專(zhuān)利名稱：一種植物耐低溫脅迫相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物耐低溫脅迫相關(guān)蛋白及其編碼基因在改變植物耐冷脅迫能 力中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物生長(zhǎng)在自然環(huán)境中，會(huì)受到各種各樣的不良因素的影響，主要包括生物脅迫 和非生物脅迫。前者主要是指各種病原微生物的入侵；后者則主要指鹽，干旱，低溫，高溫 等滲透脅迫。春去冬來(lái)，四季更替，溫度的變化不僅是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子之 一，同時(shí)也是限制作物產(chǎn)量的主要非生物因素。很多農(nóng)作物的大量減產(chǎn)是由于低溫寒害造 成的，因此，研究植物響應(yīng)低溫脅迫的生理生化反應(yīng)及其分子機(jī)制，能夠?yàn)樘岣咧参锏挚沟?溫寒害的能力創(chuàng)造條件。植物由于其生長(zhǎng)的固定性，為了在一定范圍的溫度條件下能夠正常的生長(zhǎng)和發(fā) 育，當(dāng)外界環(huán)境溫度發(fā)生變化時(shí)，植物自身會(huì)對(duì)這一變化作出反應(yīng)，包括Ca2+信號(hào)的傳遞， 一系列冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)，還有各種新成代謝上的變化。近幾年來(lái)，雖然有關(guān)植物如何響應(yīng) 低溫分子機(jī)制研究已經(jīng)比較深入，但是我們?nèi)匀徊磺宄参锏降资侨绾胃兄蜏匦盘?hào)并傳 遞低溫信號(hào)到核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄或引起一系列生理生化反應(yīng)。擬南芥是一種十字花科植物，由于其形態(tài)個(gè)體小，生長(zhǎng)周期快，基因組小，重復(fù)序 列少，并且全部基因組測(cè)序已經(jīng)完成，且容易被人工誘變產(chǎn)生大量不同基因位點(diǎn)遺傳變異 突變植株，因此已成為一種典型的模式植物，廣泛用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物 學(xué)的研究。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供植物耐低溫脅迫相關(guān)蛋白及其編碼基因在改變植物耐冷脅 迫能力中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)一個(gè)冷敏感突變體，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致該突變體冷敏感的基因，我們發(fā)現(xiàn)它的 編碼蛋白的新功能，就是能夠調(diào)控冷脅迫引起的細(xì)胞死亡，即可以改變植物對(duì)冷脅迫的耐 受能力。本發(fā)明的植物耐低溫脅迫相關(guān)蛋白，即調(diào)控植物低溫細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白AtLSDl， 來(lái)源于擬南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中SEQ ID No 2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中SEQ ID No 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取 代和/或缺失和/或添加且與SEQ ID N2 :2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID Na 2 衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中SEQ ID N2 :2是由183個(gè)氨基酸殘基組成。本發(fā)明提供的植物耐低溫脅迫相關(guān)基因，是調(diào)控溫度誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡相 關(guān)基因，是在冷信號(hào)途徑上起作用的基因，名稱為AtLSDl (Arabidopsis thaliana lesionsimulating disease resistance〗)，該基因在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)為At4g20380)，來(lái)源于哥倫比亞生態(tài)型的擬南芥，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID Na 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID Na 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID Na 1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA序列。序列表中序列1的DNA序列由2272個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第1 位到第1880位堿基，含有7個(gè)內(nèi)含子，分別為自5’端第199位到第318位堿基；自5’端第 381位到第505位堿基；自5，端第635位到第723位堿基；自5，端第擬9位到第1317位 堿基；自5’端第1458位到第1557位堿基；自5’端第1630位到第1721位堿基；自5’端 第1794位到第1880位堿基。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌及擴(kuò)增AtLSDl中任 一片段的引物對(duì)均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，上游引物和下游引物之間的距離 在50到2000個(gè)堿基之間；該引物對(duì)其中的每一個(gè)引物的長(zhǎng)度為15到25個(gè)堿基，如 引物 1:lsdl-R :5，-TCCGTTGATGAAAGCGGAAAGTCG-3，(SEQ ID Na 3)引物 2 :lsdl_F 5， -GGAATAGAGGAAGAATTTGGA-3， (SEQ ID Ns :4)。本發(fā)明還提供一種構(gòu)建低溫敏感型擬南芥的方法，是將擬南芥中的植物耐低溫脅 迫相關(guān)蛋白滅活；所述植物耐低溫脅迫相關(guān)蛋白為權(quán)利要求1所述的蛋白；所述滅活為點(diǎn) 突變、缺失或插入突變擬南芥中的植物耐低溫脅迫相關(guān)蛋白的編碼基因。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明的AtLSDl基因 敲除(或沉默)后，植物表現(xiàn)為低溫敏感。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及 篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記或具有抗性的抗生素標(biāo)記物。 被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發(fā)明的基因?yàn)榕嘤偷?溫植物新品種提供了基因資源，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為冷敏感突變體lsdl-3的表型分析和圖位克隆圖2為ATLSDl調(diào)控溫度依賴的細(xì)胞死亡驗(yàn)證
具體實(shí)施例方式我們通過(guò)篩選擬南芥EMS突變體庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)冷敏感突變體，克隆得到了這個(gè) 在冷信號(hào)途徑上起作用的基因。我們分析了該基因的生理生化功能，進(jìn)一步了解了植物感 知及應(yīng)答環(huán)境溫度的分子機(jī)制。以下述實(shí)施例說(shuō)明其獲得方法及其功能。實(shí)施例1、AtLSDl的圖位克隆(1)突變體chs4的獲得和表型分析我們通過(guò)篩選擬南芥EMS突變體庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了 2個(gè)冷敏感突變體，原來(lái)命名為chs4_l 和chs4-3。這兩個(gè)突變體是同一個(gè)等位基因。我們發(fā)現(xiàn)突變體在低溫條件下出現(xiàn)細(xì)胞死 亡，葉片萎蔫的表型(圖1A，圖2A)。(2)突變體的圖位克隆
為了克隆得到基因，我們將突變體與另一生態(tài)型Ler雜交后得到F2代，挑選低溫 敏感植株構(gòu)建圖位克隆的群體。利用BSA，初步將該突變基因定位第四條染色體的中部，經(jīng) 過(guò)SSLP和CAP或者dCAP標(biāo)記進(jìn)一步定位分析，把突變基因精細(xì)定位于F18F4與T7J7之 間(圖1B)，利用測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，在chs4-l中，突變堿基位于at4g20380(以前報(bào)道過(guò)的基 因ATLSD1)最后一個(gè)外顯子和內(nèi)含子的交接處，由G-A，造成了剪切錯(cuò)誤，致使在chs4-l中， mRNA多出將近90bp (圖1C)。在chs4_3中，突變堿基發(fā)生在第七個(gè)外顯子上，由C-T。這些 突變?cè)斐闪?at4g20380蛋白的不穩(wěn)定，在突變體里，ATLSDl蛋白含量表達(dá)很低(圖1D)。為 了進(jìn)一步證實(shí)是由于at4g20380的突變?cè)斐闪?chs4_l的冷敏感表型，我們做了互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)， 將野生型基因轉(zhuǎn)入突變體植株，能夠互補(bǔ)突變體的表型，因此進(jìn)一步確定了該突變體確實(shí) 是由于ATLSDl發(fā)生突變所致。因此我們將chs4-l重新命名為lsdl-3(圖1 E)。上述突變 體的鑒定，鑒定chs4-l突變位點(diǎn)所用引物為Isdl-R TCCGTTGATGAAAGCGGAAAGTCG(Taql)； Isdl-F :GGAATAGAGGAAGAATTTGGA。實(shí)施例2、ATLSDl調(diào)控溫度依賴的細(xì)胞死亡在低溫條件下突變體體內(nèi)有大量細(xì)胞死亡，同時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)了抗病基因PRl和冊(cè)2， 并且積累了高水平的SA。(1)用臺(tái)盼藍(lán)染色液染色，在體視鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，低溫處理之后，lsdl-3的葉片有 大量細(xì)胞死亡(圖2A)；(2)Northern blot 用1Trizol提取正常條件下和低溫條件下野生型和突變體的 RNA。以IX MOPS為電泳緩沖液，12%甲醛變性膠進(jìn)行電泳分離。用10XSSC將RNA轉(zhuǎn)移到尼 龍膜上，紫外交連后用于雜交。雜交過(guò)程選用Church Buffer, PCR擴(kuò)增探針之后用同位素 α -32P-dCTP進(jìn)行標(biāo)記，雜交16 h之后，洗膜三次，分別用2 X SSC, 0. 1 % SDS, 15min ； 1 X SSC, 0. SDS，65°C下 15min，0. 5 X SSC, 0. SDS，65°C下 15min ；最后用 X 光片顯影，結(jié)果顯示 Chs4-1體內(nèi)的rai，PR2大量誘導(dǎo)表達(dá)(圖2B)。報(bào)告基因I3Rl:⑶S染色也證明在lsdl_3 體內(nèi)確實(shí)PRl表達(dá)高于WT (圖2C)。(3)甲醇提取WT和lsdl-3體內(nèi)水楊酸，環(huán)己烷和乙酸乙酯萃取之后風(fēng)干，乙腈溶 解之后用HPLC測(cè)定，結(jié)果顯示在lsdl-3中，不論是游離SA還是SAG，都高于WT (圖2D)。(4) lsdl-3在低溫條件下也表現(xiàn)出細(xì)胞死亡。綜上所述，我們得出結(jié)論=ATLSDl調(diào) 控溫度依賴的細(xì)胞死亡。序列表<160>4<210>1<211>2272<212>DNA<213> 擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaiiana(L.)HEYNH.)<400>1cttacgcgtc atgtaaaaaa aaaagaagcg taaattacga aaaacagaga gataaatccg60ggcattgaga ttttggagat agagagagag aaaaatcgaa atctattgtc tatctcctca120atttggattg gattttctgc atatcatcgc tctagctttc gcgggttttg gattcgattc180cttacccttc tccaatcggt aagaacaagc tccaaagttt gttccttttt ttcaattttc240
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〈213〉擬南芥屬擬南芥(Arabidopsi
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thaliana(L. )HEYNH.)0083]Met Gln AspGlnLeuValHisGlyCysArg AsnLeuLeuMetTyr Pro0084]1510150085]Arg Gly AlaSerAsnValArgCysAlaLeuCysAsnThrlieAsnMet0086]2025300087]Val Pro ProProProProProHisAspMetAlaHislielieCysGly0088]3540450089]Gly Cys ArgThrMetLeuMetTyrThrArgGlyAlaSerSerValArg0090]5055600091]Cys Ser CysCysGlnThrThrAsnLeuValProAlaHisSerAsnGln0092]657075800093]Val Ala HisAlaProSerSerGlnValAlaGlnlieAsnCysGlyHis0094]8590950095]Cys Arg ThrThrLeuMetTyrProTyrGlyAlaSerSerValLysCys0096]1001051100097]Ala Val CysGlnPheValThrAsnValAsnMetSerAsnGlyArgVal0098]1151201250099]Pro Leu ProThrAsnArgProAsnGly ThrAlaCysProProSerThr0100]1301351400101]Ser Thr SerThrProProSerGlnThrGlnThrValValValGluAsn0102]1451501551600103]Pro Met SerValAspGluSerGlyLysLeuValSerAsnValValVal0104]1651701750105]Gly Val ThrThrAspLysLys0106]1800107]<210>30108]<211>240109]<212>DNA0110]<213>人工序列0111]<220>0112]<223>0113]<400>30114]TCCGTTGATGAAAGCGGAAAGTCG200115]<210>40116]<211>210117]<212>DNA0118]<213>人工序列0119]<220>0120]<223>0121]<400>4
GGAATAGAGGAAGAATTTGGA權(quán)利要求
1.植物耐低溫脅迫相關(guān)蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID No . 2的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID N2 . 2氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和 /或缺失和/或添加且具有SEQ ID No 2的氨基酸殘基序列相同活性的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的植物耐低溫脅迫相關(guān)蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物耐低溫脅迫相關(guān)蛋白的編碼基因，其核苷酸序列是下列 核苷酸序列之一1)序列表中SEQID Na 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID No 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQID N2 :1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋 白質(zhì)的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)載體
5.含有權(quán)利要求2或3所述基因的宿主菌。
6.含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因任一片段的引物對(duì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的引物對(duì)，其特征在于所述引物對(duì)為序列表中SEQID No 3 和 SEQ ID Na :4。
9.權(quán)利要求2或3所述基因在改變植物耐低溫脅迫能力中的應(yīng)用。
10.一種構(gòu)建低溫敏感型擬南芥的方法，是將擬南芥中的植物耐低溫脅迫相關(guān)蛋白滅 活；所述植物耐低溫脅迫相關(guān)蛋白為權(quán)利要求1所述的蛋白；所述滅活為點(diǎn)突變、缺失或插 入突變擬南芥中的植物耐低溫脅迫相關(guān)蛋白的編碼基因。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種植物耐低溫脅迫相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQ ID №.2氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的基因?yàn)榕嘤偷蜏刂参镄缕贩N提供了基因資源，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102101882SQ200910241990
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者楊淑華, 黃小貞 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)