專利名稱：：新組合物、方法及應用的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一類具有白蛋白結(jié)合親和性的工程化多肽。還涉及新的方法及應用，其采用這些及其它化合物與白蛋白在不同環(huán)境中的結(jié)合，其中一些具有治療哺乳動物包括人類的疾病的意義。背景血清白蛋白血清白蛋白是哺乳動物血清中最豐富的蛋白質(zhì)(40g/l;人類中大約0.7mM)，其功能之一是結(jié)合諸如脂質(zhì)和膽紅素的分子(PetersT，AdvancesinProteinChemistry37:161,1985)。血清白蛋白的半衰期與動物大小直接成比例，其中例如人血清白蛋白(HSA)半衰期是19天，兔血清白蛋白半衰期是大約5天(McCurdyTRetal，JLabClinMed143:115,2004)。人血清白蛋白在體內(nèi)廣泛分布，特別是在腸道和血液區(qū)室內(nèi)，其中其主要參與維持摩爾滲透壓濃度。結(jié)構(gòu)上，白蛋白是單鏈蛋白，包含3個同源結(jié)構(gòu)域，總共584或585個氨基酸(DugaiczykLetal，ProcNatlAcadSciUSA79:71,1982)。白蛋白含有17個二硫橋和一個反應硫醇C34，但是缺少N-連接和0-連接碳水化合物部分(Peters,1985，supra;NicholsonJPetal，BrJAnaesth85:599，2000)。缺少糖基化簡化了白蛋白的重組表達。白蛋白的這一性質(zhì)與其三維結(jié)構(gòu)是已知的的事實(HeXMandCarterDC，Nature358:2091992)—起使其成為有吸引力的候選物而用于重組融合蛋白。這種融合蛋白通常組合治療蛋白(其在給予該蛋白本身時會迅速從身體內(nèi)清除)和血漿蛋白(其顯示天然的慢清除)在一個多肽鏈中(SheffieldWP，CurrDrugTargetsCardiovacsHaematolDisord1:1,2001)。這種融合蛋白可提供臨床益處，注射頻率降低，體內(nèi)治療蛋白水平更高。與HSA的融合或締合導致增加的蛋白質(zhì)體內(nèi)半衰期血清白蛋白缺少任何酶學或免疫學功能，因此當與生物活性多肽偶聯(lián)時應該不顯示不希望的副作用。另外，HSA是天然載體，參與內(nèi)源轉(zhuǎn)運和輸送各種天然和治療分子(SellersEMandKoch-WeserMD，AlbuminStructure，F(xiàn)unctionandUses,edsRosenoerVMetal，Pergamon，Oxford,p159,1977)。已報道幾種策略以將蛋白質(zhì)直接共價偶聯(lián)至血清白蛋白或者偶聯(lián)至允許體內(nèi)締合血清白蛋白的肽或蛋白質(zhì)。后一途徑的例子已在例如W091/01743，W001/45746及Dennisetal，JBiolChem277:35035-43(2002)中描述。第一個文件描述了衍生自鏈球菌蛋白G(SpG)的白蛋白結(jié)合肽或蛋白質(zhì)的應用，用于增加其它蛋白質(zhì)的半衰期。其中的觀點是將細菌衍生的白蛋白結(jié)合肽/蛋白質(zhì)與已顯示在血液中快速清除的治療感興趣肽/蛋白質(zhì)融合。由此產(chǎn)生的融合蛋白結(jié)合體內(nèi)血清白蛋白并從其更長的半衰期獲益，其增加了融合的治療感興趣肽/蛋白質(zhì)的凈半衰期。W001/45746及Dermis"al涉及同一概念，但是作者利用相對短的肽結(jié)合血清白蛋白。所述肽選自噬菌體展示的肽文庫。在De皿isetal中，早期工作被提及，其中發(fā)現(xiàn)了對鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人補體受體1型的重組融合體的免疫學應答的增強。US專利申請US2004/0001827(Dermis)也披露了使用包含肽配體的構(gòu)建體，其也由肽展示技術(shù)鑒別，其結(jié)合血清白蛋白及綴合生物化學化合物用于腫瘤靶向。與HSA締合導致降低的免疫原性除了對生物學活性蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期的作用之外，還提示生物學活性蛋白質(zhì)和白蛋白結(jié)合蛋白之間的融合體的與白蛋白的非共價締合降低對生物學活性蛋白的免疫應答。因此，在W02005/097202中，描述了用這一原理降低或消除對生物學活性蛋白的免疫應答。細菌受體蛋白質(zhì)的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域鏈球菌蛋白G(SpG)是存在于一些鏈球菌菌株的表面上的雙功能受體，能結(jié)合IgG和血清白蛋白(Bj6rcketal，MoIImmunol24:1113,1987)。所述結(jié)構(gòu)高度重復，具有幾個結(jié)構(gòu)和功能不同的結(jié)構(gòu)域(Gussetal，EMBOJ5:1567，1986)，更精確3個Ig結(jié)合基序和3個血清白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Olssonetal，EurJBiochem168:319,1987)。3個血清白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一的結(jié)構(gòu)已確定，顯示三螺旋束結(jié)構(gòu)域(Kraulisetal，F(xiàn)EBSLett378:190,1996)。這一基序命名為ABD(白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，大小為46個氨基酸殘基。在文獻中，其也被稱為G148-GA3。除了來自鏈球菌的蛋白G之外的其它細菌白蛋白結(jié)合蛋白也已經(jīng)鑒別，其含有類似于蛋白G的白蛋白結(jié)合三螺旋結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域。這種蛋白的例子是PAB，PPL，MAG和ZAG蛋白。這種白蛋白結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究已經(jīng)進行和報道，例如Johansson和同事(Johanssonetal，JMolBiol266:859-865,1997Johanssonetal，JBiolChem277:8114-8120，2002)，其引入了命名"GA模塊"(蛋白G相關白蛋白結(jié)合模塊)，針對負責白蛋白結(jié)合的三螺旋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。另外，Rozaketal報道了產(chǎn)生GA模塊的人工變體，其被選擇和研究不同物種特異性和穩(wěn)定性(Rozaketal，Biochemistry45:3263-3271，2006)。在本說明書中，使用Johanssonetal和Rozaketal文章中建立的對來自不同細菌物種的GA模塊的術(shù)語。除了上述含有三螺旋的蛋白質(zhì)之外，存在結(jié)合白蛋白的其它細菌蛋白質(zhì)。例如，命名為"M蛋白"的鏈球菌蛋白質(zhì)家族包含結(jié)合白蛋白的成員(參見Navarre&Schneewind，匪BR63:174-229，1999中的表2)。非限制性例子是蛋白質(zhì)Ml/Emml，M3/Emm3，M12/Emml2，EmmL55/Emm55，Emm49/EmmL49和H。新生Fc受體(FcRn)介導的HSA的胞轉(zhuǎn)MHC1類新生Fc受體(FcRn)介導白蛋白和IgG的細胞運輸和再循環(huán)(Brambelletal，Nature203:1352，1964;Chaudhuryetal，JExpMed197:315,2003)。FcRn也稱為Brambell受體，在低內(nèi)體pH特異結(jié)合白蛋白和IgG，因此通過轉(zhuǎn)運至細胞表面并在中性pH釋放而保護胞飲蛋白免于溶酶體降解。FcRn在pH5-6對白蛋白和IgG有良好親和性，而在中性pH顯示差的至無親和性。以此方式，白蛋白和IgG的濃度和半衰期被調(diào)節(jié)。另外，F(xiàn)cRn負責主動轉(zhuǎn)運白蛋白和IgG穿過細胞屏障，例如氣道的表皮和覆蓋腸道和胎盤的內(nèi)皮。如從背景描述不同段落證明的，提供選擇具有對白蛋白的高親和性的多肽是開發(fā)各種生物醫(yī)學、生物技術(shù)和其它應用的關鍵因素，因此現(xiàn)有技術(shù)需要額外的這種多肽分子。發(fā)明公開本發(fā)明第一方面滿足了對具有相當高的白蛋白親和性的新多肽的需求，其是通過10提供包含白蛋白結(jié)合基序的白蛋白結(jié)合多肽而滿足，所述基序由如下氨基酸序列組成GVSDX5YKX8X9IXUX12AX14TVEGVX2。ALX23X24X25I其中各自獨立地，X5選自Y和F;X8選自N，R禾口S;Xg選自V，I，L，M，F(xiàn)禾口Y;Xu選自N，S，E禾口D;X12選自R，K禾口N;X14選自K禾口R;X加選自D，N，Q，E，H，S，R禾口K;X23選自K，I禾口T;乂24選自A，S，T，G，H，L禾口D;禾口X25選自H，E禾口D;條件是所述氨基酸序列不是GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI;所述白蛋白結(jié)合多肽結(jié)合白蛋白，從而相互作用的KD值最大為1X10—9M。本發(fā)明的序列相關的白蛋白結(jié)合多肽種類的上述定義是基于大量如下實驗章節(jié)詳細描述的鑒別和鑒定的白蛋白結(jié)合多肽的統(tǒng)計學分析。變體選自親代多肽序列或"骨架"的隨機變體的大集合，所述選擇基于在例如噬菌體展示或其它選擇實驗中與白蛋白的相互作用。鑒別的白蛋白結(jié)合基序或"ABM"相應于親代骨架的白蛋白結(jié)合區(qū)，所述區(qū)域組成三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的2個a螺旋。盡管親代骨架中的2個ABM螺旋的原始氨基酸殘基已經(jīng)組成結(jié)合表面用于與白蛋白相互作用，該結(jié)合表面根據(jù)本發(fā)明通過取代修飾以提供另外的白蛋白結(jié)合能力。本領域技術(shù)人員會認識到任何多肽的功能，例如本發(fā)明多肽的白蛋白結(jié)合能力，依賴于多肽的三級結(jié)構(gòu)。因此可以對多肽的氨基酸序列進行小改變而不影響其功能。因此，本發(fā)明涵蓋了ABM的修飾變體，它們使得白蛋白結(jié)合特征被保留。例如，可以將屬于某一功能組的氨基酸殘基(例如疏水性、親水性、極性等)的氨基酸殘基用來自相同功能組的另一A氨基酸交換。-方面的多肽的一-方面的多肽的一一個實施方案中，X9是L。一個實施方案中，Xn選自N和S，并且可以特別是N。一個實施方案中，X12選自R和K，例如X12是R或X12是K。在本發(fā)明這-在本發(fā)明這-在本發(fā)明這-在本發(fā)明這-在本發(fā)明這--個實施方案中，Xs是Y。-個實施方案中，&選自N和R，并且可以特別是R。-方面的多肽的--方面的多肽的--方面的多肽的-在本發(fā)明這-在本發(fā)明這-以特別是E。在本發(fā)明這-在本發(fā)明這--方面的多肽的--方面的多肽的--方面的多肽的--方面的多肽的--個實施方案中，A-個實施方案中，A-個實施方案中，&-個實施方案中，&是K。選自D，N，Q，E，H，S和R，并且可選自K和I，并且可以特別是K。選自A，S，T，G，H禾口L。在本發(fā)明這一方面的多肽的一個更具體的實施方案中，X24是L。在本發(fā)明這一方面的多肽的一個甚至更具體的實施方案中，X23X24是KL。在本發(fā)明這一方面的多肽的另一個甚至更具體的實施方案中，X23X24是TL。在本發(fā)明這一方面的多肽的一個實施方案中，XM選自A，S，T，G和H。在本發(fā)明這一方面的多肽的一個更具體的實施方案中，X24選自A，S，T，G和H，以及L是I。在本發(fā)明這一方面的多肽的一個實施方案中，X25是H。如以下實驗章節(jié)詳述，白蛋白結(jié)合變體的選擇導致鑒別大量的各個白蛋白結(jié)合基序(ABM)序列。這些序列組成了本發(fā)明這一方面的白蛋白結(jié)合多肽的定義中的ABM序列的各個實施方案。各個白蛋白結(jié)合基序的序列如圖l和SEQIDNO:1-257所示。在本發(fā)明的白蛋白結(jié)合多肽的一些實施方案中，ABM由選自SEQIDNO:1-257的氨基酸序列組成。在本發(fā)明這一方面的一個更具體的實施方案中，ABM序列選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDN0:9、SEQIDNO:15、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:46、SEQIDNO:49、SEQIDN0:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDN0:155、SEQIDNO:239、SEQIDNO:240、SEQIDN0:241、SEQIDNO:242、SEQIDNO:243、SEQIDNO:244禾卩SEQIDNO:245。在本發(fā)明這一方面的更具體的實施方案中，ABM序列選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:53和SEQIDNO:239。在本發(fā)明實施方案中，ABM可形成三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域的部分。例如，ABM可基本上組成或形成所述三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的具有互連環(huán)的兩個a螺旋。在本發(fā)明的特定實施方案中，這種三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域選自由細菌受體蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)域組成的組。這種細菌受體蛋白的非限制性例子可以選自由來自鏈球菌、消化鏈球菌和Finegoldia的物種的白蛋白結(jié)合受體蛋白組成的組，例如選自由蛋白G、MAG、ZAG、PPL和PAB組成的組。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，ABM形成蛋白G例如來自鏈球菌菌株G148的蛋白G的部分。在這一實施方案的不同變體中，ABM形成其部分的三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域選自由來自鏈球菌菌株G148的蛋白G的結(jié)構(gòu)域GA1、結(jié)構(gòu)域GA2和結(jié)構(gòu)域GA3組成的組，特別是結(jié)構(gòu)域GA3。在其它實施方案中，ABM形成來自金黃色葡萄球菌的細菌受體蛋白蛋白A的5個三螺旋結(jié)構(gòu)域的一或多個的部分，即所述三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域選自由蛋白A結(jié)構(gòu)域A、B、C、D和E組成的組。在其它相似實施方案中，ABM形成衍生自來自金黃色葡萄球菌的蛋白A的結(jié)構(gòu)域B的蛋白Z的部分。在本發(fā)明的實施方案中，其中ABM"形成三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域的部分"，是指ABM的序列"插入"或"移植"到天然發(fā)生的(或原始的)三螺旋束結(jié)構(gòu)域的序列之中或之上，從而ABM置換原始結(jié)構(gòu)域中相似的結(jié)構(gòu)基序。例如，不希望受理論束縛，ABM被認為組成三螺旋束的三個螺旋中的兩個，因此可以置換任何三螺旋束內(nèi)的這種兩個螺旋基序。如本領域技術(shù)人員理解，由兩個ABM螺旋置換三螺旋束結(jié)構(gòu)域的兩個螺旋應該不影響多肽的基本結(jié)構(gòu)而進行。即，本發(fā)明的這一實施方案的多肽的Ca骨架的整體折疊與其形成部分的三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域的整體折疊基本上相同，例如具有相同順序的相同二級結(jié)構(gòu)元件等。因此，如果本發(fā)明這一實施方案的多肽與原始結(jié)構(gòu)域具有相同折疊，則本發(fā)明的ABM"形成"三螺旋束結(jié)構(gòu)域的"部分"，提示基本結(jié)構(gòu)性質(zhì)被共享，所述性質(zhì)例如產(chǎn)生相似的CD譜。技術(shù)人員了解相關的其它參數(shù)。在本發(fā)明的一個實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽是三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域，其包含上述白蛋白結(jié)合基序和構(gòu)成三螺旋構(gòu)型的其余部分的額外序列。因此，本發(fā)明提供了白蛋白結(jié)合多肽，其包含如下氨基酸序列LAEAKXaXbAXcXdELXeKY_[ABM]-LAALP射[ABM]是上述定義的白蛋白結(jié)合基序，以及，各自獨立地，Xa選自V禾口E;Xb選自L，E和D;Xc選自N，L禾口I;&選自R和K;及Xe選自D和K。在這個多肽的一個實施方案中，Xa是V。在這個多肽的一個實施方案中，Xb是L。在這個多肽的一個實施方案中，X。是N。在這個多肽的一個實施方案中，Xd是R。在這個多肽的一個實施方案中，&是D。同樣，如以下實驗章節(jié)詳述，大量白蛋白結(jié)合變體的選擇和測序?qū)е妈b別各個白蛋白結(jié)合多肽序列。這些序列組成了本發(fā)明第一方面的上述實施方案的白蛋白結(jié)合多肽的各個實施方案。這些白蛋白結(jié)合多肽各自的序列在圖l和SEQIDNO:257-514中示出。本發(fā)明還涵蓋具有與選自SEQIDNO:257-514的序列具有85%或更大相同性的氨基酸序列的白蛋白結(jié)合多肽。在具體的實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽的序列選自SEQIDN0:247，SEQIDN0:248，SEQIDN0:254，SEQIDN0:260，SEQIDN0:270，SEQIDN0:272，SEQIDNO:291，SEQIDNO:294，SEQIDNO:298，SEQIDNO:299，SEQIDNO:300，SEQIDNO:400，SEQIDNO:484，SEQIDNO:485，SEQIDNO:486，SEQIDNO:487，SEQIDNO:488，SEQIDNO:489和SEQIDNO:490以及與其有85%或更大相同性的序列。在本發(fā)明這一方面的更具體的實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽的序列選自SEQIDNO:248，SEQIDNO:298和SEQIDNO:484以及與其有85%或更大相同性的序列。如以上證明，除了氨基酸序列選自SEQIDNO:257-514或其亞集的多肽之外，本發(fā)明還涵蓋其變體。這種涵蓋的變體的氨基酸序列與SEQIDNO:257-514相比僅顯示小差異。這種變體的一個定義見上述，及具有與選自SEQIDNO:257-514的序列有至少85%相同性的氨基酸序列的白蛋白結(jié)合多肽。在一些實施方案中，本發(fā)明多肽可具有與選自SEQIDNO:257-514的序列至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的序列。比較可以在相應于被比較的序列的最短者的窗口進行，或者在相應于在被比較的序列的至少一種中的白蛋白結(jié)合基序的窗口進行。術(shù)語"白蛋白結(jié)合"和"對白蛋白的結(jié)合親和性"在本說明書中是指多肽的性質(zhì)，其可以例如用表面等離子體共振技術(shù)如在Biacore儀器中被測試。例如如下述實施例所述，白蛋白結(jié)合親和性可以在實驗中測試，其中白蛋白或其片段固定化在儀器的傳感器芯片上，含有被測多肽的樣品通過芯片?；蛘?，被測多肽固定化在儀器的傳感器芯片上，含有白蛋白或其片段的樣品通過芯片。白蛋白可以是來自哺乳動物的血清白蛋白，如人血清白蛋白。技術(shù)人員可以然后解釋這種實驗獲得的結(jié)果以建立多肽對白蛋白的結(jié)合親和性的至少一種定性測量。如果希望定性測量，例如確定相互作用的KD值，也可以使用表面等離子體共振方法。結(jié)合值可以例如在Biacore2000儀器(BiacoreAB)中限定。白蛋白被適當?shù)毓潭ɑ跍y量的傳感器芯片上，待確定親和性的多肽的樣品用系列稀釋制備并以隨機順序注射。然后可用例如由儀器廠商提供的BIAevaluation4.1軟件的1:lLangmuir結(jié)合模型從結(jié)果計算KD值(BiacoreAB)。根據(jù)本發(fā)明的第一方面的白蛋白結(jié)合多肽結(jié)合白蛋白，從而相互作用的K。值是最多1X10—l即lnM。在一些實施方案中，相互作用的K。值是最多1X10—"M，如最多1X10—"M，例如最多1X10—12M。在本發(fā)明的一個實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽結(jié)合的白蛋白是人血清白蛋白。本發(fā)明也涵蓋了上述白蛋白結(jié)合多肽，其進一步包含位于白蛋白結(jié)合基序的一側(cè)或兩側(cè)的一或多個額外氨基酸。這些額外氨基酸殘基可起增強多肽對白蛋白的結(jié)合的作用，但是可有其它目的，相關于例如生產(chǎn)、純化、體內(nèi)或體外穩(wěn)定化、多肽的偶聯(lián)或檢測及其任意組合。這種額外的氨基酸殘基可包含一或多個添加的氨基酸殘基，用于化學偶聯(lián)于例如層析樹脂的目的，以獲得親和基質(zhì)，或者偶聯(lián)于螯合部分以與金屬放射核素復合。一個例子是在多肽鏈的第一個或最后一個位置添加半胱氨酸殘基，及在N或C端。這種額外的氨基酸殘基也可以包含"標記(tag)"用于純化或檢測多肽，如六組氨酸(His6)標記或"myc"("c-myc")標記或"FLAG"標記用于與特異于該標記的抗體相互作用。技術(shù)人員了解其它替代方式。上述"額外的氨基酸殘基"也可組成具有任何希望功能的一或多個多肽結(jié)構(gòu)域，如與第一個白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域相同結(jié)合功能，或者另一種結(jié)合功能，或者治療功能，或酶功能，或熒光功能，或其混合物。本發(fā)明的這種多肽中的連接的多肽"單位"可以用已知有機化學方法共價偶聯(lián)而連接，或者在多肽的重組表達系統(tǒng)中表達為一或多個融合多肽，或者以任何其它方式連接，直接連接或由包含一些氨基酸的接頭介導連接。另外，本發(fā)明這一方面還涵蓋保留白蛋白結(jié)合的白蛋白多肽的片段。產(chǎn)生具有保留的結(jié)合特異性的野生型三螺旋結(jié)構(gòu)域的片段的可能性由BraistedACetal在ProcNatlAcadSciUSA93:5688-5692(1996)中示出。在該論文中描述的實驗中，使用基于結(jié)構(gòu)的設計及噬菌體展示方法，59個殘基的三螺旋束的結(jié)合結(jié)構(gòu)域被降低為33個殘基的產(chǎn)生的二螺旋衍生物。這通過逐步選擇來自不同區(qū)域的隨機突變而實現(xiàn)，其槽中穩(wěn)定性和結(jié)合親和性迭代改良。基于相同理由，用本發(fā)明的多肽，技術(shù)人員能獲得"最小化"白蛋白結(jié)合多肽，其具有與"親代"白蛋白結(jié)合多肽相同的結(jié)合性質(zhì)。因此，組成本發(fā)明的多肽的片段并基本上保留白蛋白結(jié)合的多肽屬于本發(fā)明范圍。作為非限制性例子，片段可以相應于上述白蛋白結(jié)合多肽，其是N-末端截短的。這種截短可例如是l-3個氨基酸。如上所述，本發(fā)明還涵蓋具有對白蛋白的親和性的多肽的多聚體，即包含至少二個白蛋白結(jié)合多肽或其片段作為單體單位的多肽鏈?？赡芨信d趣的是例如在白蛋白的純化方法中或者在利用白蛋白結(jié)合功能的治療方法中，用本發(fā)明的一個多肽獲得甚至更強的白蛋白結(jié)合是可能的。在這種情況中，提供多聚體如二聚體、三聚體或四聚體多肽可提供必需的親合力作用。多聚體可由合適數(shù)目的本發(fā)明多肽組成。本發(fā)明的這些多肽結(jié)構(gòu)域在這種多聚體中形成單體，可以全部具有相同的氨基酸序列，但是也可能它們具有不同的氨基酸序列。如上所述，在本發(fā)明的多聚體中的連接的多肽"單位"可使用已知的有機化學方法通過共價偶聯(lián)連接，或者在用于多肽的重組表達的系統(tǒng)中表達為一或多個融合多肽，或者以任何其它方式連接，直接連接或由包含一些氨基酸的接頭介導。另外，"異種"融合多肽或蛋白或綴合物也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中本發(fā)明的白蛋白結(jié)合多肽或其片段或多聚體組成第一個結(jié)構(gòu)域或第一個部分，第二個和進一步的部分具有非結(jié)合白蛋白的其它功能。在這種蛋白質(zhì)中的融合多肽或綴合物的第二個和進一步的部分合適地具有希望的生物學活性。這種希望的生物學活性的非限制性例子包括治療活性，結(jié)合活性和酶活性。在本發(fā)明這個方面的一些實施方案中，第二個部分和任何進一步的部分選自如下一組GLP-1(胰高血糖素樣肽1);HGH(人生長激素)；G-CSF(粒細胞集落剌激因子)；IL-1受體激動劑(白介素1受體激動劑)；TNF-a腫瘤壞死因子a);和凝血因子VII、VIII、IX和X。在其他實施方案中，所述第二個和任何進一步的部分選自能與靶分子選擇性相互作用(結(jié)合)的結(jié)合部分，所述靶分子典型地是除白蛋白之外的靶分子，盡管白蛋白不除外。這種結(jié)合部分合適地選自如下一組抗體及其基本上保留抗體結(jié)合活性的片段和結(jié)構(gòu)域；微體，maxybodies，高親合性多聚體(avimer)及其他小的含二硫鍵蛋白質(zhì)；及衍生自選自如下一組骨架的結(jié)合蛋白，所述的組由如下組成葡萄球菌蛋白A及其結(jié)構(gòu)域；lipocalins，錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Y晶體，綠色熒光蛋白，人細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4，蛋白酶抑制劑，PDZ結(jié)構(gòu)域，肽適體(即tamer)，葡萄球菌核酸酶，tendamistats，纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域，鋅指，芋螺毒素和Kunitz結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一些實施方案中，用于結(jié)合所述靶結(jié)合部分的靶分子選自如下一組AP肽；其他疾病相關淀粉樣肽；毒素，如細菌毒素和蛇毒；凝血因子，如vonWillebrand因子；白介素，如IL-13;肌抑素(myostatin);促炎因子，如TNF-a，TNF-a受體和IL-8;補體因子，如C3a和C5a;過敏介質(zhì)，如組胺和IgE;腫瘤相關抗原，如CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD40，CD52，CD70，cMet，HER1，HER2，HER3，HER4，CA9，CEA，IL-2受體，MUC1，PSMA，TAG-72。產(chǎn)生融合多肽或綴合物的其它可能性也包括在內(nèi)。因此，本發(fā)明第一方面的白蛋白結(jié)合多肽可以共價偶聯(lián)于第二個或進一步的部分，其除了靶結(jié)合之外或代替靶結(jié)合展示其它功能。一個例子是一或多個白蛋白結(jié)合多肽與作為報道或效應部分的酶學活性多肽的融合?？膳c白蛋白結(jié)合多肽偶聯(lián)形成然后對比的報道酶的例子是技術(shù)人員已知的并包括酶如e-半乳糖苷酶，堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，羧基肽酶。本發(fā)明的融合多肽或綴合物的第二個和進一步的部分的其它選擇還非限制性包括熒光多肽如綠色熒光蛋白，紅色熒光蛋白，螢光素酶及其變體。對于摻入本發(fā)明的白蛋白結(jié)合多肽的融合蛋白或綴合物的以上描述，應注意第一個、第二個和進一步的部分的命名是為清楚起見，以區(qū)分本發(fā)明的白蛋白結(jié)合多肽和具有其它功能的部分。這些命名不是指不同結(jié)構(gòu)域在融合蛋白或綴合物的多肽鏈中的實際順序。因此，例如所述第一個部分不加限制地出現(xiàn)在融合蛋白或綴合物的N-末端，在中部或者在C-末端。本發(fā)明還涵蓋這樣的多肽，其中上述白蛋白結(jié)合多肽已被提供標記，如選自由熒15光染料和金屬、生色染料、化學發(fā)光化合物及生物發(fā)光蛋白、酶、放射性核素和顆粒組成的組，例如用于體外或體內(nèi)檢測多肽。本發(fā)明的相關方面提供了編碼上述多肽的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的表達載體及包含所述表達載體的宿主細胞。本發(fā)明的后三個方面是產(chǎn)生本發(fā)明多肽的工具，鑒于本文的有關待表達多肽的信息以及蛋白質(zhì)重組表達領域的當前技術(shù)水平，技術(shù)人員無需過多負擔即能夠獲得它們并將它們用于實際應用。因此，本發(fā)明的其它相關方面是產(chǎn)生本發(fā)明第一方面的多肽的方法，包括表達本文所述的多核苷酸，例如通過將本文所述宿主細胞在允許從表達載體表達多肽的條件下培養(yǎng)，以及分離多肽。如背景部分描述以及本領域技術(shù)人員熟知，具有對白蛋白的結(jié)合親和性的多肽分子的可能應用有幾種。本發(fā)明的白蛋白結(jié)合多肽以及其片段、多聚體和融合蛋白或綴合物可以用于任一或多種這些應用中。作為上述白蛋白結(jié)合多肽的應用的非限制性例子，本發(fā)明在另一方面提供了本發(fā)明第一方面的白蛋白結(jié)合多肽與具有希望的生物學活性(如上定義)的多肽的融合蛋白或綴合物在制備藥物中的應用，所述藥物顯示比具有希望的生物學活性的多肽的體內(nèi)半衰期更長的體內(nèi)半衰期。換句話說，本發(fā)明提供了延長具有希望的生物學活性的多肽的體內(nèi)半衰期的方法，其通過將這種多肽與本發(fā)明第一方面的白蛋白結(jié)合多肽融合或綴合進行。對于白蛋白結(jié)合分子的這一應用的細節(jié)，參見例如PCT申請W091/01743和W001/45746，其引入本文作參考。作為另一個應用的非限制性例子，本發(fā)明在另一方面提供了本發(fā)明第一方面的白蛋白結(jié)合多肽與具有希望的生物學活性(如上定義)的多肽的融合蛋白或綴合物在制備藥物中的應用，與給予哺乳動物具有希望的生物學活性的多肽本身所引起的免疫應答相比，所述藥物在給予哺乳動物時不引起或引起降低的免疫應答。換句話說，本發(fā)明提供了降低具有希望的生物學活性的多肽的免疫原性的方法，，其通過將這種多肽與本發(fā)明第一方面的白蛋白結(jié)合多肽融合或綴合進行。對于白蛋白結(jié)合分子的這一應用的細節(jié)，參見例如PCT申請W02005/097202，其引入本文作參考。本發(fā)明另一系列方面設計提供新手段，增加可溶性差的化合物的水溶解度，其通過與白蛋白結(jié)合多肽偶聯(lián)而進行。可溶性差的化合物與白蛋白結(jié)合多肽的復合物能夠與白蛋白體內(nèi)或體外締合，所述締合增加水溶解度?？捎帽景l(fā)明增加水溶解度的化合物的例子可典型地包括用于癌癥化療的可溶性差的細胞毒性劑。使用這一方法，例如在藥物組合物的配制中，使得能凍干所得制劑，然后其可以在水溶液中重配。另外，本發(fā)明這些方面提供了與化合物本身相比具有降低的聚集傾向的制劑。因此，本發(fā)明另一方面提供了組合物，其包含化合物，其本身在水中溶解度不超過100iig/ml;該化合物偶聯(lián)于白蛋白結(jié)合多肽，其具有對白蛋白的親和性，從而所述相互作用的K。不超過1X10—6M。在一個實施方案中，化合物本身具有不超過10iig/ml、如不超過liig/ml的水中溶解度。在一個實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽具有對白蛋白的親和性，從而所述相互作用的KD不超過1X10—7M，如不超過1X10—8M，例如不超過1X10—9M，如不超過1X10—1QM，如不超過1X10—"M，例如不超過1X10—12M。在一些實施方案中，化合物可以是藥物活性化合物，例如細胞毒性劑。細胞毒性劑的非限制性例子是選自calicheamycin，auhstatin，阿霉素、maytansinoid、紫杉醇、ecteinascidin、格爾德霉素及其衍生物以及其組合的那些?；蛘?，細胞毒性劑可以是非衍生自天然發(fā)生的化合物的合成的化學毒素?；衔锖桶椎鞍捉Y(jié)合多肽可以非共價締合，但是其優(yōu)選是共價偶聯(lián)在一起。本發(fā)明這個方面的組合物包含白蛋白結(jié)合多肽。在一個實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽是天然發(fā)生的多肽或其白蛋白結(jié)合片段或衍生物。白蛋白結(jié)合多肽可以作為非限制性例子選自由白蛋白結(jié)合蛋白Ml/Emml、M3/Emm3、Ml2/Emml2、EmmL55/Emm55、Emm49/EmmL49、H、G、MAG、ZAG、PPL和PAB組成的組。在更具體的實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽是鏈球菌蛋白G或其白蛋白結(jié)合片段或衍生物。在還更具體的實施方案中，能結(jié)合白蛋白的多肽選自由鏈球菌菌株G148的蛋白G的結(jié)構(gòu)域GA1、結(jié)構(gòu)域GA2和結(jié)構(gòu)域GA3組成的組，因此可例如是GA3結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽包含大約5至大約214個氨基酸殘基，如大約5至大約46個氨基酸殘基，例如大約10至大約20個氨基酸殘基。在本發(fā)明這個方面的另一個實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽包含選DICLPRWGCLW、DLCLRDWGCLW和DICLARWGCLW的氨基酸序列。在本發(fā)明這些方面的另一個實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽包含本發(fā)明第一方面的任一白蛋白結(jié)合多肽，即通過其白蛋白結(jié)合基序定義一類新的白蛋白結(jié)合多肽的本發(fā)明的方面。在本發(fā)明這些方面的另一個實施方案中，白蛋白結(jié)合多肽能與人血清白蛋白的至少一個、優(yōu)選全部殘基F228、A229、A322、V325、F326和M329相互作用，從而增強該分子與白蛋白的結(jié)合。例如，白蛋白結(jié)合多肽包括形成與人血清白蛋白中的M329殘基的相互作用的氨基酸殘基，從而增強該分子與白蛋白的結(jié)合。另外，或者，白蛋白結(jié)合多肽可包括一氨基酸殘基，其與人血清白蛋白結(jié)構(gòu)域IIB中的螺旋7形成相互作用，從而增強該分子與白蛋白的結(jié)合。另外，或者，白蛋白結(jié)合多肽可包括一氨基酸殘基，其與人血清白蛋白結(jié)構(gòu)域IIA中的殘基形成相互作用，從而增強該分子與白蛋白的結(jié)合。另外，或者，白蛋白結(jié)合多肽可包括一氨基酸殘基，其與人血清白蛋白的螺旋2或3之間的殘基形成相互作用，從而增強該分子與白蛋白的結(jié)合。除了可溶性差的化合物和白蛋白結(jié)合多肽之外，本發(fā)明這個方面的組合物在一些實施方案中還可包括具有對臨床相關靶的親和性的結(jié)合多肽。這一結(jié)合多肽適當?shù)夭煌诎椎鞍捉Y(jié)合多肽，并可以非共價或共價偶聯(lián)于本發(fā)明組合物的其它組分。作為非限制性例子，具有對臨床相關靶的親和性的結(jié)合多肽可以選自如下一組抗體及其基本上保留抗體結(jié)合活性的片段和結(jié)構(gòu)域；微體，maxybodies，高親合性多聚體及其他小的含二硫鍵蛋白質(zhì)；及衍生自選自如下一組骨架的結(jié)合蛋白，所述的組由如下組成葡萄球菌蛋白A及其結(jié)構(gòu)域；lipocalins，錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Y晶體，綠色熒光蛋白，人細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4，蛋白酶抑制劑，PDZ結(jié)構(gòu)域，肽適體(即tamer)，葡萄球菌核酸酶，tendamistats，纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域，鋅指，芋螺毒素和Kunitz結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明上述方面的組合物通過提供在白蛋白結(jié)合多肽組合物中而具有與白蛋白體內(nèi)或體外締合的能力。在一些情況中，可能有利的是形成與活生物體外的白蛋白的組合物復合物，即向組合物中加入外源白蛋白。因此，本發(fā)明還提供了上述組合物，其進一步包含白蛋白，如人血清白蛋白。本發(fā)明還提供了上述方面的組合物用作藥物，當化合物是治療活性化合物時。適當?shù)?，提供白蛋白結(jié)合多肽和任選地白蛋白不毀壞性影響活性化合物的治療功效，因此本發(fā)明組合物用于化合物本身適用的治療或預后情況中。本發(fā)明的相關方面提供了制備上述組合物的方法。所述方法包括提供化合物，所述化合物本身在水中溶解度不超過100g/ml;及將所述化合物與白蛋白結(jié)合多肽共價偶聯(lián)，所述多肽具有對白蛋白的親和性，從而所述相互作用的KD不超過IX10—6M，由此形成化合物與白蛋白結(jié)合多肽的共價復合物。在白蛋白被包括在組合物中的本發(fā)明的實施方案中，所述方法可有利地包括額外步驟，將化合物和白蛋白結(jié)合多肽的所述復合物與白蛋白混合，由此形成組合物，其包含i)化合物和白蛋白結(jié)合多肽的共價復合物和ii)白蛋白的非共價復合物。這一非共價復合物的兩種組分的相對比例可以例如是l:l，從而一個單位的可溶性差的化合物和白蛋白結(jié)合多肽的復合物與一個分子的白蛋白締合。在一個實施方案中，所述方法額外包括凍干所述非共價復合物以活動凍干的組合物。在另一個密切相關方面中，本發(fā)明提供了增加化合物的水溶解度的方法，包括提供化合物，所述化合物本身在水中溶解度不超過100iig/ml;將所述化合物與白蛋白結(jié)合多肽共價偶聯(lián)，所述多肽具有對白蛋白的親和性，從而所述相互作用的K。不超過1X10—、，由此形成化合物與白蛋白結(jié)合多肽的共價復合物；及在促進白蛋白結(jié)合多肽與白蛋白的非共價締合的條件下將化合物和白蛋白結(jié)合多肽的所述復合物與白蛋白混合；由此所述復合物中的化合物在水中的溶解度大于化合物本身在水中的溶解度。在關于可溶性差的化合物的溶解度的這些方法方面中，各種組分的任選特征如前述組合物方面所述。如上所述，本發(fā)明這些方面的實施方案特別涉及靶向都統(tǒng)與白蛋白結(jié)合多肽的組合，這一分子與例如化學毒素的綴合，以及配制和給予具有白蛋白的所得化學毒素綴合物以避免低溶解度問題?；瘜W毒素通常是疏水性化合物。因此，溶解度差是處理和配制化學毒素綴合物包括與化學毒素綴合的抗體的一個挑戰(zhàn)。當試圖將毒素分子簇與一個載體蛋白偶聯(lián)時這一問題加重了。相反，與白蛋白分子復合的化學毒素綴合的白蛋白結(jié)合融合蛋白具有源于白蛋白增溶性質(zhì)的優(yōu)異溶解度，這由白蛋白作為血漿中許多小分子的載體的作用而反映。本發(fā)明這些實施方案的一個方面是白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域與白蛋白的強締合以防止可能導致非締合的白蛋白結(jié)合蛋白綴合物的沉淀的其它相互作用。單克隆抗體從血液的緩慢外滲已經(jīng)被認為是限制抗體介導的療法的生物學屏障之一(WuandSenter，NatureBiotechnology23:1137-46,2005)。令人感興趣地，在平衡時，在人類中大約60%的血清白蛋白被發(fā)現(xiàn)在間隙中，而僅40%發(fā)現(xiàn)在血液中。因此，本發(fā)明提供的與白蛋白的締合被認為是獲得血液外廣泛分布的優(yōu)異手段。與血清白蛋白的締合的親和性合適地特征在于解離速率(復合物解體)足夠慢，從而僅微小部分的復合物在從血液轉(zhuǎn)運到間質(zhì)過程中解離。但是，相互作用不是必須是共價的，因為在轉(zhuǎn)運期間再結(jié)合是可能的。外滲和廣泛分布的一個可能貢獻機制是在血清白蛋白與FcRn受體結(jié)合后主動轉(zhuǎn)運。結(jié)果，為獲得相似分布，對白蛋白結(jié)合融合蛋白中的白蛋白結(jié)合部分有一定要求。例如，親和性在受體在細胞中轉(zhuǎn)運過程中遇到的酸性環(huán)境中可能在低至PH低于6的環(huán)境中也非常緊密。附圖簡述圖l是包含在本發(fā)明的白蛋白結(jié)合多肽中的白蛋白結(jié)合基序例子的氨基酸序列列表(SEQIDNO:1-257)，本發(fā)明白蛋白結(jié)合多肽例子的氨基酸序列列表(SEQIDNO:257-514)及來自鏈球菌菌株G148的蛋白G的GA3結(jié)構(gòu)域氨基酸序列列表(SEQIDNO:515)。圖2是是表達載體pAY1075中的編碼插入序列的主要特征示意圖，該表達載體不具有(A)和具有(B)編碼變體ABD分子的螺旋2和3的盒。圖3A顯示了在制備表達載體pAY1075的編碼插入序列中用于擴增編碼虛擬、Zwt和GIII的DNA片段的策略。圖3B示出用于產(chǎn)生完整編碼插入序列的這些片段的重疊。圖4是表達載體pAY1075的載體圖譜，如實施例1所述制備。圖5是表達載體pAY1075-ABD的載體圖譜，如實施例1所述制備。圖6是一個表，顯示如實施例1所述用AFFI-793寡核苷酸混合物產(chǎn)生的ABD變體亞文庫中每個變化位置的氨基酸變化的理論值(陰影欄)和實驗(透明欄)值。圖7是一個表，顯示如實施例1所述用AFFI-794寡核苷酸混合物產(chǎn)生的ABD變體亞文庫中每個變化位置的氨基酸變化的理論值(陰影欄)和實驗(透明欄)值。圖8是根據(jù)實施例2的描述在pAY442載體中表達的ABD變體的氨基酸序列的示意圖。圖9A-9C示出當在用Z00342包被的ELISA平板上分析時，如實施例4所述在0_45天從用Z00342注射的靈長類動物獲得的血清的ELISA滴定曲線。圖10A-10C示出當在用Z00342-ABD00003包被的ELISA平板上分析時，如實施例4所述在0-45天從用Z00342-ABD00003注射的靈長類動物獲得的血清的ELISA滴定曲線。圖11示出特異于如實施例4所述在0-45天從用Z00342及Z00342-ABD00003注射的靈長類動物獲得的血清中Z變體的IgG中位濃度。圖12示出如實施例4所述用夾心ELISA分析的隨時間推移血液循環(huán)中A)Z00342和B)Z00342-ABD00003的量。圖13A-13B示出當在用(Z01154)2包被的ELISA平板上分析時，如實施例5所述在0-45天從用(Z01154)2注射的靈長類動物獲得的血清的ELISA滴定曲線。圖14A-14B示出當在用(Z01154)廠ABD00239包被的ELISA平板上分析時，如實施例5所述在0-45天從用(Z01154)2-ABD00239注射的靈長類動物獲得的血清的ELISA滴定曲線。圖15示出分別在圖13和圖14中分析的A)(Z01154)2和B)(Z01154)2_ABD00239樣品的標準化值。樣品吸光度針對1600x稀釋度的陽性對照標準化。本發(fā)明將通過所進行的非限制性實驗描述進一步描述。除非另外說明，使用常規(guī)化學和分子生物學方法。實施例實施例1郞站舶齢縫頓柳翁鍾廳t自概述在本實施例中，產(chǎn)生了多肽變體的噬菌體展示文庫，其通過在鏈球菌菌株G148的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域GA3(以下稱為"ABD")的螺旋2和3的16個位置的變化產(chǎn)生。ABD的野生型序列(〃ABDwt〃)在圖1中的SEQIDN0:491和后附的序列表中示出?；谙惹懊枋龅膒Affil載體(Gr6nwalletal，JBiotechnol128:162-183，2007)的新噬菌體展示載體(pAY1075)被構(gòu)建用于這一新文庫。變化的ABD片段(螺旋2-3)用限制酶Sacl和Nhel克隆進pAY1075。純化連接液并電穿孔進大腸桿菌RR1AM15細胞(Riither，NucleicAcidsRes10:5765-5772,1982)。新構(gòu)建的文庫命名為LibABDmat2005并由2個亞文庫組成，取決于哪些寡核苷酸被用于產(chǎn)生螺旋2和3的變化的序列。一個在ABD分子上構(gòu)建，另一個在ABD的位置17和18之間插入一額外氨基酸，一些與ABD同源的蛋白質(zhì)具有其(參見例如Rozaketal，Biochemistry45:3263-3271，2006)。LibABDmat2005的大小是1X109個成員(每個亞文庫5X108)。新文庫的質(zhì)量是滿意的，DNA測序顯示大約87X的克隆是功能性的并且氨基酸相對頻率的測量值與理論值良好符合。構(gòu)建噬菌粒載體pAY1075構(gòu)建了新噬菌體展示載體(pAY1075)用于該新文庫。pAY1075基于噬菌粒載體pAffil(Gr6nwalletal，supra)。為產(chǎn)生pAY1075，pAffil用Xhol和Xmal(10單位/ii1;NewEnglandBiolabs)消化，產(chǎn)生新的插入序列或克隆盒并連接進載體。所述新插入序列含有DNA，編碼ABDwt的螺旋1、虛擬序列、凝血酶位點、Zwt(基于葡萄球菌蛋白A的結(jié)構(gòu)域B的工程化IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域，參見Nilssonetal，ProtEng1:107-113，1987)、截短的GIII(殘基249-406)、終止結(jié)構(gòu)域TT和一些額外的限制酶位點。由這一插入序列編碼的元件的示意圖見圖2A。圖2B顯示了當虛擬序列被編碼剩余ABD變體多肽的序列置換時表達載體的插入序列(見下述)。在克隆實驗和文庫構(gòu)建中用作引物的各種DNA寡核苷酸和模板的序列見下表l。表1:寡核苷酸引物和模板<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>為了產(chǎn)生用于pAY1075的新的克隆盒，用圖3A的引物，從pAffil經(jīng)PCR擴增虛擬片段和GIII，從質(zhì)粒pEZZ18(L6wenadleretal，Gene58:87-97,1987)擴增Zwt。新產(chǎn)生的片段互相有重疊節(jié)段，如圖3B所示。PCR片段用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商推薦凝膠純化，之后在組裝PCR中用寡核苷酸AFFI-772(圖3B)組裝在一起。用外部引物AFFI-772和AFFI-40進行另外的PCR反應以擴增完整片段。PCR產(chǎn)物用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商推薦純化。質(zhì)粒pAffil用QIAgenmidi-pr印試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商推薦純化。之后，pAffil和用于克隆盒的擴增的PCR片段用XhoI和Xmal(10單位/ii1;NewEnglandBiolabs)在NEB4緩沖液(20mMTrisacetate,10mM醋酸鎂，50mM醋酸鉀，lmM二硫蘇糖醇，pH7.9;NewEnglandBiolabs)中于37。C消化1小時，載體之后用牛腸堿性磷酸酶(CIAP;Fermentas)去磷酸化。消化液在1%瓊脂糖凝膠上用QIAquick凝膠提取試劑盒根據(jù)廠商推薦純化。新片段在室溫用T4DNA連接酶(5單位/ii1;Fermentas)連接進XhoI和Xmal裂解的pAffill小時。部分連接混合物用lmm小池電穿孔進E.coliTG1細胞(Stratagene)。細胞鋪板于補加200iig/ml氨芐青霉素的胰蛋白月示血瓊脂基平板(TBAB平板；30g/1TBAB)上。具有正確插入序列的克隆經(jīng)PCR鑒別，使用3種不同引物對AFFI-21/AFFI-42，AFFI-47/AFFI-40及AFFI-21/AFFI-40。PCR片段在1%瓊脂糖凝膠上分析，陽性克隆用QIApr印Minipr印試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商推薦質(zhì)粒純化，置于用引物AFFI-38，40，71，72禾口772使用ABIPRISMBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction試劑盒3."AppliedBiosystems)測序。測序PCR反應在Magnathx8000儀器(MagneticBiosolutions)上純化，核苷酸序列用ABIPRISM3100Geneticanalyzer(AppliedBiosystems)石角定。SequencerTMv4.0.5(GeneCodesCorporation)用于記錄禾口分析序歹廿數(shù)據(jù)。測序揭示了新的噬菌粒載體已成功產(chǎn)生。具有虛擬序列的載體(pAY1075)或具有編碼變化的ABD螺旋2和3的序列的載體(pAY1075-ABD)的載體圖譜分別示于圖4和圖5。設計變體ABD序列文庫如下制備了一組具有針對ABD分子的螺旋2和3的隨機序列的寡核苷酸。這些寡核苷酸隨后用于置換pAY1075中的虛擬序列，以產(chǎn)生pAY1075-ABD(圖2B和圖5)。pAY1075-ABD載體隨后用于在噬菌體表面上表達ABD變體文庫。設計是基于來自ABD的丙氨酸突變(Linhultetal，ProteinSciencell:206-213,2002)、ALB8-HSA復合物研究(Lejonetal，JBiolChem279:42924-42928，2004)、與其它已知白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列同源性及寡核苷酸制備的容易性的信息。選擇了SEQIDN0:491代表的ABDwt序列中16個氨基酸位置用于一定程度隨機化，并基于如下特征分成4組(1)疏水核心，(II)保守位置，(III)靜電相互作用和(IV)其它(I)位置Y20、L24、L27和141參與產(chǎn)生中心疏水核心，與血清白蛋白相互作用。這些位置在與ABD同源的結(jié)構(gòu)域中是高度保守的，這些位置中的隨機化測試是否另一個疏水氨基酸殘基可以改良疏水相互作用。(n)位置18'、S18、T30、E32和G33在白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域中非常保守。位置S18和T30參與2個分子間H鍵，隨機化的基本原理是相似的極性氨基酸如蘇氨酸(T)和天冬酰胺(N)也可行。E32和G33不與結(jié)合表面相互作用至任何高程度。但是它們可能對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是重要的，感興趣的是了解另一個氨基酸是否可行。ABDwt的序列不包含位置18'(即18'代表在ABDwt的位置17和18之間的添加的氨基酸殘基)，但是同源結(jié)構(gòu)域在該位置具有蘇氨酸或絲氨酸。感興趣的是了解用這一額外氨基酸是否可改良結(jié)合。(III)位置N23、N27、K29和E40參與或可以參與靜電相互作用。在這些位置的隨機化基于有興趣了解是否可以增強或抑制這些氨基酸殘基與白蛋白的吸引或排斥相互作用的一些。(IV)位置A36、K35和D39由于其它類似考慮被隨機化。為了在每個位置產(chǎn)生希望的氨基酸殘基混合物，根據(jù)表2變化ABDwt序列。變異被分為"隨機化的"或"摻雜的"。在"隨機化的"位置中，所有選擇的氨基酸均比其它更常見，即該位置朝向原始氨基酸偏倚(biased)。表2:變體ABD序列的設計策略<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>、=任何核苷酸2"摻雜"或偏倚朝向下劃線的氨基酸殘基從Scandinavian5GeneSynthesisAB獲得寡核苷酸混合物AFFI-793和AFFI-794，其相應于編碼根據(jù)表2修飾的ABDwt的殘基13-46的DNA并包括限制位點。AFFI-794包括由位置18'代表的額外氨基酸。AFFI-793:41403937363533323029272423XXXGTTGATXXXXXXCTT2018GTAXXXGTCXXXTACTCCATATTTGTCGAG-3'113bpAFFI-794:41403937363533323029272423XXXGTTGATXXXXXXCTT201818'GTAXXXGTCXXXXXXTACTCCATATTTGTCGAG-3'116bp表3總結(jié)了在實現(xiàn)表2所述文庫設計所需的寡核苷酸混合物中的所需的核苷酸分布百分比。23表3:AFFI-793和AFFI-794寡核苷酸混合物中的核苷酸分布<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>文庫構(gòu)建下述程序用于產(chǎn)生編碼ABD變體的基因文庫LibABDmat2005。在一個組裝反應中，寡核苷酸AFFI-791和寡核苷酸混合物AFFI-793或AFFI-794退火并用TaqDNA聚合酶延伸。進行使用外部引物AFFI-791和AFFI-792的PCR反應以擴增片段。PCR產(chǎn)物用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商推薦純化。用Qiagenplasmidmidi試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商推薦從250ml過夜培養(yǎng)物(trypticsoybroth，2%葡萄糖，100yg/ml氨芐青霉素)制備噬菌粒pAY1075。該噬菌粒用SacI禾口Nhel(10單位/ii1;NewEnglandBiolabs)在NEB4緩沖液(20mMTrisacetate,10mM醋酸鎂，20mM醋酸鉀，lmM二硫蘇糖醇，pH7.9;NewEnglandBiolabs)中于37"C消化3小時。該溶液用酚/氯仿純化和乙醇沉淀，載體然后從l^瓊脂糖凝膠用QIAquickgelextraction試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商推薦純化。來自AFFI-791和AFFI-793或AFFI-794之間的組裝反應的PCR擴增片段用Sacl和Nhel在NEB4緩沖液中于37。C消化3小時。DNA片段從1%瓊脂糖凝膠用QIAquickgelextraction試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商推薦純化。所得的編碼兩個亞文庫ABD變體的基因片段在室溫用T4DNA連接酶(5單位/ii1;Fermentas)連接進Sacl和Nhel裂解的pAY1075中。連接反應然后酚/氯仿提取，乙醇沉淀并溶解于小體積的10mMTris中。電感受態(tài)E.coliRR1AM15細胞(Riither，1982，supra)用60等份的兩個亞文庫的每一個的連接材料轉(zhuǎn)化，使用0.2cm間隔大小的小池，于ECM630set(BTX)中，使用參數(shù)2.5kV，125Q和50iiF。細胞在SOC培養(yǎng)基(47mlTSB+YE(30g/ltrypticsoybroth，5g/l酵母膏)，補加1X葡萄糖、10mMMgCl2、10mMMgS04、10mMNaCl禾P2.5mMKC1)中生長50分鐘，轉(zhuǎn)移到10個Erlenmayer瓶中，每個瓶含有1L補加2%葡萄糖和100yg/ml氨芐青霉素的TSB+YE(30g/1trypticsoybroth，5g/l酵母膏)，并在37。C生長過夜。細胞然后在6000g離心，重懸于PBS/甘油溶液(PBS:2.68mMKC1，1.47mMKH2P04，137mMNaCl，8.ImMNa2HP04，pH7.4)至最終大約濃度為20%甘油。細胞然后等份化并儲存在-8(TC。電穿孔、擴增和轉(zhuǎn)移至甘油原液后的細胞數(shù)在補加200iig/ml氨芐青霉素的TBAB平板上滴定。每個亞文庫的大小是5X108，即文庫LibABDmat2005的總大小是IX109。該文庫被擴增大約50000次，甘油原液的密度大約為1X1011細胞/ml。在此，文庫的"大小"是指包括在文庫中的成員總數(shù)，不考慮由文庫編碼的獨特的變體的數(shù)目。來自兩個亞文庫各96個集落被挑取進行DNA測序以核實具有征求讀框的克隆的設計和頻率。這些隨機挑取的集落從甘油原液培養(yǎng)并源自每個文庫的集合，其用寡核苷酸AFFI-21和AFFI-22進行PCR擴增。用ABIPRISMdGTP，BigDyeTerminatorv3.OReadyReactionCycleSequencing試齊U盒(AppliedBiosystems)根據(jù)廠商推薦用生物素化寡核苷酸AFFI-72進行擴增片段的測序。測序反應通過用Magnathx8000(MagneticBiosolutions)結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠而純化，并在ABIPRISM3100GeneticAnalyser(AppliedBiosystems)上分析。在用AFFI-793產(chǎn)生的亞文庫中，3個克隆不能讀出，11個是不正確的，7個克隆是來自其它亞文庫的污染。這個亞文庫中的氨基酸分布從測序數(shù)據(jù)推導出，與理論值比較，結(jié)果見圖6。關于使用AFFI-794產(chǎn)生的亞文庫，3個克隆不能讀出，16個是不正確的。這個亞文庫中的氨基酸分布從測序數(shù)據(jù)推導出，與理論值比較，結(jié)果見圖7。每個氨基酸的頻率與預期值符合良好，大約87%的克隆具有正確讀框。實施例2fi舶齢縫頓柳翁鍾廳條纏g概述生物素化人血清白蛋白(HSA)在使用實施例1構(gòu)建的文庫的噬菌體展示選擇中用作靶。選擇用各種條件進行以最大化獲得具有對白蛋白高親和性的ABD變體的可能性。在進化選擇的噬菌體后，相應于的表達的蛋白質(zhì)在ELISA中被測試對白蛋白的親和性。鑒別陽性克隆并測序，相應的多肽及其白蛋白結(jié)合基序的預測氨基酸序列被推導，其產(chǎn)生大量本發(fā)明的白蛋白結(jié)合多肽的序列。推導的白蛋白結(jié)合基序的氨基酸序列列于圖l和序列表中的SEQIDNO:1-257，相應的全長ABD變體的氨基酸序列列于圖1和序列表中的SEQIDNO:258-514。人血清白蛋白的生物素化凍干的人血清白蛋白(Sigma，cat.no.A3782-5G)溶解在PBS中(2.68mMKCl，1.47mMKH2P04，137mMNaCl，8.1mMNa2HP04，pH7.4)至終濃度為10mg/ml。EZ-linkSulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce,cat.no.21335)溶解在水中至終濃度為lmg/ml并且5和10倍摩爾過量被加入到在總體積0.5ml中的500mg白蛋白中?；旌衔镌谑覝乇?0分鐘。未結(jié)合的生物素通過用透析盒(Slide-A-Lyser，10kDa;Pierce)對PBS透析除去。噬菌體展示選擇總共進行5輪選擇，使用增加的嚴格條件。在最初3輪主要建立合適選擇方案后，從實施例1制備的甘油原液制備所得噬菌體原液。然后用表4所列選擇緩沖液、耙濃度和固體支持物的組合進行2輪選擇。表4:HSA選擇的選擇條件<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>選擇程序中用的所有試管和珠在TPBSB(5X)(0.05%Tween20，5%牛血清白蛋白(BSA)，0.02X疊氮化鈉于PBS中)或明膠(0.5%)中在室溫溫和攪拌下預封閉30分鐘，隨后不攪拌4t:過夜。選擇溶液(1ml)含有生物素化人血清白蛋白、噬菌體、疊氮化鈉(0.02%)、Tween20(0.05%)和BSA(3X)或明膠(0.1%)，如表4，并在PBS中制備。噬菌體與生物素化人血清白蛋白靶在第4輪的3天期間及在第5輪的1天期間在4t:保溫，隨后在攪拌下在室溫保溫1小時。選擇樣品轉(zhuǎn)移至封閉的鏈霉抗生物素蛋白珠，在室溫攪拌下保溫15分鐘。珠用lml選擇緩沖液(即TPBSB(3%)(0.05%Tween20，3%牛血清白蛋白(BSA)，0.02%疊氮化鈉于PBS中)或GT(O.1%)(0.1%明膠，0.1%Tween20和0.02X疊氮化鈉于PBS中))洗10次，隨后用PBS洗10次，其中第2次至最后一次洗滌用時2小時。噬菌體用1000ml0.05M甘油-HCl，pH2.2在室溫進化10分鐘，隨后用補加100ml1MTris-HCl，pH8.0的900mlPBS立即中和，或者用1000iil胰蛋白酶(2mg/ml)在室溫進化30分鐘，隨后添加1000ii1抑酶肽。每輪選擇后，進化的噬菌體(3/4體積)用于感染50ml對數(shù)期E.coliRR1AM15細胞(Riither，1982，supra)。溫和攪拌保溫30分鐘和在37。C劇烈攪拌30分鐘后，離心細胞，沉淀溶于小體積并涂布于TSB+YE平板(30g/ltrypticsoybroth，5g/l酵母膏)，最后在37t:保溫過夜。選擇循環(huán)導致滿意數(shù)目的進化噬菌體。噬菌體原液制備來自平板的細胞重懸于TSB培養(yǎng)基中(30g/ltrypticsoybroth)，細胞濃度通過測量600nm的光密度確定，假定0D6。。=1相應于5X108細胞/ml。細胞在100ml補加2%葡萄糖和100mg/ml氨芐青霉素的TSB+YE培養(yǎng)基中保溫(細胞相比于進化噬菌體大約100倍過量)，并在37t:生長至大約0D6。。=0.5-0.7。之后，10ml轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶并用25倍過量的M13K07輔助噬菌體(lX1012cfu/ml;NewEnglandBiolabs，cat.no.N0315S)感染，并緩慢攪拌保溫30分鐘。細胞在2Q00g離心10分鐘并重懸于100ml補加lOOmM異丙基-p-D-l-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)、50mg/ml卡那霉素和100mg/ml氨芐青霉素的TSB+YE培養(yǎng)基中，在100rpm、25t:生長過夜。一部分重懸細胞在-S(TC儲存作為甘油原液。誘導的培養(yǎng)物在2500rpm離心10分鐘，通過加入1/4體積的沉淀緩沖液(PEG/NaCl)沉淀上清中的噬菌體并在冰上保溫1小時。沉淀的噬菌體在4°ClOOOOg離心30分鐘而沉淀，重懸于20mlPBS中，之后噬菌體溶液過濾經(jīng)過0.45iim濾膜。重復沉淀程序，噬菌體最終重懸于lmlPBS中。選擇溶液在選擇后與每一輪選擇后的洗滌和進化溶液一起滴定。噬菌體溶液在微滴板中于無菌水中稀釋，向每一噬菌體稀釋液中加入100ii1對數(shù)期E.coliRR1AM15細胞。在室溫保溫20分鐘后，來自每個滴定的5iU滴加到TYE平板(15g瓊脂、10g胰胨、5g酵母膏、3gNaCl，補加2X葡萄糖和100iig/ml氨芐青霉素)上并在37。。C保溫過夜。所得菌落計數(shù)并計算效價(cfu/ml)。白蛋白結(jié)合的ELISA分析來自每個選擇的克隆加上ABDwt被表達和篩選HSA結(jié)合活性，使用使得能檢測具有對血清白蛋白的從10nM至低pM的KD值的結(jié)合劑的ELISA設置。隨機挑取的菌落在96孔深孔板中表達，這通過將每個菌落接種于lml補加100mg/ml氨芐青霉素和lmMIPTG的TSB+YE培養(yǎng)基中并在37t:生長過夜而進行。細胞在3000g離心15分鐘沉淀，重懸于400iUPBS-T(0.5%Tween20于PBS中)并在-8(TC冷凍。冷凍樣品在水浴中解凍，在3700g沉淀細胞碎片40分鐘。收集含有ABD變體-Zwt融合蛋白的上清并4t:儲存直至用于如下ELISA中。微滴定孔(Costar)用100iUHSA在4。C包被過夜，及用對照大鼠血清白蛋白(RSA)、人血清白蛋白(HSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)各在1孔中包被，濃度為0.4yg/ml于ELISA包被緩沖液(0.1M碳酸鈉，pH9.5)中。孔用封閉緩沖液(2X牛奶于PBS中)在室溫封閉2小時。向每孔中加入100ii1的制備的ABD變體-Zwt融合蛋白，平板在室溫保溫1.5小時。向孔中加入濃度為0.5mg/ml于洗滌緩沖液中(0.5%Tween20于PBS中)的生物素化IgG并保溫1.5小時，從而任何白蛋白結(jié)合融合蛋白的Zwt部分可以結(jié)合IgG。結(jié)合的復合物用在洗滌緩沖液中l(wèi):5000稀釋的辣根過氧化物酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白(Dako，cat.no.P0397)檢測，并在室溫保溫1小時。通過將等體積的TMB底物A和B(Imm皿oPureTMB，Pierce)混合制備顯色溶液，并將，and100y1加入到每孔中。黑暗中保溫30分鐘后，加入100iil終止溶液(2MH2S04)。平板在ELISA分光光度計(BasicSunrise,Tecan)中在A45。讀數(shù)。在加入每種新試劑之前，用洗滌緩沖液洗4次?？偣?72個克隆(表4樣品A-D的每種選擇各93個克隆)被隨機挑取用于用上述ELISA設置分析其HSA結(jié)合活性。大多數(shù)分析的克隆相比于低皮摩爾結(jié)合(70pM;未公布結(jié)果)的ABDwt與大鼠血清白蛋白相互作用給出更高的對HSA的信號基于這個實驗的結(jié)果，挑取克隆如下測序。測序ELISA陽性克隆來自選擇的菌落的PCR片段用寡核苷酸AFFI"69(5'-gtgagcggataacaattccccte-3')禾口AFFI—70(5'—cagcaaaaaacccctcaagaccc—3')擴增。用ABIPRISMdGTP，BigDyeTMTerminatorv3.OReadyReactionCycleSequencing試劑盒(AppliedBiosystems)根據(jù)廠商推薦用生物素化寡核苷酸AFFI-202(5'-生物素-gtgagcggataacaattcccctc-3')進行擴增片段的測序。測序反應通過用Magnathx8000儀器(MagneticBiosolutions)結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠純化，最后在ABIPRISM3100GeneticAnalyser(AppliedBiosystems)上分析。對在ELISA篩選中顯示最高A45。值的克隆測序它們的ABD變體插入序列。257個不同的鑒別的ABD變體命名為ABDftftftftft，其中#####是針對討論的變體的5位獨特標記。這些鑒別的ABD變體的序列列于圖1作為SEQIDNO:257-514?；蛞吧突?親代"ABD的白蛋白結(jié)合性質(zhì)的現(xiàn)有知識，鑒別的ABD變體的白蛋白結(jié)合基序被降低至位于螺旋2和3中，相應于從氨基酸位置G16至141的序列段。鑒別的ABD變體的白蛋白結(jié)合基序以ABMftftSSS命名，其中#####是針對討論的基序的5位獨特標記。鑒別的白蛋白結(jié)合基序的序列列于圖1作為SEQIDNO:1-257。令人感興趣地，鑒別的序列的一個亞集合包含在相應于ABDwt的位置38的自發(fā)突變，盡管這一位置在產(chǎn)生變體文庫時未被隨機化。ABD變體亞克隆進pAY442編碼ABDwt的DNA(SEQIDNO:515)和來自選擇的12個克隆被選擇用于亞克隆進表達載體pAY442(Gr6nwalletal，supra)中。參照圖1，選擇的ABD變體克隆是ABD00002，ABD00003，ABD00009，ABD00015，ABD00025，ABD00027，ABD00046，ABD00049，ABD00053，ABD00054，ABD00055和ABD00245。含有編碼這些ABD變體分子的插入序列的質(zhì)粒使用QiagenMini試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商推薦從2mlE.coliRR1AM15細胞(Riither，1982，supra)的過夜培養(yǎng)物(trypticsoybroth培養(yǎng)基(30g/l)，補加2%葡萄糖和100yg/ml氨芐青霉素)中純化。編碼ABDwt和ABD變體分子的DNA通過AccI-NotIPCR粘末端克隆(10單位/Pl每種酶；NewEnglandBiolabs)被亞克隆進表達載體pAY442，使用表5所列引物對AFFI-780，-898和AFFI-782，-899:表5:寡核苷酸引物寡核苷酸序列AFFI-7805，-P-agacttagctgaagctaaagtcttagc-3，AFFI-7825'-acttagctgaagctaaagtcttagc-3'AFFI-8985'-gctttaaggtaatgcagctaaaat-3'AFFI-8995'-P-ggccgcttte3ggteatgc3gcte^3t-3'從文庫載體pAY1075針對每個ABD變體分子產(chǎn)生2個重疊PCR產(chǎn)物，導致大約25%的具有Accl-Notl位點的正確片段。表達載體pAY442在二步中在37。C消化4小時，使用分別在NEB4緩沖液(20mMTrisacetate,10mM醋酸鎂，50mM醋酸鉀，lmM二硫蘇糖醇，pH7.9;NewEnglandBiolabs)和NEB3緩沖液(50mMTris-HCl，10mMMgCl2，100mMNaCl，lmM二硫蘇糖醇，pH7.9;NewEnglandBiolabs)中的Accl和Notl，并且用牛腸堿性磷酸酶(CIAP;Fermentas)在37。C去磷酸化1小時。裂解的質(zhì)粒和片段用QIAquickPCR純化試28劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商推薦純化。PCR產(chǎn)物雜交并連接進Accl-Notl消化和去磷酸化的pAY442，反應實驗T4DNA連接酶(5單位/iU;Fermentas)在室溫進行1小時。部分連接液電穿孔進E.coliBL21(DE3)細胞(F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm(DE3))，電穿孔用lmm小池和ECM630裝置(BTX)，使用參數(shù)1700V,200Q和25iiF。細胞在補加50yg/ml卡那霉素的胰蛋白月示血瓊脂基平板(TBAB)鋪板并在37t:保溫過夜。陽性克隆首先在細菌PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠上核實，最后用DNA序列分析核實。含有亞克隆的ABD變體的pAY442克隆編碼圖8所述構(gòu)建體，即基本上是His6標記的ABD變體。His6標記的ABD變體的變體和純化ABDwt禾P12個ABD變體均亞克隆在上述pAY442中，在E.coliBL21(DE3)中表達為與N-末端His6標記的融合體，并用IMAC純化。每個ABD變體的菌落用于接種5ml補加50i!g/ml卡那霉素的TSB培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在37t:生長過夜。第二天，將50每種培養(yǎng)物單獨接種在1升培養(yǎng)瓶中的100ml補加50g/ml卡那霉素的TSB+YE培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在lOOrpm于37t:生長至0D6。。為0.7_1，之后加入IPTG至終濃度為0.5mM，細胞在lOOrpm于室溫保溫過夜。在8000g離心5分鐘收集培養(yǎng)物，沉淀儲存在冰箱中直至蛋白質(zhì)制備。在變性條件下用Ni-NTASuperflow柱禾PQIAsoft4.1，protein/Ni-NTASuperflow96denaturinglargescale2Vac4-24樣品在Biorobot3000(Qiagen)上IMAC純化HiSe標記的蛋白質(zhì)。通過用透析盒(Slide-A-Lyser，3.5kDa;Piercecat.no.66330)對5升PBS透析2小時將緩沖液置換為PBS，隨后進一步過夜透析。蛋白質(zhì)濃度用A，和BCAProteinAssayReagent試劑盒(Pierce)如廠商推薦確定。蛋白質(zhì)純度在4-12%Novex凝膠上經(jīng)SDS-PAGE分析并用考馬斯藍R染色，這一分析顯示僅少量雜質(zhì)存在。生物傳感器分析ABD變體對HSA和MSA的親和性在Biacore2000儀器(Biacore)上的生物傳感器分析用經(jīng)胺偶聯(lián)到CM-5芯片(研究級；Biacore)表面上的羧基化葡聚糖層固定化的MSA、HSA和RSA根據(jù)廠商推薦進行。芯片上的表面l被活化和失活并用作注射期間的參考cell，而表面2包含用350RU(共振單位)固定化的MSA，表面3包含用360RU固定化的HSA，表面4包含用340RU固定化的RSA。如上所述表達和純化的ABD變體和ABDwt在HBS-EP(Biacore)中稀釋至25nM并以恒定流速25ii1/min注射10分鐘，隨后注射HBS-EP30分鐘。表面用兩次注射20y115mMHC1隨后0.05%SDS和一次注射20ii1HC1而再生。Biacore研究的進行不是為了確定變體對人和小鼠血清白蛋白的親和性的精確參數(shù)，而是結(jié)果提供了這些分子對白蛋白的相對親和性的定性測量。結(jié)合MSA和HSA的結(jié)果見表6。表6:ABD變體結(jié)合來自小鼠和人的血清白蛋白的生物傳感器分析<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>如表所證明，所有測試的ABD變體均具有比野生型ABD分子高得多的對人血清白蛋白的親和性，K。值至少低一個數(shù)量級，經(jīng)常接近低二個數(shù)量級。另外，對小鼠血清白蛋白的相當?shù)暮?或更高的親和性也由全部變體顯示。實施例3選擇的ABD變體的額外的生物傳感器鑒定概述在本實施例中，選擇的ABD變體ABD00003，ABD00053和ABD00239加上ABDwt全部如實施例2所述亞克隆進pAY442，并以更大規(guī)模表達及用HisGravitr即TM試劑盒純化。表達的分子用Biacore儀器鑒定對HSA的親和性。His6標記的ABD變體的蛋白質(zhì)表述和純化用實施例2所述構(gòu)建體將ABD00003,ABD00053,ABD00239和ABDwt在E.coliBL21(DE3)細胞中表達為與N-末端His6標記的融合體并經(jīng)IMAC純化。每個ABD變體的一個菌落用于接種10ml補加50g/ml卡那霉素的TSB培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在37。C生長過夜。第二天，500iU每種培養(yǎng)物分別接種在5升培養(yǎng)瓶中的500ml補加50yg/ml卡那霉素的TSB+YE培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在37。C在lOOrpm生長至0D6。。為0.7_1，隨后加入IPTG至終濃度為0.5mM并在室溫保溫過夜。在8000g離心5分鐘收集培養(yǎng)物，沉淀儲存于-2(TC直至蛋白質(zhì)制備。Hise標記的蛋白質(zhì)在變性條件下用His-Gravitr即TM試劑盒(GEHealthcare)經(jīng)IMAC純化。沉淀(渦旋)重懸于20ml變性緩沖液B-7M(100mMNaH2P04，10mMTris-CI，7M脲，pH8)，加入8ii1benzonase。溶液在室溫以200rpm保溫30分鐘。加入另外20ml緩沖液B-7M，溶液轉(zhuǎn)移至50mlFalcon試管并在冰上如下超聲化在3分鐘期間3秒開/關，并具有40%振幅。細胞碎片通過在25000g離心40分鐘除去。Gravitr即TM柱用緩沖液B-7M平衡并加入樣品。柱然后用10ml緩沖液B-7M，20ml結(jié)合緩沖液(20mMNaP04，500mMNaCl，20mM咪唑)及最后用10ml洗滌緩沖液(20mNNaP04，500mMNaCl，60mM咪唑)洗滌。ABD分子用3ml洗脫緩沖液(20mNNaP04，500mMNaCl，500mM咪唑)洗脫。用Slide-A-Lyser透析盒(3.5kDa;Pierce，cat.no.66330)進行的緩沖液交換為PBSpH7.2是如下進行對5升PBSpH7.2透析2小時，隨后過夜透析，最終根據(jù)廠商推薦用PD10柱(GEHealthcare)交換緩沖液為PBSpH5。蛋白質(zhì)濃度用Abs28。確定，蛋白質(zhì)純度在4-12%Novex凝膠上用SDS-PAGE分析并用考馬斯藍R染色。蛋白質(zhì)以可接受收率被成功表達和純化。凝膠電泳分析顯示不存在雜質(zhì)(未示出)。對人血清白蛋白的結(jié)合動力學的生物傳感器分析在Biacore2000儀器(Biacore)上的生物傳感器分析用經(jīng)胺偶聯(lián)到CM-5芯片(研究級；Biacore)表面上的羧基化葡聚糖層固定化的HSA根據(jù)廠商推薦進行。HSA的固定化產(chǎn)生450共振單位的信號。芯片上的一個細胞(cell)表面被活化和失活并在注射期間用作參考細胞。純化的His6-ABD樣品在HBS-EP(Biacore)中稀釋至4，10,40，100和400nM(針對ABDwt)，及0.2，0.8，2，5和20nM(針對選擇的ABD變體)。樣品以恒定流速25y1/min注射10分鐘，隨后注射HBS-EP3小時。表面用兩次注射20ill5和10mMHC1再生。估計并在表7中給出，證實實施例2的結(jié)果，即獲得了顯示非常高的對HSA的親和性的分子。表7:純化的ABD分子對HSA的動力學參數(shù)(ka、kd和KD)ka(Ms—0kd(s-"KD(M)ABDwt5.5X1056.5X10—41.2X10—9ABD000038.0X1063.0X10—53.8X10—12ABD000533.0X1061.5X10—55.0X10—12ABD002393.0X1071.5X10—55.0X10—13實施例4與第一個ABD變體融合的Z變體多肽的靈長類免疫原件和藥動學31概述先前在小鼠和大鼠中的研究表明與ABDwt融合的各種Z變體產(chǎn)生與僅Z變體相比更低的抗體應答。本研究目的在于l)在靈長類中證實這些結(jié)果并將其擴展到顯示相比ABDwt高103倍的對白蛋白的結(jié)合親和性的ABD的突變變體，和2)比較ABD融合的和裸的Z變體的血清半衰期。將具有對HER2受體的親和性的Z變體給予靈長類，有或沒有ABD變體作為融合配偶體。在45天期間重復免疫和放血過程。用ELISA測定分析對Z變體分子的特異抗體應答及Z變體分子的血清半衰期。研究的分子Z00342:Z蛋白的變體，依次衍生自葡萄球菌蛋白A的B結(jié)構(gòu)域，具有對HER2受體的親和性。這個變體經(jīng)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。用陽離子交換和反向?qū)游龇椒ㄟM行純化，隨后在Detoxi-GelAffinityPakTMPre-packed柱(Pierce,catno2034)根據(jù)廠商推薦除去內(nèi)毒素。Z00342分子的詳細描述見0rlovaetal，CancerRes66:8，4339-48(2006)，在i亥文章中其被稱為Z^j。Z00342-ABD00003:Z變體Z00342與實施例2中選擇的變體ABD分子ABD00003的融合蛋白。這個融合蛋白用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。用在HSA-s印harose上的親和性捕獲和反向?qū)游黾兓⑷缟铣?nèi)毒素。方法纟合予及取樣方案在SMI(Smittskyddsinsitutet)，Solna，Sweden進行動物研究，當?shù)氐赖聞游镂瘑T會準許(N196/06)。在給予測試分子和取血樣前靈長類給予鎮(zhèn)靜劑，肌肉內(nèi)給予氯胺酮(Ketalai^)。IO個短尾猴靈長類(cynomolgusprimates)Macacafascicularis分成2組，根據(jù)表8方案靜脈內(nèi)注射測試分子。表8:測試分子的給予組動物編號分子給予途徑mg/kg/注射ml/動物/注射19023,9039,10025，10105,11019Z00342i.v.0.51212031,12041,12047，12061,12065Z00342-ABD00003i.v.0.51給予和放血時間點見表9。PK是指用于藥動學研究的樣品。血液儲存在4t:過夜，血清隨后在-2(TC保持。表9:給予測試分子和取血樣的時間點320249]天活動0在0、30、60分鐘、4小時(PK)放血&注射11放血(PK)2放血(PK)3放血(PK)7放血(PK)&注射214放血&注射321放血&注射428放血&注射535放血&注射645放血一般ELISA方法一般地,對于所有保溫歩驟使用毎孔50y1體積，除了封閉時使用100ill體積。平板在4t:在包被緩沖液(15mMNa2C03，35mMNaHC03，pH9.6)中包被過夜，并用自來水洗滌。封閉和稀釋在具有0.5X酪蛋白的PBS中進行。室溫的保溫時間對于封閉和血清是1-2小時，對于第二抗體是1小時，對于底物溶液(ImmunoPureTMB，Pierce,catno34021)是10分鐘。在所有步驟之間用自動化ELISASkanWasher300(Skatron)用每孔4x250ii1PBS-T(具有0.05%Tween20的PBS)洗滌。顏色反應通過加入502MH2S04終止，平板在450nm用配有Magellan軟件v3.ll(Tecan)的Ultra384讀板器(Tecan)讀出。抗Z00342IgG特異件ELISA:平板用在包被緩沖液中稀釋的0.3yg/mlZ00342包被并在4t:保溫過夜。洗滌后，平板如上所述封閉。來自靈長類的血清以起自1/100的2倍系列稀釋液加入。來此超免疫的靈長類的純化血清用作陽性對照并以起自8g/ml的2倍稀釋液加入。保溫后，洗滌平板，加入HRP綴合的抗人IgG二抗(SouthernBiotechcat.no.2040-05)(1/10000稀釋)。最終保溫后，洗滌平板并如上所述顯色。用于PK分析的血清-Z特異件ELISA:平板用2yg/ml親和性純化的山羊抗ZIg(in-house生產(chǎn)，特異于所有Z變體共有的表位)并4。C保溫過夜。洗滌后，如上所述封閉平板。來自用Z00342或Z00342-ABD00003注射的靈長類的血清以起自1/40(對于Z00342)或1/80(對于Z00342-ABD00003)的二倍系列稀釋液加入。以起自20ng/ml的二倍系列稀釋液加入每種分子的標準。保溫后，洗滌平板，加入第二步抗體(對Z00342，2iig/ml兔抗33ZIgG(in-house生產(chǎn))；對于Z00342-ABD00003，l/5000o兔抗Z-ABDIgG(in-house生產(chǎn)))。保溫后，洗滌平板，加入1:5000稀釋的HRP綴合的抗兔Ig(Dakocat.no.0448)。最終保溫后，洗滌平板并如上所述顯色。結(jié)果在用Z00342灃射的靈長類中的特異于Z的IgG:經(jīng)ELISA分析來自每次放血的血清中特異于Z變體的IgG的存在(圖9A-9C)。在第0天除了一個具有中等水平預形成抗體的靈長類(9039)之外均檢測到低水平IgG。在第14天后，在三個動物(9039，10025，11019)中抗體效價穩(wěn)定增加并在第28-35天達到最大，而兩個動物顯示在45天期間低抗體應答(9023和10105)。在用Z00342-ABD00003灃射的靈長類中的特異于Z的IgG:經(jīng)ELISA分析來自每次放血的血清中特異于Z-ABD00003分子的IgG的存在(圖10A-10C)。在兩個靈長類(12047和12065)中未觀測到抗體應答，而兩個靈長類(12041和12061)顯示高應答。第5個靈長類(12031)具有高血清前水平抗體，其在45天期間幾乎不改變。特異于Z變體的抗體濃度:血清中特異于Z變體的IgG的濃度用陽性對照作為標準用線性回歸計算(圖ll)。在每組靈長類中有個體差異。在第45天，組1和組2中特異性IgG的中位濃度分別是2和0.1單位/ml，表示與ABD00003的融合降低了抗Z00342的抗體應答。Z00342在血清中的藥動學:在藥動學分析中比較了Z00342和Z00342-ABD00003的循環(huán)時間。從標準曲線計算分子隨時間推移的濃度，標準曲線分別從已知量的Z00342和Z00342-ABD00003的系列稀釋液產(chǎn)生。結(jié)果顯示融合于ABD00003的ABD融合的Z00342與僅Z00342相比在血液循環(huán)中保持更長(圖12)。Z00342在4小時內(nèi)從循環(huán)消失，而ABD00003融合的分子在7天后仍可檢測。才既述這個研究的結(jié)果表明ABD融合的Z變體分子與不含白蛋白結(jié)合融合配偶體的Z變體分子相比產(chǎn)生更低的免疫應答及顯示延長的消失半衰期。實施例5與第二個ABD變體g屯合的Z變體多肽的靈長類免,疫原件研究的分子在實施例4的這個延伸中，具有更高的對白蛋白的親和性(KD=10—13M)的第二個ABD變體與二聚體Z變體融合并用于靈長類免疫原性研究。(Z01154)2:蛋白Z的二聚體變體，依次衍生自葡萄球菌蛋白A的B結(jié)構(gòu)域。這個二聚體變體由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。用陽離子交換、反向?qū)游龊完庪x子交換方法純化，之后在Detoxi-GelAffinityPakPre-packed柱(Piercecatno2034)上除去內(nèi)毒素。單體Z01154分子的詳述見GunneriussonEetal，ProteinEng12:10，873-878(1999)，在那里其被稱為Z^w。(Z01154)2-ABD00239:(Z01154)2二聚體和實施例2選擇的變體ABD分子ABD00239的融合蛋白。這個融合蛋白由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。用在HSA-s印harose上的親和性捕獲和反向?qū)游黾兓S后如上除去內(nèi)毒素。方法纟合予及取樣方案:在SMI(Smittskyddsinsitutet)，Solna，Sweden進行動物研究，當?shù)氐赖聞游镂瘑T會準許(N196/06)。在給予測試分子和取血樣前靈長類給予鎮(zhèn)靜劑，肌肉內(nèi)給予氯胺酮(Ketalar⑧)。7個短尾猴靈長類Macacafascicularis分成2組，分別為3個和4個，根據(jù)表10靜脈內(nèi)注射測試分子。表10:測試分子的給予<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>給予和放血時間點見表11。表11:給予測試分子和取血樣的時間點<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>特異性ELISA分析血漿樣品:用在包被緩沖液(15mMNa2C03，35mMNaHC03，pH9.6)中稀釋至終濃度為2iig/ml的(Z01154)2或(Z01154)廠ABD00239包被平板。每孔使用50溶液，平板在4t:保溫過夜。在室溫用PBS+0.5X酪蛋白進行l(wèi)-2小時。加入起自在封閉緩沖液中1/100稀釋的2倍系列稀釋血清。來自超免疫靈長類的純化的血清用作陽性對照。保溫在室溫進行1-2小時，用自動化ELISASkanWasher300(Skatron)用每孔4x175ylPBS-T(具有0.05%Tween20的PBS)洗滌。在室溫進行與二抗在封閉緩沖液中1:5000稀釋的HRP綴合的山羊抗人IgG(Fab)2(Jacksoncat.no.109-035-097)的保溫l-2小時。進行如上所述的自動化洗滌。檢測用ImmunoPure⑧TMB(Piercecat.no.34021)進行，其中反應在12分鐘后通過加入2M112504猝滅。平板在450nm用配有Magellan軟件v3.ll(Tecan)的Ultra384讀板器(Tecan)讀出。結(jié)果用(Z01154U口(Z01154L-ABD00239免疫來自用裸或ABD00239-融合的(Z01154)2免疫的靈長類的血清分別在weretitratedon(Z01154)2and(Z01154)2-ABD00239包被的板上滴定，滴定曲線示于圖13A-13B和圖14A-14B。來自超免疫猴的血清包括在滴定中作為陽性對照。1600x稀釋的陽性對照的吸光度設為100%并用于標準化。圖15示出個體應答的標準化值。結(jié)果顯示所有3個動物均應答(Z01154)2，盡管一個靈長類(E89)的數(shù)量級較低。相反，4個動物中僅1個應答(Z01154)2-ABD00239。實施例6站舶始g隨穀譜勿附曾力口白權(quán)膽概述產(chǎn)生融合蛋白ABDwt-(Z00342)2-Cys(重組產(chǎn)生的融合蛋白，包含野生型ABD結(jié)構(gòu)域和Z變體Z00342的二聚體，具有對HER2受體的親和性)與結(jié)構(gòu)式如下的非極性分子馬來酰亞胺_間隔接頭_阿霉素之間的綴合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>游離接頭及綴合物均具有在水性溶劑中的低溶解度。例如，需要30%的有機溶劑以保持綴合物在溶液中。但是向水溶液中添加人血清白蛋白大大改善溶解度。綴合馬來酰亞胺_間隔接頭_阿霉素(SyntargaB.V.，Netherlands)溶于N，N_二甲基甲酰胺(Sigma，cat.no.D-4551)至終濃度為4ymol/ml，并儲存在-80。C備用。將4ml以1.9mg/ml于PBS中的融合蛋白ABDwt-(Z00342)2_Cys用20mMDTT(AcrosOrganics，cat.no.165680250)在40。C還原30分鐘。過量DTT通過在PD-10柱上緩沖液交換至PBS(2.68mMKCl，1.47mMKH2P04，137mMNaCl，8.1mMNa2HP04，pH7.4)。蛋白質(zhì)樣品通過加入3ml乙月青(AcN，Merck，cat.no.1.14291.2500)調(diào)整至30%(v/v)有機溶劑。198ii1或2倍摩爾過量的馬來酰亞胺_間隔接頭_阿霉素加入到蛋白質(zhì)溶液中?；旌?0分鐘后，溶液在fC保溫過夜。反應混合物最終在用去離子水/AcN(70:30，v/v)平衡的HiPr印26/10脫鹽柱(GE，cat.no.17-5087-01)上純化。通過測量在280nm的UV吸收確定蛋白質(zhì)濃度為0.44mg/ml。1.lmg蛋白質(zhì)等份在Alpha2-4LSC凍干儀(MartinChristGmbH，Germany)中凍干。小瓶在凍干后充氮氣，加蓋并在4t:儲存。溶解度研究三種溶液用于溶解度測試l.DMEM，Dulbecco改良的Eagle's培養(yǎng)基(CambrexBioScience,cat.no.BE12-917F)，2.如1中的DMEM，但是補加人血清白蛋白(HSA)，6mg/ml(Sigma，cat-no.A1887-5G)，及3.如1中的DMEM，但是補加10%胎牛血清(FCS)。溶液1和2過濾通過0.22iiMillex-GV無菌濾膜(Millipore，cat-no.SLGV033啦。凍干的綴合重溶于分別含有0.5ml每種溶液的小瓶中。在37。C保溫30分鐘后，樣品經(jīng)肉眼觀察評價。在具有溶液1和3的小瓶中可見大部分不溶材料，而在具有溶液2的小瓶中未觀察到可見沉淀。重配的綴合物的LC-MS分析來自每小瓶(溶液1-3)的30ill在印pendorf離心機中以13000rpm離心10分鐘。用在線質(zhì)譜檢測(AgilentIIOO，LC-MS)經(jīng)液相層析分析20所得上清。柱Zorbax300SB-C18(4.6X150mm，3.5u)用65%溶劑A(0.1%TFA于去離子水中)和35%溶劑B(0.lXTFA于can中)以流速0.5ml/min平衡。記錄在220，280，254和495nm的UV吸收。樣品組分用50-60X溶劑B的淺(shallow)線性梯度在35分鐘期間洗脫。比較樣品間的相應于溶液中綴合物分子的量的峰面積。結(jié)果示于表12。溶于補加HSA的DMEM(溶液2)的綴合物示出比溶于僅DMEM(溶液1)的樣品大10倍的面積，及比溶于補加10%FCS的DMEM(溶液3)的樣品大4倍的面積。表12:重配的綴合物的LC-MS分析溶劑峰面積(mAU*s)與DMEM之比DMEM2347.41.00DMEM+HSA22659.69.65DMEM+FCS5872.02.503權(quán)利要求包含白蛋白結(jié)合基序的白蛋白結(jié)合多肽，所述基序由如下氨基酸序列組成GVSDX5YKX8X9IX11X12AX14TVEGVX20ALX23X24X25I其中各自獨立地，X5選自Y和F；X8選自N，R和S；X9選自V，I，L，M，F(xiàn)和Y；X11選自N，S，E和D；X12選自R，K和N；X14選自K和R；X20選自D，N，Q，E，H，S，R和K；X23選自K，I和T；X24選自A，S，T，G，H，L和D；和X25選自H，E和D；條件是所述氨基酸序列不是GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI；所述白蛋白結(jié)合多肽結(jié)合白蛋白，從而相互作用的KD值最大為1×10-9M。2.權(quán)利要求l的白蛋白結(jié)合多肽，其中Xs是Y。3.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，其中&選自N和R。4.權(quán)利要求3的白蛋白結(jié)合多肽，其中X8是R。5.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，其中X9是L。6.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，其中Xn選自N和S。7.權(quán)利要求6的白蛋白結(jié)合多肽，其中Xn是N。8.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，其中&2選自R和K。9.權(quán)利要求8的白蛋白結(jié)合多肽，其中^是R。10.權(quán)利要求8的白蛋白結(jié)合多肽，其中^是K。11.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，其中XM是K。12.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，其中&。選自D，N，Q，E，H，R和S。13.權(quán)利要求12的白蛋白結(jié)合多肽，其中&。是E。14.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，其中&3選自K和I。15.權(quán)利要求14的白蛋白結(jié)合多肽，其中^是K。16.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，其中X^選自A，S，T，G，H和L。17.權(quán)利要求16的白蛋白結(jié)合多肽，其中XM是L。18.權(quán)利要求17的白蛋白結(jié)合多肽，其中X23X24是KL。19.權(quán)利要求17的白蛋白結(jié)合多肽，其中X^XM是TL。20.權(quán)利要求16的白蛋白結(jié)合多肽，其中^4選自A，S，T，G和H。21.權(quán)利要求20的白蛋白結(jié)合多肽，其中^是I。22.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，其中L是H。23.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述白蛋白結(jié)合基序由選自SEQIDNO:1-257的氨基酸序列組成。24.權(quán)利要求23的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述白蛋白結(jié)合基序由選自SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:9，SEQIDNO:15，SEQIDNO:25，SEQIDNO:27，SEQIDNO:46，SEQIDNO:49，SEQIDNO:53，SEQIDNO:54，SEQIDNO:55，SEQIDNO:155，SEQIDNO:239，SEQIDNO:240，SEQIDNO:241，SEQIDNO:242，SEQIDNO:243，SEQIDNO:244和SEQIDNO:245的氨基酸序列組成。25.權(quán)利要求24的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述白蛋白結(jié)合基序由選自SEQIDNO:3，SEQIDNO:53和SEQIDNO:239的氨基酸序列組成。26.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述白蛋白結(jié)合基序形成三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域的一部分。27.權(quán)利要求26的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域選自由細菌受體蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)域組成的組。28.權(quán)利要求27的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述細菌受體蛋白選自由來自鏈球菌(Str印tococcus)、消化鏈球菌(P印tostr印tococcus)禾口Finegoldia的物禾中的白蛋白結(jié)合受體蛋白組成的組。29.權(quán)利要求28的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述白蛋白結(jié)合受體蛋白選自由G;MAG;ZAG;PPL;和PAB組成的組。30.權(quán)利要求29的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述白蛋白結(jié)合受體蛋白是蛋白G。31.權(quán)利要求30的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述白蛋白結(jié)合受體蛋白是來自鏈球菌菌株G148的蛋白G。32.權(quán)利要求31的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域選自由來自鏈球菌菌株G148的蛋白G的結(jié)構(gòu)域GA1、結(jié)構(gòu)域GA2和結(jié)構(gòu)域GA3組成的組。33.權(quán)利要求32的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域是來自鏈球菌菌株G148的蛋白G的結(jié)構(gòu)域GA3。34.權(quán)利要求27的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述細菌受體蛋白是來自金黃色葡萄球菌的蛋白A。35.權(quán)利要求34的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域選自蛋白A結(jié)構(gòu)域A、B、C、D和E組成的組。36.權(quán)利要求34的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域是源自來自金黃色葡萄球菌的蛋白A的結(jié)構(gòu)域B的蛋白Z。37.權(quán)利要求26的白蛋白結(jié)合多肽，其包含氨基酸序列LAEAKXaXbAXcXdELXeKY_[ABM]-LAALP射[ABM]是權(quán)利要求1-25任一項定義的白蛋白結(jié)合基序，以及，各自獨立地，Xa選自V禾口E;Xb選自L，E和D;Xc選自N，L禾口I;&選自R和K;及Xe選自D和K。38.權(quán)利要求37的白蛋白結(jié)合多肽，其中l(wèi)是V。39.權(quán)利要求37-38任一項的白蛋白結(jié)合多肽，其中Xb是L。40.權(quán)利要求37-39任一項的白蛋白結(jié)合多肽，其中X。是N。41.權(quán)利要求37-40任一項的白蛋白結(jié)合多肽，其中Xd是R。42.權(quán)利要求37-41任一項的白蛋白結(jié)合多肽，其中Xe是D。43.白蛋白結(jié)合多肽，其氨基酸序列包含滿足選自如下的一種定義的序列i)其選自SEQIDNO:258-514;i)其是與選自SEQIDNO:258-514的序列有85%或更高相同性的氨基酸序列。44.權(quán)利要求43的白蛋白結(jié)合多肽，其氨基酸序列包含滿足選自如下的一種定義的序列iii)其選自SEQIDNO:247，SEQIDNO:248，SEQIDNO:254，SEQIDNO:260，SEQIDNO:270，SEQIDNO:272，SEQIDNO:291，SEQIDNO:294，SEQIDNO:298，SEQIDNO:299，SEQIDNO:300，SEQIDNO:400，SEQIDNO:484，SEQIDNO:485，SEQIDNO:486，SEQIDNO:487，SEQIDNO:488，SEQIDNO:489和SEQIDNO:490;iv)其是與iii)的序列有85%或更高相同性的氨基酸序列。45.權(quán)利要求44的白蛋白結(jié)合多肽，其氨基酸序列包含滿足選自如下的一種定義的序列v)其選自SEQIDNO:248，SEQIDNO:298和SEQIDNO:484;vi)其是與v)的序列有85%或更高相同性的氨基酸序列。46.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，其結(jié)合白蛋白，從而相互作用的K。值最大為1X10—10M。47.權(quán)利要求46的白蛋白結(jié)合多肽，其結(jié)合白蛋白，從而相互作用的K。值最大為1X10—"M。48.權(quán)利要求47的白蛋白結(jié)合多肽，其結(jié)合白蛋白，從而相互作用的K。值最大為1X10—12M。49.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，其結(jié)合人血清白蛋白。50.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽，進一步包含位于白蛋白結(jié)合基序一側(cè)或兩側(cè)的一或多個額外氨基酸。51.權(quán)利要求50的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述額外氨基酸增強白蛋白被多肽的結(jié)合。52.權(quán)利要求50的白蛋白結(jié)合多肽，其中所述額外氨基酸改良選自多肽的生產(chǎn)、純化、體內(nèi)或體外穩(wěn)定化、偶聯(lián)或檢測及其任意組合的特征。53.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽的片段，所述片段基本上保留白蛋白結(jié)合。54.權(quán)利要求53的片段，相應于N-末端截短的權(quán)利要求l-52任一項的白蛋白結(jié)合多肽。55.權(quán)利要求54的片段，其中N-末端截短是1-3個氨基酸截短。56.前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽或其片段的多聚體，包含至少二個白蛋白結(jié)合多肽或其片段作為單體單位。57.權(quán)利要求56的多聚體，其中單體單位的氨基酸序列相同。58.權(quán)利要求56的多聚體，其中單體單位的氨基酸序列不同。59.融合蛋白或綴合物，包含i)第一部分，由前述任一項權(quán)利要求的白蛋白結(jié)合多肽、片段或多聚體組成；及ii)第二部分，由具有希望的生物學活性的多肽組成。60.權(quán)利要求59的融合蛋白或綴合物，其中所述希望的生物學活性是治療活性。61.權(quán)利要求59的融合蛋白或綴合物，其中所述希望的生物學活性是結(jié)合活性。62.權(quán)利要求59的融合蛋白或綴合物，其中所述希望的生物學活性是酶活性。63.權(quán)利要求59的融合蛋白或綴合物，其中所述第二部分選自由GLP-1;HGH;G-CSF;IL-1受體激動劑；TNF-a;和凝血因子VII、VIII、IX和X組成的組。64.權(quán)利要求59的融合蛋白或綴合物，其中所述第二部分是能與靶分子選擇性相互作用的結(jié)合部分，所述結(jié)合部分選自如下一組抗體及其基本上保留抗體結(jié)合活性的片段和結(jié)構(gòu)域；微體，maxybodies，高親合性多聚體及其他小的含二硫鍵蛋白質(zhì)；及衍生自選自下組的骨架的結(jié)合蛋白葡萄球菌蛋白A及其結(jié)構(gòu)域；lipocalins，錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Y，綠色熒光蛋白，人細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4，蛋白酶抑制劑，PDZ結(jié)構(gòu)域，肽適體，葡萄球菌核酸酶，tendamistats，纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域，鋅指，芋螺毒素和Kunitz結(jié)構(gòu)域。65.權(quán)利要求64的融合蛋白或綴合物，其中所述靶分子選自如下一組AI3肽；其他疾病相關淀粉樣肽；毒素，如細菌毒素和蛇毒；凝血因子，如vonWillebrand因子；白介素，如IL-13;肌抑素；促炎因子，如TNF-a，TNF-a受體和IL-8;補體因子，如C3a和C5a;過敏介質(zhì)，如組胺和IgE;腫瘤相關抗原，如CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD40，CD52，CD70，cMet，HER1，HER2，HER3，HER4，CA9，CEA，IL-2受體，MUC1，PSMA，TAG-72。66.前述任一項權(quán)利要求的多肽，進一步包含標記。67.權(quán)利要求66的多肽，其中所述標記選自由熒光染料和金屬、生色染料、化學發(fā)光化合物及生物發(fā)光蛋白、酶、放射性核素和顆粒組成的組。68.編碼權(quán)利要求1-65任一項的多肽的多核苷酸。69.產(chǎn)生權(quán)利要求1-65任一項的多肽的方法，包括表達權(quán)利要求68的多核苷酸。70.包含權(quán)利要求69的多核苷酸的表達載體。71.包含權(quán)利要求70的表達載體的宿主細胞。72.產(chǎn)生權(quán)利要求l-65任一項的多肽的方法，包括在允許多肽從所述表達載體表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求71的宿主細胞，及分離所述多肽。73.權(quán)利要求59-65任一項的融合蛋白或綴合物在制備藥物中的應用，所述藥物顯示比具有希望的生物學活性的多肽本身的體內(nèi)半衰期更長的體內(nèi)半衰期。74.權(quán)利要求59-65任一項的融合蛋白或綴合物在制備藥物中的應用，所述藥物與在將具有希望的生物學活性的多肽本身給予哺乳動物引起的免疫應答相比在給予哺乳動物時不引起免疫應答或引起降低的免疫應答。75.組合物，包含本身在水中溶解度不超過100iig/ml的化合物，其偶聯(lián)于白蛋白結(jié)合多肽，其具有對白蛋白的親和性，從而相互作用的K。不超過1X10—6M。76.權(quán)利要求75的組合物，其中所述溶解度不超過10iig/ml。77.權(quán)利要求76的組合物，其中所述溶解度不超過1yg/ml。78.權(quán)利要求75-77任一項的組合物，其中所述KD不超過1X10—9M。79.權(quán)利要求78的組合物，其中KD不超過1X10—1QM。80.權(quán)利要求79的組合物，其中KD不超過1X10—"M。81.權(quán)利要求80的組合物，其中KD不超過1X10—12M。82.權(quán)利要求75-81任一項的組合物，其中所述化合物是藥物活性化合物。83.權(quán)利要求82的組合物，其中所述藥物活性化合物是細胞毒性劑。84.權(quán)利要求83的組合物，其中所述細胞毒性劑選自calicheamycin，auhstatin，阿霉素、maytansinoid、紫杉醇、ecteinascidin、格爾德霉素及其衍生物以及其組合。85.權(quán)利要求83的組合物，其中所述細胞毒性劑是非衍生自天然發(fā)生化合物的合成化學毒素。86.權(quán)利要求75-85任一項的組合物，其中所述化合物和所述白蛋白結(jié)合多肽是共價偶聯(lián)的。87.權(quán)利要求75-86任一項的組合物，其中所述白蛋白結(jié)合多肽是天然發(fā)生的多肽或其白蛋白結(jié)合片段或衍生物。88.權(quán)利要求87的組合物，其中天然發(fā)生的多肽選自蛋白質(zhì)M1/Emml、M3/Emm3、M12/Emml2、EmmL55/Emm55、Emm49/EmmL49、H、G、MAG、ZAG、PPL和PAB。89.權(quán)利要求88的組合物，其中所述白蛋白結(jié)合多肽是鏈球菌蛋白G或其白蛋白結(jié)合片段或衍生物。90.權(quán)利要求89的組合物，其中所述白蛋白結(jié)合多肽選自由來自鏈球菌菌株G148的蛋白G的結(jié)構(gòu)域GA1、結(jié)構(gòu)域GA2和結(jié)構(gòu)域GA3組成的組。91.權(quán)利要求75-90的組合物，其中所述白蛋白結(jié)合多肽包含大約5至大約214個氨基酸殘基。92.權(quán)利要求91的組合物，其中所述白蛋白結(jié)合多肽包含大約5至大約46個氨基酸殘基。93.權(quán)利要求92的組合物，其中所述白蛋白結(jié)合多肽包含大約10至大約20個氨基酸殘基。94.權(quán)利要求75-93任一項的組合物，其中所述白蛋白結(jié)合多肽包含選自DICLPRWGCLW，DLCLRDWGCLW和DICLARWGCLW的氨基酸序列。95.權(quán)利要求75-94任一項的組合物，其中所述白蛋白結(jié)合多肽是權(quán)利要求1-67任一項的白蛋白結(jié)合多肽。96.權(quán)利要求75-95任一項的組合物，其中所述白蛋白結(jié)合多肽能與人血清白蛋白中的殘基F228、A229、A322、V325、F326和M329中的至少一個、優(yōu)選全部相互作用以增強分子與白蛋白的結(jié)合。97.權(quán)利要求96的組合物，其中所述白蛋白結(jié)合多肽包括氨基酸殘基，其形成與人血清白蛋白中M329的相互作用以增強分子與白蛋白的結(jié)合。98.權(quán)利要求75-97任一項的組合物，其中所述白蛋白結(jié)合多肽包括氨基酸殘基，其形成與人血清白蛋白結(jié)構(gòu)域IIB中螺旋7的相互作用以增強分子與白蛋白的結(jié)合。99.權(quán)利要求75-98任一項的組合物，其中所述白蛋白結(jié)合多肽包括氨基酸殘基，其形成與人血清白蛋白結(jié)構(gòu)域IIA中殘基的相互作用以增強分子與白蛋白的結(jié)合。100.權(quán)利要求75-99任一項的組合物，其中所述白蛋白結(jié)合多肽包括氨基酸殘基，其形成與人血清白蛋白螺旋2和3之間的殘基的相互作用以增強分子與白蛋白的結(jié)合。101.權(quán)利要求75-100任一項的組合物，其進一步包含具有對臨床相關靶有結(jié)合親和性的多肽。102.權(quán)利要求101的組合物，其中所述結(jié)合多肽選自如下一組抗體及其基本上保留抗體結(jié)合活性的片段和結(jié)構(gòu)域；微體，maxybodies，高親合性多聚體及其他小的含二硫鍵蛋白質(zhì)；及衍生自選自如下一組骨架的結(jié)合蛋白，所述的組由如下組成葡萄球菌蛋白A及其結(jié)構(gòu)域；lipocalins，錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Y晶體，綠色熒光蛋白，人細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4，蛋白酶抑制劑，PDZ結(jié)構(gòu)域，肽適體(即tamer)，葡萄球菌核酸酶，tendamistats，纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域，鋅指，芋螺毒素和Kunitz結(jié)構(gòu)域。103.權(quán)利要求75-102任一項的組合物，其進一步包含白蛋白。104.權(quán)利要求103的組合物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。105.制備權(quán)利要求75-102任一項的組合物的方法，包括提供化合物，所述化合物本身在水中溶解度不超過100iig/ml;及將所述化合物與白蛋白結(jié)合多肽共價偶聯(lián)，所述多肽具有對白蛋白的親和性，從而所述相互作用的KD不超過IX10—6M，由此形成包含化合物與白蛋白結(jié)合多肽的共價復合物的組合物。106.權(quán)利要求105的方法，其進一步包括將化合物和白蛋白結(jié)合多肽的所述復合物與白蛋白混合，由此形成包含i)化合物和白蛋白結(jié)合多肽的共價復合物和ii)白蛋白的非共價復合物的組合物。107.權(quán)利要求106的方法，其進一步包括凍干包含所述非共價復合物的所述組合物以獲得凍干組合物。108.增加化合物的水溶解度的方法，包括提供化合物，所述化合物本身在水中溶解度不超過lOOiig/ml;將所述化合物與白蛋白結(jié)合多肽共價偶聯(lián)，所述多肽具有對白蛋白的親和性，從而所述相互作用的KD不超過IX10—6M，由此形成化合物與白蛋白結(jié)合多肽的共價復合物；及在促進白蛋白結(jié)合多肽與白蛋白的非共價締合的條件下將化合物和白蛋白結(jié)合多肽的所述復合物與白蛋白混合；由此所述復合物中的化合物在水中的溶解度大于化合物本身在水中的溶解度。109.權(quán)利要求105-108任一項的方法，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。110.權(quán)利要求105-109任一項的方法，其中所述溶解度和/或K。如權(quán)利要求76-81任一項的定義。111.權(quán)利要求105-110任一項的方法，其中所述化合物如權(quán)利要求82-85任一項的定義。112.權(quán)利要求105-111任一項的方法，其中所述白蛋白結(jié)合多肽如權(quán)利要求87-100任一項的定義。113.權(quán)利要求105-112任一項的方法，其中所述復合物進一步包含具有對臨床相關靶的結(jié)合親和性的多肽。114.權(quán)利要求113的方法，其中所述結(jié)合多肽如權(quán)利要求102的定義。115.權(quán)利要求82-104的組合物，用作藥物。全文摘要本發(fā)明涉及一類具有白蛋白結(jié)合親和性的工程化多肽。還涉及新的方法及應用，其采用這些及其它化合物與白蛋白在不同環(huán)境中的結(jié)合，其中一些具有治療哺乳動物包括人類的疾病的意義。文檔編號C07K14/195GK101765608SQ200880101168公開日2010年6月30日申請日期2008年7月17日優(yōu)先權(quán)日2007年7月31日發(fā)明者A·榮森,J·多甘,L·阿布拉姆森,P-A·尼格倫申請人:阿菲博迪公司