人工dna-結(jié)合蛋白及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及由人工DNA?結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)和相關(guān)分子組成的蛋白質(zhì)及其用途。具體地，該蛋白質(zhì)是ZF?DBD或TALE?DBD并且用于治療由于功能獲得突變導(dǎo)致的眼部疾病。該疾病可以是ADRP，具體是由視紫紅質(zhì)基因突變導(dǎo)致的ADRP。本發(fā)明還涉及鑒定順式調(diào)節(jié)元件以及通過DBD調(diào)節(jié)它們的方法。
【專利說明】
人工DNA-結(jié)合蛋白及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及由人工DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)和相關(guān)分子組成的蛋白質(zhì)及其用途。具 體地，該蛋白質(zhì)是ZF-DBD或TALE-DBD，并且用于治療由于功能獲得突變導(dǎo)致的眼部疾病。該 疾病可以是ADRP，具體是由視紫紅質(zhì)基因突變導(dǎo)致的ADRP。本發(fā)明還涉及鑒定順式調(diào)節(jié)元 件的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 從基因組序列中提取生物信息內(nèi)容仍然是具有挑戰(zhàn)性的。除了進(jìn)化中保守的DNA- 序列基序以外，預(yù)測在特定DNA序列中體現(xiàn)的順式調(diào)節(jié)模塊/元件(CRM/CRE，即一段DNA，其 中多個效應(yīng)/轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合并調(diào)節(jié)周圍基因的表達(dá))并且理解它們的功能仍然是一個具 有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。此外，現(xiàn)有的DNA序列功能模型一般不能提取CRM序列的特殊性質(zhì)。CRM序 列的特殊性質(zhì)部分由ENCODE項(xiàng)目揭示，其提供對CRM和基因調(diào)節(jié)的關(guān)鍵洞見。新方案正顯示 CRM之間物理聯(lián)系的結(jié)構(gòu)和染色體上的空間分步在基因調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用。事實(shí)上，基因 調(diào)節(jié)根本上是一種動態(tài)過程，涉及基因組DNA和核蛋白器之間的組合相互作用。顯而易見的 是特定CRE的銜接決定細(xì)胞類型選擇性DNA調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。因此，出現(xiàn)的情況是，基因調(diào)節(jié) (而非功能)必須進(jìn)化以使調(diào)節(jié)的替代性選擇與特定基因相關(guān)，并且這進(jìn)而產(chǎn)生個體內(nèi)和個 體間以及物種間的多樣性。因此，通過在基因組調(diào)節(jié)區(qū)CRE中含有的調(diào)節(jié)組合性質(zhì)來生成細(xì) 胞特異性多樣性，最后調(diào)芐基因集(genes set)。
[0003] DNA元件百科全書(ENCODE)聯(lián)盟是由國家人類基因組研究所資助的研究組國際協(xié) 作。ENCODE的目標(biāo)是構(gòu)建人類基因組中功能性元件的詳細(xì)部分列表，包括在蛋白質(zhì)和RNA水 平上作用的元件，以及控制細(xì)胞的調(diào)節(jié)元件和使基因有活性的環(huán)境。然而，廣為人知的是同 一 DNA元件可被不同細(xì)胞環(huán)境中不同（一般相關(guān))的轉(zhuǎn)錄因子識別，具有替代性的功能后果。 另外，作者現(xiàn)在知曉許多ENCODE-定義的元件的生物化學(xué)特征(signature)顯示出復(fù)雜的跨 細(xì)胞活性模式（ENCODE項(xiàng)目聯(lián)盟.2012. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome(人類基因組中DNA元件的整合百科全書)Nature.2012年9月6日；489 (7414):57-74.doi：10.1038/naturell247；Thurman^.2012.The accessible chromatin landscape of the human genome(人類基因組的可及染色質(zhì)相圖）.Nature .2012年9月6 日；489(7414) :75-82 .doi : 10.1038/naturell232)，其可以伴隨著功能性質(zhì)，如與不同目標(biāo) 基因相互作用的增強(qiáng)子（Santos-Rosa等.2002Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3(活化蛋白在組蛋白H3的K4處三甲基化）.Nature 419:407_411;Sanyal等 ? 2012.The long-range interaction landscape of gene promoters(基因啟動子的長程 相互作用相圖）.Nature .2012年9月6 日；489(7414) :109-13.doi :10.1038/naturel 1279; Thurman等· 2012 The accessible chromatin landscape of the human genome(人類基 因組的可及染色質(zhì)相圖）.Nature .2012 年 9 月6 日；489 (7414) :75-82 .doi :10.1038/ naturell232)?？傊?，這些觀察表明，事實(shí)上，基因組可被廣泛多重編碼，即同一 DNA元件在 不同細(xì)胞類型中產(chǎn)生不同的活性。由ENCODE揭示的遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)DNA中明顯的交叉細(xì)胞類型調(diào) 節(jié)模式（Song 等· 2011 Open chromatin defined by DNase I and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity(由DNA酶I和FAIRE定義的開放染 色質(zhì)鑒定形成細(xì)胞類型相同性的調(diào)節(jié)元件）.Genome Res 21:1757-1767;Thurman等.2012 The accessible chromatin landscape of the human genome(人類基因組的可及染色質(zhì) 相圖）.Nature .2012年9月6 日；489(7414) :75-82 .doi :10.1038/naturell232)表明巨大的 異質(zhì)性和功能多樣性。
[0004] 上述考慮表明DNA-結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)組成并非唯一地結(jié)合至相同細(xì)胞類型中的 同一DNA元件。相反，同一DNA元件在不同細(xì)胞類型中產(chǎn)生不同活性。
[0005] 因此，順式調(diào)節(jié)元件和反式元件之間的界面和相互作用強(qiáng)烈依賴于精細(xì)獨(dú)特細(xì)胞 亞型環(huán)境中的順式調(diào)節(jié)元件和對應(yīng)特定細(xì)胞亞型而改變的反式結(jié)合元件性質(zhì)(生物化學(xué)性 質(zhì)）（Stamatoyannopoulos JA.Genome Res.2012年9月；22(9):1602_11)〇
[0006] 顯性遺傳的遺傳疾病的基因治療比隱性疾病的基于基因的治療更難，后者可用基 因補(bǔ)充來治療。顯性疾病的治療需要基因補(bǔ)充伴隨通過DNA水平的基因修復(fù)，或通過RNA水 平的RNA干擾或轉(zhuǎn)錄抑制的對于突變基因的表達(dá)抑制。
[0007] 遺傳沉默策略的主要目標(biāo)是信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物，其功能可受到基于反義-RNA、 基于核酶和最近采用的基于小干擾(s i) RNA和微小(mi) RNA的方法的抑制。具體地，RNA干擾 (RNAi)對于以突變依賴和獨(dú)立方式治療顯性疾病而言有很好的前景，利用其mRNA轉(zhuǎn)錄物切 割的效率（LaVail 等.2000 PNAS USA 97:11488-11493;Lewin 等.1998 Nat Med 4:967- 971;0'Reilly等.2007 Am J Hum Genet 81:127-135;Xia等.2004 Nat Med 10:816-820)。 無論如何，研究已經(jīng)顯示高水平的siRNA可通過多種機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞毒性(Boudreau等，2009; Grimm等，2006)。
[0008] 這類RNA-靶向方法的可能替代是通過使用基于鋅指（ZF)的人工轉(zhuǎn)錄因子（ZF- ATF)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)芐基因表達(dá)，該人工轉(zhuǎn)錄因子可經(jīng)調(diào)整適應(yīng)所需的DNA目標(biāo)序列。這類人 工ZF蛋白（也稱為ZFP)正成為基因操作和治療方法開發(fā)的新型和強(qiáng)力技術(shù)平臺（Jamieson 等.2003 Nat Rev Drug Discov 2:361_368;Pearson 2008 Nature 455:160_164;Segal和 Barbas 2001 Curr Opin Biotechnol 12:632-637)。人工ZFP包含DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD，即 獨(dú)立折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其含識別雙鏈或單鏈DNA的至少一個基序。DBD可識別特異性DNA 序列(識別序列)或?qū)NA有一般親和性），其基于與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(如激活子或抑制子)融 合的Cys2His2 ZF支架。它們的模塊結(jié)構(gòu)允許同時(shí)依次組裝多個ZF以生成具有不同目標(biāo)特 異性的DBD和使用各種效應(yīng)結(jié)構(gòu)域來對ATF或核酸酶進(jìn)行工程改造。
[0009] 迄今為止，已經(jīng)生成了幾種功能性ZF-ATF來體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá) (Mattei等.2007 PL0S One 2:e774;Rebar等.2002 Nat Med 8:1427-1432)。妣88〇1111〇等 能夠證明在ADRP小鼠模型中通過載體介導(dǎo)的體基因轉(zhuǎn)移體內(nèi)沉默人疾病基因視紫紅質(zhì) (hRHO)歸功于包含抑制子結(jié)構(gòu)域的ZF(Mussolino等.2011 ΕΜΒ0 Mol Med 3:118-128)。 TO2012106725涉及包含工程改造的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其中該蛋白 結(jié)合至少一個內(nèi)源性視紫紅質(zhì)等位基因中的目標(biāo)位點(diǎn)，并且調(diào)節(jié)該至少一個內(nèi)源性視紫紅 質(zhì)等位基因的表達(dá)。該文獻(xiàn)公開了包括核酸酶作為效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的靶向視紫紅質(zhì)的鋅指蛋 白。這類蛋白質(zhì)識別視紫紅質(zhì)基因的特異性目標(biāo)序列。這類序列對應(yīng)于特異性核酸酶的剪 切位點(diǎn)并且位于特異性RH0突變附近。因此，各所述鋅指蛋白僅作用于可由ZFN-驅(qū)動的DNA 修復(fù)改性的視紫紅質(zhì)的特定突變上。
[0010] 類似地，可使用人工TAL(轉(zhuǎn)錄激活物樣)效應(yīng)蛋白（通常稱為TALE)。它抱含可通 過中央重復(fù)結(jié)構(gòu)域識別DNA序列的DBD，該中央重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(如激活 子或抑制子)融合的變化數(shù)量的約34個氨基酸重復(fù)。目標(biāo)序列中的各DNA堿基和各重復(fù)中2 個關(guān)鍵氨基酸的相同性之間似乎存在一一對應(yīng)。多個工作組已經(jīng)設(shè)計(jì)出能夠在多個實(shí)驗(yàn)系 統(tǒng)中識別新DNA序列的人工TAL效應(yīng)物。這類工程改造的TAL效應(yīng)物已經(jīng)用于同樣地在人類 系統(tǒng)中產(chǎn)生可用于靶向并激活或抑制內(nèi)源性基因的人工轉(zhuǎn)錄因子(Miller等.（2010).〃A TALE nuclease architecture for efficient genome editing(高效基因組編輯的TALE 核酸酶結(jié)構(gòu)）〃 .Nature Biotechnology 29(2): 143-148; Cong等·〃 Comprehens ive interrogation of natural TALE DNA-binding modules and transcriptional repressor domains(天然TALE DNA-結(jié)合模塊和轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)構(gòu)域的全面解調(diào))〃 .Nature Communications . 968 3 ; Zhang等·（ 2011) .''Efficient construction of sequence- specific TAL effectors for modulating mammalian transcription(用于調(diào)節(jié)哺乳動 物轉(zhuǎn)錄的序列特異性TAL效應(yīng)物的高效構(gòu)建)〃 .Nature Biotechnology 29(2): 149)。
[0011] 常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性(ADRP)是人類中最具有遺傳異質(zhì)性的遺傳疾病:超 過30種基因和許多不同的突變，僅在視紫紅質(zhì)上有超過100種突變，已與視網(wǎng)膜色素變性相 關(guān)聯(lián)。視網(wǎng)膜色素變性的顯性形式包括分子上易于發(fā)生功能獲得突變的那些或單倍體不足 (aplo-insufficiency)或顯性負(fù)面效應(yīng)的那些。這種遺傳異質(zhì)性與變性的程度和速率差異 相關(guān)。占所有視網(wǎng)膜色素變性病例的30%_40%，常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性(ADRP)是24 種已知基因（表1)中突變的結(jié)果(Rossmiller等.Molecular Vision 2012;18:2479-2496)。 不論導(dǎo)致ADRP的基因的范圍，大約30%的ADRP來自視紫紅質(zhì)基因中的突變，因此作者著重 于治療影響視紫紅質(zhì)基因的突變。
[0012] 表1 :導(dǎo)致ADRP的已知基因和相關(guān)蛋白質(zhì)名稱。參考RetNet :https :// sph.uth.edu/retnet/〇

[0015] 目前，還沒有對ADRP的有效治療。特征是維生素 A或維生素 A加二十二碳六烯酸的 營養(yǎng)治療在一些患者中降低了變性速率。功能為分子伴侶的視網(wǎng)膜類似物和藥物顯示在動 物模型中保護(hù)視網(wǎng)膜的一些進(jìn)展，并且?guī)讉€抗氧化劑研究已經(jīng)顯示脂溶性抗氧化劑?；敲?氧膽酸（TUDCA)、金屬復(fù)合物鋅去鐵敏(metallocomplex zinc desferrioxamine)、N_乙酰 基-半胱氨酸，和抗氧化劑的混合物在嚙齒類rdl、rdl0,和Q344ter模型中延緩了視網(wǎng)膜變 性。已經(jīng)開始并著手進(jìn)行臨床試驗(yàn)來測試蛋白質(zhì)去乙酰化酶抑制劑丙戊酸作為視網(wǎng)膜色素 變性治療的功效。丙戊酸阻斷T-型鈣通道和電壓門控的鈉通道，并且與明顯的副作用(如聽 力損失和腹瀉）相關(guān)。因此，使用丙戊酸作為視網(wǎng)膜色素變性治療已經(jīng)受到質(zhì)疑 (Rossmiller等.Molecular Vision 2012;18:2479-2496)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 在本發(fā)明中，作者生成了新型功能性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且，通過將其與之前描述 的還包括抑制子結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)相比，并功能性地評估2個動物物種中健康和患病視網(wǎng)膜感 光體細(xì)胞特異性亞型上的轉(zhuǎn)錄輸出和生理和病理結(jié)果而出乎預(yù)料地確定了這種分離的結(jié) 構(gòu)域的新性質(zhì)。另外，作者還研究了在感光體細(xì)胞特異性亞型中改變DNA目標(biāo)位點(diǎn)上的順式 作用元件的結(jié)果。
[0017]具體地，在該研究中，作者證明，當(dāng)通過體基因轉(zhuǎn)移至視網(wǎng)膜-視桿感光體時(shí)，靶向 人視紫紅質(zhì)（RH0)近端啟動子的20堿基對(bp)長的序列的人工DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ZF6-DBD) 本身能阻斷視紫紅質(zhì)表達(dá)。與天然轉(zhuǎn)錄因子(TF)不同，這種人工DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺少效應(yīng) 結(jié)構(gòu)域，因此，這種ZF6-DBD令人驚訝地由于其DNA-結(jié)合性質(zhì)本身而產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄沉默。
[0018]在此，作者證明僅ZF-DBD，沒有其他功能性結(jié)構(gòu)域如抑制子結(jié)構(gòu)域，能夠令人驚訝 地在2種不同的動物設(shè)定(小鼠和豬）中抑制人類疾病基因視紫紅質(zhì)。本發(fā)明是一個示例，并 且也可應(yīng)用于其他DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如，其他鋅指和TAL衍生的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及RNA-導(dǎo) 向的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Crispr/cas 9)。
[0019] 這些令人驚訝的結(jié)果對于顯性遺傳的遺傳性眼病，尤其是常染色體顯性視網(wǎng)膜色 素變性有明顯有益的效果。具體地，從人工DNA-結(jié)合蛋白融除效應(yīng)結(jié)構(gòu)域生成具有不同性 質(zhì)（與包含DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的完整蛋白質(zhì)，即KRAB相比）的蛋白質(zhì)，其反映在 不同的功能結(jié)果上，這些包括：
[0020] 1-當(dāng)通過腺相關(guān)病毒(AAV)載體遞送至常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性(adRP)的小 鼠模型的感光體時(shí)視網(wǎng)膜功能的更高恢復(fù)(圖3)，
[0021] 2-當(dāng)在不同時(shí)間點(diǎn)通過AAV載體遞送至adRP的小鼠模型的感光體時(shí)視網(wǎng)膜功能的 更高恢復(fù)(圖6)，
[0022] 3-當(dāng)通過腺相關(guān)病毒(AAV)載體遞送至2個物種(小鼠和豬）的感光體時(shí)更高的視 紫紅質(zhì)轉(zhuǎn)錄下調(diào)（圖4和8)，
[0023] 4-當(dāng)在不同時(shí)間點(diǎn)通過腺相關(guān)病毒(AAV)載體遞送至2個物種（小鼠和豬）的感光 體時(shí)更高的視紫紅質(zhì)轉(zhuǎn)錄下調(diào)（圖4、8、12)，
[0024] 5-沒有潛在副作用(沒有脫靶;沒有Arr3減少，圖8);
[0025] 6-良好的載體產(chǎn)率（改善的蛋白質(zhì)生產(chǎn)），尤其是腺相關(guān)病毒載體，更具體地是 AAV8-CMV系統(tǒng)（圖 14)。
[0026]天然轉(zhuǎn)錄因子(TF)同時(shí)具有DBD和效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，其通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用吸 引多種其他蛋白質(zhì)，這可最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制或轉(zhuǎn)錄激活。轉(zhuǎn)錄抑制和轉(zhuǎn)錄激活生成細(xì)胞特 異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括全細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄組圖(whole cell-specific transcriptome map)。 相反，人工DBD是外部的并且獨(dú)立于調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（它們?nèi)鐚?shí)施例中那樣被CMV啟動 子驅(qū)動并且它們不通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)圖相連)并且在轉(zhuǎn)錄上獨(dú)立于內(nèi)源性細(xì)胞特異 性調(diào)節(jié)代碼(全細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄組圖）。事實(shí)上，天然TF本身屬于細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄組圖，即調(diào) 節(jié)子的調(diào)節(jié)子，因此它們受到其他細(xì)胞特異性TF設(shè)定的精細(xì)調(diào)節(jié)，其通過結(jié)合至TF結(jié)合位 點(diǎn)控制轉(zhuǎn)錄激活或抑制，最終產(chǎn)生細(xì)胞特異性功能。
[0027]本發(fā)明的數(shù)據(jù)表明，新型短（20bp)順式作用DNA序列（順式調(diào)節(jié)元件，CRE)在進(jìn)化 中并不完全保守，其不是增強(qiáng)子，但可明顯控制RH0水平。這些結(jié)果支持了 DNA目標(biāo)順式作用 元件本身(除了結(jié)合蛋白質(zhì)的活性以外)含有RH0表達(dá)的關(guān)鍵信息內(nèi)容。
[0028] 關(guān)于順式作用DNA目標(biāo)序列，觀察到：
[0029] 1-當(dāng)在合適的特異性細(xì)胞亞型環(huán)境中用AAV載體表達(dá)時(shí)，DNA目標(biāo)的位點(diǎn)特異性融 除導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因表達(dá)的明顯下降（圖19)，
[0030] 2-當(dāng)在合適的特異性細(xì)胞亞型環(huán)境中用AAV載體表達(dá)時(shí)，DNA目標(biāo)的位點(diǎn)特異性誘 變導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因表達(dá)的明顯下降（圖20)。
[0031] 然后，作者提出2步抑制-替換策略：（i)通過ZF-DBD的人視紫紅質(zhì)基因的突變非依 賴沉默(靶向野生型和突變的RH0等位基因的轉(zhuǎn)錄沉默）；和任選的（ii)通過載體介導(dǎo)的感 光體外源基因轉(zhuǎn)移的內(nèi)源性RH0拷貝的基因替換。
[0032] 所提出的該方案的可行性基于以下考慮：
[0033] (i)作者已經(jīng)證明ZF-DBD遞送下調(diào)RH0基因轉(zhuǎn)錄水平的優(yōu)越能力，其表示該策略中 的主要限制步驟;（ii)治療水平的轉(zhuǎn)錄沉默導(dǎo)致表型改善；
[0034] (ii i)作者已經(jīng)證明與包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和功能性結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相比，ZF-DBD 遞送的優(yōu)越安全性(具體由于更少的脫靶效應(yīng)）；
[0035] (iv)能夠?qū)⒊聊吞鎿Q構(gòu)建體整合到同一載體中。
[0036]事實(shí)上，整合ZF-DBD和替換基因的載體將確保它們在同一轉(zhuǎn)導(dǎo)的感光體中同時(shí)作 用，例如，使用允許協(xié)調(diào)表達(dá)2種轉(zhuǎn)基因的雙向啟動子。
[0037]本發(fā)明提供了一種由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的蛋白質(zhì)，該DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靶向選自下 組的基因的 DNA 調(diào)節(jié)序列：RH0、BEST1、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、GUCA1B、RP48、MPDH1、 RP10、KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、0RP1、DCDC4A、RP1、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、 PRPF8、PRPH2、RDS、RP7、R0M1、RP1、L1、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、 T0P0RS、HK1、PRPF4、RDH12、LCA13、RP53、SNRNP200、ASCC3L1、BRR2、HECIC2、RP33。
[0038] 優(yōu)選地，DNA調(diào)節(jié)序列的靶向誘導(dǎo)對所述基因表達(dá)的抑制。
[0039] 優(yōu)選地，所述基因是突變形式或野生形式。所述基因的突變形式造成遺傳眼病，優(yōu) 選常染色體顯性遺傳眼病，優(yōu)選常染色體隱性遺傳眼病。其可以是表1報(bào)告的基因中的任意 突變。
[0040] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，基因是突變形式。
[0041] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自下組:鋅指結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活物樣 (TAL)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或RNA-導(dǎo)向的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其功能性片段或其衍生物。
[0042]優(yōu)選地，在所述基因的啟動子區(qū)序列中包含DNA調(diào)節(jié)序列。
[0043] 優(yōu)選地，在RH0的啟動子區(qū)序列中包含DNA調(diào)節(jié)序列。
[0044] 更優(yōu)選地，DNA調(diào)節(jié)序列包含選自下組的序列：GGGGGTTAGAGGGTCTACGA(SEQ ID No.22)、CACCCCCAATCTCCCAGATGCTGAT(SEQ ID No.23)、TCAGCATCTGGGAGATTG(SEQ ID No.24)、GGGGGTTAGAGGGTCT(SEQ ID No.25)、GGGGGTTAGAGGGTCTA(SEQ ID No.26)、 TGAACACCCCCAATCTCC(SEQIDNo.27)SGTGGGGGTTAGAGGGT(SEQIDNo.28)。
[0045] 更優(yōu)選地，DNA調(diào)節(jié)序列基本是選自下組的序列:GGGGGTTAGAGGGTCTACGA(SEQ ID No.22)、CACCCCCAATCTCCCAGATGCTGAT(SEQ ID No.23)、TCAGCATCTGGGAGATTG(SEQ ID No.24)、GGGGGTTAGAGGGTCT(SEQ ID No.25)、GGGGGTTAGAGGGTCTA(SEQ ID No.26)、 TGAACACCCCCAATCTCC(SEQIDNo.27)SGTGGGGGTTAGAGGGT(SEQIDNo.28)。
[0046] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)基本由選自下組的序列組成:SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.l3、SEQ ID No.l5、SEQ ID Νο·17,或其片 段或其衍生物。
[0047] 本發(fā)明提供了編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子。
[0048] 本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸分子的載體。
[0049] 優(yōu)選地，所述載體是病毒載體。優(yōu)選地，該載體選自下組：腺病毒載體、慢病毒載 體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)載體(AAV)或裸質(zhì)粒DNA載體。
[0050] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述載體還包括選自下組的基因的核苷酸序列：RH0、 BEST1、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、(；UCA1B、RP48、MPDH1、RP10、KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、 RP27、ORP1、DCDC4A、RP1、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、PRPH2、RDS、RP7、R0M1、 RP1、L1、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、T0P0RS、HK1、PRPF4、RDH12、 LCA13、RP53、SNRNP200、ASCC3L1、BRR2、HECIC2和RP33。
[0051] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，載體還包括視網(wǎng)膜特異性啟動子，和任選的，調(diào)節(jié)序 列。
[0052] 優(yōu)選地，視網(wǎng)膜特異性啟動子是視紫紅質(zhì)激酶(RH0K)啟動子或轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白1 (GNAT1) 啟動子，優(yōu)選人轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白l(GNATl)啟動子。
[0053]本發(fā)明提供了用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0054] 本發(fā)明提供了含本發(fā)明的載體的病毒顆粒。
[0055] 本發(fā)明提供了包含上述蛋白質(zhì)或核酸或含有上述載體的宿主細(xì)胞或病毒顆粒和 藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。
[0056] 本發(fā)明提供了包含上述載體和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。
[0057]在本發(fā)明中，在藥物組合物中可使用上述蛋白質(zhì)、核酸、宿主細(xì)胞或載體的任意組 合。
[0058]優(yōu)選地，該組合物還包括包含選自下組的基因的核苷酸序列的載體:RH0、BEST1、 CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、GUCA1B、RP48、MPDH1、RP10、KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、 0RP1、DCDC4A、RP1、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、PRPH2、RDS、RP7、R0M1、RP1、L1、 RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP3 5、MERTK、RP33、T0P0RS、HK1、PRPF4、RDH12、LCA13、RP5 3、 SNRNP200、ASCC3L1、BRR2、HECIC2和RP33。
[0059] 優(yōu)選地，上述的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或核酸或載體或宿主細(xì)胞或病毒顆?；蛩幬锝M合 物用于治療常染色體顯性遺傳眼病和/或常染色體隱性遺傳眼病。
[0060] 具體地，BEST1、NR2E3、NRL、RH0、RP1、RPE65是導(dǎo)致常染色體顯性和隱性遺傳眼病， 如常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性和常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性的基因。
[0061] 優(yōu)選地，治療是基因治療。更優(yōu)選地，常染色體顯性遺傳眼病是常染色體顯性視網(wǎng) 膜色素變性(ADRP)或先天性靜止性夜盲。更優(yōu)選地，常染色體顯性遺傳眼病是常染色體顯 性視網(wǎng)膜色素變性(ADRP)。
[0062] 優(yōu)選地，常染色體隱性遺傳眼病是常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性。
[0063]本發(fā)明提供了用于治療有此需要的對象中常染色體顯性遺傳眼部疾病或常染色 體隱性遺傳眼病的方法，所述方法包括給予合適量的上述的蛋白質(zhì)或核酸或載體或宿主細(xì) 胞或病毒或藥物組合物。
[0064]本發(fā)明提供了鑒定靶向潛在DNA調(diào)節(jié)序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，包括：
[0065] a)生成2個獨(dú)立構(gòu)建體：
[0066]-包含在潛在DNA調(diào)節(jié)序列控制之下的報(bào)告基因序列的第一構(gòu)建體；
[0067]-包含在已經(jīng)突變的潛在DNA調(diào)節(jié)序列控制之下的報(bào)告基因序列的第二構(gòu)建體；
[0068] b)在視網(wǎng)膜中體內(nèi)表達(dá)步驟a)的各構(gòu)建體；
[0069] c)比較在潛在DNA調(diào)節(jié)序列控制下的報(bào)告基因的表達(dá)與在突變的潛在DNA調(diào)芐基 因控制下的報(bào)告基因的表達(dá)；
[0070] 其中，如果觀察到與在潛在DNA調(diào)節(jié)序列控制下的報(bào)告基因的表達(dá)相比突變的潛 在DNA調(diào)節(jié)序列控制下報(bào)告基因的表達(dá)減少，則潛在DNA調(diào)節(jié)序列是DNA調(diào)節(jié)序列并且由此 鑒定到了 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[0071] d)任選地，設(shè)計(jì)靶向DNA調(diào)節(jié)序列的DNA結(jié)合蛋白。
[0072]本發(fā)明提供了由上述方法鑒定的靶向潛在DNA調(diào)節(jié)序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選 地，由上述方法鑒定的靶向潛在DNA調(diào)節(jié)序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域如上文定義。
[0073]在本發(fā)明中，通過唯一DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方式靶向DNA調(diào)節(jié)序列誘導(dǎo)了對感興趣 基因表達(dá)的抑制。術(shù)語抑制表示阻滯、降低、減少基因表達(dá)。
[0074]在本發(fā)明中，可通過給予單一載體來實(shí)現(xiàn)基因治療，包括：
[0075]-一種編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸分子，該DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靶向控制選自下組的基 因表達(dá)的 DNA 調(diào)節(jié)序列：RH0、BE ST 1、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP3 0、GUCA1B、RP48、IMPDH1、 RP10、KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、0RP1、DCDC4A、RP1、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、 PRPF8、PRPH2、RDS、RP7、R0M1、RP1、L1、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、 1'0卩01?、冊1、？1?^4、^)!112、1^^13、1^53、5順陬200、厶50：31^、81^2、冊(：102和1^33，
[0076] -選自下組的野生型基因的核酸分子:RHO、BEST 1、CA4、RP 17、CRX、FSCN2、RP30、 GUCA1B、RP48、頂PDH1、RP10、KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、ORP1、DCDC4A、RP1、PRPF3、RP18、 PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、PRPH2、RDS、RP7、R0M1、RP1、L1、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、 RP35、MERTK、RP33、T0P0RS、HK1、PRPF4、RDH12、LCA13、RP53、SNRNP200、ASCC3L1、BRR2、 HECIC2和RP33。
[0077] 或者，可使用2種載體，其各自分別包含i)或ii)。
[0078] 在本發(fā)明中，可基于所需效果和已知方法容易地確定待給予的劑量。優(yōu)選地，本發(fā) 明的分子或組合物在視網(wǎng)膜內(nèi)給予。
[0079] 本發(fā)明的遞送載劑可給予患者。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定適當(dāng)?shù)慕o藥速率。術(shù)語 "給予"包括通過病毒或非病毒技術(shù)遞送。載體可以是，例如，質(zhì)粒載體、mRNA載體(例如，體 內(nèi)轉(zhuǎn)錄的mRNA載體)或病毒載體。病毒遞送機(jī)制包括但不限于上文所述腺病毒載體、腺相關(guān) 病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、和桿狀病毒載體、痘苗病毒、 泡沫病毒、巨細(xì)胞病毒、塞姆利基森林病毒、痘病毒、RNA病毒載體和DNA病毒載體等，如上所 述。此類病毒載體為本領(lǐng)域熟知。非病毒遞送機(jī)制包括脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì) 體、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、陽離子表面兩親物(CFA)及其組合。
[0080] 作為向細(xì)胞遞送多核苷酸的替代，本發(fā)明的DBD可通過蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)遞送至細(xì)胞。蛋 白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如，可以通過載體遞送或通過直接蛋白質(zhì)遞送來進(jìn)行。
[0081] 本發(fā)明還提供了用于治療個體的藥物組合物，其中該組合物包含治療有效量的本 發(fā)明的蛋白質(zhì)/核酸/載體或宿主細(xì)胞或由其產(chǎn)生或獲得的病毒顆粒。該藥物組合物可用于 人或動物用途。通常，醫(yī)師都可確定對單個患者而言最適用的實(shí)際劑量且其會根據(jù)特定個 體的年齡、體重和反應(yīng)而變化。該組合物可任選包含藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、稀釋劑、賦形 劑或佐劑。藥用運(yùn)載體、賦形劑或稀釋劑的選擇可基于指定的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐。
[0082] 除運(yùn)載體、賦形劑或稀釋劑外，該藥物組合物還可包含任何合適的粘合劑、潤滑 劑、助懸劑、包衣劑、增溶劑和輔助或提高病毒進(jìn)入靶位點(diǎn)的其他運(yùn)載體試劑(例如脂質(zhì)遞 送系統(tǒng)）。
[0083] 適當(dāng)時(shí)，藥物組合物可通過以下任意一種或多種方式給予:吸入給予，以栓劑或陰 道栓的形式給予，以洗劑、溶液劑、乳膏、軟膏或撒粉的形式外用，使用皮膚貼片，以包含淀 粉或乳糖等賦形劑的片劑形式口服給予，或單獨(dú)或與賦形劑混合的膠囊或卵泡形式，以包 含調(diào)味劑或著色劑的酏劑、溶液劑或混懸劑形式給予，或者可以胃腸外注射給予，例如海綿 體內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下。在一個方面中，胃腸外給藥途徑可以是眼內(nèi)給藥。本發(fā)明的眼內(nèi) 給藥可通過注射或直接(例如，局部)給藥至眼來完成。除上述對眼給藥的局部途徑外，合適 的眼內(nèi)給藥途徑還包括玻璃體內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、視網(wǎng)膜下、眼筋膜囊下、眼球周邊和眼球后、跨 角膜和跨鞏膜給藥。這類眼內(nèi)給藥途徑是本領(lǐng)域公知常識。
[0084]對于胃腸外給藥，這些組合物最好是無菌水溶液形式，可包含其他物質(zhì)如足量的 鹽或單糖以使溶液與血液等滲。對于含服或舌下給藥，這些組合物可以是采用常規(guī)方式配 制的片劑或錠劑形式。
[0085]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解將多核苷酸或載體整合至宿主細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如轉(zhuǎn) 染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、病毒感染、熱擊、轉(zhuǎn)化(細(xì)胞融合或細(xì)胞膜的化學(xué)通透后）。
[0086] 本文中，術(shù)語"宿主細(xì)胞或遺傳工程改造的宿主細(xì)胞"指使用本文所述構(gòu)建體或載 體轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
[0087] 作為適當(dāng)宿主細(xì)胞的代表性示例，可舉例細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌、鏈霉菌屬、鼠傷 寒沙門氏菌）、真菌細(xì)胞(如酵母）、昆蟲細(xì)胞(如Sf 9)、動物細(xì)胞(如CH0或C0S)、植物細(xì)胞等。 本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文教導(dǎo)能夠選擇合適的宿主。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是動物細(xì)胞，且 更優(yōu)選是人細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞或原代細(xì)胞，即直接從生物體(如人）中分 離。該宿主細(xì)胞可以是粘附性細(xì)胞或懸浮的細(xì)胞，即懸液形式生長的細(xì)胞。
[0088] 給予治療活性量的本發(fā)明的組合物或"有效量"定義為在一定劑量和作用時(shí)間下， 有效于實(shí)現(xiàn)提高/降低蛋白質(zhì)生成的所需結(jié)果的量。物質(zhì)的治療有效量可根據(jù)一些因素而 變化，所述因素包含，例如疾病狀態(tài)/健康、接受者的年齡、性別和體重、特定多肽、編碼其的 核酸或重組病毒引發(fā)所需應(yīng)答的固有能力?？烧{(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳治療響應(yīng)。例如，可 每天或采取其它合適的時(shí)間間隔給予數(shù)個分開的劑量，或者該劑量可按治療情況危急程度 的指示按比例減少。例如，通常對于病毒載體給藥，合適的劑量范圍是1〇8至l〇13vg(載體基 因組)/眼。
[0089] 本發(fā)明中使用的轉(zhuǎn)錄、突變非依賴性策略目標(biāo)在于改善ZF的用途以克服開發(fā)針對 常染色體顯性遺傳眼病中功能獲得突變(gain-of function mutation)的有效治療策略中 的障礙。
[0090] "蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域"是給定的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)的保守部分，其可獨(dú)立于蛋白質(zhì)鏈的 其余部分進(jìn)化、發(fā)揮功能和存在。各結(jié)構(gòu)域形成緊密的三維結(jié)構(gòu)并且通?？瑟?dú)立地穩(wěn)定并 折疊。許多蛋白質(zhì)由幾個結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域組成。分子進(jìn)化使用結(jié)構(gòu)域作為建造模塊并且這些可 以不同的排列重組以產(chǎn)生具有不同功能的蛋白質(zhì)。結(jié)構(gòu)域的長度在約25個氨基酸至500個 氨基酸之間變化。因?yàn)樗鼈兪仟?dú)立穩(wěn)定的，結(jié)構(gòu)域可通過在一個蛋白質(zhì)和另一個之間的遺 傳工程改造"交換"以制備嵌合蛋白質(zhì)。
[0091] "DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域"（DBD)是獨(dú)立折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其含有識別雙鏈或單鏈DNA 的至少一個基序。DBD可識別特異性DNA序列（識別或調(diào)節(jié)序列）或具有對DNA的一般親和性。 一個或多個DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域通常是所謂的DNA結(jié)合蛋白（即由其他不同功能的結(jié)構(gòu)域組成 的較大蛋白質(zhì)）的部分。其他結(jié)構(gòu)域通常調(diào)節(jié)DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的活性。DNA結(jié)合的功能是結(jié) 構(gòu)性的或包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，這2種作用有時(shí)重疊。
[0092]在本發(fā)明中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是鋅指結(jié)構(gòu)域(ZF結(jié)構(gòu)域)或轉(zhuǎn)錄激活物樣DNA結(jié) 合結(jié)構(gòu)域(TAL結(jié)構(gòu)域)或RNA-導(dǎo)向的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Crispr/cas 9)。具體地，合成或人工 2卩或了41^結(jié)構(gòu)域或者8祖-導(dǎo)向的0嫩-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(〇丨8?以〇&89)。0嫩結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是上 述結(jié)構(gòu)域的功能性片段或功能性衍生物。功能性片段是缺少一個或多個分子并仍然維持識 別特異性調(diào)節(jié)序列的能力的結(jié)構(gòu)域。功能性衍生物是含有突變、取代并仍然維持識別特異 性調(diào)節(jié)序列的能力的結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知設(shè)計(jì)ZF或TAL或Crispr/cas結(jié)構(gòu)域及其 功能性片段和功能性衍生物并測試特異性的方法。
[0093]單個ZF基序（也稱為模塊）由具有簡單β-β-α折疊的大約30個氨基酸組成，其通過 疏水相互作用和單一鋅離子的螯合穩(wěn)定化。各ZF模塊主要識別重疊的3-4-bp DNA序列，其 中最后一個堿基對是之后目標(biāo)的第一個堿基度(各目標(biāo)的第四堿基在相對鏈上）。結(jié)合通過 關(guān)鍵的氨基酸殘基發(fā)生，其可經(jīng)交換以生成具有不同序列特異性的ZF模塊。為了獲得調(diào)整 適應(yīng)哺乳動物基因組DNA(人類基因組大小，3.0_109bp)中獨(dú)特目標(biāo)序列（也稱為調(diào)節(jié)序列） 的DBD，理論上，需要超過18bp的序列，并且這可通過連續(xù)連接一個或多個ZF模塊，尤其是至 少2個ZF模塊，至少3個ZF模塊、至少4個ZF模塊、至少5個或6個ZF模塊來完成。然而，這種理 論序列長度是不考慮人類感光體細(xì)胞特異性基因組特征的一般推測。因此，短于18bp的特 異性序列可在特異性組織和細(xì)胞類型中被同等唯一地識別。
[0094]衍生自轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)物(TALE)的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一般結(jié)構(gòu)，TALE衍生自植 物病原性黃單胞菌屬細(xì)菌，或來自青枯菌的TALE-樣蛋白質(zhì)也可經(jīng)工程改造以結(jié)合預(yù)定DNA 序列（Li，L.等.Characterization and DNA-binding specificities of Ralstonia TAL- like effectors(青枯菌TAL-樣效應(yīng)物的表征和DNA-結(jié)合特異性）.]?〇1.?131^6，1318- 1330; 2013) JAL-DBD包含33-35個氨基酸重復(fù)的串聯(lián)陣列，其各自識別大溝中的單一堿基 對。通過12和13位處的2個氨基酸確定各重復(fù)模塊的核苷酸特異性（M〇SC〇u，M.J.和 Bogdanove,A.J.A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors(簡單密 碼支配TAL效應(yīng)物識別DNA). Science 326,1501; 2009)，其稱為重復(fù)可變雙殘基(RVD)。4個 不同的RVD模塊-即六811-4811、4811-116、]^8-48。和4811-6154皮最廣泛地用于分別識別鳥噪呤、 腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
[0095] CRISPR(成簇且規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列）系統(tǒng)提供針對靶向的基因調(diào)節(jié)的潛 在平臺（Barrangou等，2007)。已經(jīng)在不同生物體中發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)；最簡單的之一是來自 釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes)的II型CRISPR系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，編碼Cas9蛋白質(zhì) 的單個基因以及2個RNA，一個成熟CRISPR RNA(crRNA)和部分互補(bǔ)反式作用RNA(tracrRNA) 是必需的，并且足以用于對外來DNA進(jìn)行RNA-導(dǎo)向的沉默。DNA切割中具有缺陷的突變蛋白 質(zhì)Cas9實(shí)際上能夠作為簡單RNA-導(dǎo)向的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域起作用。
[0096]因此，釀膿鏈球菌的CRI SPR/Cas系統(tǒng)可經(jīng)編程以通過用針對這種調(diào)節(jié)DNA位點(diǎn)的 堿基配對互補(bǔ)性引導(dǎo)RNA進(jìn)行簡單工程改造來設(shè)計(jì)針對特定真核調(diào)節(jié)序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu) 域。Cas9可用作定制的RNA-導(dǎo)向的DNA-結(jié)合平臺。
[0097] DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即，缺少效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的DNA-結(jié)合蛋白）本身是強(qiáng)效的因?yàn)樗鼈冊?信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的來源處(基因組DNA)發(fā)生作用，模擬并勝過轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)性質(zhì)的固有穩(wěn)健性，考 慮到特異性和因此的治療安全性和效力。
[0098]轉(zhuǎn)錄因子(TF)是包括2個主要功能性結(jié)構(gòu)域、效應(yīng)結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA- 結(jié)合蛋白。效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)е罗D(zhuǎn)錄激活和抑制。激活子結(jié)構(gòu)域和抑制子結(jié)構(gòu)域主要通過大轉(zhuǎn) 錄共激活子和共抑制子復(fù)合物通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的募集來實(shí)現(xiàn)。然后，這些共因 子同時(shí)進(jìn)行直接和間接作用，來調(diào)節(jié)RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄器(transcriptional machinery)在 核心啟動子處的活性。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有確定DNA識別性質(zhì)(DNA-結(jié)合特異性）的功能。特 定類別的成員（即旁系同源TF)通常具有相似的DNA結(jié)合偏好(Badis等，2009)。然而，不論 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域明顯共有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，TF可能顯示出非保守性結(jié)合性質(zhì)。在這些情況中， 認(rèn)為一般發(fā)生在效應(yīng)結(jié)構(gòu)域和其他細(xì)胞特異性核蛋白質(zhì)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用導(dǎo) 致體內(nèi)DNA對TF結(jié)合的差異。例如，KRAB-介導(dǎo)的基因沉默需要結(jié)合至共抑制子KAP-1 ARAB: KAP-1相互作用需要RING-B盒-卷曲螺旋(RBCC)結(jié)構(gòu)域(Peng H.等）。因此，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì) 相互作用還參與生成不同的DNA-結(jié)合特異性。確定體內(nèi)TF結(jié)合的另一個因素是局部染色質(zhì) 環(huán)境(Arvey等，2012)。另外，天然TF本身屬于細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄組圖（調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)子），因此 它們受到其他細(xì)胞特異性TF設(shè)定的精細(xì)調(diào)節(jié)，其控制它們的激活或抑制，最終產(chǎn)生細(xì)胞特 異性功能。
[0099]因此，總之，天然轉(zhuǎn)錄因子和偶聯(lián)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的人工DBD都具有DBD和效應(yīng)結(jié)構(gòu)域， 其通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用吸引多種其他蛋白質(zhì)，這可最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制或轉(zhuǎn)錄激活。
[0100] 相反，人工分離的DBD在調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的外部，并且轉(zhuǎn)錄上不依賴于內(nèi)源性 細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)代碼(全細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄組圖）。因此，人工DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域適于生成有效 并安全地調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)效方式，然后生成治療劑。
[0101] 通過參考下圖非限制性實(shí)施例闡述本發(fā)明。
[0102] 圖 1.A-ZF6轉(zhuǎn)錄抑制子（ZF6-KRAB;Mussolino等2011(EMB0 Mol Med.2011 年3月；3 (3) :118-28)和新ZF6-DBD的示意圖。B-人類啟動子鄰近區(qū)域上的DNA序列，大寫字母是同時(shí) 針對ZF6-KRAB和ZF6-DBD的DNA堿基結(jié)合位點(diǎn)。C-HEK293細(xì)胞上轉(zhuǎn)染后的使用抗HA表位抗體 的Western印跡分析，顯示相比之下ZF6-KRAB(34KDa)與ZF6-DBD(22KDa)不同的分子量。用 抗微管蛋白抗體對總蛋白質(zhì)的量標(biāo)準(zhǔn)化。
[0103] 圖 2.在P30時(shí)用AAV8-CMV-ZF6-DBD或AAV8-CMV-ZF6-KRAB或AAV8-CMV-EGFP (1X10E9 vg)視網(wǎng)膜下注射的P347 S小鼠上由ERG分析記錄的視網(wǎng)膜電生理響應(yīng)。A-C，幅度表 示通過在暗光適應(yīng)(暗光）和光適應(yīng)(亮光)條件下增加光強(qiáng)度引發(fā)的視網(wǎng)膜響應(yīng)。處理前 (基線:P30;黑色圓圈）和處理后(P50;三角形）的B-波振幅。載體遞送20天后，與對照對側(cè) EGFP注射的眼相比，視網(wǎng)膜的電生理響應(yīng)在ZF6-DBD和ZF6-KRAB處理的眼中保留。D圖表示 與對照相比，ZF6-DBD和ZF6-KRAB視網(wǎng)膜中都保持功能性響應(yīng)，然而，在視網(wǎng)膜功能保持水 平上，ZF6-DBD勝過ZF6-KRAB。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（t-檢驗(yàn)）統(tǒng)計(jì)值為*p<0.01，**p< 0.001，#邙<0.0001:圖24[注射66??之前的眼（基線，？30)對比用66??注射的眼(？50)];圖 2B[注射ZF6-KRAB之前的眼（基線，P30)對比用ZF6-KRAB注射的眼（P50)];圖2B[注射ZF6- DBD之前的眼（基線，P30)對比用ZF6-DBD注射的眼（P50)]。
[0104] 圖 3.在P14時(shí)用AAV8-CMV-ZF6-DBD或AAV8-CMV-ZF6-KRAB或AAV8-CMV-EGFP (lxlOE9vg)視網(wǎng)膜下注射并在P30時(shí)死的P347S小鼠上由ERG分析記錄的視網(wǎng)膜電生理響應(yīng) 的比較。A-B，幅度表示通過在暗光適應(yīng)(暗光)和光適應(yīng)(亮光)條件下增加光強(qiáng)度引發(fā)的視 網(wǎng)膜a-和b-波響應(yīng)。組A中EGFP對照眼和ZF6-DBD注射的眼之間；組B中eGFP對照眼和ZF6- DBD注射的眼之間以及ZF6-DBD和ZF6-KRAB之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(方括號）Χ，載體遞送14 天后，在ZF6-DK)處理的眼中視網(wǎng)膜的電生理響應(yīng)比ZF6-KRAB處理的眼中保留的明顯更多； ZF6-DBD和ZF6-KRAB注射的眼對比eGFP注射的眼之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。D，代表相對于 ZF6-DBD和ZF6-KRAB的視網(wǎng)膜ERG響應(yīng)保留的直接比較的圖；ZF6-DBD注射的眼(η = 32)對比 ZF6-KRAB注射的眼（n=10)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異為*p<0.01，**p< 0 · 001，***p<0 · 0001，（t-檢驗(yàn)）。
[0105] 圖4.(A)在用ZF6-DBD (21只分析的眼中17只眼視紫紅質(zhì)下調(diào)）和ZF6-KRAB (11只分 析的眼中10只眼視紫紅質(zhì)下調(diào))轉(zhuǎn)導(dǎo)的視網(wǎng)膜中對hRHO和Gna 11 mRNA水平的定量RT-PCR分 析的柱狀圖。所得值用鼠 GAPDH和Ac切轉(zhuǎn)錄物水平標(biāo)準(zhǔn)化，ZF6-DBD注射的眼對比eGFP注射 的眼之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異為郵<〇.〇1，*邙<〇.〇〇1，林邙<〇.〇〇〇1(卜檢驗(yàn)）。（8)在視網(wǎng) 膜下注射 lxl〇E9 的 AAV8-CMV-EGFP、AAV8-CMV-ZF6-DBD 和 AAV8-CMV-ZF6-KRAB 載體顆粒后 AAV8載體轉(zhuǎn)基因的平均表達(dá)水平。（C)用AAV8-CMV-EGFP、AAV8-CMV-ZF6-DBD和AAV8-CMV- ZF6-KRAB處理的視網(wǎng)膜樣品中對RH0的Western印跡分析。（D)對用AAV8-CMV-ZF6-DBD注射 的P347S小鼠的免疫熒光分析。（E)HA染色的視網(wǎng)膜顯示HA標(biāo)簽的核定位，并且在AAV8-CMV- EGFP對照中缺少其存在。（F-H)人特異性3A6抗體并不標(biāo)記野生型視網(wǎng)膜(F)，在AAV8-CMV- ZF6-DBD處理的眼(G)中實(shí)際上不存在，并且標(biāo)記AAV8-CMV-EGFP處理的對照視網(wǎng)膜(H)。
[0106] 圖 5 ·在P4 時(shí)用 AAV8-CMV-ZF6-DBD 或 AAV8-CMV-EGFP (1X10E9 vg)視網(wǎng)膜下注射并在 P30時(shí)分析的P347 S小鼠上，由ERG分析記錄的視網(wǎng)膜電生理響應(yīng)，ZF6-DBD注射的眼對比 eGFP注射的眼之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異為*p<0.01;#p<0.001 (t-檢驗(yàn)）。
[0107] 圖 6 ·在P4、P14和P30 時(shí)用 AAV8-CMV-ZF6-DBD或 AAV8-CMV-EGFP (lxlOE9vg)視網(wǎng)膜 下注射并在P30或P50時(shí)分析(P30注射組)的P347S小鼠的ERG分析所記錄的視網(wǎng)膜電生理響 應(yīng)。A不同熒光下用ZF6-DBD(P4，P14，P30)處理的眼和eGFP處理的眼（P30)的代表性波形。B 不同注射時(shí)間點(diǎn)處用ZF6-DBD(黑線)處理的眼和eGFP處理的眼(灰線）的波形;P4頂部組圖， P14中間組圖和P30底部組圖。C不同時(shí)間點(diǎn)處ZF6-DBD注射的眼對比用eGFP注射的對側(cè)眼之 間的中值△ ERG響應(yīng)。
[0108] 圖7.A.近端視紫紅質(zhì)啟動子的染色體定位。視紫紅質(zhì)近端啟動子的示意圖，表示 轉(zhuǎn)錄啟示位點(diǎn)和順式調(diào)節(jié)元件的位置及其同源結(jié)合蛋白。B.人和豬近端啟動子的比對;粗 體是ZF6-DBDCis-seq;紅色是人和豬ZF6-DBDCis-seq之間的錯配。C.用人和豬視紫紅質(zhì)啟 動子結(jié)合ZF6-DBD的示意圖。
[0109] 圖8.在P90時(shí)用AAV8-CMV-ZF6-DBD或AAV8-CMV-ZF6-KRAB處理野生型豬的視網(wǎng)膜， 并在15天后處死(載體劑量SxlOelOvghA通過q實(shí)時(shí)PCR評價(jià)的視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄本水平。與eGFR 處理的眼相比，ZF6-DBD降低了內(nèi)源性視紫紅質(zhì)表達(dá)，其中視網(wǎng)膜的其他基因未改變;#p值 < 〇，〇 1。B使用α-RHO (1D4)的對豬視網(wǎng)膜裂解物的Wes tern印跡分析;α-微管蛋白抗體用于 標(biāo)準(zhǔn)化。
[0110] 圖9.Α.與由AAV在豬視網(wǎng)膜中遞送的ZF6-DBD相比的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子(CRX和NRL) 的表達(dá)分析。Β.視網(wǎng)膜中已知主轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平（以FPKM計(jì)）。
[0111] 圖l〇.ZF6-DBD(Zf6DBD)對視紫紅質(zhì)啟動子的結(jié)合。在豬(Sus scrofa)視網(wǎng)膜中使 用針對HA的抗體的Ch IP分析。我們比較了 ZF6-DBD對視網(wǎng)膜的ZF6-DBD處理的部分對比未處 理的部分中視紫紅質(zhì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（Tss)的物理結(jié)合。我們觀察到與在未處理區(qū)域中的結(jié) 合水平相比，在處理的區(qū)域中特異性和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的富集。
[0112] 我們使用視紫紅質(zhì)啟動子(3000bp上）的上游區(qū)域作為隱性對照，在這種情況中， 處理的和未處理的區(qū)域之間沒有差異。*P值< 0，05。
[0113] 圖11.用AAV8-CMV-ZF6-DBD注射的豬視網(wǎng)膜的形態(tài)表征。A.豬視網(wǎng)膜對1D4(綠色） 和HA-標(biāo)簽(紅色）的共免疫標(biāo)記分析，其鑒定ZF6-DBD蛋白質(zhì)，注射的ZF6-DBD3.使用視紫 紅質(zhì)1D4(藍(lán)色）、HA-標(biāo)簽(紅色)和GNAT1 (綠色)對ZF6-DBD注射的視網(wǎng)膜的三重免疫熒光分 析;紅色箭頭表示HA-標(biāo)簽陽性細(xì)胞;綠色箭頭表示HA-標(biāo)簽陰性細(xì)胞。C.使用視錐抑制蛋白 抗體(Arr3;未注射的視網(wǎng)膜中紅色并且注射的視網(wǎng)膜中綠色）和表示視錐完整性的HA-標(biāo) 簽(紅色）的免疫熒光分析。放大:40倍;0S，外節(jié);IS，內(nèi)節(jié);ONL，外核層。
[0114] 圖 12 · A)在 lxlOElOvg 的載體劑量下 AAV8-CMV-ZF6-DBD 和 AAV8-CMV-ZF6-KRAB 遞送 至P90豬視網(wǎng)膜導(dǎo)致與對照(ZF-KRAB未轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)（NT)和ZF-DBD未轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)(NT))相比在P97時(shí)高 度顯著的內(nèi)源性豬視紫紅質(zhì)轉(zhuǎn)錄抑制。B)從收獲的視網(wǎng)膜中獲得的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平(RT- PCR)〇
[0115] 圖13.A.ZF6-KRAB和ZF-DBD差異表達(dá)的基因之間的交叉；B.由ZF-DBD和ZF-DBD- KRAB共有的DEG的倍數(shù)變化水平之間的關(guān)系;差異表達(dá)的基因（FDR<0.05)顯示DBD-KRAB和 DBD處理之間共有的差異表達(dá)的基因的倍數(shù)變化水平之間的相關(guān)水平和維恩圖，顯示ZF6- KRAB和ZF6-DBD之間的交叉(57DEG)在功能上相關(guān)并且因此可能結(jié)合相同的基因組目標(biāo)。
[0116] 圖14.在AAV8載體產(chǎn)生之后，由qPCR評價(jià)載體顆粒。N = 4AAV8-CMV-ZF6-KRAB，η = 2AAV8-RH0K-ZF6-KRAB，η = 2AAV8-CMV-ZF6-DBD。ZF6-DBD 對比 ZF6-KRAB (遍在啟動子）之間 的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異為*P <0.01。
[0117]圖15.在豬成年視網(wǎng)膜中評價(jià)針對沉默替換策略的RH0替換步驟的人GNAT1啟動子 強(qiáng)度。左上組圖：表示包括CRX TF結(jié)合位點(diǎn)中的突變的GNAT1啟動子基因座的圖，其突變能 夠增強(qiáng)基因表達(dá)(J.Lee等，Gene Therapy 2010)。右下圖：含GNAT1元件的增加的AAV8載體 劑量(AAV8hGNATl-EGFP:lxl0el0;lxl0ell;lxl0el2vg)在視網(wǎng)膜下空間中遞送之后轉(zhuǎn)基因 轉(zhuǎn)錄物的水平(EGFP)。下圖：不同載體劑量（Ixl0el0;lxl0ell;lxl0el2vg)下處理的視網(wǎng)膜 的組織學(xué)分析的代表圖。
[0118] 圖16.豬中進(jìn)行的沉默和替換實(shí)驗(yàn)。A.用AAV8-CMV-ZF6-DBD(劑量：lxl(Tll)和 AAV8-hGNAT 1 -hRHO (劑量：1X1 0-12)注射并在注射后15天處死的豬的內(nèi)源性視網(wǎng)膜基因的 表達(dá)水平。B.注射的眼中ZF6-DBD的表達(dá)水平。
[0119] 圖17.由ZF6-DBD識別的最小核心序列的鑒定。結(jié)合至包括ZF6-DBDCis-seq的hRho 近端啟動子區(qū)（hRho 43bp)的ZF6-DBD DNA的凝膠移位分析(A)。顯示了hRho 43bp野生型、 hRho 43bp突變F和hRh〇43bp突變L寡核苷酸的序列(B);核心序列用下劃線表示，并且已經(jīng) 突變的堿基表示為綠色(B)。
[0120]圖18.A.人視紫紅質(zhì)近端啟動子的序列：分別是野生型、ZF6-DBDCiS-seq突變 (MZF6-DBD)和ZF6-DBDCis-seq缺失（AZF6-DBD)(綠色是CRX結(jié)合位點(diǎn)，藍(lán)色是NRL結(jié)合位 點(diǎn)，粗體是ZF6-DBDCiS-seq，紅色是突變和缺失的序列）。1通過相對于報(bào)告載體(hRHO)表 達(dá)的倍數(shù)變化分析評價(jià)eGFP的表達(dá)水平。
[0121] 圖19.通過AAV8載體（lxlOE9vg)視網(wǎng)膜遞送缺少ZF6目標(biāo)DNA基序的報(bào)告子(EGFP) 的表達(dá)盒（GGGGGTTAGagGGTCTACGA SEQ ID No.22;AZF6;AAV8-hRH0-AZF6-5'UTR-EGFP) 進(jìn)行體內(nèi)順式調(diào)節(jié)(ZF6DNA-結(jié)合基序)顯著性的評價(jià)。通過使用針對聚腺苷酸(bGH，牛生長 激素聚腺苷酸）的引物的qRT-PCR評價(jià)的注射的眼中AAV8-hRH0-5 ' UTR-EGFP和AAV8-hRH0- 厶2卩6-5'17^16??的66??表達(dá)水平。冊0-5'17^-66??注射的眼對比11冊0-八2?6-5'17^- EGFP之間的顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異為*林？<0.0001』通過組織學(xué)分析的注射的眼中AAV8- hRHO-5 ' UTR-EGFP和AAV8-hRH0- Δ ZF6-5 ' UTR-EGFP的 eGFP表達(dá)水平。
[0122] 圖20.通過AAV8載體（1 x 10E9vg)視網(wǎng)膜遞送缺少ZF6目標(biāo)DNA基序的報(bào)告子(EGFP) 表達(dá)盒（TTACTGTAATCTTAACCGGA[SEQ ID Νο·29] ;MutZF6;AAV8-hRH0-MutZF6-5'UTR-EGFP) 進(jìn)行體內(nèi)順式調(diào)節(jié)(ZF6DNA-結(jié)合基序)顯著性的評價(jià)。通過使用針對聚腺苷酸(bGH，牛生長 激素聚腺苷酸）的引物的qRT-PCR評價(jià)的注射的眼中AAV8-hRH0-5 ' UTR-EGFP和AAV8-hRH0- Δ ZF6-5 ' UTR-EGFP的eGFP表達(dá)水平。RH0-5 ' UTR-eGFP注射的眼對比hRH0-MutZF6-5 ' UTR- EGFP之間的顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異為*林？<0.0001』通過組織學(xué)分析的注射的眼中AAV8- hRH0-5 ' UTR-EGFP 和 AAV8-hRH0-MutZF6-5 ' UTR-EGFP 的 eGFP 表達(dá)水平。
[0123] 圖 21 ·Α·視紫紅質(zhì)近端啟動子的序列：hRH0、mRH0、hRH0 insMurine、mRHO insHuman、hRH0AEvo、hRH0 Mevo、hRH0 5G和hRHO T3C(綠色是CRX結(jié)合位點(diǎn)，藍(lán)色是NRL結(jié) 合位點(diǎn)，粗體是ZF6-DBDCiS-seq，紅色是突變和缺失的序列）。1通過相對于報(bào)告載體 (hRHO)表達(dá)的倍數(shù)變化分子評價(jià)eGFP的表達(dá)水平。#p值< 0，01; 值< 0，001。
[0124] 圖 22A.含 ZF6-DBDCis-seq 的 25bp(TSS 上游 100bp)的 Transfac 分析。該位點(diǎn)在文獻(xiàn) 中報(bào)道含有針對klΠ 5 (豬序列）的結(jié)合位點(diǎn)。B.用AAV8-CMV-hKLF 15 (劑量:2x 1 0-10)注射并 在注射后15天處死的豬的內(nèi)源性視網(wǎng)膜的表達(dá)水平(NT，未轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)）。
[0125] 圖23 ·顯示由ZF6-KRAB、ZF6-DBD、TALE-DBD和對照ZF9-KRAB介導(dǎo)的相對于熒光素 酶活性的CRX反式激活的抑制程度的柱狀圖。ZF6-KRAB、ZF6-DBD和TALE-DBD明顯抑制由CRX 誘導(dǎo)的熒光素酶活性。
[0126] 圖 24 · pAAV2 · 1-CMV-ZF6-DBD。特征：
[0128] ITR:末端反向重復(fù)
[0129] CMV:巨細(xì)胞病毒
[0130] BGH:牛生長激素聚腺苷酸
[0131] AmpR:抗氨芐青霉素
[0132] WPRE: 土撥鼠肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件
[0133] 圖 25 · pAAV2 · 1 -hGNAT 1 -hRHO。特征：
[0136] 圖26.生成靶向順式作用元件以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的DNA-結(jié)合蛋白的總體方法。A-利用AAV 載體向感光體的基因轉(zhuǎn)移效力，能夠研究合適的細(xì)胞特異性環(huán)境內(nèi)順式作用元件的活性 (AAV-順式作用元件-報(bào)告子，即，體內(nèi)遞送至感光體的AAV-RH0-啟動子-突變體-EGFP)。一 旦鑒定到敏感的順式作用元件，即能夠生成靶向該序列（例如AAV-ZF6-DBD)的DNA-結(jié)合蛋 白，以模擬順式作用效應(yīng)。在RH0啟動子內(nèi)分離順式作用性質(zhì)后生成ZF6DBD-5TALRH0-02和 TAL7DBD結(jié)構(gòu)域。B-在如報(bào)道所述生成RH0沉默子之后，能夠生成含有該沉默子的AAV載體并 將其偶聯(lián)至替換構(gòu)建體(即，視紫紅質(zhì)）以生成沉默(ZF6-DBD)和替換(視紫紅質(zhì))策略。
[0137] 圖 27 .pAAV2.1-CMV-ZF6-5F。特征：
[0140] 圖 28 · pAAV2 · 1-CMV-TAL7-DBD。特征：
[0141] 特征：
[0143]圖 29 · pAAV2 · 1-CMV-TALRH0 (02) DBD。特征：
[0146] 圖30.2?6-5?、了41^7-080和了41^!10(02)080與人和豬視紫紅質(zhì)啟動子的結(jié)合的示意 圖?；赯F6-DBDCis-seq元件結(jié)果使DBD結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)位點(diǎn)移位(基于鋅指和TALE技術(shù)），參 見圖21。考慮到基因組ZF6-DBDCis-seq內(nèi)CCCCCA[SEQ ID No. 30]序列的敏感性，人工DNA結(jié) 合蛋白是部分片段化的，ZF6-5F，對應(yīng)于ZF6-DBD的相同氨基酸組成但是缺少最后的指（指 6,圖7)或者靶向CCCCCA[SEQ ID如.30]序列中心的5"上游序列。在了六1^!10(02)(17模塊） 中，+鏈上游6個堿基。在TAL7 (15模塊）中，-鏈上游2個堿基。目標(biāo)序列用下劃線表示，ZF6- DBDCis-seq加粗表示?？蚴荂RX結(jié)合位點(diǎn)，虛線框是NRL結(jié)合位點(diǎn)。
[0147] 圖31 ·在P15時(shí)用AAV8-CMV-ZF6-5F或TALRH0(02)DBD或AAV8-CMV-TAL7-DBD (lxlOE9vg)視網(wǎng)膜下注射的P347S小鼠上由ERG分析記錄的視網(wǎng)膜電生理響應(yīng)。幅度表示通 過在暗光適應(yīng)(暗光)和光適應(yīng)(亮光)條件下增加光強(qiáng)度引發(fā)的視網(wǎng)膜響應(yīng)。載體遞送15天 后的B-波振幅(P30小鼠），與對照對側(cè)EGFP注射的眼相比，在ZF6-5F、TALRH0(02)和TAL7處 理的眼中保留視網(wǎng)膜的電生理響應(yīng)。
[0148] 發(fā)明詳述
[0149] 材料和方法
[0150] 序列
[0151] 人視紫紅質(zhì)啟動子及其5'UTR的核苷酸序列（SEQ ID No.l)
[0153] ZF6-DBD的核苷酸序列（SEQ ID Νο·2)
[0155] ZF6-DBD的蛋白質(zhì)序列（SEQ ID Νο·3)
[0157] ZF2的核苷酸序列（SEQ ID No.4)
[0159] ZF2的蛋白質(zhì)序列（SEQ ID No.5)
[0161] TAL01 的核苷酸序列（SEQ ID Νο·6)
[0162]


















[0203] RT-PCR 研究
[0204] 按照生產(chǎn)商方案，使用RNAeasy小型試劑盒(凱杰公司（Qiagen))從組織分離RNA。 按照生產(chǎn)商的說明，使用QuantiTect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(凱杰公司）從lOOOyg分離的RNA中擴(kuò)增 cDNA。使用LightCycler 480(羅氏公司（Roche))和以下引物通過實(shí)時(shí)PCR測量轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn) 錄水平：
[0210] Gnatl_反向5' · · .GGAGAATTGAGTCTCGATAATACC. · .3' [SEQ ID Νο·36]。
[0211] 使用以下引物評價(jià)轉(zhuǎn)基因水平：
[0212] bGH_正向5'···TCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGT···3'[SEQIDNo·37]和
[0213] bGH_反向5' · · .GGGAGTGGCACCTTCC. · ,3'[SEQ ID Νο.38]。
[0214] 在20μ1的總體積中使用10μ1 LightCycler 480 SYBR Green I主混合物（羅氏公 司）和400nM引物，在以下條件下進(jìn)行cDNA的PCR:預(yù)孵育，50°C持續(xù)5分鐘，循環(huán)：95°C持續(xù) 10s，60°C持續(xù)20s和72°C持續(xù)20s的45次循環(huán)。所有的反映針對使用以下引物的鼠 GATOH和 ActP標(biāo)準(zhǔn)化：
[0215] mGAPDH_正向5' · · .GTCGGTGTGAACGGATTTG. · .3' [SEQ ID No.39]
[0216] mGAPDH_反向5，· · · CAATGAAGGGGTCGTTGATG · · · 3，[SEQ ID No · 40];
[0217] Act_正向5'· · .CAAGATCATTGCTCCTCCTGA. · ,3'[SEQ ID No.41]和
[0218] Act_反向5'CATCGTACTCCTGCTTGCTGA···3'[SEQIDNo·42]
[0219] 各樣品在2個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中重復(fù)分析。
[0220]免疫染色抗-HA抗體
[0221 ]將冷凍的視網(wǎng)膜切片用PBS清洗一次，隨后在4%PFA中固定10分鐘。切片浸沒在回 收溶液(〇，〇 1M檸檬酸鈉緩沖液，pH 6.0)中并在微波中沸騰3次。之后，加入封閉溶液（10 % FBS，10 % NGS，1 % BSA)持續(xù)1小時(shí)。一抗小鼠抗-HA (1:300，科文斯公司（Co vance))在封閉溶 液中稀釋并在4°C下過夜孵育。將二抗(AlexaFlu〇r?:594,抗小鼠1:1000 ;分子探針公司 (Molecular Probes)，英杰公司（Invitrogen)，加利福尼亞州卡爾斯巴德)孵育1小時(shí)。使用 Vectashield(載體實(shí)驗(yàn)室公司，英國彼得堡)觀察細(xì)胞核。切片使用Zeiss 700共聚焦顯微 鏡(德國上科亨的卡爾蔡司公司（Carl Zeiss))或Leica焚光顯微系統(tǒng)(德國韋次拉爾的萊 卡微系統(tǒng)有限公司（Leica Microsystems GmbH))來照相。
[0222] h-視紫紅質(zhì)3A6抗體
[0223] 用PBS洗滌冷凍視網(wǎng)膜切片一次。切片然后在含0.2%Triton_^X-100的PBS中透化1 小時(shí)。施用含有1〇%正常山羊血清的封閉溶液(西格瑪-奧德里奇公司（318111&-41(11^11)，密 蘇里州圣路易斯），持續(xù)1小時(shí)。一抗在封閉溶液中稀釋并在4°C下過夜孵育小鼠抗-h視紫紅 質(zhì)3A6(1:5,由加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)的Robert S.Molday友情提供）。將二抗(Alexa Flu〇r?594,抗小鼠 1:1000;分子探針公司(Molecular Probes)，英杰公司（Invitrogen)， 加利福尼亞州卡爾斯巴德)孵育1小時(shí)。使用Vectashield(載體實(shí)驗(yàn)室公司，英國彼得堡)觀 察細(xì)胞核。切片用Leica熒光顯微系統(tǒng)(德國韋次拉爾的萊卡微系統(tǒng)有限公司）來照相。
[0224] AAV載體制備
[0225] AAV載體由TIGEM AAV載體中心生成，通過三重轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞隨后進(jìn)行兩輪 CsCl2純化[Auricchio A，Hildinger M，0'Connor E，Gao GP，Wilson JM(2001)Isolation of highly infectious and pure adeno-associated virus type 2 vectors with a single-step gravity-flow column(用一步重力流動柱分離高度感染性和純的2型腺相關(guān) 病毒載體）.Hum Gene Ther 12:71-76.]。對于各病毒制備物，通過平均點(diǎn)印跡分析[Doria M,Ferrara A,Auricchio A(2013)AAV2/8 vectors purified from culture medium with a simple and rapid protocol transduce murine liver,muscle,and retinaefficiently(用簡單快速方案從培養(yǎng)基中純化的AAV2/8載體有效轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟、肌肉和視網(wǎng) 膜）.Hum Gene Ther Methods]和使用TaqMan的PCR定量(美國加利福尼亞州卡爾斯巴德的 應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems))實(shí)現(xiàn)的效價(jià)來確定物理效價(jià)[基因組拷貝（GC)/ ml]。用于載體制備的pAAV2.1-CMV-ZF6-DBD和pAAV2.1-hGNATl-hRHO分別示于圖24和25。用 于載體制備的PAAV2 · l-CMV-ZF6-5F、pAAV2 · 1-CMV-TAL7-DDB和pAAV2 · 1-CMV-TALRH002DBD 分別示于圖27、28和29。?44￥2.1-01^用于所有載體制備（圖26)。
[0226] 順式-序列誘變
[0227] 通過QuikChange II XL定點(diǎn)突變試劑盒（安捷倫科技有限公司（Agilent Technologies))按照生產(chǎn)商說明書所示使用以下引物由pAAV2.1 hRhoPromoter_eGFP質(zhì)粒 誘變生成pAAV8-hRH0- Δ ZF6-5 ' UTR-EGFP:
[0230]通過QuikChange II XL定點(diǎn)突變試劑盒(安捷倫科技有限公司）按照生產(chǎn)商說明 書所示使用以下引物由PAAV2.1 hRhoPromoter eGFP質(zhì)粒誘變生成pAAV8-hRH0-MutZF6-5' UTR-EGFP：
[0233] 電生理測試
[0234] 方法描述于Surace EM，Domenici L，Cortese K，Cotugno G，Di Vicino U等， (2005)Amelioration ofboth functional and morphological abnormalities in the retina of a mouse model of ocular albinism following AAV-mediated gene transfer(在AAV-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移后眼白化病小鼠模型的視網(wǎng)膜中功能性和形態(tài)異常的改 善）.Mol Ther 12:652-658。
[0235] 小鼠在黑暗中培育2小時(shí)并麻醉。由通過Ganzf e 1 d刺激器（CS0，Cos truz ione Strumenti Oftalmici，佛羅倫薩，意大利）生成的10-ms閃光引發(fā)閃光視網(wǎng)膜電圖（ERG)并 如前所述記錄。使用以下的方案評價(jià)ERG和b-波閾值。在暗光適應(yīng)條件下，用從-5.2增加至+ 1.31og cd*s/m2(對應(yīng)于1X10-5·2至20.0cd*s/m 2)的閃光刺激眼。刺激之間的log單位間隔 為從-5.4至0 .Olog cd*s/m2之間0· 31og，并且從0 ·0至+1 · 31og cd*s/m2之間0.61og。對于在 暗光適應(yīng)條件下的ERG分析，考慮0.61og單位間隔的11次刺激(從-4至+1.31og cd*s/m2)弓| 發(fā)的響應(yīng)。為了模擬噪音，在從-4至0.Olog cd*s/m2的各0.61og單位刺激處3次ERG響應(yīng)取 平均，對于更高（〇.0-+1.31og cd*s/m2)的刺激考慮一次ERG響應(yīng)。刺激之間的時(shí)間間隔為 從-5.4至0· 71og cd*s/m2為 10秒，從0.7至+llog cd*s/m2之間為30秒，或從+1 至+1 · 31og cd*s/m2之間為120秒。暗光適應(yīng)條件中記錄的a-和b-波幅度作為光強(qiáng)度增加的變量作圖 (從-4至+1.31og cd*s/m2,圖1、S1和S2)。在暗光適應(yīng)部分之后通過用50cd/m2的恒定背景照 射上10次10ms的20.0cd*s/m2閃光來記錄光適應(yīng)ERG。
[0236] 載體給予和動物模型
[0237] 用于交配的P347S+/+動物（Li T，Snyder WK，01sson JE，Dryja TP(1996) Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S：evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments(攜帶顯性視紫 紅質(zhì)突變P347S的轉(zhuǎn)基因小鼠：視紫紅質(zhì)向外節(jié)的缺陷定向轉(zhuǎn)運(yùn)的證據(jù)）.Proc Natl Acad Sci USA 93:14176-14181)由G.Jane Farrar博士（愛爾蘭都柏林，都柏林圣三一學(xué)院，斯墨 菲基因研究所(Smurfit Institute of Genetics))友情提供并且在卡達(dá)雷利醫(yī)院（意大利 那不勒斯)生物技術(shù)中心的動物設(shè)施中與C57BL/6小鼠（意大利坎諾瓦的查爾斯河實(shí)驗(yàn)室 (Charles Rivers Laboratories))交配以獲得P347S+/-小鼠。
[0238] 小鼠
[0239] 通過腹膜內(nèi)注射2ml/100g體重的阿佛?。?.25%w/v的2,2,2_三溴甲醇和2.5%v/ v的2-甲基-2-丁醇（意大利米蘭的西格瑪-奧德里奇公司（Sigma-Aldrich)))麻醉小鼠，隨 后通過Liang等所述的經(jīng)鞏膜經(jīng)脈絡(luò)膜方法視網(wǎng)膜下遞送AAV載體[Liang FQ，Anand V， Maguire AM,Bennett J(2000)Intraocular delivery of recombinant virus(重組病毒 的眼內(nèi)遞送）·刊于:Rakoczy PE編·《視覺研究方案》(Vision Research Protocols).托托 瓦：胡馬納出版公司（Totowa:Humana Press Inc. )125_139]〇
[0240] 豬
[0241] 采用11周齡的大白（LW)雌性小豬。豬過夜禁食，自由飲水。先前描述了豬的麻醉和 手術(shù)過程[Mussolino C，della Corte M，Rossi S，Viola F，Di Vicino U，等.（2011)AAV- mediated photoreceptor transduction of the pig cone-enriched retina(豬視維富 集視網(wǎng)膜的AAV-介導(dǎo)的感光體轉(zhuǎn)導(dǎo)）.Gene Ther 18:637-645]。
[0242] 在兩條主要血管弓之間的后極的缺血性鼻區(qū)中視網(wǎng)膜下接種AAV載體，如 Mussolino等所述進(jìn)行[Mussolino C，della Corte M，Rossi S，Viola F，Di Vicino U，等· (2011)AAV_mediated photoreceptor transduction of the pig cone-enriched retina (豬視錐富集視網(wǎng)膜的AAV-介導(dǎo)的感光體轉(zhuǎn)導(dǎo)）.Gene Ther 18:637-645]。這種視網(wǎng)膜區(qū)與 從鼻延伸至與水平子午線平行的顳邊緣交叉，其中視錐密度高，達(dá)到20000至35000視錐細(xì) 胞/mm2。各病毒載體注射到100μ1的總體積中，導(dǎo)致形成具有典型"穹頂形"視網(wǎng)膜脫落的視 網(wǎng)膜下水泡形成，尺寸對應(yīng)于5個光盤(optical disc)。
[0243] Western 印跡分析
[0244] 在收獲的視網(wǎng)膜上進(jìn)行Western印跡分析。樣品在低滲緩沖液（10 mM Tris-HCl [pH 7.5]，10mM NaCl，l，5mM MgCl2，l%CHAPS，lmM PMSF，和蛋白酶抑制劑）中裂解，并且通 過12%SDS-PAGE分離20yg的該裂解物。在獲得印跡之后，用抗-1D4抗體、抗-視紫紅質(zhì)-1D4 (1:500;馬薩諸塞州劍橋的艾碧康公司（Abeam))和抗-β-微管蛋白（1:1000;意大利米蘭的 西格瑪-奧德里奇公司）抗體標(biāo)記特定蛋白質(zhì)。
[0245] 蛋白質(zhì)的克隆和純化：
[0246] 通過使用質(zhì)粒pAAV2.1 CMV ZF6-KRAB和pAAV2.1 CMV ZF6-DBD作為DNA模板的PCR 生成編碼待以麥芽糖-結(jié)合蛋白（ΜΒΡ)融合物表達(dá)的工程改造的轉(zhuǎn)錄因子ZF6-KRAB和ZF6- DBD的序列的DNA片段。使用以下寡核苷酸作為引物：對于ZF6-KRAB，引物1，5 ' - GGAATTCCATATGGAATTCCCCATGGATGC-3' [SEQ ID No·47]和弓| 物2,5'_ CGGGATCCCTATCTAGAAGTCTTTTTACCGGTATG-3 ' [ SEQ ID No · 48]，并且對于ZF6-DBD，引物3， 5'-GGAATTCCATATGCTGGAACCTGGCGAAAAACCG[SEQ ID No·49]和弓| 物45'_ CGGGATCCCTATCTAGAAGTCTTTTTACCGGTATG-3' [SEQ ID 吣.50]。用限制性酶恥61和8&111!11消 化2種PCR產(chǎn)物并且克隆到Ndel BamHl-消化的pMal C5G(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司（New England Biolabs))細(xì)菌表達(dá)載體中。人Κ1Π 5和人NR2E3編碼區(qū)從人視網(wǎng)膜cDNA上PCR擴(kuò) 增。在公開序列(分別是GeneBank登錄號ΝΜ_014079.3和ΝΜ_014249.3)的基礎(chǔ)上合成以下寡 核苷酸：對于hNR2e3，引物5,5'-GGAATTCCATATGGAGACCAGACCAACAGCTC-3'[SEQIDNo·51] 和引物6，5' -CGGAATTCCTAGTTTTTGAACATATCAC-3 ' [SEQ ID No · 52];對于hKlf!5，引物7,5'- GGAATTCCATATGGTGGACCACTTACTTCCAG-3 ' [ SEQ ID No · 53 ]和引物8，5 ' -CGGGATCC TCAGTTCACGGAGCGCACGGAG-3'[SEQ ID Νο·54]。用限制性酶Ndel和BamHl消化hKlfl5 PCR產(chǎn) 物并且克隆到Ndel BamHl-消化的pMal C5G中，并且用限制性酶Ndel和EcoRI消化Nr2e3 PCR產(chǎn)物并且克隆到Ndel EcoRI-消化的pMal C5G中（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司）。所有獲得 的質(zhì)粒經(jīng)測序以確認(rèn)在編碼序列中沒有突變。融合蛋白在大腸桿菌BL21DE3宿主菌株中表 達(dá)。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在37°C下在加0.2%葡萄糖的富培養(yǎng)基中生長(按照新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公 司的方案）直至600應(yīng)的吸光度達(dá)到0.6-0.8，同時(shí)用20(^1211504補(bǔ)充培養(yǎng)基，并且用 0.3mM異丙基1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并允許進(jìn)行2小時(shí)。然后收獲細(xì) 胞，在IX PBS(pH 7.4)(25)、1禮苯甲基磺酰氟、以1亮抑肽酶、以1抑肽酶和1(^8/1111溶菌酶 中重懸，超聲，并在27,500相對離心力下離心30分鐘。然后，將上清按照生產(chǎn)商的方案加載 到直鏈淀粉樹脂(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司）上。之后用IX PBS洗滌，純化的部分在麥芽糖 洗脫緩沖液(10mM麥芽糖，100mM Tris(pH 8.0)，和100mM NaCl)中洗脫。
[0247] 凝膠移位分析：
[0248] 除非另外說明，5pmol的各純化蛋白在冰上在25mM Hepes(pH 7.9)，50mM KC1， 6.25mM MgCl2，l%Nonidet P-40和5%甘油存在下與5?111〇1的特定標(biāo)記的雙鏈體寡核苷酸 孵育15分鐘。孵育后，將混合物加載到5%聚丙烯酰胺凝膠(29:1丙烯酰胺/二丙烯酰胺比 率)上并在4°C下在0.5X TBE中運(yùn)行(200V持續(xù)2小時(shí)15分鐘）。凝膠然后用SYBR Green(英杰 公司（Invitrogen))染色并且用Typhoon Trio++掃描儀(GE醫(yī)療公司（GE Healthcare))采 集。通過Bradf ord法(伯樂蛋白質(zhì)試驗(yàn)）的修改形式確定蛋白質(zhì)濃度。在NR2E3蛋白質(zhì)的情況 中，可能獲得表面上車父尚的蛋白質(zhì)濃度（20，50和lOOpmol )，因?yàn)椴皇撬械牡鞍踪|(zhì)樣品都 正確折疊(參見圖S1)。通過用hRho 65bp和hRho 43bp寡核苷酸滴定蛋白質(zhì)由凝膠移位試驗(yàn) 來測量表面親和結(jié)合試驗(yàn)。蛋白質(zhì)-結(jié)合DNA的分?jǐn)?shù)對反映混合物中的蛋白質(zhì)濃度作圖。所 有的數(shù)字通過使用Amersham Biosciences Typhoon Trio++設(shè)備的計(jì)算機(jī)圖像定量來獲 得。
[0249] ChIP
[0250] 對于ChIP實(shí)驗(yàn)，從眼切下相同視網(wǎng)膜的ZF6-KRAB轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)域和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)域。
[0251] 如下進(jìn)行ChIP:視網(wǎng)膜機(jī)械勻漿化并在室溫下使用PBS中1 %甲醛交聯(lián)10分鐘，然 后通過加入終濃度125mM的甘氨酸猝滅并在室溫下孵育5分鐘。視網(wǎng)膜在冷PBS IX中洗滌3 次，然后細(xì)胞在細(xì)胞裂解緩沖液(PIPES 5mM pH 8.0，Ig印al 0,5%，Kcl 85mM)中裂解15分 鐘。細(xì)胞核在細(xì)胞核裂解緩沖液(Tris HC1 pH8.0 50mM，EDTA 10mM，SDS 0,8%)中裂解30 分鐘。
[0252] 使用Covaris s220剪切染色質(zhì)。經(jīng)剪切的染色質(zhì)與抗HA ChIP級（阿柏堪穆公司 (abeam)，ab 9110)過夜免疫沉淀。經(jīng)免疫沉淀的染色質(zhì)與磁性蛋白質(zhì)A/G珠(英杰公司）孵 育3小時(shí)。然后用洗滌緩沖液洗滌珠并且在洗脫緩沖液(Tris HC1 pH 8 50mM，EDTA ImM， SDS 1%)中洗脫DNA。然后使用引物對視紫紅質(zhì)TSS和Rpl30TSS進(jìn)行實(shí)時(shí)處理。
[0253] 抗-HA、抗-GNAT1，和抗-視紫紅質(zhì)的三重免疫染色。
[0254] 將冷凍的視網(wǎng)膜切片用PBS清洗一次，隨后在4%PFA中固定10分鐘。切片浸沒在回 收溶液(〇，〇 1M檸檬酸鈉緩沖液，pH 6.0)中并在微波中沸騰3次。之后，加入封閉溶液（10 % FBS，10 %NGS，1 %BSA)持續(xù)1小時(shí)。2種一抗小鼠抗-HA(1:300，科文斯公司（Covance))和兔G αΤΙ (圣克魯茲生物技術(shù)公司（Santacruz Biotechnology))在封閉溶液中稀釋并在4°C下過 夜孵育。二抗(AlexaFluor農(nóng)594，抗-小鼠1:800，分子探針公司（Molecular Probes)，和 AlexaF_'lu〇r?488,抗-兔1:500，分子探針公司，英杰公司，加利福尼亞州卡爾斯巴德)孵育1 小時(shí)，之后用PBS清洗3次。載玻片在封閉溶液（10%NGS)中孵育1小時(shí)之后，然后用一抗小 鼠-1D4 (1:500，阿柏堪穆公司）孵育過夜。使用二抗(Alexa FI uor? 105，抗-小鼠1:200，分子 探針公司(Molecular Probes)，英杰公司)Vectashield(英國彼得堡的載體實(shí)驗(yàn)室公司）來 觀察細(xì)胞核。切片用Leica熒光顯微系統(tǒng)(德國韋次拉爾的萊卡微系統(tǒng)有限公司）來照相。
[0255] RNASEQ
[0256] 樣品與豬基因組比對（總體（ensemble) 10.2)并且用RSEM來估計(jì)計(jì)數(shù)。用egdeR bioconductor包來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和差異表達(dá)分析。我們從數(shù)據(jù)集中去除平均計(jì)數(shù)小于3的基 因。過濾和標(biāo)準(zhǔn)化過程保留起始條件的22863中的15508個基因。
[0257] 超幾何測試
[0258] 我們再次使用從數(shù)據(jù)集中提取的G0類別并計(jì)算發(fā)現(xiàn)在差異表達(dá)的基因的提取中 從包括總背景的15508個基因中富集特定G0類別（分別為204和81)，然后是交叉的57個基因 的概率。
[0259]基因集富集分析GSEA
[0260]實(shí)驗(yàn)中的基因按照它們的倍數(shù)變化值排序以得到包括過濾實(shí)驗(yàn)的總共15508個基 因的基因列表。從該數(shù)據(jù)集中，我們提取了 10734個基因本體類別(biomaRt包），并且我們?yōu)V 去具有低于10個基因的那些，獲得我們用作基因集的1426個G0類別。
[0261 ] 我們進(jìn)行1426次基因集富集分析過程(從Broadlnstitute-鏈接下載源代碼），獲 得1426個富集分?jǐn)?shù)和相關(guān)的P值。
[0262] 結(jié)果與討論
[0263] 人工鋅指基蛋白質(zhì)的DNA-結(jié)合特異性:ZF6-DBD的生成和表征。
[0264] 為了如Mussolino等，2011(EMB0 Mol Med.2011Mar;3(3) :118-28)所述在轉(zhuǎn)錄上 抑制人視紫紅質(zhì)基因座，生成ZF6-KRAB構(gòu)建體。該構(gòu)建體含有DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其通過連續(xù) 組裝靶向人RH0近端啟動子的人視紫紅質(zhì)近端區(qū)域的人工鋅指基平臺、蛋白質(zhì)N-端處的人 衍生的KrUppe 1-相關(guān)盒(KRAB)抑制結(jié)構(gòu)域、核定位信號(NLS)和HA標(biāo)簽來生成。
[0265] 作者從構(gòu)建體中去除KRAB結(jié)構(gòu)域（圖1)。所得的構(gòu)建體ZF6-DBD編碼僅具有DNA-結(jié) 合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，因此原理上具有明顯減少的功能性含量，沒有抑制能力，并且分子量小 于ZF6-KRAB對應(yīng)物（圖1C)。除了在ZF6-DBD基因座處的局部性質(zhì)，KRAB結(jié)構(gòu)域賦予轉(zhuǎn)錄輸出 主要功能基因組和表觀后果。事實(shí)上，KRAB-ZFP(KrUppel-相關(guān)盒結(jié)構(gòu)域-鋅指蛋白）是由小 鼠和人基因組以成百上千編碼的脊椎動物限制性轉(zhuǎn)錄抑制子。它們通過必需的輔助因子 KAP1發(fā)揮作用，其募集導(dǎo)致兼性異染色質(zhì)形成的效應(yīng)物。KRAB/KAP1可通過異染色質(zhì)伸展來 介導(dǎo)長程轉(zhuǎn)錄抑制，并且該過程發(fā)生在內(nèi)源性影響反擊（counter)時(shí)。因此，原理上，缺少 KRAB結(jié)構(gòu)域在遞送至視網(wǎng)膜之后應(yīng)該不產(chǎn)生不同的生物結(jié)果。
[0266]為了評價(jià)ZF6-DBD的體內(nèi)功能活性，作者生成含有在遍在巨細(xì)胞病毒啟動子片段 (CMV)轉(zhuǎn)錄控制下的ZF6-DBD的腺相關(guān)病毒(AAV)載體血清型8。為了直接比較ZF6-DBD與之 前所述的ZF6-KRAB的活性，作者將2種載體(AAV8-CMV-ZF6-KRAB和新型AAV8-CMV-ZF6-DBD) 獨(dú)立地遞送至adRP的P347S小鼠模型的視網(wǎng)膜。在給予載體之前，在第30天(P30)，作者通過 視網(wǎng)膜電圖響應(yīng)測量了基線視網(wǎng)膜功能響應(yīng)(ERG;EMB0 Mol Med.2011年3月；3(3) :118- 28)。在遞送后20天（？50，視網(wǎng)膜下分別注射2.511〇68載體劑量的44￥8<1^46??、44￥8- CMV-ZF6-DBD和AAV8-CMV-ZF6-KRAB的載體顆粒），再測量視網(wǎng)膜ERG響應(yīng)以評價(jià)視網(wǎng)膜疾病 進(jìn)程。如圖2所示，在EGFP對照眼中觀察到ERG響應(yīng)的最顯著下降，隨后分別是ZF6-KRAB和 ZF6-DBD(圖2，圖2D)。具體地，在ZF6-KRAB和ZF6-DBD ERG響應(yīng)之間觀察到明顯高度顯著性 差異。ZF6-DBD處理的眼顯示與基線測量相比保留的響應(yīng)，其中在ZF6-KRAB中觀察到ERG響 應(yīng)降低，與血88〇1丨11〇等2011化]\^0 1〇1]^(1.2011年3月；3(3):118-28)中的同等數(shù)據(jù)一致。 為了深化ZF6-DBD的分子機(jī)制和治療活性的表征，作者選擇P347S小鼠視網(wǎng)膜下遞送AAV8- CMV-ZF6-DBD載體遞送的較早時(shí)間點(diǎn)，即，P14。在該階段，視網(wǎng)膜完全分化并且P347S病變還 不明顯。作者注射大量小鼠 （n = 32)以生成多個觀察結(jié)果和ERG測量結(jié)果。如圖3所示，當(dāng)與 EGFP處理的眼比較時(shí)，用AAV8-CMV-ZF6-DBD處理的眼證明在暗光適應(yīng)和光適應(yīng)條件下ERG a-波和b-波響應(yīng)沿著寬范圍熒光的穩(wěn)健且持續(xù)的恢復(fù)。另外，當(dāng)ZF6-DBD處理的眼與AAV8- CMV-ZF6-KRAB處理的眼比較時(shí)，在AAV8-CMV-ZF6-DBD處理的眼中觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯更高 的響應(yīng)（圖3C)。事實(shí)上，處理前后的ZF6-DBD與ZF6-KRAB之間ERG響應(yīng)的直接比較顯示ZF6- DBD處理的眼中P347S視網(wǎng)膜響應(yīng)損失的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的進(jìn)展降低（圖3D)。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明 向P347S視網(wǎng)膜遞送AAV8-CMV-ZF6-DBD產(chǎn)生比AAV8-CMV-ZF6-KRAB明顯更高的功能和治療 價(jià)值。
[0267] 為了研究P347S動物的不同組中AAV8-CMV-ZF6-DBD載體處理的轉(zhuǎn)錄分子結(jié)果，作 者收集視網(wǎng)膜并且測定感光體特異性轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。如圖4所示，AAV8-CMV-ZF6-DBD的 視網(wǎng)膜下給予導(dǎo)致人RH0轉(zhuǎn)錄水平顯著且特異性下調(diào)，而GNA1感光體特異性基因的水平不 變（圖4A)。另外，作者計(jì)算了視網(wǎng)膜下注射1X10E9的AAV8-CMV-EGFP、AAV8-CMV-ZF6-DBD和 AAV8-CMV-ZF6-KRAB載體顆粒后AAV8載體轉(zhuǎn)基因的平均表達(dá)水平（圖4B)，并且沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng) 計(jì)學(xué)顯著差異。為了在蛋白質(zhì)水平確定處理的影響，在用AAV8-CMV-EGFP、AAV8-CMV-ZF6- DBD和AAV8-CMV-ZF6-KRAB處理的視網(wǎng)膜樣品中對RH0進(jìn)行Western印跡分析。如圖所示（圖 4C)，與EGFP對照視網(wǎng)膜相比，在ZF6-DBD和ZF6-KRAB處理的視網(wǎng)膜中都觀察到RH0蛋白質(zhì)的 減少。此外，通過免疫熒光分析，相對于ZF6-KRAB處理的視網(wǎng)膜，在ZF6-DBD中觀察到RH0蛋 白質(zhì)量明顯更高的減少（圖4F-H)。該結(jié)果也在組織切片中定性地確認(rèn)（圖4)。事實(shí)上，可區(qū) 分人和非人RH0蛋白質(zhì)的抗體用于P347S視網(wǎng)膜上并且顯示與EGFP對照相比，在ZF6-DBD處 理的視網(wǎng)膜中沒有人視紫紅質(zhì)蛋白染色，在EGFP對照中，陽性染色在變性的感光體外節(jié)中 是明顯的。為了進(jìn)一步表征P347S表型，作者進(jìn)行了免疫組學(xué)研究。圖4D顯示在P30時(shí)在 P347S中AAV8視網(wǎng)膜下基因轉(zhuǎn)化后20天時(shí)的ZF6-DBD的核定位?？?HA標(biāo)簽染色顯示核定位 和感光體細(xì)胞的高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。除了沒有HA染色，EGFP對照視網(wǎng)膜顯示明顯減少的感光體細(xì) 胞核。這些數(shù)據(jù)表明ZF6-DBD的AAV8遞送產(chǎn)生高效且合適的核定位，導(dǎo)致視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的部分 保留。
[0268] 在細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變、譜系關(guān)系和功能障礙期間，動態(tài)激活調(diào)節(jié)DNA元件和表觀遺傳學(xué) 特征。因此，DNA-結(jié)合蛋白對DNA的可及性同步動態(tài)變化。大體上，根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞的發(fā)育和代 謝狀態(tài)，可確保DNA-結(jié)合蛋白可能遇到完全不同的基因組特征。在這種布置下，作者決定在 活性感光體分化狀態(tài)期間測試ZF6-DBD是否對視網(wǎng)膜分化有影響，并且P347S視網(wǎng)膜功能的 功能恢復(fù)是否可能與之前可觀察到的結(jié)果一致。作者在P4時(shí)用AAV8-CMV-ZF6-DBD視網(wǎng)膜下 注射P347S小鼠。在P4時(shí)，視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞部分仍然在分裂，其中離開細(xì)胞循環(huán)的那些處 于活性分化狀態(tài)。如圖5所示，處理后26天(P30)，作者觀察到與P14和P30處理的眼相比更高 的視網(wǎng)膜功能恢復(fù)（圖6)。這些數(shù)據(jù)表明視網(wǎng)膜發(fā)育并不影響ZF6-DBD的安全性和功效。
[0269] 圖6顯示當(dāng)在早期時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行AAV8-CMV-ZF6-DBD時(shí)治療結(jié)果的主要增加。
[0270] 評估對于靶向的基因組特征(如人疾病感光體的人RH0啟動子區(qū)）指定的DNA-結(jié)合 蛋白的DNA結(jié)合特異性的主要困難之一是其他相似基因組內(nèi)容對測試的可及性。具體地，除 了P347S突變?nèi)艘曌霞t質(zhì)基因以外，P347S小鼠模型僅具有3.4kb的人RH0啟動子，即，RH0啟 動子的有效部分，并且明顯在人視紫紅質(zhì)基因周圍沒有部分，因此限制了體(感光體)基因 組細(xì)胞-特異性特征的人基因組特異性（Li T，Snyder WK，01sson JE，Dryja TP( 1996) Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S：evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments(攜帶顯性視紫 紅質(zhì)突變P347S的轉(zhuǎn)基因小鼠：視紫紅質(zhì)向外節(jié)的缺陷定向轉(zhuǎn)運(yùn)的證據(jù)）.Proc Natl Acad Sci USA 93:14176-14181 )。事實(shí)上，P347S突變?nèi)艘曌霞t質(zhì)基因的隨機(jī)整合和拷貝數(shù)變化 可能影響人RH0感光體基因座在視桿中的忠實(shí)相似度(faithful resembling)。
[0271] 基于人和豬ZF6-DBD目標(biāo)位點(diǎn)之間的序列相同性（圖7)，作者決定在豬視網(wǎng)膜中評 估構(gòu)建體的功能性能力。作者在豬視網(wǎng)膜(成年雌性P90)的生理完整的基因組特征中視網(wǎng) 膜下注射低劑量（lxlOelO)的AAV8-CMV-ZF6-DBD，該豬視網(wǎng)膜的RH0近端啟動子基因座區(qū)含 ZF6結(jié)合序列，除了 1個錯配以外（圖7)。為了評估"純"轉(zhuǎn)錄效果而非由于視網(wǎng)膜敲減的可能 的二次變性，進(jìn)行早期處死。在載體給予15天后，視網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)導(dǎo)部分(EGFP陽性）上的qRT- PCR和authorsstern印跡分析分別證明抑制45%視紫紅質(zhì)轉(zhuǎn)錄和1?11〇蛋白質(zhì)水平的穩(wěn)健下 降（圖8)。顯然，ZF6-DBD的相對表達(dá)水平和抑制的所得水平之間的比率為3個log單位。
[0272] 定量為AAV8-CMV-ZF6-DBD轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄水平（qRT-PCR)的視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)導(dǎo)效率平均比 NRL和CRX低148至32倍，NRL和CRX是用作參照的2種視桿特異性轉(zhuǎn)錄因子（圖9)。在AAV載體 轉(zhuǎn)導(dǎo)的視網(wǎng)膜上的染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP)顯示ZF6-DBD合適地占據(jù)在基因組目標(biāo)上 (圖lOhZFe-DBD AAV-轉(zhuǎn)導(dǎo)的視網(wǎng)膜與抗-HA標(biāo)簽抗體的共免疫組化染色顯示強(qiáng)的核定位。 與視桿特異性標(biāo)志物(GNAT)共免疫染色顯示ZF6-DBD的表達(dá)與視紫紅質(zhì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平逆 相關(guān)。具體地，在最強(qiáng)HA-染色的視桿中，視紫紅質(zhì)實(shí)際上不存在。另外，ZF6-DBD轉(zhuǎn)導(dǎo)的視桿 的外節(jié)似乎完全塌縮，這與視桿外節(jié)在量上包含90%的視紫紅質(zhì)(其賦予外節(jié)結(jié)構(gòu)性質(zhì)）的 事實(shí)一致(如rho敲除小鼠中所觀察到）。盡管沒有視紫紅質(zhì)，感光體細(xì)胞核的排數(shù)似乎是保 守的（圖11)。此外，ZF6-DBD在視錐細(xì)胞中的錯誤表達(dá)并不影響它們的形態(tài)外觀，還如視錐 細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄物抑制蛋白3的水平所示(圖8)。
[0273] 為了評估較早的時(shí)間點(diǎn)，作者測量了注射后7天的感光體轉(zhuǎn)錄水平，如圖所示（圖 12)，結(jié)果與注射后15天觀察到的相似。
[0274]為了評價(jià)載體劑量對ZF6-DBD功能性的影響，作者用雙倍前述所用劑量，SP 2xl0el0vg的載體劑量注射一系列豬視網(wǎng)膜。如圖12B所示，AAV8-CMV-ZF6-DBD或AAV8-CMV- EGFP的更高劑量在評估的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄水平中反映。然而，視紫紅質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平值與用 lxlOelOvg所獲得的值相似。
[0275] 通過RNA-seq在ZF6KRAB和ZF6-DBD之間比較以評價(jià)脫靶。
[0276] 為了進(jìn)一步了解對由我們的人工轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的干擾特征，作者進(jìn)行了整個轉(zhuǎn)錄 組測序[RNA_Seq](Mortazavi A，Williams BA，McCue K，Schaeffer L，Wold B.Nat Methods · 2008Jul; 5(7) :621-8) ANA-seq能夠檢測從轉(zhuǎn)錄器活性產(chǎn)生的RNA-轉(zhuǎn)錄本和水 平。因此，RNA-seq測量DNA-結(jié)合蛋白的脫靶活性和目標(biāo)的最后輸出。與其中提供給定DBD的 整個基因組圖的ChIP-seq分析不同，RNA-seq能夠檢測來自功能相關(guān)基因組位點(diǎn)中的結(jié)合 的相關(guān)功能活性(轉(zhuǎn)錄本）（轉(zhuǎn)錄上敏感）。作者具有來自在3個月用ZF6-KRAB或ZF6-DBD注射 并在注射后8或15天處死的豬的11個視網(wǎng)膜。數(shù)據(jù)集由3個ZF6-KRAB處理的和3個ZF6-DBD處 理的視網(wǎng)膜加上5個對照(與內(nèi)部對照相同的視網(wǎng)膜的非轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域，表2)組成。
[0277] 表2:用于全轉(zhuǎn)錄組測序[RNA-Seq]的視網(wǎng)膜
[0280]用以下億明達(dá)(Illumina)索引來評估讀數(shù)質(zhì)量：
[0281] 每條通道的原始簇。由圖像分析模塊檢測到的簇的數(shù)量。
[0282] 完美索引讀數(shù)％。在完美匹配給定索引的該樣品中索引讀數(shù)的百分比。
[0283] -個錯配讀數(shù)(索引）％。與給定索引有1個錯配的該樣品中索引讀數(shù)的百分比。
[0284] >=〇30的％。來自通過濾器的簇的具有Q30或更高的堿基的堿基產(chǎn)率除以通過濾 器的簇的總產(chǎn)量。
[0285] 平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)(PF)。通過濾器的簇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的總和除以通過濾器的簇的總產(chǎn) 率。
[0286] 作者用平均計(jì)數(shù)大于或等于3來過濾基因，并且選擇具有小于或等于0.05的調(diào)整 的P值的那些來鑒定處理的視網(wǎng)膜中與對照相比差異表達(dá)的基因（DEG)。令人驚訝的是，作 者發(fā)現(xiàn)與ZF6-KRAB處理相比，ZF6-DBD處理誘導(dǎo)較低數(shù)量的未調(diào)芐基因，并且與野生型條件 相比，來自經(jīng)處理的樣品的基因的波動水平可忽略。我們分別在ZF6-DBD處理的視網(wǎng)膜中獲 得81個DEG(其中的2個包括EGFP和ZF6-DBD)，并在ZF6-KRAB處理的視網(wǎng)膜中獲得204個DEG (圖13以及表3和4)。
[0287] 表 3A:ZF6-DBD 差異表達(dá)的基因（81，n)R<0.05)






















[0315]作者發(fā)現(xiàn)2個差異表達(dá)基因集之間的高一致性說明，及其倍數(shù)變化值上的高度相 關(guān)性，表明2個人工構(gòu)建體有相同的生物化學(xué)性質(zhì)并且考慮它們經(jīng)工程改造的結(jié)合特異性 能夠結(jié)合相同基因。
[0316]為了排除2次實(shí)驗(yàn)之間共同的57個目標(biāo)基因的數(shù)量是偶然的，作者計(jì)算了超幾何 概率，其測試從組成已知的群體中獲得特定基因亞組的概率，得到p值<4.711962e-93。該 值證實(shí)了以下發(fā)現(xiàn)，即2次實(shí)驗(yàn)共有大部分的干擾基因。
[0317] 如表3所示，有趣的是，在ZF6-DBD處理的視網(wǎng)膜中，81個DEG中的60個上調(diào)而21個 下調(diào)。不預(yù)期該DEG集在任何功能關(guān)系中富集。為了確定關(guān)系是否在81個DEG之間存在，作者 進(jìn)行了超集合測試。作者發(fā)現(xiàn)在2個不相關(guān)類別(G0:0005576，胞外區(qū)；G0:0010951，內(nèi)肽酶 活性的負(fù)調(diào)節(jié)）中富集(FDR< 0.05)。每一百萬個片段映射的FPKM(認(rèn)作表達(dá)水平）中每一千 個堿基外顯子的片段證明表達(dá)，其與內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子相比似乎非常低。該結(jié)果強(qiáng)調(diào)了 ZF6- DBD功能的效力（圖9)。事實(shí)上，ZF6-DBD的表達(dá)水平強(qiáng)烈地表明其特異性和親和性，也表明 ZF6-DBD至少部分不與其他內(nèi)源性TF競爭。
[0318] 值得注意的是，如果與天然轉(zhuǎn)錄因子如視桿特異性轉(zhuǎn)錄因子NRL的那些數(shù)量(457) 相比，與ZF6-DBD處理相關(guān)的DEG的數(shù)量(81) -直很小。另外，通過用qRT-PCR測量，ZF6-DBD 使RH0轉(zhuǎn)錄沉默，表達(dá)水平比NRL低148倍。
[0319] 作者進(jìn)行了在2個差異表達(dá)的基因集上進(jìn)行了基因集富集分析(基因集富集分析： 一種用于解釋基因組范圍表達(dá)概況的基于知識的方法;Subraman i an等，2005)以鑒定2個實(shí) 驗(yàn)中的上調(diào)或下調(diào)過程。作者觀察到2個集有相似的功能。尤其是在光傳導(dǎo)的內(nèi)容中，發(fā)現(xiàn) 這些過程的顯著下調(diào)[G0:0042462,眼感光系細(xì)胞發(fā)育;G0:0007602,光傳導(dǎo)]。這些數(shù)據(jù)與 由于ZF6-DBD或ZF6-KRAB活性的RH0下調(diào)導(dǎo)致二次轉(zhuǎn)錄變化的事實(shí)相一致（內(nèi)源細(xì)胞特異性 調(diào)節(jié)代碼，即，全細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄組圖）。因此，可能推導(dǎo)出ZF6-DBD或ZF6-KRAB(結(jié)合的ZF6- DBD或ZF6-KRAB基因組）的主要物理目標(biāo)遠(yuǎn)少于觀察到的那些，并且在RH0下調(diào)之后一系列 功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物被二次擾亂。
[0320]因此，由于以下事實(shí)，ZF6-DBD本身是強(qiáng)效的并且模擬并勝過轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的固有 穩(wěn)健性：
[0321] ?人工DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的外部(轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合至其目標(biāo)基 因附近的特定DNA結(jié)合位點(diǎn)的相互作用）
[0322] ?人工DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)錄上獨(dú)立于內(nèi)源性細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)代碼(全細(xì)胞特異 性轉(zhuǎn)錄組圖）。事實(shí)上，天然TF本身屬于細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄組圖（調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)子），因此它們 受到其他細(xì)胞特異性TF設(shè)定的精細(xì)調(diào)節(jié)，其控制它們的轉(zhuǎn)錄激活或抑制，最終產(chǎn)生細(xì)胞特 異性功能。
[0323] ?人工DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域沒有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域
[0324] 作為進(jìn)一步觀察，作者還假設(shè)ZF6-DBD在AAV載體生產(chǎn)期間可能具有比ZF6-KRAB更 安全的概況，其中含有轉(zhuǎn)基因（在AAV-ITR之間）的質(zhì)粒與REP和CAP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK 293細(xì) 胞中（方法參見Aur i cchi〇等，2001)。值得注意的是，在AAV載體生產(chǎn)期間，如果ITR之間的轉(zhuǎn) 基因（即，ZF-KRAB或ZF-DBD)處于遍在啟動子如CMV控制下，則其在HEK 293細(xì)胞中表達(dá)。作 者觀察到，當(dāng)產(chǎn)生AAV8-CMV-ZF6-KRAB時(shí)，觀察到非常低的載體產(chǎn)率（圖14)。相反，當(dāng)ZF6- KRAB處于視網(wǎng)膜特異性啟動子(RH0K)控制下時(shí)，載體的效價(jià)恢復(fù)至正常產(chǎn)率(約1X10E12)。 在ZF6-DBD生產(chǎn)的情況中，生產(chǎn)細(xì)胞中遍在CMV啟動子元件和由此的ZF-DBD表達(dá)沒有負(fù)面影 響并且載體產(chǎn)率在正常值內(nèi)（圖10)。
[0325] 替代策略
[0326] 對于我們用于治療常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性的治療策略的第二部分，作者評 價(jià)了用人視紫紅質(zhì)CDS的野生型拷貝替代ZF6被抑制等位基因。為了建立替換條件，作者選 擇人轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白l(GNATl)啟動子，其對于視桿有特異性(J Lee等，Gene Therapy 2010)以在 視桿中特異性遞送轉(zhuǎn)基因，并且提高AAV的劑量以具有最佳的視桿轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于人視紫紅質(zhì)啟 動子含有ZF6的結(jié)合位點(diǎn)，其不可用于替代策略。作者生成了具有eGFP報(bào)告基因的AAV以提 高轉(zhuǎn)導(dǎo)水平并進(jìn)行劑量響應(yīng)研究。作者在豬視網(wǎng)膜中注射3種不同劑量的44￥8-1^財(cái)1'1- eGFPdxlO'lxlO11和1x10^15天后，我們處死動物，并且收集視網(wǎng)膜用于評價(jià)視網(wǎng)膜中 eGFP的定位和轉(zhuǎn)錄水平。通過q實(shí)時(shí)PCR，我們評估eGFP的轉(zhuǎn)錄水平，并且觀察到eGFP mRNA 的表達(dá)增加與使用的劑量增加相關(guān)。當(dāng)我們評價(jià)視網(wǎng)膜中eGFP的定位時(shí)，我們注意到表達(dá) 僅限定于視桿中?；谶@些結(jié)果，作者使用lxl〇12劑量來替代。因此，作者在3月齡豬中使用2 種AAV來進(jìn)行沉默和替代實(shí)驗(yàn)，lxlO11劑量的AAV8-CMV-ZF6-DBD，用于抑制內(nèi)源性豬視紫紅 質(zhì)，和lxlO12劑量的AAV8-hGNATl-hRH0。注射后15天分析的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平顯示，抑制約 55%的內(nèi)源性豬紫紅質(zhì)，并且被抑制的蛋白質(zhì)用人野生型CDS替代（總豬視紫紅質(zhì)的約 33%)。該數(shù)據(jù)證明抑制內(nèi)源性視紫紅質(zhì)并用外源性人視紫紅質(zhì)將其替代是可行的。這些對 于由視紫紅質(zhì)序列突變以突變依賴方式引起的常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性的治療是非 常理想的結(jié)果（圖15和16)。如所示，GNAT1(視桿特異性)和Arr3(視錐特異性)轉(zhuǎn)錄水平不受 ZF6-錯誤表達(dá)的影響。這也得到RNA-seq數(shù)據(jù)的強(qiáng)力確認(rèn)。
[0327] 順式作用DNA元件(順式調(diào)節(jié)元件，CRE)對基因表達(dá)的貢獻(xiàn)。
[0328] 結(jié)合和非結(jié)合DNA基因組序列基序的順式調(diào)節(jié)潛力由以下確定：1-DNA本身的化學(xué) 物理性質(zhì)(A、C、G和T堿基是化學(xué)實(shí)體，其鎖著主鏈糖和磷酸基團(tuán)的納入產(chǎn)生三維雙鏈結(jié)構(gòu)， 其中各堿基對具有特定化學(xué)和構(gòu)象特征)和2-表觀遺傳約束、3-蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的 復(fù)合物、4-長距離物理連通（沿著遠(yuǎn)距離基因座，包括不同染色體的3D物理連通） (Stamatoyannopoulos JA.Genome Res.2012 Sep;22(9):1602-11和Rohs R，Jin X，West SMJoshi R，Honig B，Mann RS.Annu Rev Biochem.2010;79:233-69)。事實(shí)上，大多數(shù)由生 物化學(xué)特征限定的基因組DNA序列缺少強(qiáng)的進(jìn)化保守性，并且大多數(shù)高度保守的基因組DNA 序列元件避開了使用生物化學(xué)和其他功能性試驗(yàn)的注釋。此外，核苷酸水平的進(jìn)化保守性 本身是功能性調(diào)節(jié)變化和功能的較差預(yù)測物（Maurano MT，Wang H，Kutyavin T， Stamatoyannopoulos JA.PLoS Genet.2012;8(3):e100 2599)〇
[0329] 因此，DNA序列特征或DNA信息內(nèi)容是超過作為僅由4個字A、C、G和T組成的字母表 的一維字母鏈的核苷酸序列角度的方式，相反，存在蛋白質(zhì)和基因組DNA之間更高級復(fù)合物 (Stamatoyannopoulos JA.Genome Res.2012年9月；22(9):1602-11和Rohs R，Jin X，West SM，Joshi R，Honig B，Mann RS.Annu Rev Biochem.2010;79:233_69)〇
[0330] 已經(jīng)采用一系列不同方法來確定基因組DNA中含有的DNA序列特征（Genomic approaches towards finding cis-regulatory modules in animals(基因組方法指向發(fā) 現(xiàn)動物中的順式調(diào)節(jié)模塊）.Hardison RC，Taylor J.Nat Rev Genet.2012年 6 月 18 日；13 (7) :469-83)。無論如何，這些方法中的許多依賴于種系基因組工程改造并且因此缺少在基 礎(chǔ)科學(xué)和醫(yī)學(xué)中急需的主要特征，在發(fā)育、成年和衰老中在體細(xì)胞中的特性細(xì)胞類型中（因 此，在各自或不同類別的體細(xì)胞類型中）空間和時(shí)間上鑒定活性選擇性調(diào)節(jié)DNA之一。
[0331] 考慮到基于一級DNA序列的預(yù)測較弱，需要用于在特定體細(xì)胞類型中在空間和時(shí) 間上生成可能的活性調(diào)節(jié)DNA的無偏好篩選的系統(tǒng)。作者測試了上述提及的ZF6-DBD生物化 學(xué)特征可用作通過AAV載體介導(dǎo)的體細(xì)胞(感光體)基因轉(zhuǎn)化確定特性細(xì)胞類型(感光體）中 的順式調(diào)節(jié)元件的方法的假設(shè)。
[0332] 作者能夠證明ZF6-DBD目標(biāo)位點(diǎn)內(nèi)的短序列（ZF6-DBDCis-seq)具有賦予RH0啟動 子活性所需的堿基組成和長度。這種關(guān)聯(lián)的20bp ZF6-DBD目標(biāo)位點(diǎn)位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 94位處的人基因組啟動子上（圖7)。
[0333] 具體地，作者顯示覆蓋人視紫紅質(zhì)近端啟動子(ZF6-DBDCiS-seq)的20bp并且改變 這些序列中含有的5bp的人工DNA-結(jié)合蛋白完全消除的RH0表達(dá)。此外，作者也能夠證明單 個DNA堿基變化能夠消除RH0啟動子驅(qū)動的表達(dá)。另外，作者顯示在非視桿特異性細(xì)胞中該 區(qū)域通過內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄抑制子KLF15受到潛在控制，其靶向ZF6-DBD的相同基因組序列并且其 在視桿中的錯誤表達(dá)生成RH0轉(zhuǎn)錄沉默。
[0334] ZF6-DBDCis_seq基因組元件的特征。
[0335] 首先作者研究ZF6-DBDCiS-seq的DNA-蛋白質(zhì)相互作用性質(zhì)。凝膠移位分析證明 ZF6-DBD在hRho近端啟動子區(qū)43bp寡核苷酸雙鏈體上的結(jié)合，包括ZF6-DBD共有序列。當(dāng) 18bp ZF6-DBD核心序列保留并且43bp寡核苷酸雙鏈體的25bp改變時(shí)，特異性還得到ZF6- DBD結(jié)合的支持(hRho mut F和hRho mut L;圖 17)。
[0336] 作者接著通過互補(bǔ)研究基因組ZF6_DBDCi s-seq。為了以高度空間分辨率分離ZF6- DBDCis-seq的特征，作者生成了 259bp的短的人RH0近端啟動子（164bp來自TSS并且95bp是 5'UTR;hRHO)。為了確定hRHO驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄輸出，作者生成了AAV-EGFP報(bào)告構(gòu)建體(AAV8- hRHO-EGFP)并注射至成年WT C57BL6小鼠中并評估hRHO體內(nèi)驅(qū)動的EGFP表達(dá)（科爾沃號 (Corbo Ref))。因此，在該實(shí)驗(yàn)設(shè)定中，作者用該hRHO啟動子序列刺激整個小鼠感光體核蛋 白質(zhì)組。視網(wǎng)膜下遞送15天后的qRT-PCR分析顯示，hRHO報(bào)告構(gòu)建體能夠在體內(nèi)持續(xù)表達(dá) EGFP(圖 18)。
[0337] 為了通過在體細(xì)胞(感光體)上的AAV載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化證明特定細(xì)胞類型（感 光體）中的順式調(diào)節(jié)元件(空間和時(shí)間上活性調(diào)節(jié)DNA)，作者接著生成攜帶ZF6-DBDCis_seq 誘變或缺失的構(gòu)建體。作者生成了2個構(gòu)建體：1-完全缺失(GGGGGTTAGagGGTCTACGA[SEQ ID No· 22] ;ZF6);2-誘變的ZF6-DBD 目標(biāo)(TTACTGTAATCTTAACCGGA[SEQ ID No · 29] ;MutZF6)(圖 19 和 20)。
[0338] 為了體內(nèi)測試合適細(xì)胞類型中Δ ZF6和MutZF6 DNA變化的功能結(jié)果，作者尋求研 究AAV載體基因向感光體的轉(zhuǎn)化是否可能代表進(jìn)行這種評估的方便方法。因此，作者生成了 5'UTR處含人RH0啟動子(參見方法)并且在其RH0啟動子序列中嵌入AZF6或MutZF6以控制 在產(chǎn)生AAV載體之后，野生型小鼠（P30)以Ixl0e9vg的載體劑量接受AAV8-hRH0-Δ ZF6-5 ' 17^46??、或4六￥8-11冊0-]\1此2?6-5'1^1?46??、或44￥8-11冊0-5'17^46??作為陽性對照。如 圖11和12所示，在處死(P50)之后，RT-PCR和免疫組學(xué)研究顯示在AAV8-hRH0- Δ ZF6-5 ' UTR- EGFP或AAV8-hRH0-MutZF6-5'UTR-EGFP注射的眼中，與含有完全RH0近端啟動子DNA序列的 啟動子相比，EGFP表達(dá)水平高度顯著下降。該結(jié)果表明感光體中hRHO元件的活性需要ZF6- DBD順式作用元件。另外，小鼠中ZF6目標(biāo)序列缺少保守性強(qiáng)調(diào)了控制基因表達(dá)和體內(nèi)AAV載 體在合適的體細(xì)胞目標(biāo)（即感光體）中遞送方法強(qiáng)度的調(diào)節(jié)DNA序列中含有的關(guān)鍵特征和信 息內(nèi)容(包括結(jié)構(gòu)）以闡明順式調(diào)節(jié)元件功能。
[0339]為了縮小該ZF6-DBDCiS-seq的活性的功能性基礎(chǔ)，作者進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生序列分 析。意外的是，ZF6-DBDCiS-seq的5'在小鼠 Rho啟動子序列中不保守。作者生成了鼠形式的 報(bào)告構(gòu)建體；243bp(165bp來自TSS并且78bp是S'UThmRHO)。在成年WT C57BL6小鼠中注射 15天后，與人對應(yīng)物相比報(bào)告子活性降低(35%)。然而，活性被保留。然后，作者想知道TF結(jié) 合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)在2個物種之間是否偏離。TF結(jié)合位點(diǎn)作圖顯示NRL和CRX結(jié)合位點(diǎn)側(cè)接ZF6- DBDCis-seq。人存在脊椎動物中保守的另一個CRX結(jié)合位點(diǎn)，其似乎在小鼠中缺失。因此，作 者測試了 CRX和NRL結(jié)合位點(diǎn)與ZF6-DBDCiS-seq-起是否生成功能性單元的假設(shè)。在人hRHO 中插入鼠"功能性單元"（hRH0 InsMurine)明顯模擬鼠啟動子片段的轉(zhuǎn)錄功能（圖21)。相反 (mRHO InsHuman)，與hRHO相比，鼠 RH0近端啟動子中的人片段產(chǎn)生稍高的表達(dá)。這些結(jié)果支 持了在人和鼠啟動子中都存在離散的功能性單元的模型。為了進(jìn)一步解析該序列的性質(zhì)， 作者測試了20bp ZF6-Dm)Cis-seq的關(guān)鍵特征是否位于小鼠序列中不存在的CACCCCCA[SEQ ID No. 55]。核苷酸變化(hRHO MEvo)完全消除了活性，而同一序列的刪除(hRHO Δ Evo)令人 驚訝地產(chǎn)生持久活性。該結(jié)果支持基因組上的ZF6-DBD DNA結(jié)合位點(diǎn)不是在TF結(jié)合后控制 視紫紅質(zhì)反式激活的明顯內(nèi)源性TF結(jié)合位點(diǎn)。缺少與活性保留偶聯(lián)的結(jié)合位點(diǎn)和使用的啟 動子的縮短也排除了 "CTCF"循環(huán)機(jī)制。另外，該結(jié)果支持序列并不作為TF結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮作 用，但是該核苷酸組成和長度可能在生成啟動子功能中起到必要作用。作者還用GGGGG[SEQ IDNo.57](hRH0 5G)替代CCCCC[SEQIDNo.56]伸展測試了核苷酸變化是否對序列組成敏 感，但是觀察到類似的活性損失。為了進(jìn)一步確定該序列的敏感性水平，作者僅突變了 1個 堿基(CCACC[SEQ ID No.58];hRH0 T3C)并且明顯消除了啟動子活性（圖21)。這些數(shù)據(jù)支持 了一種模型，其中，該RH0調(diào)芐基因組功能性單元的性質(zhì)遵從準(zhǔn)確規(guī)律，連接CRX和NRL DNA- 結(jié)合位點(diǎn)的20bp-長基因組DNA(ZF6-DBDCiS-seq)攜帶在長度和核苷酸組成上復(fù)雜且有特 異性的特征。該功能單元在小鼠中偏離，然而其保留了控制人對應(yīng)物的基礎(chǔ)規(guī)則。事實(shí)上， 該功能單元在人和小鼠 RH0啟動子(hRHO InsMurine;mRHO InsHuman)中是可交互運(yùn)輸?shù)模?產(chǎn)生與其所屬物種中產(chǎn)生的相同的轉(zhuǎn)錄輸出。
[0340]基于在感光體具體上下文中通過上述實(shí)驗(yàn)回收的RH0順式作用調(diào)節(jié)性質(zhì)的提取， 作者決定使用其中存在的反式DBD結(jié)構(gòu)域方法以反映通過誘變分析生成的順式作用效果 (上述）。作者生成了缺少第6指，并且因此限制DBD結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)位點(diǎn)的ZF6-DBD的較短形式 (圖30)。稱為ZF6-5或ZF6-5F(5代表5指）的該人工DBD結(jié)構(gòu)域生成更精確地靶向鑒定的新型 RH0順式作用元件，避免ZF6-DBD在NRL位點(diǎn)上的潛在干擾。該新型蛋白質(zhì)可生成特異性地以 RH0順式作用元件CCCCCA[ SEQ ID N0.30 ]為中心的干擾。為了測試ZF6-5的活性，P15時(shí)在 P347S小鼠中注射AAV8載體(AAV8-CMV-ZF6-5F)并且在P30(載體給予后15天)時(shí)通過ERG分 析評估功能性結(jié)果。如圖31所示，與對照(AAV8-EGFP)相比，ZF6-5的活性產(chǎn)生對視網(wǎng)膜功能 的保留。為了進(jìn)一步探索其他基于TAL技術(shù)并同時(shí)更為適當(dāng)?shù)匕邢蜩b定的RH0順式作用元件 的潛在反式DBD結(jié)構(gòu)域，作者生成了如圖30所示的2個TAL-基DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。然后，這2個 DBD 結(jié)構(gòu)域TALRH0 (0 2)和TAL7 用于生成AAV8 載體(AAV8-CMV-TALRH0 (02) -DBD 和AAV8-CMV- TAL7-DBD)并且在P347S小鼠中測試，如上所述。與ZF6-5類似，與EGFP注射的對照相比， AAV8-CMV-TALRH0-(0 2) -DBD和AAV8-CMV-TALRH0-(0 2) -DBD都產(chǎn)生了 對視網(wǎng)膜功能的明顯 保留。
[0341] 為了進(jìn)一步分析ZF6-DBDCis_seq，作者通過TRANSFAC分析掃描了 20bp和相應(yīng)的鼠 序列（TATGATATCTCGCGGATGCT，[ SEQ ID No. 59 ])。如圖22所示，作者回收了人的3個基質(zhì)和 小鼠序列的1個不同基質(zhì)。以CCCCCA[SEQ ID勵.30]序列為中心的基質(zhì)顯示1?^-1因子，其 屬于視網(wǎng)膜特異性KLF15TF。KLF15是鋅指TF，其顯示在體外結(jié)合CCCCCA[SEQIDN0.30]序 列?；贙LF15在除了感光體以外的視網(wǎng)膜表達(dá)的表達(dá)特征，表明其功能可能依賴于視網(wǎng)膜 的非視桿細(xì)胞中視紫紅質(zhì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)阻斷。作者認(rèn)為，如果確實(shí)如此，KLF15在感光體中的錯 誤表達(dá)可能會導(dǎo)致RH0沉默。作者生成了攜帶人KLF15 (AAV8-CMV-KLF15)的AAV8載體并且注 射豬視網(wǎng)膜。遞送后15天，AAV8-CMV-KLF15轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致令人矚目的豬視紫紅質(zhì)的50%抑制和 視桿特異性GNAT1基因的類似相對抑制。這些結(jié)果表明當(dāng)在視桿細(xì)胞中錯誤表達(dá)時(shí)，已知結(jié) 合序列CCCCCA[SEQ ID從).30]的另一種反式作用元件（內(nèi)源性了？)與2?6-080有類似作用。
[0342] 這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈地表明ZF6-DBD所靶向的順式調(diào)節(jié)元件是對于視紫紅質(zhì)表達(dá)關(guān)鍵的 人視紫紅質(zhì)啟動子的新型順式調(diào)節(jié)元件。
[0343] 因此，ZF技術(shù)和AAV視網(wǎng)膜基因轉(zhuǎn)移允許以2種倒易的方式確定調(diào)節(jié)DNA元件的功 能：
[0344] A)不含效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的靶向DNA序列的ZF DBD的設(shè)計(jì)可用于鑒定新型順式調(diào)節(jié)元 件。在ZF6-DBD的情況中，作者鑒定了先前未知的元件。此外，考慮到順式調(diào)節(jié)元件發(fā)揮作用 的具體細(xì)胞類型，AAV載體在空間（在作者的情況中，a-視網(wǎng)膜下給予，b-具有對感光體的趨 向性的載體，并且可能用感光體特異性啟動子)和時(shí)間（在不同時(shí)間點(diǎn)上視網(wǎng)膜下給予）上 表達(dá)ZF6-DBD構(gòu)建體的能力允許經(jīng)調(diào)整的方法來在時(shí)間和空間上鑒定并確定順式調(diào)節(jié)元件 的性質(zhì)。
[0345] B)可采用許多策略來研究基因組調(diào)節(jié)序列（Genomic approaches towards finding cis-regulatory modules in animals(基因組方法指向發(fā)現(xiàn)動物中的順式調(diào)節(jié) 模塊）.Hardison RC，Taylor J.Nat Rev Genet.2012年6月 18日；13(7):469-83)。然而，首 次采用體內(nèi)AAV載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的應(yīng)用。作者顯示的數(shù)據(jù)描述了一種鑒定體細(xì)胞中AAV 載體的順式調(diào)節(jié)元件活性的方法（圖14和NhWhite MA等PNAS 2013 11952-11957,2013年 7月（Massively parallel in vivo enhancer assay reveals that highly local features determine the cis-regulatory function of ChlP-seq peaks(體內(nèi)大致平行 的增強(qiáng)子試驗(yàn)解釋了高度局部特征確定ChIP-seq峰的順式調(diào)節(jié)功能）.White MA，Myers CA，Corbo JC，Cohen BA.Proc Natl Acad Sci U S A.2013年7月16日；110(29):11952-7) 描述了一種原理上相似的方法。無論如何，在那種情況下使用視網(wǎng)膜電穿孔(代替AAV8載 體)。
[0346] 因此，作者提出了 2步方法：
[0347] -體內(nèi)測試（通過作者所示的AAV-載體遞送，或通過White MA，Myers CA，Corbo JC，Cohen BA.Proc Natl Acad Sci U S A.2013年7月16日；110(29):11952-7.Massively parallel in vivo enhancer assay reveals that highly local features determine the cis-regulatory function of ChlP-seq peaks(體內(nèi)大致平行的增強(qiáng)子試驗(yàn)解釋了 高度局部特征確定ChIP-seq峰的順式調(diào)節(jié)功能)報(bào)道的高通量電穿孔)一系列順式突變體 (感興趣的基因的啟動子、增強(qiáng)子)來鑒定控制表達(dá)的關(guān)鍵區(qū)；
[0348] -生成人工DNA-結(jié)合蛋白來模擬原理上可發(fā)揮激活子或抑制子功能的順式功能。
[0349 ] Bar row等，PNA S 2 012測試了以下假設(shè)，使用針對β-球蛋白的已知順式調(diào)節(jié)元件的 鋅指技術(shù)并且使用轉(zhuǎn)基因方法來證明沒有效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的鋅指可用于研究并且調(diào)節(jié)已知順 式調(diào)節(jié)DNA元件的功能而非鑒定新型CRE的方法。另外，Barr ow使用的轉(zhuǎn)基因與種系方法（以 不受控制的時(shí)間和空間表達(dá)與劑量隨機(jī)整合轉(zhuǎn)基因）而非采用在遍在啟動子控制下的ZF- DBD的非種系靶向方法聯(lián)用。因此，該研究主要受限于缺少時(shí)間和空間的控制，這對于在特 定細(xì)胞類型中確定順式調(diào)節(jié)元件(在空間和時(shí)間中有活性的調(diào)節(jié)DNA)的功能明顯是關(guān)鍵 的。相反，作者使用的與AAV載體介導(dǎo)的體基因轉(zhuǎn)移聯(lián)用的方法允許控制劑量、細(xì)胞限制(空 間分辨)和時(shí)間（載體遞送時(shí)間；時(shí)間分辨）；這是特定細(xì)胞類型中順式調(diào)節(jié)元件(空間和時(shí) 間上有活性的調(diào)節(jié)DNA)的合適評估的重要決定因素，尤其是考慮到現(xiàn)有的基因組研究表明 作者可合理地認(rèn)為"由體細(xì)胞構(gòu)成的身體是遺傳功能鑲嵌現(xiàn)象"。
[0350]為了評估在同一ZF6目標(biāo)DNA區(qū)上是否可應(yīng)用另一種技術(shù)生成DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，作 者使用轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)物（TALE)技術(shù)（Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors(打斷TAL-III型效應(yīng)物的DNA結(jié)合特異性的代 碼）.Boch J,Scholze H,Schornack S,Landgraf A,Hahn S，Kay S，Lahaye T，Nickstadt A，Bonas U.Science.2009年 12月 11 日；326(5959):1509-12)。由于該平臺允許調(diào)整從T DNA 堿基開始的任何DNA-結(jié)合蛋白，作者在ZF6目標(biāo)位點(diǎn)上生成了以下2個構(gòu)建體： TCAGCATCTGGGAGATTG[SEQIDNo·24]和互補(bǔ)序列TCTGGGAGATTGGGGG[SEQIDNo·60]。 HEK293細(xì)胞上的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示TALE-DBD在體外以與ZF6-DBD和ZF6-KRAB相似的程度抑 制CRX介導(dǎo)的表達(dá)(圖23)，表明TALE技術(shù)可替代鋅指技術(shù)采用上述系統(tǒng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的蛋白質(zhì)，所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靶向選自下組的基因的 DNA調(diào)節(jié)序列：RHO、BEST I、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、GUCAIB、RP48、頂PDHl、RPIO、KLHL7、 RP42、NR2E3、NRL、RP27、ORPI、DCDC4A、RPI、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、PRPH2、 RDS、RP7、R0M1、RP1、L1、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、T0P0RS、HK1、 PRPF4、RDH12、LCA13、RP53、SNRNP200、ASCC3L1、BRR2、HECIC2、RP33。2. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，對所述DNA調(diào)節(jié)序列的靶向誘導(dǎo)所述基因 的表達(dá)的抑制。3. 如權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述基因是突變型或野生型。4. 如權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述基因是突變型。5. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自下 組:鋅指結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活物樣(TAL)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或RNA-導(dǎo)向的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其功能 性片段或其功能性衍生物。6. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，在所述基因的啟動子區(qū)序列 中包含所述DNA調(diào)節(jié)序列。7. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，在RHO的啟動子區(qū)序列中包含 所述DNA調(diào)節(jié)序列。8. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述DNA調(diào)節(jié)序列包含選自下 組的序列：GGGGGTTAGAGGGTCTACGA(SEQ ID No.22)、CACCCCCAATCTCCCAGATGCTGAT(SEQ ID No.23)、TCAGCATCTGGGAGATTG(SEQ ID No.24)、GGGGGTTAGAGGGTCT(SEQ ID Νο·25)、 GGGGGTTAGAGGGTCTA(SEQIDNo.26)、TGAACACCCCCAATCTCC(SEQIDNo.27)S GTGGGGGTTAGAGGGT(SEQ ID No.28)。9. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述DNA調(diào)節(jié)序列基本具有選 自下組的序列：GGGGGTTAGAGGGTCTACGA(SEQ ID No · 22)、CACCCCCAATCTCCCAGATGCTGAT(SEQ ID No.23)、TCAGCATCTGGGAGATTG(SEQ ID No.24)、GGGGGTTAGAGGGTCT(SEQ ID Νο·25)、 GGGGGTTAGAGGGTCTA(SEQIDNo.26)、TGAACACCCCCAATCTCC(SEQIDNo.27)S GTGGGGGTTAGAGGGT(SEQ ID No.28)。10. 如權(quán)利要求7、8或9中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)基本由選自下組的序列組 成：SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.l3、SEQ ID No.15、 SEQ ID No. 17,或其功能性片段或功能性衍生物。11. 一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。12. -種載體，所述載體包含如權(quán)利要求11所述的核酸分子。13. 如權(quán)利要求12所述的載體，其特征在于，所述載體是病毒載體。14. 如權(quán)利要求13所述的載體，所述載體選自下組:腺病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體、腺相關(guān)載體(AAV)或裸質(zhì)粒DNA載體。15. 如權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所述的載體，其特征在于，所述載體還包括選自下組的 基因的核苷酸序列：RHO、BEST I、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、⑶CA IB、RP48、IMPDHl、RP10、 KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、ORPI、DCDC4A、RPI、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、 PRPH2、RDS、RP7、ROMl、RPI、LI、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、TOPORS、 冊1、？1?^4、^)!112、1^^13、1^53、5順陬200、厶5〇：31^1、81^2、冊(：1〇2和1^33。16. 如權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)所述的載體，其特征在于，所述載體還包含視網(wǎng)膜特異 性啟動子和任選的調(diào)節(jié)序列。17. 如權(quán)利要求16所述的載體，其特征在于，所述視網(wǎng)膜特異性啟動子是視紫紅質(zhì)激酶 (RHOK)啟動子或轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白I (GNAT1)啟動子，優(yōu)選人轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白I (GNAT1)啟動子。18. -種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞由權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的載體轉(zhuǎn)化。19. 一種病毒顆粒，所述病毒顆粒含有權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的載體。20. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或權(quán) 利要求11所述的核酸或權(quán)利要求18所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求19所述的病毒顆粒和藥學(xué) 上可接受的賦形劑。21. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的載體和藥學(xué) 上可接受的賦形劑。22. 如權(quán)利要求21所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包含含有選自下組的基因的 核苷酸序列的載體：RH0、BEST1、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、(；UCA1B、RP48、IMPDH1、RP10、 KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、ORPI、DCDC4A、RPI、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、 PRPH2、RDS、RP7、ROMl、RPI、LI、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、TOPORS、 冊1、？1?^4、^)!112、1^^13、1^53、5順陬200、厶5〇：31^1、81^2、冊(：1〇2和1^33。23. 用于治療常染色體顯性遺傳眼病和/或常染色體隱性遺傳眼病的權(quán)利要求1-10中 任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求11所述的核酸或權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的載體或權(quán) 利要求18所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求19所述的病毒顆粒或權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的 藥物組合物。24. 用于權(quán)利要求23的用途的權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求11所述 的核酸或權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的載體或權(quán)利要求18所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求19 所述的病毒顆?；驒?quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述治療是基因治療。25. 用于權(quán)利要求23或24的用途的權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求11 所述的核酸或權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的載體或權(quán)利要求18所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要 求19所述的病毒顆?；驒?quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述常染色體顯 性遺傳眼病是常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性(ADRP)或先天性靜止性夜盲。26. 用于權(quán)利要求23或24的用途的權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求11 所述的核酸或權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的載體或權(quán)利要求18所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要 求19所述的病毒顆?；驒?quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述常染色體顯 性遺傳眼病是常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性(ADRP)。27. 用于權(quán)利要求23或24的用途的權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求11 所述的核酸或權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的載體或權(quán)利要求18所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要 求19所述的病毒顆?；驒?quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述常染色體隱 性遺傳眼病是常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性。28. -種用于治療有此需要的對象中的常染色體顯性遺傳眼病或常染色體隱性遺傳眼 病的方法，所述方法包括給予合適量的權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求11 所述的核酸或權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的載體或權(quán)利要求18所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要 求19所述的病毒顆?；驒?quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。29. -種鑒定靶向潛在DNA調(diào)節(jié)序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括： e) 生成2個獨(dú)立構(gòu)建體： -包含在所述潛在DNA調(diào)節(jié)序列控制之下的報(bào)告基因序列的第一構(gòu)建體； -包括在已經(jīng)突變的所述潛在DNA調(diào)節(jié)序列控制之下的報(bào)告基因序列的第二構(gòu)建體； f) 在視網(wǎng)膜中體內(nèi)表達(dá)步驟a)的各構(gòu)建體； g) 比較在所述潛在DNA調(diào)節(jié)序列控制下的報(bào)告基因的表達(dá)與在突變的潛在DNA調(diào)芐基 因控制下的報(bào)告基因的表達(dá)； 其中，如果觀察到與在潛在DNA調(diào)節(jié)序列控制下的報(bào)告基因的表達(dá)相比突變的潛在DNA 調(diào)節(jié)序列控制下報(bào)告基因的表達(dá)減少，則所述潛在DNA調(diào)節(jié)序列是DNA調(diào)節(jié)序列并且由此鑒 定到了 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域； h) 任選地，設(shè)計(jì)革El向所述DNA調(diào)節(jié)序列的DNA結(jié)合蛋白。30. -種通過權(quán)利要求29所述的方法鑒定的靶向潛在DNA調(diào)節(jié)序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。31. 通過權(quán)利要求29所述的方法鑒定的靶向潛在DNA調(diào)節(jié)序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中 所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所限定。
【文檔編號】C12Q1/68GK105960413SQ201480073580
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2014年11月20日
【發(fā)明人】E·M·瑟瑞斯, E·馬魯可, S·伯塔
【申請人】泰萊托恩基金會