利用豬肺制備膠原蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物活性物質(zhì)制作技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用豬肺制備膠原蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原蛋白是世界上應(yīng)用最為廣泛的生物材料，目前國際年產(chǎn)量在2萬噸左右。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，膠原蛋白作為高生物相容性、高生物活性材料被廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷控制和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)。2011年，國際著名的商務(wù)測評機構(gòu)Frost&SulIivan的市場調(diào)研數(shù)據(jù)也表明，膠原蛋白已經(jīng)成為最有市場競爭力的生物醫(yī)學(xué)材料，用于再生醫(yī)學(xué)，并將進(jìn)一步發(fā)展，成為器官替代醫(yī)學(xué)兩大材料之一。美國醫(yī)藥食品管理局(FDA)預(yù)測，到2015年膠原蛋白將占有超過20%的生物醫(yī)學(xué)材料市場，年銷售額超過200億美元。
[0003]近年來，國際大型企業(yè)(如法國羅賽洛(RUSSEL0T)集團(tuán))開始著手開發(fā)合成膠原蛋白及其類似物的研發(fā)，但受合成技術(shù)限制，水平較低，產(chǎn)量有限，價格昂貴(目前市面合成高純度膠原蛋白的售價高達(dá)3000美元/毫克)，僅能用于科研應(yīng)用。
[0004]一直以來，膠原蛋白主要從動物的組織器官提取，如豬牛的皮、骨骼和筋腱等。膠原蛋白提取方法有傳統(tǒng)酸解法，中性鹽萃取法和酶法。所有方法都先將鼠尾清洗后置入萃取溶液進(jìn)行溶解。離心后，粗提液可以作為產(chǎn)品儲存也可以進(jìn)一步加工處理進(jìn)行精提。中性鹽萃取法有著顯著的技術(shù)劣勢，主要是產(chǎn)率低下不足5%，而且雜質(zhì)蛋白含量高，基本被淘汰了。目前，中國國內(nèi)最常見的膠原蛋白提取工藝仍然基于傳統(tǒng)的酸解法，而且主要原料是牛筋腱(蹄筋)和鼠尾筋腱。由于技術(shù)局限，酸解法提取產(chǎn)率只能從鼠尾筋腱濕重計算，產(chǎn)率不超過60%。為了提高萃取率，很多情況下，還要用胰蛋白酶對筋腱進(jìn)行預(yù)處理。雖然，動物筋腱超過90%的組分為膠原蛋白，但是其從動物體的剝離過程人力消耗大，且不易處理干凈，造成產(chǎn)品最后污染，特別是動物血液和肌肉組織的污染很難去除。另外，很多動物組織的蛋白酶仍然存在，在酸解過程中，會和酸同時起作用于膠原蛋白，造成膠原蛋白的不規(guī)則水解，大大降低了流程的可控性與可重復(fù)性，直接影響到膠原蛋白的質(zhì)量，特別是其特殊的生物學(xué)功能性。因此，需要一種簡單可行的方法來提取高純度的膠原蛋白。
[0005]能使膠原蛋白酶解的酶類較多。按照作用位點可以分為內(nèi)切酶和外切酶；從來源上可分為植物蛋白酶(如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、動物蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)、微生物蛋白酶(如枯草桿菌1398、放線菌166等)；此外，較常用于水解的蛋白酶還有風(fēng)味復(fù)合酶等。在實際應(yīng)用中，酶的選取通常要考慮三個方面:一是酶對膠原蛋白作用的強度；二是酶的價格；三是水解產(chǎn)物的要求。如果酶對膠原的作用太弱，則無法得到高的膠原水解率，除此之外，還必須考慮酶對膠原的作用位點，因為這直接影響最后水解產(chǎn)物分子量的分布，是決定能否得到目標(biāo)產(chǎn)物的一個關(guān)鍵因素，目前已知的關(guān)于制備膠原蛋白的酶種類也挺多，但是其水解效率普遍不是很高，因此，在水解效率上，還需要發(fā)現(xiàn)一種新的酶以進(jìn)一步提聞。
[0006]蚯蚓絲氨酸蛋白酶是從蚯蚓體內(nèi)提取得到的一種酸性蛋白酶，屬于胰蛋白酶，它能水解蛋白質(zhì)底物(如酪蛋白)，堿性氨基酸的酯及酰胺。PI3-4 ;20-50°C范圍穩(wěn)定；是一種糖蛋白酶類。
[0007]蚯蚓絲氨酸蛋白酶作為一組蛋白水解酶，對其酶學(xué)性質(zhì)的研究還不夠深入；蚯蚓絲氨酸蛋白酶直接切割纖溶酶原及降解纖維蛋白原是其同時具有激酶和纖溶酶活性的分子基礎(chǔ)；對不同合成底物具有專一性說明其具有不同活性中心；蚯蚓絲氨酸蛋白酶能對組織纖溶酶原激活劑(t-PA)的專一性底物S-2288有水解作用，說明其對纖溶酶原的激活方式與t-PA相似，對豬肺結(jié)締組織蛋白有很好的水解作用。
[0008]我國是養(yǎng)豬大國，每年出欄生豬約6億頭，年產(chǎn)出近50萬噸豬肺，資源十分豐富，對于低廉而滯銷的豬肺除少數(shù)部分被加工利用外，大部分都沒有得到有效利用。目前雖然有關(guān)于綜合利用豬肺的報道，如用于提取PPS和肝素鈉，但由于其生產(chǎn)成本高及技術(shù)難點問題，真正在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用得極少，因此，這些副產(chǎn)物基本上都作豬或?qū)櫸镲暳?，沒有得到很好的利用，有的屠宰場甚至未回收處理，既浪費資源，又污染環(huán)境。
[0009]研究表明，豬肺的總蛋白含量為12.51% ±0.41，粗脂肪含量為3.01% ±0.20，水分含量為83.17%士 0.33，膠原蛋白含量為3.08% ±0.12。如果提取膠原蛋白按3%含量，40%的提取率計，這樣I公斤的豬肺就能提取出12克左右的膠原蛋白，一年可提取6000噸膠原蛋白；提取之后的殘渣還可再次用來加工成各種飼料，從而真正的達(dá)到綜合利用豬副產(chǎn)物，又減少環(huán)境污染。膠原蛋白產(chǎn)品用途十分廣泛，市場前景廣闊，工業(yè)化生產(chǎn)也不用擔(dān)心市場銷路，加工成保健產(chǎn)品或應(yīng)用于醫(yī)療產(chǎn)品中，至少增值20?50倍。
[0010]2010年臺灣林詠凱等人研究開發(fā)從豬肺中制備膠原蛋白，通過對豬肺除血紅蛋白、萃取、離心、冷凍干燥，得到醫(yī)用級膠原蛋白，從一公斤豬肺中得到6.8克膠原蛋白，在經(jīng)過生化比對后，確認(rèn)在結(jié)構(gòu)上與目前日本膠原蛋白間無差異。
[0011]國內(nèi)也有部分機構(gòu)個人在研究利用豬肺制備膠原蛋白，2007年李小勇等測定了豬肺中膠原蛋白的含量，并研究了提取時豬肺中非膠原蛋白成分的去除，膠原蛋白提取過程中各種因素對提取效果的影響，提取的粗膠原蛋白的純化，純化后的膠原蛋白的基本理化特性。其研究制備工藝成本高昂不具備工業(yè)化價值。
[0012]目前，尚未見從豬肺制備膠原蛋白工業(yè)化生產(chǎn)的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠降低膠原蛋白生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品品質(zhì)和收得率的利用豬肺制備膠原蛋白的方法，同時得到的肽的含量更高，并且產(chǎn)物分離更加徹底，活性高。
[0014]本發(fā)明為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案:利用豬肺制備膠原蛋白的方法，該
方法采用如下步驟:
(1)預(yù)處理:將豬肺清洗干凈絞碎成肺漿，加入0.2%-0.4%的堿性溶液進(jìn)行浸泡20-40min，待用；
(2)稱取一定量的預(yù)處理后的原料，按照物料比l:2(w/v)-l:4(w/v)加入去離子水，80-85°C滅菌 30-40min，冷卻至 40°C ；
(3)按稱取預(yù)處理后的原料重量的1_3%。加入蚯蚓絲氨酸蛋白酶； (4 )酶解工藝條件控制:PH控制在6.5-8.0，37-42 V保溫水解6_7h，80-85 V滅活30min,然后離心過濾,取過濾清液；
(5)使用截留分子量為10000道爾頓的超濾設(shè)備進(jìn)行超濾，并補加純化水使超濾更加完全，取透出液；
(6 )將透出液進(jìn)行干燥，得到膠原蛋白。
[0015]所述步驟(I)中，堿性溶液為0.4%的NaOH溶液。
[0016]所述步驟(2)中，滅菌溫度為85°C，30min。
[0017]所述步驟(3)中，加入蚯蚓絲氨酸蛋白酶的量為稱取預(yù)處理后的原料重量的2%。。
[0018]所述步驟(4)中，PH控制在7.0，保溫水解的溫度為40°C，水解時間6.5小時，滅活溫度為80°C。
[0019]所述步驟(5)中，所述超濾設(shè)備為管式抗污染膜，孔徑為10000道爾頓，經(jīng)過5-20倍連續(xù)洗濾，獲得高純度溶液至含鹽量低于0.1%后，即得到精制的膠原蛋白溶液。
[0020]所述步驟(6)中，所述干燥采用冷凍干燥，凍干的時間為48_72h。
[0021]本發(fā)明方法的積極效果如下:
(1)收率高:本發(fā)明的方法在萃取豬肺膠原蛋白時，用堿溶液預(yù)處理可以除去豬肺中的脂肪、污潰、雜質(zhì)，同時使豬肺結(jié)締組織的體積至少膨脹百分之五十而形成一膨脹結(jié)締組織，不僅有助于膠原蛋白的萃取，以提高膠原蛋白的產(chǎn)率，還有助于去除纖維蛋白組織，以提高膠原蛋白的純度，膠原蛋白純度達(dá)到95%以上，每公斤豬肺可提取22-25克，收率達(dá)到70%以上，提高豬肺的生物利用價值；
(2)品質(zhì)好:本發(fā)明創(chuàng)造性的利用蚯蚓絲氨酸蛋白酶作為酶法制備膠原蛋白的酶原，其水解效率顯著提高，這些可以從水解后的肽含量(達(dá)到80%以上)等其他數(shù)據(jù)上看出，其明顯高于其他已知酶類；其成品分子量小，活性高，更易于人體吸收；
(3)制備時間短:本發(fā)明采用超濾技術(shù)可以將純化時間縮短到幾小時，而傳統(tǒng)的酸解法和酶解法提取純化時間需要3天，甚至一周以上。
[0022](4)應(yīng)用廣泛:本發(fā)明涉及的膠原蛋白適用于生物醫(yī)學(xué)研究，也適合做醫(yī)療器械產(chǎn)品，還可以應(yīng)用于體細(xì)胞的三維培養(yǎng)；也可以作為細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
【主權(quán)項】
1.一種利用豬肺制備膠原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)預(yù)處理:將豬肺清洗干凈絞碎成肺漿，加入0.2%-0.4%的堿性溶液進(jìn)行浸泡20-40min，待用； (2)稱取一定量的預(yù)處理后的原料，按照物料比l:2(w/v)-l:4(w/v)加入去離子水，80-85°C滅菌 30-40min，冷卻至 40°C ； (3)按稱取預(yù)處理后的原料重量的0.1-0.3%加入蚯蚓絲氨酸蛋白酶； (4 )酶解工藝條件控制:PH控制在6.5-8.0，37-42 V保溫水解6_7h，80-85 V滅活30min,然后離心過濾,取過濾清液； (5)使用截留分子量為10000道爾頓的超濾設(shè)備進(jìn)行超濾，并補加純化水使超濾更加完全，取透出液； (6 )將透出液進(jìn)行干燥，得到膠原蛋白。
2.如權(quán)利要求1中所述的利用豬肺制備膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述堿性溶液為0.4%的NaOH溶液。
3.如權(quán)利要求1中所述的利用豬肺制備膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟(2)中，滅菌溫度為85°C，30min。
4.如權(quán)利要求1中所述的利用豬肺制備膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟(3)中，力口入蚯蚓絲氨酸蛋白酶的量為稱取預(yù)處理后的原料重量的2%。。
5.如權(quán)利要求1中所述的利用豬肺制備膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟(4)中，PH控制在7.0，保溫水解的溫度為40°C，水解時間6.5小時，滅活溫度為80°C。
6.如權(quán)利要求1中所述的利用豬肺制備膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟(5)中，所述超濾設(shè)備為管式抗污染膜，孔徑為10000道爾頓，經(jīng)過5-20倍連續(xù)洗濾，獲得高純度溶液至含鹽量低于0.1%后，即得到精制的膠原蛋白溶液。
7.如權(quán)利要求1中所述的利用豬肺制備膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟(6)中，所述干燥采用冷凍干燥，凍干的時間為48-72h。
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用豬肺制備膠原蛋白的方法，包括豬肺堿液預(yù)處理、滅菌、生物酶解、超濾膜分離濃縮和冷凍干燥五個工藝步驟，大大節(jié)省提取和純化的時間，并且收率可以達(dá)到90%以上，本發(fā)明所提供的方法所生產(chǎn)的膠原蛋白分子量均勻分布，純度高，分子量小，活性高，更易于人體吸收；本發(fā)明利用豬肺制備膠原蛋白的方法的整個工藝過程條件溫和，對環(huán)境友好。
【IPC分類】C07K1-34, C07K14-78, C12P21-06
【公開號】CN104561203
【申請?zhí)枴緾N201410760685
【發(fā)明人】鄧小玲, 寧發(fā)子
【申請人】重慶都好生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月12日