專利名稱：一種單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥品的制備方法，具體是從豬腦、牛腦、水牛腦做為提取原料，提 取單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的一種方法。
背景技術(shù)：
單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂能促進(jìn)由于各種原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的功 能恢復(fù)。作用機(jī)理是促進(jìn)“神經(jīng)重構(gòu)”(包括神經(jīng)細(xì)胞的生存、軸突生長和突觸生成)。 單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂對損傷后繼發(fā)性神經(jīng)退化有保護(hù)作用。應(yīng)用單唾液酸四己糖 神經(jīng)節(jié)苷脂后對腦血流動力學(xué)參數(shù)的改善和損傷后腦水腫的減輕有良好的影響。單唾液 酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂通過改善細(xì)胞膜酶的活性減輕神經(jīng)細(xì)胞水腫。動物實驗顯示單唾液 酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂可改善帕金森病所致的行為障礙。LD5tl是872mg/kg(i.v.)至>8g/kg(s.c.)，取決于動物種類和給藥途徑。各種動 物進(jìn)行的亞急性和慢性毒性試驗、致畸試驗、生殖毒性試驗、圍產(chǎn)期毒性試驗以及誘變 性試驗均未顯示本品的任何毒性作用。實驗表明，本品無明顯血管和肌肉刺激性，亦無溶血和過敏反應(yīng)。國內(nèi)、外已有大量文獻(xiàn)報道本品廣泛用于治療脊髓損傷及變性疾病、腦缺血性 疾病、帕金森氏病、周圍神經(jīng)疾病、腰椎間盤突出術(shù)后。另外，本品也試用治療糖尿病 性、酒精中毒性、尿毒癥性及其它中毒性周圍神經(jīng)病變的治療，并取得了比較滿意的療 效。目前，隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的增長以及人口老齡化程度越來越高，腦血管意外的 發(fā)病率正逐年上升，交通的發(fā)達(dá)和意外損傷等因素也使腦脊髓損傷的發(fā)生增多。不僅危 及患者的生命，更嚴(yán)重的是傷后神經(jīng)功能不能很好的恢復(fù)，常常給患者及家屬帶來沉重 的負(fù)擔(dān)，而目前除了在急性期給予對癥支持治療，恢復(fù)期利用神經(jīng)營養(yǎng)藥物及功能鍛煉 夕卜，幾乎沒有什么特效藥。因此，國內(nèi)外許多專家學(xué)者對此進(jìn)行了大量的研究，從而單唾液酸四己糖神經(jīng) 節(jié)苷脂-GMl應(yīng)運(yùn)而生，為這些患者帶來了希望的曙光。神經(jīng)節(jié)苷脂是含唾液酸的糖神經(jīng)鞘脂類物質(zhì)，是人體細(xì)胞膜的組成成分，在神 經(jīng)系統(tǒng)中含量尤其豐富，具有保護(hù)細(xì)胞膜、促進(jìn)神經(jīng)生長、恢復(fù)神經(jīng)功能等作用。GMl 是唯一可以透過血腦屏障的一種神經(jīng)節(jié)苷脂，因此主要用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。 GMl可以通過穩(wěn)定細(xì)胞膜，恢復(fù)細(xì)胞膜Na+-K+_ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，直 接有效降低神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)含水量，減輕腦水腫，并抑制Ca2+內(nèi)流，阻止Ca2+積聚；GMl 可以對抗興奮性氨基酸和自由基的神經(jīng)毒性作用。GMl通過一系列的藥理作用促進(jìn)受損 神經(jīng)的修復(fù)及再生，加快神經(jīng)功能恢復(fù)的速度，加大恢復(fù)的程度。神經(jīng)節(jié)苷脂在國內(nèi)外已廣泛臨床應(yīng)用，其確切的療效以及良好的安全耐受性受 到專家學(xué)者的高度評價。1996年起我國開始應(yīng)用施捷因 (GM-1 )治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)病 變包括腦脊髓創(chuàng)傷、腦血管意外等，獲得了令人滿意的效果，使許許多多患者最大程度地恢復(fù)了神經(jīng)功能，也從殘疾的邊緣挽回了眾多病人。得到了廣大醫(yī)生和患者的認(rèn)可。 國內(nèi)在使用GMl治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變方面積累了豐富的經(jīng)驗，相繼在各種專業(yè)雜志上 發(fā)表了有關(guān)實驗和臨床治療的研究文章。我們憑借自身技術(shù)優(yōu)勢，在單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的提取上進(jìn)行了有益的 探索
發(fā)明內(nèi)容
神經(jīng)節(jié)苷脂是存在于細(xì)胞表面的一類酸性鞘糖脂，在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中的含 量最高，目前由豬腦、牛腦、水牛腦等作為其主要來源。在提取方法上，傳統(tǒng)方法從腦組織中提取脂類活性成分是勻漿后用甲醇和氯仿 混合溶劑提取，再用丙酮沉淀后堿性條件下水解。從總脂中分離GM1的方法很多，國內(nèi) 外實驗室多采用DEAE-Sephadex和Iatrobeads大顆粒硅膠球進(jìn)行柱層析分離提取，或采用 透析或α環(huán)糊精技術(shù)。上述方法的缺點是有機(jī)溶劑消耗量大，填料均需進(jìn)口，故成本非 常高。我們對此提取分離過程進(jìn)行如下改進(jìn)我們將在中草藥提取中分離有效成分廣泛 使用的大孔樹脂用在了單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂提取中，吸附法分離腦組織總提物中 的Gls，再用國產(chǎn)細(xì)硅膠代替上述進(jìn)口填料，用普通硅膠柱層析分離出了高質(zhì)量的單唾液 酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)干粉，由于硅膠柱層析后的產(chǎn)品依舊存在不同的金屬離子雜 質(zhì)，所以使用陽離子交換柱進(jìn)一步離子交換。該工藝經(jīng)過對傳統(tǒng)方法的改進(jìn)后，節(jié)省大 量溶劑和時間，提高了產(chǎn)率，大幅度降低了成本。制備物的純度經(jīng)檢測與Sigma公司提 供的產(chǎn)品含量相同產(chǎn)物的脂-唾液酸含量分別為19.8%-21.2% (相當(dāng)于神經(jīng)節(jié)苷脂含 量為 93% -96% )單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)制備共分為四步第一步總脂的提取以豬腦、牛腦、水牛腦等為原料，勻漿后用甲醇和氯仿混合溶劑提取，上清液 加水和0.2% NaOH溶液水解，分層后得到水相粗提物。第二步粗孔樹脂交換柱分離粗提物用大孔樹脂吸附，待飽和后用水洗至澄清，然后解吸，解樣液濃縮后用 丙酮沉淀，得神經(jīng)節(jié)苷脂混合體。第三步硅膠柱層析神經(jīng)節(jié)苷脂混合體用硅膠柱層析，收集GMl部分，經(jīng)濃縮得神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)粗品。第四步離子交換樹脂柱分離GMl濃縮液溶解后上陽離子交換樹脂柱，用5%鹽酸、甲醇洗脫，然后蒸餾、 濃縮，再用丙酮沉淀，真空干燥得GMl精制品。實施例一1.總脂的提取a、稱取5kg豬腦，加8倍量(40000ml)的氯仿-甲醇混合液(1 3)，用高速組 織搗碎機(jī)電動攪拌提取1小時(轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分)，靜置3小時，后抽取上清液，反復(fù)打 漿三次，共合并三次抽取的上清液110L。
b、每IOL上清液加入2500ml的水，攪拌1小時后靜置36小時、分層；分出底 部氯仿層共計26L，蒸餾后回收套用。C、分出上清水相106L，按0.3%加入NaOH水解，pH約為10，水浴加熱至沸騰
55 0C 士 5 °C水解反應(yīng)40分鐘。d、水解后 用間苯二酚檢測，顯紫色，OD值0.2 0.35，冷卻后備用。2、粗孔樹脂交換柱分離a、取大孔吸附樹脂(型號D4020)，用水漂洗，除去碎粒及水溶性雜質(zhì)，裝入 潔凈的玻璃柱內(nèi)(柱尺寸高90cm直徑12cm)，裝樣量為玻璃柱的2/3。b、進(jìn)行酸處理，用5個柱體積的0.1%鹽酸-甲醇洗滌樹脂，然后用水將樹脂洗 到pH6.5 7.5，水用量約30L。C、取上述冷卻液上柱吸附，流速每小時2L，上樣至流出液間苯二酚顯色法顯淡 紫色，停止上樣。一般吸附250L后得到飽和，飽和后用3倍柱體積水正洗、反沖樹脂 柱，盡可能使樹脂松散，充分洗至洗滌水澄清。d、換用pH9_10的甲醇解吸，沖洗2 3小時，收集洗脫液約5000ml，解樣液 60°C減壓蒸餾濃縮至1/10體積(約500ml)，濃縮液用3倍量丙酮沉淀，取沉淀物，自然 風(fēng)干即為神經(jīng)節(jié)苷脂混合體。收率為豬腦濕重的1.5-2%。。3、硅膠柱層析a、取適量層析用硅膠(青島海洋化工廠柱層析用80 100目與100 200目硅 膠1 1混合)，用醇相濕法裝柱(柱尺寸高90cm直徑2cm)，并用甲醇洗5個柱體 積，平衡后待用。b、取神經(jīng)節(jié)苷脂混合體20g，溶于20 40ml流動相中〔氯仿-甲醇-水 (60 35 5)〕。充分溶解后上柱分離，流速每小時25ml 35ml，TLC法檢測流出 液(TLC法條件展開劑氯仿/甲醇/0.02%氯化鈣=55 45 9 ；點樣量10_20U1 ； 展層至板邊緣Icm處取出，鄰苯二酚溶液噴霧顯色，110°C烘烤15分鐘。)，依次為前沿 月旨、GM3> GM1^ GM1下點，待TLC法顯示只有單點時改流速為每小時50ml 70ml， 洗脫液用HPLC跟蹤檢測，控制質(zhì)量達(dá)到98%以上時開始收集流動相，至含量又下降到 98%以下為止，收集流動相約5000ml，所得即是用HPLC檢測酸根部分含量大于98%的 GM10C、合并GM1部分的洗脫液，50°C減壓濃縮至體積為500ml，3倍量丙酮沉淀后 即得GMl干粉。收率為混合體的10%。4、離子交換樹脂分離a、陽離子交換樹脂的預(yù)處理取H+型陽離子交換樹脂，用三倍量的5%鹽酸甲 醇溶液走沖洗樹脂，并保留2 3小時，再用甲醇沖至pH6.5 7.5b、收集硅膠柱層析的GM1部分含有較多的金屬離子，取10g，用50ml的5%鹽 酸甲醇溶液溶解，再加甲醇至1000ml，^漏斗過濾除去不溶物。C、濾液通過離子交換樹脂柱，收集得溶液pH為1.8 2.0，如果pH高于2.0， 那么濾液需要樹脂再生后再次過柱。d、所收集濾液用飽和NaOH調(diào)pH至4.5，減壓濃縮至100ml，用300ml丙酮沉
淀，靜止12小時后抽濾，所得濾出物用少量丙酮洗滌3次，抽干后真空干燥，得到GM1干粉。


圖1是詳細(xì)制備條件和工藝流程圖。
權(quán)利要求
1.一種單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的提取方法，其特征在于a:總脂的提取；b: 粗孔樹脂交換柱分離；c 硅膠柱層析；d 離子交換樹脂柱分離
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述總脂的提取是以豬腦、牛腦或水牛腦為原料，勻漿后用甲醇和 氯仿混合溶劑提取，上清液加水和0.2% NaOH溶液水解，分層后得到水相粗提物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述粗孔樹脂交換柱分離是粗提物用大孔樹脂吸附，待飽和后用水 洗至澄清，然后解吸，解樣液濃縮后用丙酮沉淀，得神經(jīng)節(jié)苷脂混合體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述硅膠柱層析是指神經(jīng)節(jié)苷脂混合體用硅膠柱層析，收集GMl 部分，經(jīng)濃縮得神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)粗品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述離子交換樹脂柱分離指GMl濃縮液溶解后上陽離子交換樹 脂柱，用5%鹽酸、甲醇洗脫，然后蒸餾、濃縮，再用丙酮沉淀，真空干燥得GMl精制
全文摘要
一種單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的提取方法。該工藝步驟主要包括采用分離糖類等同時具有親水、親脂性的天然產(chǎn)物的大孔樹脂，吸附法分離腦組織總提物中的G1S，用普通硅膠柱層析分離出了高質(zhì)量的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)干粉，由于硅膠柱層析后的產(chǎn)品依舊存在不同的金屬離子雜質(zhì)，所以使用陽離子交換柱進(jìn)一步離子交換。該工藝經(jīng)過對傳統(tǒng)方法的改進(jìn)后，節(jié)省大量溶劑和時間，提高了產(chǎn)率，大幅度降低了成本。
文檔編號C07H15/10GK102020684SQ20091017757
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月16日
發(fā)明者胡增榮 申請人:胡增榮, 黑龍江省哈爾濱醫(yī)大藥業(yè)有限公司