專利名稱：大豆GmFTL4蛋白和GmFTL6蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及兩個大豆開花基因、其編碼的蛋白及其在植物光周期和開花時間調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆是重要的農(nóng)作物之一，是植物蛋白質(zhì)、食用油、生物柴油以及異黃酮和卵磷脂等次生代謝產(chǎn)物的重要來源。因?yàn)榇蠖故嵌倘罩参铮_花受光周期的嚴(yán)格控制，因而不同區(qū)域間的優(yōu)異品種不能相互引種、生育期也受環(huán)境光周期的制約ahang等.，2008)。如果能降低大豆對光周期的敏感性，突破大豆開花對光周期的限制，就能解決大豆的引種問題，從而實(shí)現(xiàn)各區(qū)域間優(yōu)質(zhì)品種的相互交換，豐富各地優(yōu)異種質(zhì)資源，調(diào)節(jié)大豆生育期，提高大豆產(chǎn)量和品質(zhì)。以往解決大豆光周期敏感性主要是通過雜交的方法獲得新品種，但是，這種育種方法具有對親本的依賴性強(qiáng)和周期長等缺點(diǎn)，到目前為止尚未獲得大豆光周期廣適應(yīng)性品種。對擬南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受極其復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)控制的 (Mouradov等.，2002 ；Turck等，2008)。但是，其中一個關(guān)鍵蛋白對開花時間的調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用，它就是FloweringLocus T (簡稱FT)，它在葉片中產(chǎn)生，通過維管組織系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)缴L點(diǎn)并誘導(dǎo)生長點(diǎn)形成花(Blazquez and ffeigel,2000 ；Lee等·，2000 ；Samach 等，2000 ;Turck 等，2008)。因而，F(xiàn)T 蛋白被稱為成花素(Corbesier 等，2007 Jaeger and ffigge,2007 ；Mathieu等，2007)。該成花素的表達(dá)可以降低植物對光周期的敏感性，促進(jìn)植物開花。FT基因的功能在不同的植物中有報道(Bohlenius等，2006 ;Hsu等，2006 ;Yan 等，2006 ；Corbesier 等，2007 Jaeger and Wigge，2007 ；Lin 等·，2007 ；Mathieu 等，2007 ； Tamaki等，2007 ;Li and Dubcovsky，2008)，但在大豆FT基因的功能及其應(yīng)用未見報道。通過調(diào)節(jié)大豆開花基因表達(dá)來改變植物對光周期的敏感性和開花時間也沒有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供兩個大豆開花基因、其編碼的蛋白及其在植物光周期和開花時間調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種大豆GmFTL4蛋白，其具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，以及大豆 GmFTL6蛋白，其具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供編碼上述的大豆GmFTL4蛋白和大豆GmFTL6蛋白的基因。編碼大豆 GmFTL4蛋白的基因具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。編碼大豆GmFTL6蛋白的基因具有如SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。本發(fā)明的GmFTL4和GmFTL6(全稱為 Glycine max FloweringLocus T Like 4禾口 6) 是從大豆墾農(nóng)18 (Glycine max L. Kennong 18)中克隆到的兩個基因，它們編碼蛋白的氨基酸序列之間的相似性為96. 5%，與擬南芥FT蛋白的氨基酸序列之間的相似性均為65. 3%0 并且GmFTL4和GmFTL6蛋白與擬南芥FT具有序列相近的保守域。因此，GmFTL4和GmFTL6 與擬南芥FT基因具有類似促進(jìn)開花的功能。但是，GmFTL4和GmFTL6的蛋白質(zhì)序列與擬南芥FT蛋白有重要不同。在重要功能域中，大豆GmFTL4和GmFTL6的蛋白質(zhì)第131位氨基酸殘基為天冬氨酸(D)，第134位氨基酸殘基為異亮氨酸(I)，第135位氨基酸殘基為蘇氨酸 (T)，第137位氨基酸殘基為谷氨酸(E)，第140位氨基酸殘基是組氨酸(H)，第151位氨基酸殘基為天冬酰胺(N)，而擬南芥相應(yīng)部位分別是谷胺酰胺(Q)、酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、谷胺酰胺(Q)和酪氨酸(Y)。這些差異導(dǎo)致GmFTL4和GmFTL6的活性比擬南芥FT 弱。大豆GmFTL4和GmFTL6基因主要在開花前期和開花期的葉中表達(dá)。本發(fā)明包括通過各種方法獲得的、如SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白質(zhì)以及編碼這些衍生蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明將GmFTL4和GmFTL6基因構(gòu)建到表達(dá)載體p35S_GW上，并在大腸桿菌DH5 α 中擴(kuò)繁。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，將P35S-GW攜帶的GmFTL4和GmFTL6基因轉(zhuǎn)入擬南芥， 獲得擬南芥轉(zhuǎn)化植株。結(jié)果表明，GmFTL4和GmFTL6具有降低植物對光周期的敏感性并促進(jìn)擬南芥開花的作用。本發(fā)明還包括含有GmFTL4和GmFTL6核苷酸序列或其片段的克隆載體或各類表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明具有如下有益效果1)提供了大豆GmFTL4和GmFTL6基因及其編碼的蛋白本身；2)通過在植物中過表達(dá)GmFTL4和GmFTL6基因縮短植物生育期，促進(jìn)植物開花；3)GmFTL4和GmFTL6基因及其編碼的蛋白可以調(diào)節(jié)花期，可用于解決雜交育種中的花期不遇的問題，各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制的問題以及光周期敏感性問題和引種問題；4)大豆GmFTL4和GmFTL6基因調(diào)節(jié)花期的效應(yīng)較擬南芥FT基因的效應(yīng)弱，但轉(zhuǎn)基因植株生長較為健壯。


圖1為本發(fā)明大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6編碼蛋白的氨基酸序列與FT基因編碼蛋白的氨基酸序列的比較；圖2為本發(fā)明實(shí)施例3的植物表達(dá)載體p35S-GW的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例4的克隆中間載體pGWCm的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4顯示大豆開花基因GmFTL4轉(zhuǎn)化擬南芥，導(dǎo)致擬南芥早開花；圖5顯示大豆開花基因GmFTL6轉(zhuǎn)化擬南芥，導(dǎo)致擬南芥早開花；圖6A為本發(fā)明實(shí)施例7的大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6在不同發(fā)育時期的表達(dá)水平；圖6B為本發(fā)明實(shí)施例7的大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6在不同組織器官的表達(dá)水平；
圖7A為本發(fā)明實(shí)施例8的大豆開花基因GmFTL4在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞核中的定位；圖7B為本發(fā)明實(shí)施例8的大豆開花基因GmFTL6在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞核中的定位；其中，在圖6A和圖6B中，短線前面的字母表示植株的發(fā)育時期，短線后面的字母表示器官，U代表單葉；T代表復(fù)葉(T后面的數(shù)字為復(fù)葉的順序)；F代表花；Pd代表莢；Pt 代表葉柄(其后數(shù)字表示不同時期的莢)；R代表根；HH代表上胚軸；EH代表下胚軸；SAM代表生長點(diǎn)At代表莖；L代表側(cè)生葉；C代表子葉。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6的克隆分別禾Ij用正向引物5’ -ATGGCACGGGAGAACCCTCT-3，和反向引物 5，-TTAATATCTCCTTCCACCGCAAC-3，以及正向引物 5，-AACACAAACAATATAGTATCTAACA-3，和反向引物 5’ -AAAAAATCTTCATTGAACTTG-3’ 從大豆墾農(nóng) 18 (Glycine max L. Kennong 18)中克隆并測序獲得GmFTL4和GmFTL6基因，其基因序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示；由其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ IDN0. 1和SEQ ID NO. 2所示。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C 5min 預(yù)變性，95°C 30S，45°C 35S,72°C Imin，25 個循環(huán)， 72 0C IOmin 延伸。實(shí)施例2大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6編碼蛋白的氨基酸序列分析 大豆開花基因的GmFTL4和GmFTL6蛋白序列之間的同源性大于96. 5%，C端的功能域與擬南芥相似性較高，但存在重要區(qū)別，如圖1所示。大豆GmFTL4和GmFTL6的蛋白質(zhì)第131位氨基酸殘基為天冬氨酸(D)，第134位氨基酸殘基為異亮氨酸(I)，第135位氨基酸殘基為蘇氨酸(T)，第137位氨基酸殘基谷氨酸為(E)，第140位氨基酸殘基是組氨酸(H)， 第151位氨基酸殘基天冬酰胺為(N)，而擬南芥相應(yīng)部位分別是谷胺酰胺⑴)、酪氨酸(Y)、 丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、谷胺酰胺(Q)和酪氨酸(Y)。這些差異導(dǎo)致GmFTL4和GmFTL6的活性比擬南芥FT弱。實(shí)施例3大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6的克隆載體從實(shí)施例1中擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物直接按照TA克隆方法克隆到如圖3所示的 pGWCm載體上。先將pGWCm載體用Ahd I內(nèi)切酶水解后用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物以獲得T載體。然后PCR產(chǎn)物和T載體于16°C進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，并在其中擴(kuò)增，篩選陽性克隆并測序。實(shí)施例4大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6的植物表達(dá)載體分別將從實(shí)施例3中得到的大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6的克隆載體與如圖2 所示的植物表達(dá)載體P35S-GW等比例混合后通過LR反應(yīng)(兩種質(zhì)粒各50ng，LR酶1 μ 1， 補(bǔ)H2O至終體積5 μ 1，混勻后25°C反應(yīng)6小時以上)，將GmFTL4和GmFTL6構(gòu)建在p35S_GW 上，用于在植物中過表達(dá)大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6，研究其功能。植物的轉(zhuǎn)化方法采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行。植物中的篩選標(biāo)記為Bar。實(shí)施例5大豆開花基因GmFTL4促進(jìn)擬南芥開花從實(shí)施例4獲得的擬南芥轉(zhuǎn)化植株與其親本(野生型Col對照)在長日植株生長室中的條件(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強(qiáng)80 μ m0l*m_2· S—1)下同時培育，直至轉(zhuǎn)化植株開花(約20)。圖4顯示大豆開花基因GmFTL4轉(zhuǎn)化擬南芥，導(dǎo)致擬南芥早開花，對光周期不敏感。如圖4所示，其中左側(cè)代表對照野生型Col，右側(cè)代表轉(zhuǎn)基因植株。說明大豆GmFTL4蛋白具有開花活性，可以促進(jìn)植物開花。實(shí)施例6大豆開花基因GmFTL6促進(jìn)擬南芥開花從實(shí)施例4獲得的擬南芥轉(zhuǎn)化植株與其親本(野生型Col對照)在長日植株生長室中的條件(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強(qiáng)80 μ m0l*m_2· S—1)下同時培育，直至轉(zhuǎn)化植株開花(約20)。圖5顯示大豆開花基因GmFTL6轉(zhuǎn)化擬南芥，導(dǎo)致擬南芥較早開花， 對光周期不敏感。如圖5所示，其中左側(cè)代表對照野生型Col，右側(cè)代表轉(zhuǎn)基因植株。說明大豆GmFTL6蛋白具有開花活性，可以促進(jìn)植物開花。實(shí)施例7大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6在大豆的不同發(fā)育時期及組織器官中的表達(dá)水平利用實(shí)時定量熒光PCR(quantitative real time RT-PCR)測定大豆開花基因 GmFTL4和GmFTL6在大豆不同發(fā)育時期及組織器官中的表達(dá)。實(shí)時熒光定量PCR采用ABI M^One進(jìn)行，用STOR Green I檢測熒光信號。反應(yīng)體系為SYBR Primix Ex Taq (2 X) (TaKaRa) _7. 5 μ 1上游引物(10μ Μ)0. 3 μ 1下游引物(10μ Μ)0. 3 μ 1ROX Reference Dye(50x)0. 3 μ 1cDNA1. 0μ 1ddH20 (滅菌雙蒸水)5· 6 μ 1反應(yīng)參數(shù)為兩步法95°C 10S，熱啟動；95°C 5S，60°C lmin，40個循環(huán)。用基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件Genesis對基因的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并作圖。大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6主要在開花前期和開花期的葉片中表達(dá)，GmFTL4 和GmFTL6在葉柄中表達(dá)水平最高，如圖6所示。實(shí)施例8大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6編碼蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的定位采用基因槍轟擊的方法，將大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6與YFP的融合基因，轉(zhuǎn)化至大豆葉片中。具體方法如下1)微粒子彈的制備將10 μ g重組質(zhì)粒DNA與6 μ 1 50mg/ml的金粉懸液(直徑為1. 0 μ m)、4 μ 1 0. lmol/L亞精胺(抽濾滅菌)和6 μ 1 2. 5mol/LCaCl2,渦旋振蕩混勻，冰上靜置15min，12，OOOrpm離心10s，收集金粉沉淀，用20 μ 1無水乙醇重懸。2)轟擊受體材料將幼嫩的洋蔥表皮或大豆幼嫩葉片擺放在MS培養(yǎng)基上，22°C 預(yù)培養(yǎng)4h。選用IlOOpsi的壓力膜，將20 μ 1金粉-DNA混合物點(diǎn)在轟擊膜中央，采用PDS 1000/He型基因槍(Bio-Rad)進(jìn)行轟擊，轟擊距離6cm，真空度為25 . Hg。轟擊后的洋蔥表皮細(xì)胞22°C暗培養(yǎng)24h后，在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2)下觀察。轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的GFP/YFP熒光信號表示大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6編碼蛋白的定位，如圖7所示。圖7顯示大豆開花基因GmFTL4(圖7A)和GmFTL6 (圖7B)編碼的蛋白在大豆葉片(圖7A和圖7B)中主要定位于核。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.大豆GmFTL4蛋白，其特征在于，其具有如SEQID No. 1所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.大豆GmFTL6蛋白，其特征在于，其具有如SEQID No. 2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.編碼權(quán)利要求1所述的大豆GmFTL4蛋白的基因。
4.編碼權(quán)利要求2所述的大豆GmFTL6蛋白的基因。
5.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，其具有如SEQID No. 3所示的核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于，其具有如SEQID No. 4所示的核苷酸序列。
7.含有權(quán)利要求3-6任一項所述基因或其片段的載體。
8.含有權(quán)利要求7所述載體的宿主。
9.含有權(quán)利要求3-6任一項所述基因或其片段的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
10.權(quán)利要求3-6任一項所述的基因或其片段在調(diào)節(jié)植物光周期和開花時間中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆GmFTL4蛋白和GmFTL6蛋白，其具有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。過表達(dá)大豆開花基因GmFTL4和GmFTL6可明顯促進(jìn)植物(擬南芥)開花，使開花時間縮短，生育期縮短?？捎糜诮鉀Q雜交育種中的花期不遇問題、各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題、光周期敏感性問題和引種問題。
文檔編號C07K14/415GK102199203SQ20101013353
公開日2011年9月28日 申請日期2010年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日
發(fā)明者傅永福, 張曉玫 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所