藥劑接觸。在此類(lèi)篩選方法中，多種藥劑可以包含超過(guò)約IO4種樣品、或超過(guò)約IO5種樣品、或超過(guò)約IO6種樣品。本發(fā)明的體外和細(xì)胞測(cè)定法可以包括可溶性測(cè)定法，或者可以進(jìn)一步包括用于固定化測(cè)定法的一種或多種組分的固相基片。例如，可以經(jīng)由共價(jià)或非共價(jià)連接將WRKY蛋白，或表達(dá)WRKY蛋白的細(xì)胞直接結(jié)合至固體狀態(tài)的組分。任選地，結(jié)合可以包括介導(dǎo)WRKY蛋白間接結(jié)合至基片的接頭分子或標(biāo)簽。WRKY結(jié)合測(cè)定法本發(fā)明還涵蓋鑒定WRKY抑制劑的方法，其通過(guò)測(cè)定物質(zhì)(例如，先前所描述的藥劑)對(duì)WRKY蛋白的特異性結(jié)合來(lái)進(jìn)行。例如，鑒定WRKY結(jié)合配偶體的方法可以包括(a)提供SEQ ID NO: 2和4中任一項(xiàng)的WRKY蛋白；(b)在足以結(jié)合的條件下使WRKY蛋白與一種或多種藥劑接觸；(c)測(cè)定藥劑對(duì)分離的WRKY蛋白的結(jié)合；并(d)選擇表明對(duì)WRKY蛋白的特異性結(jié)合的藥劑。特異性結(jié)合也可以涵蓋相互作用的質(zhì)量或狀態(tài)，使得藥劑對(duì)WRKY蛋白的結(jié)合是抑制性的。特異性結(jié)合指在蛋白質(zhì)的異質(zhì)群體和其它生物材料中確定蛋白質(zhì)存在的結(jié)合反應(yīng)。若結(jié)合親和力是約IxIO4M4至約IxlO6M-1或更大，則可以認(rèn)為藥劑對(duì)WRKY蛋白的結(jié)合是特異性的。特異性結(jié)合也指可飽和結(jié)合。為了表明藥劑對(duì)WRKY蛋白的可飽和結(jié)合，可以實(shí)施 Scatchard 分析，如例如 Mak 等，J. Biol. Chem.，264:21613-21618(1989)所描述的?？梢允褂脦追N技術(shù)在不采用已知競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的情況中檢測(cè)WRKY蛋白與藥劑間的相互作用。代表性的方法包括但不限于熒光相關(guān)光譜學(xué)、表面增強(qiáng)激光解吸/離子化飛行時(shí)間光譜學(xué)、和BIACORl^R:;技術(shù)，每種技術(shù)在下文中描述。這些方法可適用于自動(dòng)化高通量篩選。熒光相關(guān)光譜學(xué)(FCS)測(cè)量小樣品體積內(nèi)熒光分子的平均擴(kuò)散率。樣品大小可以低到IO3種熒光分子，而樣品體積低到單一細(xì)菌的胞質(zhì)。擴(kuò)散率是分子質(zhì)量的函數(shù)，并且隨質(zhì)量增加而降低。因此，F(xiàn)CS可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)-配體相互作用分析，其通過(guò)測(cè)量結(jié)合后分子的質(zhì)量并且因此擴(kuò)散率的變化來(lái)進(jìn)行。在一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)中，要分析的靶物(例如，WRKY蛋白)以具有在N端或C端插入的序列標(biāo)簽，諸如多組氨酸序列的重組蛋白表達(dá)。在宿主細(xì)胞，諸如大腸桿菌、酵母、非洲蟾蜍屬(Xenopus)卵母細(xì)胞、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)。使用層析方法純化蛋白質(zhì)。例如，可以使用多組氨酸標(biāo)簽來(lái)將表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)合至金屬螯合物柱，諸如亞氨二乙酸瓊脂糖上螯合的Ni2+。然后，用熒光標(biāo)簽諸如羧基四甲基羅丹明或B0DIPY 試劑(可購(gòu)自Molecular Probes of Eugene, Oregon)標(biāo)記蛋白質(zhì)。然后，將蛋白質(zhì)在溶液中暴露于潛在的配體，并且使用可購(gòu)自Carl Zeiss, Inc. (Thornwood of NewYork, New York)的儀器通過(guò)FCS測(cè)定其擴(kuò)散率。通過(guò)蛋白質(zhì)擴(kuò)散率的變化測(cè)定配體結(jié)合。表面增強(qiáng)激光解吸/ 離子化(SELDI)由 Hutchens 和 Yip, Rapid Commun. MassSpectrom.，1993，7:576-580開(kāi)發(fā)。在與時(shí)間飛行質(zhì)譜儀(TOF)偶聯(lián)時(shí)，SELDI提供了一種快速分析芯片上保留的分子的技術(shù)。它可以應(yīng)用于配體-蛋白質(zhì)相互作用分析，其通過(guò)在芯片上共價(jià)結(jié)合靶蛋白或其部分，并通過(guò)質(zhì)譜術(shù)分析結(jié)合此蛋白質(zhì)的小分子進(jìn)行(Worrall等，Anal Chem. ,1998，70 (4) :750-756 (1998))。在一種典型的實(shí)驗(yàn)中，將靶蛋白(例如，WRKY蛋白)重組表達(dá)并純化。通過(guò)利用多組氨酸標(biāo)簽或者通過(guò)其它相互作用，諸如離子交換或疏水性相互作用將靶蛋白結(jié)合至SELDI芯片。然后，經(jīng)由例如能夠以序貫方式將配體移液的投遞系統(tǒng)(自動(dòng)取樣儀)將如此制備的芯片暴露于潛在的配體。然后，將芯片在增加的嚴(yán)格性的溶液中清洗，例如用含有增加的離子強(qiáng)度的緩沖溶液的一系列清洗。在每次清洗后，通過(guò)將芯片提交給SELDI-T0F分析結(jié)合的材料。特異性結(jié)合靶蛋白的配體通過(guò)其洗脫需要的洗液的嚴(yán)格性來(lái)鑒定。BiACCmmH衣賴(lài)于表面層上在配體與該層上固定化的靶蛋白(例如WRKY蛋白)的結(jié)合后的折射率變化。在此系統(tǒng)中，將小配體的集合在2-5微升細(xì)胞中序貫注射，其中靶蛋白在細(xì)胞內(nèi)固定化。通過(guò)記錄自表面折射的激光通過(guò)表面等離振子共振(SPR)檢測(cè)結(jié)合。一般地，表面層上質(zhì)量濃度的給定變化的折射率變化對(duì)于所有蛋白質(zhì)和肽實(shí)際上是相同的，容許單一方法對(duì)于任何蛋白質(zhì)是可應(yīng)用的。在一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)中，將靶蛋白重組表達(dá)，純化，并結(jié)合至:BIACORI^芯片。可以通過(guò)利用多組氨酸標(biāo)簽或者通過(guò)其它相互作用，諸如離子交換或疏水性相互作用促進(jìn)結(jié)合。然后，經(jīng)由由Biacore (Uppsala, Sweden)出售的儀器中整合的用于以序貫方式將配體移液的遞送系統(tǒng)(自動(dòng)取樣儀)將如此制備的芯片暴露于一種或多種潛在的配體。記錄芯片上的SPR信號(hào)，并且折射率的變化指示固定化的祀物與配體間的相互作用。對(duì)結(jié)合速率(on rate)和解離速率(off rate)的信號(hào)動(dòng)力學(xué)的分析容許辨別非特異性和特異性相互作用(還可見(jiàn)Homola等，Sensors andActuators, 54:3-15(1999)及其中的參考文獻(xiàn))。構(gòu)象測(cè)定法本發(fā)明還涵蓋鑒定WRKY結(jié)合配偶體和抑制劑的方法，其依賴(lài)于在被物質(zhì)(例如先前所描述的藥劑)結(jié)合或與其以其它方式相互作用時(shí)WRKY蛋白的構(gòu)象變化。例如，對(duì)大分子的溶液應(yīng)用圓二色性揭示這些大分子的構(gòu)象狀態(tài)。該技術(shù)可以區(qū)別無(wú)規(guī)卷曲、alpha螺旋、和beta鏈構(gòu)象狀態(tài)。為了鑒定WRKY蛋白的抑制劑，可以使用重組表達(dá)的WRKY蛋白實(shí)施圓二色性分析。將WRKY蛋白例如通過(guò)離子交換和大小排阻層析純化，并與藥劑混合。將混合物進(jìn)行圓二色性。將在存在藥劑的情況中WRKY蛋白的構(gòu)象與在沒(méi)有藥劑的情況中WRKY蛋白的構(gòu)象比較。在存在藥劑的情況中WRKY蛋白的構(gòu)象狀態(tài)的變化鑒定出WRKY結(jié)合配偶體或抑制劑。代表性方法記載于美國(guó)專(zhuān)利No. 5，776，859和5，780, 242?？梢允褂霉δ苄詼y(cè)定法評(píng)估抑制劑的拮抗活性，諸如測(cè)定改變的脅迫耐受性，如本文中描述的。依照公開(kāi)的方法，表達(dá)WRKY的細(xì)胞可以在可用于實(shí)施WRKY功能的測(cè)定法的試劑盒形式中提供。例如，用于檢測(cè)WRKY的試劑盒可以包括用編碼全長(zhǎng)WRKY蛋白的DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的WRKY活性測(cè)定法可以包括區(qū)別經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與非轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的標(biāo)志物。標(biāo)記物可以由用于WRKY表達(dá)的構(gòu)建體編碼或與其以其它方式關(guān)聯(lián)，使得用編碼WRKY和標(biāo)志物的核酸分子同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞?？捎米鳂?biāo)志物的代表性可檢測(cè)分子包括但不限于異源核酸，由轉(zhuǎn)染的構(gòu)建體編碼的蛋白質(zhì)(例如，酶或熒光蛋白)、結(jié)合蛋白、和抗原。另外，采用表達(dá)重組WRKY的細(xì)胞或表達(dá)WRKY的植物的測(cè)定法可以采用基本上缺乏天然的WRKY和任選地與WRKY蛋白基本上相似的蛋白質(zhì)的對(duì)照細(xì)胞或植物。在使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞時(shí)，對(duì)照細(xì)胞可以包含例如，未轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。在使用表達(dá)WRKY蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系時(shí)，對(duì)照細(xì)胞可以包含例如，用于衍生WRKY表達(dá)細(xì)胞系的親本細(xì)胞系?？筗RKY 抗體在本發(fā)明的另一方面，提供了用于生成特異性結(jié)合WRKY蛋白的抗體的方法。依照該方法，將全長(zhǎng)重組WRKY蛋白配制為使得它可以作為有效的免疫原使用，并且用于免疫動(dòng)物，使得在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答以生成可以自動(dòng)物的血清收集的抗體為特征?？贵w是免疫球蛋白蛋白質(zhì)，或者包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段(例如，F(xiàn)ab、經(jīng)修飾的Fab、Fab’、F(ab’)2 *Fv片段、或具有至少一個(gè)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)或至少一個(gè)免疫球蛋白重鏈區(qū)的蛋白質(zhì))。本發(fā)明的抗體包括雙抗體、四聚抗體、單鏈抗體、四價(jià)抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、和識(shí)別特定表位的域特異性抗體。本發(fā)明還涵蓋生成抗WRKY抗體的細(xì)胞系?？贵w對(duì)WRKY蛋白的特異性結(jié)合指在包含多種不同抗原的異質(zhì)樣品中優(yōu)先結(jié)合WRKY蛋白。基本上缺乏結(jié)合描述了抗體對(duì)對(duì)照蛋白或樣品的結(jié)合，S卩，表征為非特異性或背景結(jié)合的結(jié)合水平。若結(jié)合親和力是至少約10_7M或更高，諸如至少約10_8M或更高，包括至少約KT9M或更高、至少約KT11M或更高，或至少約KT12M或更高，則抗體對(duì)抗原的結(jié)合是特異性的?？梢栽谏婕癢RKY蛋白表達(dá)和活性的本領(lǐng)域中已知的方法中使用如本文中所公開(kāi)的那樣制備的WRKY抗體，例如以克隆編碼WRKY蛋白的核酸、免疫純化WRKY蛋白、和檢測(cè)植物樣品中的WRKY蛋白、以及測(cè)量植物樣品中WRKY蛋白的水平。為了實(shí)施此類(lèi)方法，本發(fā)明的抗體可以進(jìn)一步包含可檢測(cè)標(biāo)記物，包括但不限于放射性標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、表位標(biāo)記物、和可以在體內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)記物。用于選擇適合于特定檢測(cè)技術(shù)的標(biāo)記物的方法和用于與抗體偶聯(lián)或以其它方式聯(lián)合可檢測(cè)標(biāo)記物與抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
實(shí)施例本發(fā)明現(xiàn)在參考以下實(shí)施例進(jìn)行描述。這些實(shí)施例僅為了例示目的提供，并且本發(fā)明不限于這些實(shí)施例，而是涵蓋由于本文中提供的教導(dǎo)而明顯的所有變型。實(shí)施例I鑒定來(lái)自小麥的WRKY基因WRKY蛋白含有保守的WRKY基序(WRKYGQK)和新的鋅指樣基序(C2-H2或C2-H-C基序)。通過(guò)使用兩種基序的共有序列針對(duì)來(lái)自小麥的494，195種表達(dá)的序列標(biāo)簽(ESTs)進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索(basic local alignment search, BLAST),鑒定出許多EST。在序列裝配及隨后除去那些沒(méi)有WRKY基序的序列后，推定的WRKY單基因(unigene)。通過(guò)使用RT-PCR 和 RACE 獲得 TaWRKY-2 (SEQ ID NO: I)和 TaWRKY-19 (SEQ ID NO: 3)的全長(zhǎng)編碼區(qū)。TaffRKY2和TaWRKY19的可讀框的長(zhǎng)度都是1407bp，并且編碼長(zhǎng)度為468個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(即，TaWRKY-2 (SEQ ID NO: 2)和 TaWRKY-19 (SEQ ID NO: 4))。除了 WRKY 域外，TaWRKY-2 和TaffRKY-19共享很少的同一性。
實(shí)施例2響應(yīng)各種非生物脅迫的TaWRKY基因表達(dá)于37。C在水中浸沒(méi)2天后,將小麥(普通小麥(Triticicum aestivum L.)栽培種Xifeng 20)的種子在濕潤(rùn)的紗布上于25° C萌發(fā)，然后在培養(yǎng)皿中于25° C在連續(xù)光(約2500勒克斯)下在水中浸沒(méi)的紗布上以溶液培養(yǎng)方式培養(yǎng)。然后，將15天齡幼苗受到干旱、250mM NaCl、4° C、受傷和100 μ MABA處理。在干旱脅迫實(shí)驗(yàn)中，將幼苗轉(zhuǎn)移到濾紙上，并于25° C和20%相對(duì)濕度干燥O、I、3、6、12、和24小時(shí)。對(duì)于NaCl和ABA處理，將幼苗根在分別含有200mM NaCl和100 μ M ABA的水中浸沒(méi)0、1、3、6、12、和24小時(shí)。對(duì)于4° C處理，將幼苗于4° C以溶液培養(yǎng)方式培養(yǎng)0、1、3、6、12、和24小時(shí)。在處理后，將葉收集，并在液氮中立即冷凍，并于-70° C貯存，用于總RNA制備。還將來(lái)自在正常生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)的20天齡幼苗的根、莖和葉收獲以進(jìn)行分析。將冷凍的組織在液氮中用研缽和杵棒研磨成細(xì)粉末以進(jìn)行總RNA分離。將總RNA通過(guò)使用硫氰酸胍法分離，并通過(guò)酚-氯仿提取純化。遵循第一鏈cDNA合成試劑盒(Promega)的用法說(shuō)明書(shū)合成第一鏈cDNA，即用于RT-PCR中擴(kuò)增的模板。設(shè)計(jì)匹配TaWRKY基因序列的特異性引物。PCR反應(yīng)混合物的總體積是15μ 1，其包含1μ I第一鏈cDNA、O. 2 μ M每種引物、Ix PCR緩沖液(其含有I. 5mM Mg2+)、0· 2mM dNTP和I個(gè)單位的Taq DNA聚合酶(Takara)。以如下程序?qū)嵤U(kuò)增94° C持續(xù)3分鐘進(jìn)行變性；94° C持續(xù)I分鐘，58° C(TaWRKY2)、52° C(TaWRKY 19)，或 54° C(肌動(dòng)蛋白)持續(xù) I 分鐘，及 72° C 持續(xù) I分鐘的30個(gè)循環(huán)；和72° C持續(xù)10分鐘進(jìn)行最終的延伸。擴(kuò)增小麥肌動(dòng)蛋白基因作為對(duì)照。將擴(kuò)增產(chǎn)物在l%w/v瓊脂糖凝膠上分開(kāi)，用溴化乙啶染色，并通過(guò)使用Gel Doc GS670凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)評(píng)估。在鑒定的TaWRKY基因中，通過(guò)4或5種前述處理誘導(dǎo)TaWRKY2和19(見(jiàn)圖Ia和lb)。在干旱脅迫下，TaWRKY2得到高度誘導(dǎo)，而TaWRKY19僅得到適度誘導(dǎo)。在鹽脅迫下，TaffRKY2和TaWRKY19得到誘導(dǎo)。響應(yīng)低溫，TaWRKY19得到中等誘導(dǎo)，但是TaWRKY2表達(dá)不受影響。在受傷后，TaWRKY2和TaWRKY 19表達(dá)得到較弱或適度誘導(dǎo)。ABA誘導(dǎo)這兩種基因的表達(dá)。還在小麥植物的不同器官中檢查兩種基因的表達(dá)。TaWRKY19在根、莖和葉中較弱表達(dá)。然而，TaWRKY2的表達(dá)水平在根和葉中相對(duì)較高，但是在莖中較低(見(jiàn)圖lc)。實(shí)施例3TaffRKY基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物中的過(guò)表達(dá)將pGEM⑩-T-TaWRKY2構(gòu)建體用BamHI和SacI分開(kāi)消化，并將所得的TaWRKY2編碼序列連接入由組成性CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體pBIN121中，生成pBIN121-pBIN121-TaWRKY2構(gòu)建體。以相同的方式，將來(lái)自初始pGEM -T-TaffRKY19構(gòu)建體的全長(zhǎng)TaWRKY19連接至pBIN121載體的Smal/SacI位點(diǎn)，生成pBIN121_TaWRKY19構(gòu)建體。將所得的構(gòu)建體通過(guò)測(cè)序確認(rèn)，然后通過(guò)電穿孔分開(kāi)轉(zhuǎn)化入根癌土壤桿菌GV3101中，接著通過(guò)記載于例如 Bechtold 和 Pelletier, Methods Mo I. Biol. 82, 259-66 (1998)的真空滲入法轉(zhuǎn)染入擬南芥屬生態(tài)型Columbia植物(Col-O)中。將轉(zhuǎn)基因植物在加有3%(w/v)鹿糖和50mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog瓊脂(MS瓊脂)上選擇。對(duì)TaWRKY2 (48個(gè)系)和TaWRKY19 (8個(gè)系)創(chuàng)建獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因系。基于所有T1轉(zhuǎn)基因系的全長(zhǎng)TaWRKY基因使用特異性引物通過(guò)RT-PCR檢查每個(gè)系中TaWRKY轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。實(shí)施總RNA分離和RT-PCR分析，如上文所描述的。使用Col-O作為陰性對(duì)照。使用AtActin-7基因作為內(nèi)部對(duì)照。對(duì)于具有高表達(dá)水平的TaWRKY基因的T1轉(zhuǎn)基因系，通過(guò)Northern印跡分析進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。將總RNA(25 μ g)通過(guò)含有甲醛的I. 0%瓊脂糖凝膠分開(kāi)，轉(zhuǎn)移至Hybond尼龍膜上，并雜交,如先前記載于Zhang等，Theor. Appl.Genet, 99:1006-1011 (1999)的。通過(guò)隨機(jī)引發(fā)法用a -32P-dCTP標(biāo)記含有來(lái)自初始pGEM-T_TaWRKY構(gòu)建體的全長(zhǎng)TaffRKY基因的BamHI/SacI和Smal/SacI片段，并作為探針用于Northern印跡分析。使用18S和28S RNA作為內(nèi)部對(duì)照。通過(guò)使用Typhoon Trio掃描儀(Amersham Biosciences/GE Healthcare, USA)顯現(xiàn)特定條帶。用獨(dú)立的RNA樣品將RT-PCR和Northern印跡分析重復(fù)兩次。對(duì)過(guò)表達(dá)TaWRKY2或TaWRKY19的轉(zhuǎn)基因系詳細(xì)調(diào)查其在不同非生物脅迫下的性倉(cāng)泛。實(shí)施例4TaffRKY2轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物的性能對(duì)過(guò)表達(dá)TaWRKY2的三種轉(zhuǎn)基因擬南芥屬系(2_12、2_1和2_2);見(jiàn)圖2a)的純合T3或T4種子檢查其在干旱、鹽和冷脅迫下的性能。通過(guò)70%(v/v)乙醇持續(xù)3-5分鐘和15%(v/v)漂白劑(KaoCorporation, Tokyo, Japan)持續(xù)10分鐘，接著用無(wú)菌水漂洗5次將Col-O和TaWRKY2轉(zhuǎn)基因系的種子表面滅菌。將經(jīng)滅菌的種子于4° C在黑暗中春化3天，然后在MS瓊脂上于pH5. 8，隨后在蛭石上于23° C在連續(xù)光下在生長(zhǎng)室中培養(yǎng)。為了評(píng)估干旱和鹽耐受性，將在水平放置的MS瓊脂上生長(zhǎng)的Col-O和轉(zhuǎn)基因系的7天齡幼苗小心轉(zhuǎn)移到O. 5x MS瓊脂或加有300mM山梨糖醇或150mM NaCl的O. 5x MS瓊脂上，接著水平生長(zhǎng)生長(zhǎng)。在山梨糖醇處理20天或NaCl處理15天后，觀(guān)察到所得的表型變化。將經(jīng)處理的幼苗轉(zhuǎn)移至蛭石上以自山梨糖醇處理恢復(fù)20天和自NaCl處理恢復(fù)10天和25天。將在MS瓊脂上生長(zhǎng)的Col-O和轉(zhuǎn)基因植物的17周齡幼苗轉(zhuǎn)移至蛭石中，于正常的生長(zhǎng)溫度培養(yǎng)4天，然后用于評(píng)估轉(zhuǎn)基因植物的耐受性。將3周齡幼苗移入于4° C在光照中的冷室中，冷馴化(acclimation) 16小時(shí)，然后移入于-4° C在光照中的溫度受調(diào)節(jié)的冰箱中，冷凍4天,之后在冷室中于4° C去馴化(deacclimation) 24小時(shí)。隨后,將經(jīng)低溫處理的幼苗轉(zhuǎn)移至正常的生長(zhǎng)溫度，恢復(fù)20天。為了評(píng)估自山梨糖醇、NaCl和低溫處理恢復(fù)后植物的存活和生長(zhǎng)，評(píng)估所得的存活率、抽苔率、和植物高度。存活率代表在恢復(fù)指定時(shí)間后存活植物相對(duì)于經(jīng)處理植物的數(shù)目的百分比。抽苔率指示具有抽苔物(bolt)(大于等于5mm)的植物的數(shù)目相對(duì)于恢復(fù)后存活植物的數(shù)目的百分比。植物高度表示在恢復(fù)后具有超過(guò)5-mm長(zhǎng)度抽苔物的植物的峰抽苔物的平均值。為了評(píng)估與植物響應(yīng)干旱和鹽脅迫有關(guān)的其它指標(biāo)，將Col-O和轉(zhuǎn)基因TaWRKY2植物的7天齡幼苗小心轉(zhuǎn)移到O. 5x MS瓊脂和加有各種濃度的山梨糖醇(200mM和300mM)或似(1(1251111和1501111)的O. 5x MS瓊脂上達(dá)5天。收獲來(lái)自經(jīng)山梨糖醇處理的、經(jīng)NaCl處理的、和未處理的對(duì)照的蓮座叢(Rosette)葉以測(cè)量丙二醛(MDA)含量、可溶性糖含量、和電解質(zhì)滲漏。通過(guò)由Cui 和 Wang, Plant Soil Environ.，52:523-529 (2006)描述的硫代巴比土酸反應(yīng)性物質(zhì)(TBARS)測(cè)定法的改良型式評(píng)估MDA含量和可溶性糖含量。將葉(約O. 4g, Μ)稱(chēng)重,在液氮中用件棒和含有石英紗的研缽研磨，然后添加至4ml (V) 10%(w: v)三氯乙酸(TCA)。將勻漿以8000x g離心20分鐘，并將200 μ I上清液與200 μ I在10%TCA中的O. 6%(w:v)硫代巴比土酸(TBA)混合以在沸水中反應(yīng)15分鐘。將產(chǎn)物冷卻至室溫，并以 10, OOOx g 離心 10 分鐘。用 UV-VIS 分光光度計(jì)(Shimadzu, Japan)于 450nm(A450)、532nm (A532)和600nm (A600)檢查上清液的吸光度。以下式評(píng)估MDA含量=MDA ( μ mol/gFff) = [6. 45x (A532-A600)-O. 56x A450Jx V/M(FW代表鮮重)。以下式評(píng)估可溶性糖含量可溶性糖(mmol/g Fff) =11. 71x A450X V/M。遵循如先前由Cao等，Plant Physiol, 143:707-719 (2007)描述的規(guī)程通過(guò)DDS-IlA電導(dǎo)檢測(cè)器檢查葉的電解質(zhì)滲漏。將來(lái)自三個(gè)幼苗的充分清洗的葉盤(pán)在去離子水(終體積為12ml)中浸沒(méi)，進(jìn)行真空滲入達(dá)20分鐘，并在水中維持2小時(shí)。檢查所得溶液的電導(dǎo)率(Cl)。在將去離子水中的葉段煮沸15分鐘后，將相應(yīng)的溶液冷卻至室溫，并產(chǎn)生其電導(dǎo)率(C2)。Cl除以C2的百分比(C1/C2)表示為電解質(zhì)滲漏。為了評(píng)估與植物響應(yīng)冷脅迫有關(guān)的其它指標(biāo)，將Col-O和轉(zhuǎn)基因TaWRKY2植物的3周齡幼苗在冷室中于4° C馴化16小時(shí)，然后在溫度受調(diào)節(jié)的冰箱中暴露于-4° C達(dá)4天。收獲來(lái)自經(jīng)冷脅迫的和未處理的對(duì)照的蓮座叢葉以測(cè)量MDA含量、可溶性糖含量和電解質(zhì)滲漏，如上文所描述的。在用300mM山梨糖醇處理20天后，轉(zhuǎn)基因植物保持綠色，而Col-O植物的大多數(shù)葉變黃(見(jiàn)圖2b)。隨后，將板培養(yǎng)的植物轉(zhuǎn)移入含有蛭石的盆中以在正常條件下恢復(fù)。在20天后，轉(zhuǎn)基因植物比Col-O植物顯示更好的存活和生長(zhǎng)，如從存活率、抽苔率和植物高度(見(jiàn)圖2c，d，e和f)判斷的。在經(jīng)干旱脅迫處理的植物中，可溶性糖水平在2-12系中顯著上調(diào)，但是在其它兩個(gè)系中僅略微升高(見(jiàn)圖2g)。相對(duì)電解質(zhì)滲漏在300mM山梨糖醇處理下在2-12系中顯著降低，但是在相同處理的其它系中僅略微降低。在200mM山梨糖醇時(shí)，所有三個(gè)系都顯示相對(duì)電解質(zhì)滲漏的略微降低(見(jiàn)圖2h)。在正常條件下，Col-O和轉(zhuǎn)基因植物良好生長(zhǎng)，并且沒(méi)有顯示表型和生理學(xué)參數(shù)的顯著差異。在經(jīng)鹽脅迫的條件(consition)中，Col-O植物的蓮座叢葉顯示嚴(yán)重的偏上性，而大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物僅受到適度影響(見(jiàn)圖3a)。隨后，將經(jīng)鹽處理的植物轉(zhuǎn)移入含有蛭石的盆中，并容許在正常條件下恢復(fù)。在恢復(fù)10天后，超過(guò)79%的轉(zhuǎn)基因植物存活，而小于50%的Col-O植物存活(見(jiàn)圖3b，d)。在恢復(fù)25天后，經(jīng)鹽處理的轉(zhuǎn)基因系比Col-O植物展現(xiàn)出更高的抽苔率(見(jiàn)圖3c，e)。經(jīng)鹽處理的轉(zhuǎn)基因植物的花序也比經(jīng)脅迫的Col-O植物的花序高(見(jiàn)圖3f)。與經(jīng)脅迫的Col-O植物相比，可溶性糖水平在經(jīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)基因植物中實(shí)質(zhì)性升高(見(jiàn)圖3g)。相反，與經(jīng)鹽處理的Col-O植物相比，MDA水平和相對(duì)電解質(zhì)滲漏在鹽脅迫后的TaffRKY2過(guò)表達(dá)植物中降低(見(jiàn)圖3h，i)。在正常生長(zhǎng)條件下在Col-O與TaWRKY2轉(zhuǎn)基因植物間沒(méi)有觀(guān)察到表型或生理學(xué)參數(shù)的顯著差異(見(jiàn)圖3a_i)。這些結(jié)果指示TaWRKY2增強(qiáng)植物對(duì)滲透脅迫(諸如在干旱條件中誘導(dǎo)的滲透脅迫)的耐受性，而且增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的耐受性。實(shí)施例5TaffRKY19轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物的性能也對(duì)過(guò)表達(dá)TaWRKY19的三種獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系(19_1、19_4和19_5 ;見(jiàn)圖4a)檢查其在冷、鹽和干旱脅迫下的性能，如實(shí)施例4中所描述的。在300mM山梨糖醇處理20天后，轉(zhuǎn)基因植物比對(duì)照Col-O植物展現(xiàn)出更多綠葉(見(jiàn)圖4b)。在將經(jīng)山梨糖醇處理的幼苗轉(zhuǎn)移入蛭石中并恢復(fù)20天后，轉(zhuǎn)基因系比Col-O對(duì)照顯示更好的生長(zhǎng)，如通過(guò)更高的存活率、更高的抽苔率和更高的花序表明的(見(jiàn)圖4c, d，e和f)。與Col-O植物中的水平相比，相對(duì)電解質(zhì)滲漏在山梨糖醇處理后在TaWRKY19過(guò)表達(dá)植物中也降低(見(jiàn)圖4g)。在正常條件下，在植物生長(zhǎng)和電解質(zhì)滲漏方面在Col-O和TaffRKY19轉(zhuǎn)基因植物間沒(méi)有觀(guān)察到顯著差異(見(jiàn)圖4)。在用150mM NaCl處理15天后，轉(zhuǎn)基因植物比對(duì)照植物顯示更好的生長(zhǎng)(見(jiàn)圖5a)。在恢復(fù)10天后，超過(guò)94%的經(jīng)鹽處理的轉(zhuǎn)基因植物存活，而僅47%的經(jīng)鹽處理的對(duì)照植物存活(見(jiàn)圖5b，d)。在恢復(fù)25天后，轉(zhuǎn)基因系19-1和19-4比對(duì)照和轉(zhuǎn)基因系19_5具有顯著更高的抽苔率(見(jiàn)圖5c，e)。轉(zhuǎn)基因植物的花序也比對(duì)照植物的化學(xué)高(見(jiàn)圖5c, f)。可溶性糖水平在經(jīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)基因植物中比在經(jīng)鹽脅迫的對(duì)照植物中顯著更高，而MDA和電解質(zhì)滲漏水平兩者更低(見(jiàn)圖5g，h, i)。將蛭石中生長(zhǎng)的3周齡幼苗暴露于冷凍溫度，然后容許在正常生長(zhǎng)條件下恢復(fù)。在處理后，所有TaWRKY19轉(zhuǎn)基因植物是活的且抽苔的(見(jiàn)圖6a，b, c)。相反，小于一半的對(duì)照植物存活，而且僅約35%的存活對(duì)照植物抽苔(見(jiàn)圖6a，b, c)。在抽苔的植物中，轉(zhuǎn)基因植物的均值植物高度大于對(duì)照植物的均值植物高度(見(jiàn)圖6d)。與經(jīng)冷凍處理的對(duì)照植物相比，經(jīng)冷處理的轉(zhuǎn)基因植物也具有更高的可溶性糖水平，但是更低的MDA和相對(duì)電解質(zhì)滲漏水平(見(jiàn)圖6e，f，g)。在正常生長(zhǎng)條件下，所有轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植物良好生長(zhǎng)，并且在表型和生理學(xué)參數(shù)上沒(méi)有顯示顯著差異(見(jiàn)圖6)。這些結(jié)果指示TaWRKY19增強(qiáng)植物對(duì)干旱、鹽和冷脅迫的耐受性。實(shí)施例6TaffRKY蛋白的亞細(xì)胞定位對(duì)于TaWRKY蛋白的亞細(xì)胞定位，用特異性引物通過(guò)PCR獲得TaWRKY2和TaWRKY19的完整編碼序列，將其用限制酶BamHI/Sall和Xhol/Spel消化，然后與瞬時(shí)表達(dá)載體中的綠色熒光蛋白(GFP)基因的5’或3’端融合以生成在組成性CaMV 35S啟動(dòng)子控制下的pUC-pUC-TaffRKY2-GFP和pUC_GFP_TaWRKY19構(gòu)建體。將兩種構(gòu)建體和陽(yáng)性對(duì)照pUC_GFP質(zhì)粒分開(kāi)轉(zhuǎn)染入自懸浮細(xì)胞制備的擬南芥屬原生質(zhì)體中。在共聚焦顯微鏡下觀(guān)察到GFP熒光。所有TaWRKY-GFP融合蛋白限于細(xì)胞核，而在胞質(zhì)中觀(guān)察到對(duì)照GFP蛋白(見(jiàn)圖7a)。這些結(jié)果指示兩種TaWRKY都是核蛋白。實(shí)施例7TaffRKY蛋白的轉(zhuǎn)錄激活還對(duì)TaWRKY2和TaWRKY19調(diào)查其在酵母和擬南芥屬原生質(zhì)體測(cè)定系統(tǒng)兩者中的轉(zhuǎn)錄激活能力。在酵母測(cè)定系統(tǒng)中，將每種TaWRKY基因與質(zhì)粒GAL4DBD中編碼GAL4DNA結(jié)合域的DNA序列融合。將所得的pBD-TaWRKY融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入YRG-2酵母細(xì)胞中，所述YRG-2酵母細(xì)胞含有在GAL4上游激活序列(UAS)控制下的整合的報(bào)告基因IacZ和HIS3。如圖8a中顯示的，含有pBD_TaWRKY2、pBD_TaWRKY19或陰性對(duì)照質(zhì)粒pBD的酵母細(xì)胞不能生長(zhǎng)，并且在存在X-Gal的情況中不顯示藍(lán)色。所有這些轉(zhuǎn)化體在正常YPAD培養(yǎng)基上良好生長(zhǎng)。這些結(jié)果指示TaWRKY2和TaWRKY19不擁有轉(zhuǎn)錄激活活性(至少在此酵母系統(tǒng)中)。使用雙重螢光素酶報(bào)告測(cè)定系統(tǒng)(Promega，USA)來(lái)檢查T(mén)aWRKY蛋白在擬南芥屬原生質(zhì)體中的轉(zhuǎn)錄激活活性。將效應(yīng)質(zhì)粒PBD-TaWRKY和表達(dá)螢火蟲(chóng)螢光素酶(LUC)的報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染入擬南芥屬原生質(zhì)體中，并測(cè)定相對(duì)LUC活性。如圖8b中顯示的，TaWRKY2和TaffRKY19比GAL4DBD陰性對(duì)照具有更小的LUC活性。這些結(jié)果指示TaWRKY2和TaWRKY19在原生質(zhì)體測(cè)定法中似乎沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活能力。實(shí)施例8TaffRKY蛋白的DNA結(jié)合特異性還調(diào)查T(mén)aWRKY2和TaWRKY19結(jié)合W框(TTGACC/T)的能力。使用含有BamHI和SalI位點(diǎn)及EcoRI和SalI位點(diǎn)的特異性引物PCR擴(kuò)增含有兩個(gè)完整的WRKY域的TaWRKY2和TaWRKY19的截短的編碼序列，然后融合入pMAL_c2X載體(New England Biolabs, USA)(其包含麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)編碼基因)中。TaWRKY2和19截短物具有兩個(gè)WRKY域，并且范圍分別為氨基酸位置181至468和193至468。這兩種表達(dá)的蛋白質(zhì)分別具有預(yù)期分子量74和73KD (見(jiàn)圖7b)。在大腸桿菌菌株TBl中表達(dá)融合有MBP的TaWRKY截短蛋白，并通過(guò)使用直鏈淀粉樹(shù)脂親和柱純化。通過(guò)于25。C以180rpm搖動(dòng)細(xì)胞8小時(shí)通過(guò)O. 15mM異丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。將TaWRKY蛋白通過(guò)在10%聚丙烯酰胺凝膠上的SDS-PAGE分開(kāi)，并用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。還純化MBP作為對(duì)照。為了分析TaWRKY蛋白對(duì)W框的結(jié)合特異性，通過(guò)于70° C加熱5分鐘，接著緩慢冷卻至室溫將2對(duì)合成的單鏈寡核苷酸Wb和mWb (各含有三個(gè)串聯(lián)的TTGAC重復(fù)和突變的TTGAA序列)在50mM NaCl中退火以生成雙鏈寡核苷酸。遵循制造商的手冊(cè)通過(guò)[Y -32P] -dATP (Amersham Pharmacia)和T4多核苷酸激酶(Promega)末端標(biāo)記雙鏈寡核苷酸，并通過(guò)使用旋轉(zhuǎn)柱層析(G_25Sephadex柱，Amersham Pharmacia)純化經(jīng)32P標(biāo)記的寡核苷酸。將結(jié)合反應(yīng)于室溫在含有2-4μ g純化的蛋白質(zhì)、I μ I經(jīng)[Y-32P]標(biāo)記的DNA片段和2 μ I凝膠移位結(jié)合5χ緩沖液[20%甘油、5mM MgCl、5mM ZnSO4,2. 5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、2. 5mM 二硫蘇糖醇(DTT)、250mM NaCl、50mM 三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)-HCl、
O.25mg/mL 聚(dl-dC)聚(dl-dC)，ρΗ 7· 5]的 5 μ I 混合物中溫育 20 分鐘。在 O. 5x TBE 緩沖液(O. IM Tris、90mM硼酸、ImM EDTA)中用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠以200V將蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合物分離35分鐘，直至溴酚藍(lán)染料行進(jìn)凝膠長(zhǎng)度的3/5。隨后，將凝膠轉(zhuǎn)移至濾紙上，于室溫干燥，并于-70° C在增感屏(intensifyingscreen)的情況中暴露于X-射線(xiàn)膠片。使用Typhoon Trio掃描儀(Amersham Biosciences/GE Healthcare, USA)顯現(xiàn)特定條帶。通過(guò)具有等同的標(biāo)記突變體探針的延遲條帶的衰減和在結(jié)合反應(yīng)中使用多至10倍過(guò)量的未標(biāo)記探針通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法評(píng)估探針結(jié)合特異性。這兩種蛋白質(zhì)都與經(jīng)標(biāo)記的Wb元件形成復(fù)合物(見(jiàn)圖7c)。延遲條帶的強(qiáng)度在包括非標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)物探針時(shí)顯著降低，指示這兩種TaWRKY蛋白都可以特異性結(jié)合W框序列。還對(duì)這兩種蛋白質(zhì)測(cè)試其結(jié)合突變體元件mWb的能力。兩種蛋白質(zhì)都不展現(xiàn)出對(duì)突變體的顯著結(jié)合(圖7c)。MBP沒(méi)有顯示結(jié)合Wb或mWb元件。這些結(jié)果指示這兩種TaffRKY蛋白都特異性結(jié)合Wb元件。實(shí)施例9TaWRKY轉(zhuǎn)基因植物中改變的基因表達(dá)自Col-O和轉(zhuǎn)基因植物的12天齡幼苗分離總RNA，并通過(guò)RT-PCR在TaWRKY轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)查脅迫相關(guān)基因DREB2A、RD29A、RD29、C0R15A、STZ和C0R6. 6的表達(dá)，并通過(guò)Northern印跡分析進(jìn)一步確認(rèn)。各種脅迫相關(guān)基因的特異性引物基于自www.arabidopsis. org下載的擬南芥屬基因序列。為了測(cè)試TaWRKY蛋白對(duì)調(diào)節(jié)基因的啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合特異性，在TaWRKY調(diào)節(jié)基因的I. 5kb啟動(dòng)子區(qū)中進(jìn)一步調(diào)查推定的WRKY結(jié)合W框元件的存在。1.5kb啟動(dòng)子序列獲自擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC)。在這些啟動(dòng)子序列后，將與特定DNA片段對(duì)應(yīng)的正向和反向單鏈寡核苷酸合成，退火，然后通過(guò)[Y -32P]-dATP (Amersham Pharmacia)作為探針末端標(biāo)記。RD29B和STZ基因的表達(dá)在TaWRKY2轉(zhuǎn)基因植物中增強(qiáng)，指示TaWRKY2可以至少經(jīng)由調(diào)節(jié)兩種基因在脅迫耐受性中發(fā)揮功能(見(jiàn)圖9a)。在了&1腿￥19轉(zhuǎn)基因植物中，01 82八、RD29B、Cor6. 6和RD29A基因比在Col-O植物中以更高的水平表達(dá)(見(jiàn)圖％)。這些結(jié)果提示了這兩種TaWRKY基因都經(jīng)由調(diào)節(jié)不同下游基因改善脅迫耐受性。每種元件的分布頻率在不同基因間是不同的，并且注意到具有不同側(cè)翼序列的預(yù)測(cè)元件(見(jiàn)圖10a)。認(rèn)為WRKY蛋白SUSBIBA2可以結(jié)合大麥isol啟動(dòng)子中非典型的W框序列GTGACT，合成STZ、Cor6. 6、RD29A、和CorlSA基因的I. 5kb啟動(dòng)子區(qū)中的典型的W框TTGAC(T/C)和非典型的W框GTGAC兩者以進(jìn)行凝膠移位測(cè)定法(見(jiàn)圖IOb)。RD29B和DREB2A基因的1.5kb啟動(dòng)子區(qū)中缺乏這兩個(gè)W框(見(jiàn)圖11a)。然而，因?yàn)榛パa(bǔ)鏈中推定的TTGACA元件和CTGACT元件以5bp的間隔存在于RD29B的_898bp至_882bp區(qū)中，所以還合成相應(yīng)的DNA片段以進(jìn)一步分析(見(jiàn)圖Ilb)。TaffRKY2顯示了對(duì)來(lái)自RD29B和STZ-I的元件的適度特異性結(jié)合，而且對(duì)來(lái)自STZ-2的元件具有非特異性結(jié)合(見(jiàn)圖IOc)。TaWRKY19展現(xiàn)出對(duì)來(lái)自Cor6. 6基因的元件的強(qiáng)烈的特異性結(jié)合，但是對(duì)來(lái)自RD29A和RD29B基因的元件僅非常弱的特異性結(jié)合(見(jiàn)圖IOc)。這些結(jié)果提示了 TaWRKY2和TaWRKY19經(jīng)由對(duì)其啟動(dòng)子中元件的直接結(jié)合完全調(diào)節(jié)六種下游基因中的至少四種。在此通過(guò)提及而將本文中應(yīng)用的每篇專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和出版物的公開(kāi)內(nèi)容完整收入本文。雖然已經(jīng)參考具體實(shí)施方案公開(kāi)了本發(fā)明，但是顯而易見(jiàn)的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不偏離本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍的前提下設(shè)計(jì)本發(fā)明的其它實(shí)施方案和變型。所附權(quán)利要求書(shū)包括所有此類(lèi)實(shí)施方案和等同變型。
權(quán)利要求
1.一種分離的WRKY多核苷酸，其選自下組 (a)包含SEQID NO: I和3中任一項(xiàng)的核苷酸序列的核酸； (b)包含與(a)至少70%相同的核苷酸序列的核酸； (c)包含在嚴(yán)格雜交條件下與(a)的互補(bǔ)物特異性雜交的核苷酸序列的核酸； (d)包含編碼WRKY蛋白的可讀框的核酸，所述WRKY蛋白包含SEQIDNO:2和4中任一項(xiàng)的多肽序列； (e)包含編碼WRKY蛋白的可讀框的核酸，所述WRKY蛋白包含與⑷至少70%相同，并且進(jìn)一步包含至少一個(gè)WRKY域的多肽序列；及 (f)包含作為(a)-(e)中任一項(xiàng)的互補(bǔ)物的核苷酸序列的核酸。
2.—種載體,其包含權(quán)利要求I的分離的WRKY多核苷酸。
3.—種宿主細(xì)胞，其表達(dá)權(quán)利要求2的載體。
4.權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自下組動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞。
5.一種轉(zhuǎn)基因植物或種子，其包含權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因植物或種子，其中所述植物是單子葉植物。
7.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因植物或種子，其中所述植物是雙子葉植物。
8.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因植物或種子，其中所述轉(zhuǎn)基因植物選自下組玉米、小麥、大麥、黑麥、甘薯、豆、豌豆、菊苣、萵苣、甘藍(lán)、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、石刁柏、洋蔥、大蒜、胡椒、芹菜、西葫蘆、南瓜、大麻、小胡瓜、蘋(píng)果、梨、榲梓、甜瓜、李、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、樹(shù)莓、黑莓、鳳梨、鱷梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三葉草、煙草、胡蘿卜、棉花、苜蓿、稻、馬鈴薯、茄子、黃瓜和擬南芥屬。
9.一種分離的WRKY多肽，其包含選自下組的氨基酸序列 (a)SEQ ID NO:2和4中任一項(xiàng)的多肽序列；和 (b)與(a)/(d)至少70%相同，并且進(jìn)一步包含至少一個(gè)WRKY域的多肽序列。
10.一種用于生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括自依照權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。
11.一種用于生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將依照權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物雜交。
12.通過(guò)依照權(quán)利要求10或11的方法生成的植物或自其衍生的轉(zhuǎn)基因種子。
13.—種改變植物中的性狀的方法，包括在植物中表達(dá)權(quán)利要求I的分離的多核苷酸。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述性狀選自下組:干旱耐受性、鹽耐受性和低溫耐受性。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述分離的WRKY多核苷酸包含SEQID NO: 1，且所述性狀是干旱耐受性。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述分離的WRKY多核苷酸包含SEQID NO: 1，且所述性狀是鹽耐受性。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述分離的WRKY多核苷酸包含SEQID NO:3。
18.通過(guò)依照權(quán)利要求13至17中任一項(xiàng)的方法生成的植物或自其衍生的轉(zhuǎn)基因種子。
19.一種用于生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將依照權(quán)利要求18的植物與非轉(zhuǎn)基因植物雜交。
全文摘要
使用WRKY核酸和多肽對(duì)植物賦予脅迫耐受性的組合物和方法。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102939384SQ201080066415
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2010年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月24日
發(fā)明者張勁松, 陳受宜, 牛燦芳, 馬彪, 張萬(wàn)科, 林晴, 何鍶潔 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所