專利名稱：一種修飾膠原蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)膠原蛋白進(jìn)行修飾改性的方法，具體地說，涉及對(duì)膠原蛋白的氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行化學(xué)修飾，以連接上新的功能基團(tuán)，賦予膠原蛋白新的物理化學(xué) 特性。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是人體組織的主要支撐結(jié)構(gòu)，是人體的主要結(jié)構(gòu)蛋白， 構(gòu)成人體約30%的蛋白質(zhì)。膠原蛋白含有大量的甘氨酸(31.4% -33.4% )、脯氨酸 (11.7% -13. 8% )、羥脯氨酸(9. 4% -12. 5% )，其最主要的特征是由三條α肽鏈纏繞形成 的三股螺旋結(jié)構(gòu)，在三股螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域有甘氨酰-脯氨酰_羥脯氨酰、甘氨酰-脯氨酰-Y、 甘氨酰-X-Y(X、Y代表除甘氨酰和脯氨酰、羥脯氨酰以外的任何氨基酸殘基)這樣一些三 肽的重復(fù)順序存在。已報(bào)道的膠原蛋白有27種類型，并且可能還有尚未發(fā)現(xiàn)和報(bào)道的類 型，最常見的類型是I型、II型和III型，其中I型的生物體含量最為豐富，占全部膠原蛋白 含量的90%以上，在皮膚、肌腱、骨、血管等組織和器官中含量非常豐富，被廣泛用作生物材 料。膠原蛋白具有抗原性低、與細(xì)胞親和力大、可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、與血小板產(chǎn)生凝血作用等 特點(diǎn)。由于其優(yōu)良的生物相容性，膠原蛋白堪稱最合適的組織工程材料，但以天然膠原制作 的組織工程產(chǎn)品和縫合線等醫(yī)療植入物機(jī)械強(qiáng)度較低，力學(xué)性能較差，降解速率過快，不能 滿足長(zhǎng)期執(zhí)行細(xì)胞支架功能的需要。為達(dá)到醫(yī)學(xué)應(yīng)用的要求，必須對(duì)膠原蛋白進(jìn)行改性。目前對(duì)膠原蛋白進(jìn)行改性的方法主要分為物理方法、化學(xué)方法以及與其它高分子 材料共混改性，也是目前膠原基材料制作中常用的方法。共混改性由于關(guān)系到其它高分子 材料的性能，并非本專利的關(guān)注點(diǎn)，在此不予討論。物理方法即通過物理手段，如紫外線照 射、重度脫水、Y射線照射和熱交聯(lián)等方法對(duì)膠原蛋白進(jìn)行改性，其缺點(diǎn)在于交聯(lián)程度低且 不均勻，目前僅作為輔助手段來使用。而化學(xué)方法又可以具體分為化學(xué)試劑交聯(lián)、側(cè)鏈修飾和生理活性物的固定化三種 方法。生理活性物的固定化是指以膠原為支撐物，將各種生理活性物質(zhì)固定化，在使用過程 中再釋放出來發(fā)揮各自的生理作用。側(cè)鏈修飾就是對(duì)膠原分子側(cè)鏈上的功能基團(tuán)進(jìn)行化學(xué) 修飾，改善電荷分布，使膠原獲得新的特性的方法，這方面的研究目前還較少，僅有對(duì)側(cè)鏈 氨基和羧基的修飾研究?；瘜W(xué)試劑交聯(lián)法是使用最廣泛的化學(xué)改性方法?；瘜W(xué)交聯(lián)劑從功 能上分為兩類第一類是具有兩個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的交聯(lián)劑，可以在相鄰的兩條肽鏈間形成 胺基橋鍵；另一類則可以活化谷氨酸或天東氨酸殘基上的羧基，使之與另一條肽鏈上的氨 基反應(yīng)形成酰胺鍵，從而形成交聯(lián)。目前常用的化學(xué)交聯(lián)劑有醛類(戊二醛、甲醛、乙二醛 等)、1，6_己二異氰酸酯(HDI)、碳化二亞胺(EDC)、疊氮磷酸二苯酯(DPPA)、乙酰疊氮、環(huán) 氧化物(包括單功能和多功能兩大類)、京尼平、胼等。在這些交聯(lián)劑中，碳化二亞胺、胼和 疊氮類化合物(包括DPPA、乙酰疊氮等)通過活化氨基酸殘基上的羧基與氨基形成酰胺鍵 產(chǎn)生交聯(lián)，而醛類、1，6_己二異氰酸酯、京尼平等都是通過與氨基反應(yīng)形成胺基橋鍵形成交 聯(lián)。環(huán)氧化物則在不同條件下既可與氨基反應(yīng)，也可與羧基反應(yīng)。交聯(lián)可以提高膠原產(chǎn)品的機(jī)械強(qiáng)度和力學(xué)性能，并且降低膠原的酶降解速度和機(jī) 械強(qiáng)度的下降速度，而且這些作用隨交聯(lián)程度的提高而增強(qiáng)。這是由于交聯(lián)的作用使酶無 法與膠原分子充分接觸，酶的分解作用只能在膠原產(chǎn)品表面進(jìn)行，因此減緩了膠原的分解速度和機(jī)械強(qiáng)度的下降速度。

發(fā)明內(nèi)容
目前無論是化學(xué)交聯(lián)還是側(cè)鏈修飾，均是利用了膠原蛋白側(cè)鏈上的氨 基和羧基。而對(duì)于側(cè)鏈上含量更為豐富的羥基，由于其反應(yīng)活性低于氨基和羧基，在適用于 膠原蛋白的溫和反應(yīng)條件下一般不起反應(yīng)，因而目前還未得到利用。由于膠原蛋白含有獨(dú) 特的羥脯氨酸和羥賴氨酸，這使得膠原蛋白側(cè)鏈上的羥基不僅來源于絲氨酸、蘇氨酸和酪 氨酸的殘基，也來源于羥脯氨酸和羥賴氨酸的殘基。膠原蛋白中羥脯氨酸含量很高，可以 達(dá)到9. 4% -12. 5%，這使得側(cè)鏈上羥基的含量大大高于氨基和羧基的含量。以牛I型膠原 α -1鏈為例，其在三螺旋區(qū)的肽段長(zhǎng)度為1014個(gè)氨基酸，含有89個(gè)由賴氨酸、精氨酸和組 氨酸殘基提供的氨基和78個(gè)由天冬氨酸和谷氨酸殘基提供的羧基，以及49個(gè)由絲氨酸和 蘇氨酸殘基提供的羥基。由于脯氨酸和羥脯氨酸主要存在于三螺旋區(qū)，所以按保守的估計(jì) 假定這一肽段中羥脯氨酸含量為10%計(jì)算，則含有101個(gè)羥脯氨酸殘基，再加上49個(gè)絲氨 酸和蘇氨酸殘基，共可提供150個(gè)羥基，由于羥賴氨酸的含量很低，此處沒有計(jì)算其含量。 可見如能將羥基轉(zhuǎn)化為可交聯(lián)位點(diǎn)，與目前的交聯(lián)方法相比，可以顯著提高膠原的交聯(lián)程 度，從而在更高程度上提高膠原產(chǎn)品的機(jī)械強(qiáng)度和力學(xué)性能，以及降低膠原的酶降解速度 和機(jī)械強(qiáng)度的下降速度。本發(fā)明利用羥基的酯化作用，向羥基上連接新的分子結(jié)構(gòu)。這個(gè)分子結(jié)構(gòu)必須含有一個(gè)或一個(gè)以上的參與酯鍵形成的?；?，除此以外還可同時(shí)帶有氨基、巰基、羧基等可用 來交聯(lián)的功能團(tuán)或其它功能團(tuán)，用來提供交聯(lián)位點(diǎn)或賦予膠原蛋白新的物理化學(xué)性能。常 見的酯化方法有酰鹵法、酸酐法、活化酯法、疊氮法等。酰鹵法是指用酰鹵(指酰氟、酰氯、酰溴或酰碘)與羥基反應(yīng)形成酯。由于酰鹵很 活潑，該反應(yīng)很容易進(jìn)行。也正因?yàn)轷｛u非?；顫?，一般在使用前制備酰鹵。參見實(shí)施例1?；罨シ赐ㄟ^預(yù)先將羧基活化，形成不穩(wěn)定的酯，再與膠原蛋白的羥基反應(yīng)成 酯?？墒褂锰级啺奉惢衔?，如N，N' -二異丙基碳二亞胺(DIC)、二環(huán)己基碳二亞胺 (DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)等，來活化羧基。參見實(shí)施例 2。疊氮法則是將羧基活化為?；B氮，再與膠原蛋白的側(cè)鏈羥基反應(yīng)成酯。如用 DPPA與羧基反應(yīng)形成酰基疊氮，再與膠原的側(cè)鏈羥基成酯。反應(yīng)在二甲基甲酰胺溶液中進(jìn) 行，過程類似于DPPA催化的膠原蛋白交聯(lián)反應(yīng)。在交聯(lián)反應(yīng)中，由于氨基比較活躍，因而羧 基與氨基形成酰胺鍵；而羥基相對(duì)不活躍，一般認(rèn)為在交聯(lián)條件下不形成酯鍵。疊氮法反應(yīng) 速度很慢，如使用DPPA的交聯(lián)反應(yīng)需24小時(shí)，而用乙酰疊氮活化羧基則所需時(shí)間更長(zhǎng)。酸酐法則是用酸酐與羥基反應(yīng)成酯。如果使用二元酸的酸酐則可以在羥基的位置 上連接一個(gè)羧基。酸酐比酰鹵穩(wěn)定，不必臨用前制備。參見實(shí)施例3。使用以上任一種方法可將一個(gè)分子結(jié)構(gòu)通過酯鍵連接到膠原蛋白上。這個(gè)分子 結(jié)構(gòu)除了帶有形成酯鍵所需的一個(gè)或多個(gè)酰基外，還可以帶有巰基、羧基、氨基等可交聯(lián)基 團(tuán)或其它功能基團(tuán)。如果帶有這些可交聯(lián)基團(tuán)或其它易受酯化過程影響的基團(tuán)，必須先對(duì) 這些基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)才可以進(jìn)行酯化反應(yīng)。常用的巰基保護(hù)基有對(duì)甲苯基、對(duì)甲氧芐基、三苯 甲基、二硫化物等，待酯化反應(yīng)完成后用相應(yīng)的方法脫保護(hù)，這樣就可以在原先羥基的位置 產(chǎn)生可交聯(lián)的巰基，這個(gè)巰基可以在氧化條件下在膠原蛋白的肽鏈間產(chǎn)生交聯(lián)。羧基可以 用酸酐保護(hù)，如使用二元酸的酸酐，在成酯反應(yīng)完成后，一個(gè)羧基與膠原蛋白的羥基形成酯鍵，另一個(gè)則處于活性狀態(tài)，可參加其它反應(yīng)。氨基的保護(hù)方法比較多，常用的氨基保護(hù)基 有芴甲氧羰?；?縮寫=Fmoc)、叔丁氧羰基(縮寫t-Boc)、芐氧羰基(縮寫CBz)、2_聯(lián) 苯基-2-丙氧羰基(縮寫B(tài)Poc)、三氟乙?；?trifluoroacetyl)等，可根據(jù)保護(hù)和脫保護(hù) 的反應(yīng)條件加以選用。 這個(gè)分子結(jié)構(gòu)不僅可以攜帶一個(gè)或多個(gè)功能基團(tuán)，也可以具有一定的立體構(gòu)型。 不同的立體構(gòu)型可以賦予修飾后的膠原蛋白不同的理化特性，同時(shí)也對(duì)酯鍵的水解產(chǎn)生影 響。復(fù)雜的或疏水的立體構(gòu)型對(duì)酯鍵的穩(wěn)定性有保護(hù)作用，原因在于這樣的立體構(gòu)型可以 形成位阻，阻礙親核基團(tuán)對(duì)酯鍵的攻擊。由于氨基比羥基活潑，能與羥基發(fā)生成酯反應(yīng)的試劑通常也可以與氨基發(fā)生反應(yīng) 形成酰胺。而通常用來保護(hù)氨基的方法也可以同時(shí)與羥基發(fā)生成酯反應(yīng)，因此如果需要在 成酯反應(yīng)過程中專一性的保護(hù)膠原蛋白側(cè)鏈上的氨基，可以使用醛類，如苯甲醛，預(yù)先與氨 基反應(yīng)形成SchifT堿，在酯化反應(yīng)完成后，采用還原胺化法去除氨基的保護(hù)。由于在酸 性環(huán)境下羥基不能與醛基發(fā)生反應(yīng)，因而醛在保護(hù)了氨基的情況下并不影響羥基的反應(yīng)活 性。此方法參見實(shí)施例4。但是該操作方法比較繁瑣，如非必要，也可以用常用的氨基保 護(hù)方法，但是對(duì)氨基的專一性差，通過控制保護(hù)試劑的用量，盡量減少保護(hù)試劑與羥基的反 應(yīng)。如果在后續(xù)產(chǎn)品制作過程中不再利用氨基，或者是在羥基的位置上引入氨基，則氨基可 以不保護(hù)。本專利采用的成酯方法都是在室溫或低溫進(jìn)行，所用的溶劑也不會(huì)破壞膠原的氫 鍵，可保持膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)。因而本專利對(duì)變性或未變性的膠原蛋白都適用，而且也 適用于不同類型的膠原蛋白，以及來自不同種屬動(dòng)物的膠原蛋白。通過酯鍵連接到膠原蛋 白上的功能基團(tuán)，可以參與交聯(lián)反應(yīng)，也可以參與其他反應(yīng)，或?yàn)槟z原蛋白帶來不同的理化 特性，如等電點(diǎn)、粘度等發(fā)生改變。通過調(diào)節(jié)羥基的酯化反應(yīng)程度，可以控制連接到膠原蛋 白的側(cè)鏈上的功能基團(tuán)數(shù)目，使得膠原的可交聯(lián)程度和其他特性發(fā)生改變。使用本專利修飾的膠原蛋白，可以應(yīng)用于組織工程產(chǎn)品、縫合線、海綿等醫(yī)用產(chǎn) 品，也可以應(yīng)用于其他以變性或未變性的膠原蛋白為材料的產(chǎn)品。
實(shí)施例以下所用試劑均為市售1.酰氯法。步驟如下①用酶法提取牛I型膠原蛋白，將純化的膠原蛋白溶于0. 1摩爾濃度醋酸中，凍 干除去水分；②取89. 2毫克Fmoc-甘氨酸溶于0. 75毫升二氯甲烷中，然后再加入50微升吡啶 和42微升2，6- 二氯苯甲酰氯，混合；③將混合物加入100毫克凍干的膠原蛋白中，在搖床中反應(yīng)2小時(shí)，溫度20°C ；④反應(yīng)結(jié)束后，除去溶劑，依次加入無水甲醇、二氯甲烷洗滌一次，每次一分鐘，除 去溶液；⑤加入1毫升含20% (體積分?jǐn)?shù))哌啶的二甲基甲酰胺，反應(yīng)20分鐘，除去溶液；⑥依次加入無水甲醇、二氯甲烷各洗滌三次，每次一分鐘，除去溶液；⑦凍干法除去殘留溶劑。
如此即通過酯鍵使膠原蛋白的側(cè)鏈羥基與甘氨酸相連接，甘氨酸的羧基與羥基成酯，而游離氨基可以參加交聯(lián)反應(yīng)或其他反應(yīng)。2.活化酯法。操作基本同于酰氯法，僅步驟②改為89. 2毫克Fmoc-甘氨酸與30 毫克1-羥基苯并三氮唑溶于0. 75毫升二甲基乙酰胺中，加入48微升二異丙基碳二亞胺， 混合，搖床中反應(yīng)1小時(shí)，溫度20°C，反應(yīng)結(jié)束后，加入2毫克二甲基氨基吡啶。如此即通過酯鍵使膠原蛋白的側(cè)鏈羥基與甘氨酸相連接，甘氨酸的羧基與羥基成 酯，而游離氨基可以參加交聯(lián)反應(yīng)或其他反應(yīng)。3.酸酐法。步驟如下①用酶法提取牛I型膠原蛋白，將純化的膠原蛋白溶于0. 1摩爾濃度醋酸中，凍 干除去水分；②取丁二酸酐35. 4毫克和吡啶24微升，溶于二氯甲烷中，混勻；③將混合物加入100毫克凍干的膠原蛋白中，在密閉容器中反應(yīng)2小時(shí)，溫度 25 0C ；④反應(yīng)結(jié)束后，除去溶劑，依次加入無水甲醇、二氯甲烷洗滌三次，每次一分鐘，除 去溶液；⑤凍干法除去殘留溶劑。如此即通過酯鍵使膠原蛋白的側(cè)鏈羥基與丁二酸相連接，丁二酸的一個(gè)羧基與羥 基成酯，另一個(gè)游離羧基可以參加交聯(lián)反應(yīng)或其他反應(yīng)。4.在成酯反應(yīng)中對(duì)氨基的保護(hù)。步驟如下①用酶法提取牛I型膠原蛋白，將純化的膠原蛋白溶于0. 1摩爾濃度醋酸中；②加入苯甲醛溶液，混勻，室溫放置10分鐘，氨基與苯甲醛形成Schiff堿；③凍干法除去水分和苯甲醛；④以酰氯法或活化酯法或酸酐法將羥基酯化，詳細(xì)方法參見實(shí)施例1、2、3 ；⑤取0. 3毫摩爾硼氫化鈉，溶于二氯甲烷中，加入到100毫克在實(shí)施例1、2、3中已 除去殘留溶劑的膠原蛋白中，還原Schiff堿，得到芐基取代的側(cè)鏈胺基，反應(yīng)中多余的硼 氫化鈉可用稀的氫氧化鈉溶液除去；⑥用H2/Pt催化氫化法從側(cè)鏈氨基上脫去芐基。如此即在不影響膠原蛋白的側(cè)鏈羥基進(jìn)行成酯反應(yīng)的情況下，保留了膠原蛋白的 側(cè)鏈氨基的活性。
權(quán)利要求
一種修飾膠原蛋白的方法，即對(duì)膠原蛋白的氨基酸側(cè)鏈上的羥基進(jìn)行酯化修飾，以連接上新的分子結(jié)構(gòu)，而這個(gè)分子結(jié)構(gòu)可以帶有不同的功能基團(tuán)，賦予膠原蛋白不同的物理化學(xué)性能。
2.按權(quán)利要求書1所述修飾膠原蛋白的方法，其特征在于是對(duì)膠原蛋白的側(cè)鏈上的羥 基進(jìn)行酯化修飾，酯化方法有酰商法、活化酯法、疊氮法、酸酐法等，可以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)過程 來控制羥基的酯化程度。
3.按權(quán)利要求書1所述修飾膠原蛋白的方法，其特征在于側(cè)鏈上的羥基可由絲氨酸、 蘇氨酸、酪氨酸、羥脯氨酸和羥賴氨酸的殘基提供。
4.按權(quán)利要求書1所述連接上的新的分子結(jié)構(gòu)，這個(gè)分子結(jié)構(gòu)的特征在于除了帶有形 成酯鍵所需的一個(gè)或一個(gè)以上的?；?，還可以分別或同時(shí)帶有一個(gè)或一個(gè)以上的氨基、 巰基、羧基等可交聯(lián)功能基團(tuán)或其它功能基團(tuán)，這些功能基團(tuán)可以相互之間或與膠原蛋白 原有的功能基團(tuán)間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，也可以參加其他反應(yīng)，或?yàn)槟z原蛋白提供新的理化特性； 這個(gè)分子結(jié)構(gòu)可以具有一定的立體構(gòu)型，這個(gè)構(gòu)型可以提高或降低酯鍵的穩(wěn)定性，也可以 對(duì)酯化反應(yīng)的速度和效率產(chǎn)生影響。
5.按權(quán)利要求書1所述的修飾膠原蛋白的方法，可應(yīng)用于變性和未變性的膠原蛋白， 也可應(yīng)用于膠原蛋白的各種類型以及不同種屬動(dòng)物的膠原蛋白。
6.按權(quán)利要求書1所述的修飾膠原蛋白的方法，所制得的修飾后的膠原蛋白可作為材 料應(yīng)用于所有以膠原蛋白為材料的產(chǎn)品，包括現(xiàn)有的各種組織工程產(chǎn)品和縫合線以及其他 膠原基產(chǎn)品，也包括尚未開發(fā)的產(chǎn)品。
7.按權(quán)利要求書1、2所述的酯化修飾，如果對(duì)膠原蛋白的側(cè)鏈氨基在后續(xù)制作過程中 的作用產(chǎn)生影響，則可以在側(cè)鏈氨基受到保護(hù)的條件下進(jìn)行酯化反應(yīng)，可以用Schiff堿來 專一性的保護(hù)氨基，也可以使用常規(guī)的氨基保護(hù)方法；如果對(duì)后續(xù)過程沒有影響則也可以 在氨基沒有保護(hù)的條件下進(jìn)行酯化反應(yīng)。
8.按權(quán)利要求書1、2所述的酯化修飾，其特征在于反應(yīng)條件溫和，在室溫或低于室溫 即可進(jìn)行，所用溶劑也不會(huì)破壞膠原蛋白的立體結(jié)構(gòu)，在反應(yīng)過程中膠原蛋白可保持其特 征性的三股螺旋結(jié)構(gòu)。
9.按權(quán)利要求書4所述的分子結(jié)構(gòu)，這個(gè)分子結(jié)構(gòu)除了攜帶形成酯鍵所需的?；?， 另外攜帶的不參加酯化反應(yīng)的氨基、巰基、羧基等功能基團(tuán)須在受到保護(hù)的狀態(tài)下進(jìn)入酯 化反應(yīng)過程，以免受到酯化過程的影響，并可在酯化反應(yīng)完成后脫除保護(hù)基。
10.按權(quán)利要求書1、2、4所述的酯化修飾和分子結(jié)構(gòu)，可以通過調(diào)節(jié)酯化反應(yīng)過程來 調(diào)節(jié)連接到膠原蛋白上的功能基團(tuán)數(shù)目，從而可以對(duì)膠原蛋白產(chǎn)品的最大可交聯(lián)程度產(chǎn)生 影響；提高羥基的酯化程度可以提高膠原蛋白產(chǎn)品的最大可交聯(lián)程度，從而提高其力學(xué)性 能；通過調(diào)節(jié)修飾后的膠原蛋白的最大可交聯(lián)程度和所連接的分子結(jié)構(gòu)的立體構(gòu)型，可以 調(diào)節(jié)膠原產(chǎn)品的酶降解速度；交聯(lián)程度越大，分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)型越復(fù)雜、疏水程度越高，則膠 原的降解速度越低。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對(duì)膠原蛋白的修飾方法。用化學(xué)方法將膠原蛋白氨基酸側(cè)鏈上的羥基酯化，通過酯鍵可以在側(cè)鏈上連接新的分子結(jié)構(gòu)。這些分子結(jié)構(gòu)帶有至少一個(gè)參與酯鍵形成的?；⒖赏瑫r(shí)帶有氨基、巰基、羧基等可交聯(lián)基團(tuán)或其他功能基團(tuán)。這些功能基團(tuán)在被保護(hù)基保護(hù)的狀態(tài)下不會(huì)受到酯化過程的影響，并在酯化反應(yīng)完成后脫保護(hù)。通過酯化過程調(diào)節(jié)被修飾的羥基數(shù)量，以及調(diào)節(jié)分子結(jié)構(gòu)的大小、立體構(gòu)型和所攜帶的功能基團(tuán)種類、數(shù)量，可以改變膠原蛋白的最大可交聯(lián)程度、抗降解能力和力學(xué)性能，以及賦予膠原蛋白新的物理化學(xué)特性。本發(fā)明可用來制備目前以膠原蛋白為材料的各種組織工程產(chǎn)品和縫合線以及其他膠原基產(chǎn)品等。
文檔編號(hào)C07K1/107GK101798345SQ20091005686
公開日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2009年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月5日
發(fā)明者顏建華 申請(qǐng)人:顏建華