專利名稱：：核糖開關(guān)及使用核糖開關(guān)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本文公開的發(fā)明主要涉及基因表達(dá)領(lǐng)域，具體涉及基因表達(dá)調(diào)節(jié)的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：精確遺傳控制是活體系統(tǒng)的一個基本特征，因為細(xì)胞必須通過改變基因表達(dá)模式來對多種生化信號和環(huán)境信號作出應(yīng)答。大多數(shù)已知的遺傳控制機(jī)制涉及到蛋白因子的使用，所述蛋白因子會感受到化學(xué)或物理刺激，然后通過與相關(guān)DNA或信使RNA序列選擇性相互作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。蛋白可采用復(fù)雜形狀并行使使活體系統(tǒng)可準(zhǔn)確地感受到它們的化學(xué)和物理環(huán)境的多種功能。對代謝物有應(yīng)答的蛋白因子通常通過結(jié)合DNA調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始(如lac阻遏蛋白；Matthews,K.S.，andNichols,J.C.，1998，Prog.NucleicAcidsRes.Mol.Biol.58,127-164)或通過結(jié)合RNA控制轉(zhuǎn)錄終止(如PyrR蛋白；Switzer,R.L.，etal.，1999，Prog.NucleicAcidsRes.Mol.Biol.62，329-367)或翻譯(如TRAP蛋白；Babitzke,P.，andGollnick,P.，2001，J.Bacteriol.183,5795-5802)來發(fā)揮作用。蛋白因子通過多種機(jī)制如變構(gòu)調(diào)節(jié)或翻譯后修飾來應(yīng)答于環(huán)境刺激，并擅長利用這些機(jī)制來作為高反應(yīng)性遺傳開關(guān)(如參見Ptashne，M.，andGann，A.(2002).GenesandSignals.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。除了蛋白質(zhì)因子廣泛參與基因控制之外，還已知RNA也可在基因調(diào)節(jié)中有活躍的作用。最近的研究逐漸揭示出小的非編碼RNA在選擇性靶向破壞mRNA從而導(dǎo)致基因表達(dá)的下調(diào)方面的重要作用(參見例如Hannon，GJ.2002，Nature418，244-251和該文章的參考文獻(xiàn))。這種RNA干擾過程利用了短RNA通過Watson-Crick堿基互補(bǔ)而選擇性識別目標(biāo)mRNA靶標(biāo)的能力，在該過程之后被結(jié)合的mRNA通過蛋白質(zhì)的作用而被破壞。在這一系統(tǒng)中RNA為分子識別的理想媒介物，因為通過進(jìn)化過程產(chǎn)生新的靶標(biāo)特異性RNA因子要比產(chǎn)生具有新的高特異性RNA結(jié)合位點的蛋白質(zhì)因子容易得多。雖然蛋白質(zhì)可以滿足生物學(xué)對于酶、受體和結(jié)構(gòu)功能的大部分需求，但是RNA也具有這些能力。例如，RNA具有足夠的結(jié)構(gòu)塑性，能形成多種具有很高的酶活力和精確的分子i只另1J能力的核BI結(jié)豐勾域(Cech&Golden,BuildingacatalyticactivesiteusingonlyRNA.In:TheRNAfforldR.F.Gesteland,T.R.Cech,J.F.Atkins,eds.，pp.321-350(1998)；Breaker,Invitroselectionofcatalyticpolynucleotides.Chem.Rev.97,371-390(1997))和受體結(jié)構(gòu)域(Osborne&Ellington，Nucleicacidselectionandthechallengeofcombinatorialchemistry.Chem.Rev.97,349-370(1997)；Hermann&Patel,Adaptiverecognitionbynucleicacidadapters.Science287,820-825(2000))。此外，上述能力還可以組合產(chǎn)生可被效應(yīng)物分子選擇性調(diào)節(jié)的變構(gòu)核酶(Soukup&Breaker，EngineeringprecisionRNAmolecularswitches.Proc.Natl.Acad.Sci.USA96,3584-3589(1999)；Seetharamanetal.,Immobilizedriboswitchesfortheanalysisofcomplexchemicalandbiologicalmixtures.NatureBiotechnol.19,336-341(2001))。細(xì)菌核糖開關(guān)RNA是主要位于特定mRNA的主編碼區(qū)的5‘非翻譯區(qū)(5‘-UTR)內(nèi)的遺傳控制元件。結(jié)構(gòu)探測研究(后文進(jìn)一步討論)揭示了核糖開關(guān)元件通常由兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成一個用做配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然適體(T.Hermann，D.J.Patel，Science2000，287,820；L.Gold,etal.,AnnualReviewofBiochemistry1995，64，763)，以及一個與參與基因表達(dá)的RNA元件接合(interface)的“表達(dá)平臺”(如Shine-Dalgarno(SD)元件；轉(zhuǎn)錄終止子莖)。
發(fā)明內(nèi)容本文公開了一種包含編碼這樣的一個RNA的核酸分子的可調(diào)節(jié)基因表達(dá)構(gòu)建體，即該RNA包含一個可操作連接于一個編碼區(qū)的核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)調(diào)節(jié)所述RNA的表達(dá)，其中所述核糖開關(guān)和編碼區(qū)是異源的。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。所述核糖開關(guān)可包含一個適體結(jié)構(gòu)域和一個表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域是異源的。所述核糖開關(guān)還可包含兩個或多個適體結(jié)構(gòu)域和一個表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域，其中至少一個所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域是異源的。至少兩個所述適體結(jié)構(gòu)域可呈現(xiàn)出協(xié)同性結(jié)合。還公開了一種核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)是一種天然存在的核糖開關(guān)的非天然衍生物。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。所述核糖開關(guān)可包含一個適體結(jié)構(gòu)域和一個表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域是異源的。所述核糖開關(guān)還可包含一個或多個其他適體結(jié)構(gòu)域。至少兩個所述適體結(jié)構(gòu)域可呈現(xiàn)出協(xié)同性結(jié)合。所述核糖開關(guān)可被一觸發(fā)分子激活，其中所述核糖開關(guān)被所述觸發(fā)分子激活時產(chǎn)生一個信號。還公開了一種檢測目的化合物的方法，所述方法包括將一個樣品與一種核糖開關(guān)進(jìn)行接觸，其中所述核糖開關(guān)可被所述目的化合物激活，其中所述核糖開關(guān)被所述目的化合物激活時產(chǎn)生一個信號，其中當(dāng)所述樣品包含所述目的化合物時所述核糖開關(guān)產(chǎn)生一個信號，其中所述核糖開關(guān)包括一種核糖開關(guān)或一種核糖開關(guān)的衍生物。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。當(dāng)所述目的化合物激活所述核糖開關(guān)時，所述核糖開關(guān)可改變構(gòu)象，其中所述構(gòu)象變化通過構(gòu)象依賴標(biāo)記產(chǎn)生一個信號。當(dāng)所述目的化合物激活核糖開關(guān)時，所述核糖開關(guān)還可改變構(gòu)象，其中所述構(gòu)象變化會引起連接所述核糖開關(guān)的RNA表達(dá)的變化，其中所述表達(dá)變化產(chǎn)生一個信號。所述信號可由連接至所述核糖開關(guān)的RNA表達(dá)的報告蛋白產(chǎn)生。還公開了一種方法，包括(a)測試一種抑制編碼含有核糖開關(guān)的RNA的基因的基因表達(dá)的化合物，其中所述抑制通過所述核糖開關(guān)實現(xiàn)，其中所述核糖開關(guān)包括一種核糖開關(guān)或一種核糖開關(guān)的衍生物；(b)通過使一種細(xì)胞和步驟(a)中抑制基因表達(dá)的一種化合物相接觸來抑制基因表達(dá)，其中所述細(xì)胞含有編碼含有核糖開關(guān)的RNA的基因，其中所述化合物通過結(jié)合到所述核糖開關(guān)抑制所述基因的表達(dá)。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。還公開了一種方法，包括(a)測試一種脫抑制編碼含有核糖開關(guān)的RNA的基因的基因表達(dá)的化合物，其中所述脫抑制通過所述核糖開關(guān)實現(xiàn)，其中所述核糖開關(guān)包括一種核糖開關(guān)或一種核糖開關(guān)的衍生物；(b)通過使一種細(xì)胞和步驟(a)中脫抑制基因表達(dá)的一種化合物相接觸來脫抑制基因表達(dá)，其中所述細(xì)胞含有編碼含有核糖開關(guān)的RNA的基因，其中所述化合物通過結(jié)合到所述核糖開關(guān)脫抑制所述基因的表達(dá)。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。公開了一種識別核糖開關(guān)的方法，所述方法包括在存在和不存在觸發(fā)分子的條件下評估RNA分子的直讀探測的自發(fā)切割(in-linespontaneouscleavage)，其中所述RNA分子由被所述觸發(fā)分子調(diào)節(jié)的基因所編碼，其中RNA分子的直讀探測的自發(fā)切割模式的改變表明一種核糖開關(guān)對所述觸發(fā)分子有應(yīng)答。所述觸發(fā)分子可以是環(huán)二GMP、S-腺苷高半胱氨酸、preQpMoco或SAM。還公開了一種改變基因表達(dá)的方法，所述方法包括使一種化合物和一個細(xì)胞相接觸，其中所述化合物為環(huán)二GMP、pGpG、GpG或GpGpG。所述化合物還可以為可激活一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)的環(huán)二GMP、pGpG、GpG或GpGpG的衍生物。還公開了一種改變基因表達(dá)的方法，所述方法包括使一種化合物和一個細(xì)胞相接觸，其中所述化合物為S-腺苷高半胱氨酸。所述化合物還可以為可激活一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)的S-腺苷高半胱氨酸衍生物。例如，所述化合物可以為S-腺苷-L-半胱氨酸(SAC)。還公開了一種改變基因表達(dá)的方法，所述方法包括使一種化合物和一個細(xì)胞相接觸，其中所述化合物為preQ10所述化合物還可以是能夠激活一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)的preQjiJ生物。還公開了一種改變基因表達(dá)的方法，所述方法包括使一種化合物和一個細(xì)胞相接觸，其中所述化合物為Moco。所述化合物還可以是能夠激活一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)的Moco衍生物。還公開了一種改變基因表達(dá)的方法，所述方法包括使一種化合物和一個細(xì)胞相接觸，其中所述化合物為SAM。所述化合物還可以是能夠激活一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)的SAM衍生物。用于激活一種SAM-IV核糖開關(guān)的化合物還可以為MeAzaAdoMet。對于preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)(及衍生自preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)的核糖開關(guān))有用的化合物包括preQi的衍生物，其中第1位的N可以被取代為C、0或S，其中第2位的氨基可被取代為氫鍵供體，其中第6位的氧可被取代為氫鍵受體，其中第7位的氨基可被取代為氫鍵受體，并且所述氮可被取代為或者衍生為氫鍵供體。氫鍵供體和受體的實例包括NH、NH2\NH3\0、OH、S、SH、C_R5、CH_R5、N_R5、NH_R5、O-R5或S-R5，其中R5為NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、c(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、羥甲基、1-羥乙基、2-羥乙基、1，2-二羥乙基、2-羥-1-甲基乙基、1-羥丙基、2-羥丙基、3-羥丙基、1，3-二羥丙基、2，3-二羥丙基、1-羥丁基、2-羥丁基、3-羥丁基、4-羥丁基、1，4_二羥丁基、2，4-二羥丁基、1-羥-2-甲基丙基、2-羥-2-甲基丙基、3-羥-2-甲基丙基、1_羥甲基-1-甲基乙基、三羥甲基甲基、硫醇甲基、1-硫醇乙基、2-硫醇乙基、1，2-二硫醇乙基、2-硫醇-1-甲基乙基，1-硫醇丙基、2-硫醇丙基、3-硫醇丙基、1，3-二硫醇丙基、2，3-二硫醇丙基、1-硫醇丁基、2-硫醇丁基、3-硫醇丁基、4-硫醇丁基、1，4-二硫醇丁基、2，4-二硫醇丁基、1-硫醇-2-甲基丙基、2-硫醇-2-甲基丙基、3-硫醇-2-甲基丙基、1-硫醇甲基-1-甲基乙基、三硫醇甲基甲基、氨基甲基、1-氨基乙基、2-氨基乙基、1，2-二氨基乙基、2-氨基-1-甲基乙基、1-氨基丙基、2-氨基丙基、3-氨基丙基、1，3-二氨基丙基、2，3-二氨基丙基、1-氨基丁基、2-氨基丁基、3-氨基丁基、4-氨基丁基、1，4-二氨基丁基、2，4-二氨基丁基、1-氨基-2-甲基丙基、2-氨基-2-甲基丙基、3-氨基-2-甲基丙基、1-氨基甲基-1-甲基乙基和三氨基甲基甲基。所述細(xì)胞可以被鑒定為需要改變的基因表達(dá)。所述細(xì)胞可以是一種細(xì)菌細(xì)胞。所述化合物可殺滅所述細(xì)菌細(xì)胞或抑制所述細(xì)菌細(xì)胞的生長。可以通過將所述化合物給予一名受試者以使所述化合物和所述細(xì)胞相接觸。所述細(xì)胞是所述受試者體內(nèi)的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述化合物殺滅所述細(xì)菌細(xì)胞或抑制所述細(xì)菌細(xì)胞的生長。所述受試者可具有細(xì)菌感染。所述細(xì)胞可包含一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。所述化合物與另一種抗微生物化合物聯(lián)合給藥。所述化合物可抑制細(xì)菌在生物膜中的生長。還公開了一種改變細(xì)胞生理狀態(tài)的方法，所述方法包括使一種化合物和一個細(xì)胞相接觸，其中所述化合物為環(huán)二GMP、pGpG、GpG或GpGpG。所述化合物還可以為可激活一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)的環(huán)二GMP、pGpG、GpG或GpGpG的衍生物。還公開了一種產(chǎn)生觸發(fā)分子的方法，所述方法包括培養(yǎng)能夠產(chǎn)生所述觸發(fā)分子的突變細(xì)菌細(xì)胞，其中所述突變細(xì)菌細(xì)胞在一種對所述觸發(fā)分子應(yīng)答的核糖開關(guān)中包含一種突變，相對于不具有所述突變的細(xì)胞，所述突變增加了由突變細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的觸發(fā)分子；以及從所述細(xì)胞培養(yǎng)物分離觸發(fā)分子，從而產(chǎn)生所述觸發(fā)分子。所述觸發(fā)分子可為例如環(huán)二GMP、S-腺苷高半胱氨酸、preQpMoco或SAM。該方法與培養(yǎng)在所述核糖開關(guān)中不包含突變的細(xì)菌細(xì)胞相比可獲得至少提高10%的所述觸發(fā)分子產(chǎn)生量。該方法與培養(yǎng)其中在所述核糖開關(guān)中不包含突變的細(xì)菌細(xì)胞相比所述觸發(fā)分子的產(chǎn)生量可至少提高15%。該方法與培養(yǎng)在所述核糖開關(guān)中不包含突變的細(xì)菌細(xì)胞相比可獲得至少提高25%的所述觸發(fā)分子產(chǎn)生量。所述核糖開關(guān)可包含一種敲除突變。還公開一種在核糖開關(guān)中包含突變的細(xì)菌細(xì)胞，與不具有所述突變的細(xì)胞相比，所述突變將所述細(xì)胞產(chǎn)生的所述核糖開關(guān)觸發(fā)分子提高至可測量的程度。本文公開了一種抑制細(xì)菌細(xì)胞生長的方法，該方法包括使一個細(xì)胞和一種可結(jié)合核糖開關(guān)的化合物相接觸，其中所述細(xì)胞包含編碼包含對所述化合物應(yīng)答的核糖開關(guān)的RNA基因，其中所述化合物通過結(jié)合于所述核糖開關(guān)而抑制細(xì)菌細(xì)胞生長，從而改變所述基因的表達(dá)。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。與未接觸所述化合物的細(xì)胞相比，該方法可使細(xì)菌細(xì)胞生長至少降低10%?？赏ㄟ^將所述化合物給予受試者而使所述化合物和所述細(xì)胞相接觸。所述細(xì)胞可以為所述受試者體內(nèi)的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述化合物殺滅所述細(xì)菌細(xì)胞或抑制所述細(xì)菌細(xì)胞生長。所述受試者可具有細(xì)菌感染。所述化合物可與另一種抗微生物化合物聯(lián)合給藥。公開了一種在樣品中檢測一化合物的方法，包括使對所述化合物應(yīng)答的核糖開關(guān)與所述樣品相接觸；以及檢測化合物和所述核糖開關(guān)之間的相互作用，其中化合物和所述核糖開關(guān)之間的相互作用指示存在所述化合物。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。所述核糖開關(guān)可以是被標(biāo)記的。還公開了一種方法，包括通過以下方式抑制一個編碼包含核糖開關(guān)的RNA的基因的基因表達(dá)使一個細(xì)胞與這樣的一種化合物相接觸，即通過測驗該化合物對所述基因的基因表達(dá)的抑制情況，該化合物被鑒定為一種抑制所述基因的基因表達(dá)的化合物，其中所述抑制經(jīng)由所述核糖開關(guān)實現(xiàn)。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)，或這些核糖開關(guān)的衍生物。還公開了一種方法，包括通過以下方式脫抑制一個編碼包含核糖開關(guān)的RNA的基因的基因表達(dá)使一個細(xì)胞與這樣的一種化合物相接觸，即通過測驗該化合物對所述基因的基因表達(dá)的脫抑制情況，該化合物被鑒定為一種脫抑制所述基因的基因表達(dá)的化合物，其中所述脫抑制經(jīng)由所述核糖開關(guān)實現(xiàn)。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)，或這些核糖開關(guān)的衍生物。所公開的方法和組合物的其他優(yōu)點一部分將在下文的描述中闡明，一部分可以從說明書中獲知，或者可通過實施公開的方法和組合物而得知。所公開的方法和組合物的優(yōu)點將通過所附權(quán)利要求書中具體指明的要素和組合實現(xiàn)和獲得。應(yīng)當(dāng)理解的是，上文的一般性描述和下文的具體描述都僅僅是示例性和解釋性的，并不是對本發(fā)明要求保護(hù)范圍的限制。附圖包含于本說明書中并作為本說明書的一部分，附圖闡述了所公開方法和組合物的一些實施方案，它與文字描述一起作為對所公開方法和組合物的原理的解釋。圖1所示描述了所鑒定的22個基序中的7個的共有序列和結(jié)構(gòu)。對核苷酸同一性的保守性的計算/相關(guān)變異的存在和證據(jù)在實施例1中描述。具有超過5%非標(biāo)準(zhǔn)的(non-canonical)或缺失核苷酸的提議核苷酸對不被歸為相關(guān)變異類別。應(yīng)注意，核苷酸保守的水平受對所述基序的生物化學(xué)約束的影響以及受系統(tǒng)發(fā)生多樣性的影響。有限范圍的基序(例如preQi-II基序或C0G4708基序)將呈現(xiàn)出更加保守，長度可變的莖中的某些相關(guān)變異位置未示出。圖2顯示了GEMM基序的共同特征。選擇兩個GEMM實例以說明共同特征，但這兩個實例不代表全部322種GEMM。(A)該推定的RNA包含一標(biāo)準(zhǔn)的GNRA四元環(huán)和受體(灰色區(qū))。幾乎50%的GEMM實例包含一個可能的四元環(huán)受體。下游操縱子中僅第一基因被顯示。(B)—些GEMMRNA缺少四元環(huán)受體，但有兩個特別凸出的A殘基(灰色陰影)，它們出現(xiàn)于差不多半數(shù)缺乏受體的序列中?；疑蟿澗€的核苷酸可折疊形成一個不依賴于P的轉(zhuǎn)錄終止子莖(接著是3'端尾U)。該終止子似乎與P2莖(最右側(cè)的發(fā)夾)的3'部分競爭。322個GEMM實例中的78個具有與P2重疊的預(yù)測轉(zhuǎn)錄終止子。圖3顯示了環(huán)二GMP適體。㈧第二信使環(huán)二GMP的化學(xué)結(jié)構(gòu)。(B)1型及2型GEMMRNA的共有序列和結(jié)構(gòu)。(C)來自霍亂弧菌(V.cholerae)2號染色體的Vc2RNA的序列和結(jié)構(gòu)，及其鄰近VC17220RF的部分。所示的核苷酸對應(yīng)于110Vc2RNA構(gòu)建體。黑體數(shù)字標(biāo)識出如出現(xiàn)于D中的配體介導(dǎo)的結(jié)構(gòu)調(diào)變(structuremodulation)區(qū)。括號標(biāo)識出所述最小5'或3'末端(當(dāng)110Vc2RNA的對立末端被保留時)，所述末端在被以IOnM環(huán)二GMP測試時呈現(xiàn)出結(jié)構(gòu)調(diào)變。核苷酸13-20的序列為CGCACAGG。(D)由5'32P-標(biāo)記的110Vc2RNA直讀探測(in-lineprobing)生成的RNA產(chǎn)物的PAGE分離。NR(無反應(yīng))；Tl(以RNaseTl部分消化)；_0H(以堿部分消化)。將RNA在不存在㈠或存在⑴100μM環(huán)二GMP的情況下孵育。圖4顯示了環(huán)二GMP的Vc2適體的親和性和特異性。㈧切割的110Vc2適體的標(biāo)準(zhǔn)化分?jǐn)?shù)相對于環(huán)二GMP濃度的曲線圖。結(jié)構(gòu)調(diào)變位點如圖3中所示。(B)環(huán)二GMP的110Vc2適體和多種類似物所呈現(xiàn)的Kd值的比較。G(鳥苷)；pG、pGpG、pGpA(5'端磷酸化的單核苷酸及二核苷酸)；GpGpG(三核苷酸)、AMP和GMP(分別為腺苷單磷酸和鳥苷單磷酸)。(C)在直讀探測條件下，保持完整的環(huán)二GMP的分?jǐn)?shù)的自然對數(shù)相對于孵育時間的曲線圖。線的負(fù)斜率可反映第二信使切割的非催化速率常數(shù)(km。at)。圖5顯示了代表性環(huán)二GMP適體為基因控制元件的組件。(A)報告融合物構(gòu)建體攜帶來自霍亂弧菌(Vc2)的野生型(WT)或突變型(Ml至M3)核糖開關(guān)，或者攜帶來自蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)(Bcl和Bc2)或艱難梭菌(C.difficile)(Cdl)的同等WT和M3核糖開關(guān)。(B)當(dāng)A中描述的構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)中時，對這些構(gòu)建體的半乳糖苷酶報告基因測定。對這4個代表物測定的最大Miller單位分別是436、47、5和51。(C)攜帶下游融合WT或M3Cdl核糖開關(guān)的半乳糖苷酶報告基因(IacZ)并且被培養(yǎng)于含X-gal瓊脂上的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)細(xì)胞。圖6顯示了表達(dá)一種環(huán)二GMP磷酸二酯酶可改變所述Cdl核糖開關(guān)調(diào)節(jié)的報告基因。(A)如下這樣的枯草芽孢桿菌細(xì)胞，即該細(xì)胞攜帶與野生型(WT)Cdl核糖開關(guān)融合的β-半乳糖苷酶報告物構(gòu)建體，并且被以缺乏(_)或攜帶(+)編碼EAL磷酸二酯酶(PDE)的正常或突變(Ε170Α)霍亂弧菌VieA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。(B)如下這樣的枯草芽孢桿菌細(xì)胞的β-半乳糖苷酶報告物測定，即該細(xì)胞攜帶與如指定的WT或Μ3核糖開關(guān)融合的報告基因，并被以A中描述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。Cdl的標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)值1代表102個Miller單位。圖7顯示了代表性生物的環(huán)二GMP核糖開關(guān)或適體的基因組定位。示出了緊接位于代表物下游的基因，如果是多個基因則表示預(yù)測的操縱子。無基因表示所述環(huán)二GMP適體不存在于任何0RF5‘近端。C0G3070連接于一個pfam04994結(jié)構(gòu)域，這是一種類似于TfoX的蛋白排布(93,94)0染色體以陰影線表示；ori(復(fù)制起點)。圖8顯示了真核生物中的典型SAM代謝循環(huán)。來自大腸桿菌(菌株K-12)或丁香假單孢桿菌(Pseudomonassyringae)的基因名在每種酶后的括號中給出。陰影框標(biāo)識緊接SAH元件下游的0RF，而空白框標(biāo)識在存在SAH元件時有時位于SAH水解酶基因ahcY下游(并且有可能與該基因在相同操縱子中)的ORF。THF為四氫葉酸。圖9顯示了SAH元件是存在于許多革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中的高度保守RNA基序。㈧位于SAH再循環(huán)基因5'UTR的保守RNA元件的共有核苷酸序列和二級結(jié)構(gòu)模型。所述共有序列和結(jié)構(gòu)模型的確定是通過檢查68個代表性基序完成，所述基序不包括從幾乎相同基因組DNA中所鑒定的重復(fù)。Pl至P4標(biāo)識了預(yù)測的堿基對區(qū)，并且攜帶或不包括任選P3莖的非重復(fù)的代表物數(shù)目被標(biāo)示出。(B)由生物信息搜索所鑒定并由基因組前后序列所確認(rèn)的SAH元件的系統(tǒng)發(fā)生分布，包括在緊密相關(guān)的細(xì)菌株中重復(fù)命中的相同序列?！捌渌鳖愂侵冈诃h(huán)境序列中出現(xiàn)的命中。圖10顯示了來自芳香脫氯單胞菌(Dechloromonasaromatica)metH5'-UTR的SAH元件在選擇性結(jié)合SAH時發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。(A)68metHRNA的序列和二級結(jié)構(gòu)模型，它包含保守的SAH適體。從B中給出的數(shù)據(jù)鑒定了在5'32P-標(biāo)記的RNA的直讀探測過程中的自發(fā)RNA切割位點。將在天然RNA不存在的兩個鳥苷殘基添加至所述構(gòu)建體的5'端，以利于T7RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄。區(qū)1至8及63至68中的核苷酸無法在B中所示的凝膠上觀察到，因此不對這些殘基的鏈切割定量。(B)在不存在(_)和存在濃度100ρΜ-300μΜ的SAH的條件下，由68metHRNA直讀探測產(chǎn)生的自發(fā)切割模式。泳道NR、Tl和_0H分別標(biāo)識未處理的、以RNaseTl部分消化的或在升高的pH下部分消化的前體RNA。一些通過RNaseTl消化生成(在G殘基后切割)的帶被標(biāo)識(箭頭)，Pre標(biāo)識了未切割的前體RNA帶。自發(fā)RNA切割的調(diào)變區(qū)以豎條標(biāo)識，并且被定量以估計結(jié)合親和性的位點被標(biāo)號為1至3。星號表示對應(yīng)于Gll后切割的產(chǎn)物帶，但其中所述2',3'-環(huán)磷酸中間體已經(jīng)被水解得到在PAGE中呈現(xiàn)略微更大遷移率的2'-和3'-磷酸鹽產(chǎn)物的混合物。(C)的曲線描繪了68metHRNA在B中指定位點的自發(fā)切割對SAH和化合物3濃度(c)的依賴。通過使用對所收集數(shù)據(jù)的最佳擬合曲線并推定一個2態(tài)結(jié)合模型，可估計每種化合物的表觀Kd值。誘導(dǎo)半最大結(jié)構(gòu)調(diào)變所需的配體濃度可反映所述表觀KD。圖11顯示了68metHRNA與SAM相差數(shù)個數(shù)量級。㈧通過脫甲基化使放射性[3H]SAM衰竭會產(chǎn)生非放射性SAH。⑶將平衡透析用于比較已知的SAM適體(156metA)的(Corbinoetal.,2005)和68metHRNA的SAM結(jié)合親和性。每個平衡透析系統(tǒng)的槽a和b均由5000道爾頓截留分子量(MWCO)的透性膜分開。將標(biāo)示的[3H]SAM(100nM)或RNA分別添加至槽a和b。所述SAM-II適體156metA對SAM的表觀Kd為約1μM(Corbinoetal.，2005)，因此在所使用的條件下氚向槽b的轉(zhuǎn)移將是最大的。由于68metHRNA是過量存在的，非放射性SAH(來自[3H]SAM的自發(fā)脫甲基化)對所述槽之間的氚分布的影響將可以忽略。所示數(shù)據(jù)代表數(shù)次重復(fù)。(C)對SAH與68metHRNA結(jié)合和用于平衡透析的68metHRNA濃度的預(yù)測曲線的比較。當(dāng)RNA以25μM存在時68metHRNA不會最大轉(zhuǎn)移[3H]SAM,該結(jié)果表明對SAM的表觀Kd弱或差約1，000倍。M6攜帶的兩個突變(G12U和A13U)與圖13A中描繪的構(gòu)建體M6在位置和核苷酸同一性方面是相當(dāng)?shù)?。圖12顯示了68metHSAH適體的分子識別特征。(A)其配體結(jié)合親和性被以68metHRNA的直讀探測確立的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和表觀Kd值。表觀Kd值的估計如圖IOC中對SAH所述的。(B)總結(jié)了68metHRNA對SAH的已知分子識別特征。圖13顯示了一種控制報告基因表達(dá)的SAH核糖開關(guān)。(A)丁香假單孢桿菌ahcY5'-UTR的序列和二級結(jié)構(gòu)模型及被導(dǎo)入以進(jìn)行基因表達(dá)研究的多種突變。(B)的曲線比較了融合到如A中定義的野生型(WT)和突變ahcY前導(dǎo)序列下游的半乳糖苷酶報告基因(IacZ)的表達(dá)水平。PRA301表示的報告株被IacZ之前沒有任何插入的原始質(zhì)粒pRA301轉(zhuǎn)化。所使用的差異生長培養(yǎng)基在實驗步驟中定義。值是3次獨立實驗的平均值，誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。圖14顯示了SAH水平的升高可增加核糖開關(guān)-報告物融合物的表達(dá)。(A)以曲線顯示了在無補(bǔ)充物(_)或補(bǔ)充有25μΜ的Ado-2',3'-dial或250μM其他所列化合物的Vogel-Bormer培養(yǎng)基中培養(yǎng)的野生型(WT)和突變(M6)報告株(圖13A)的β-半乳糖苷酶表達(dá)水平?；衔锟s寫Ado-2'，3'-dial(腺苷-2'，3'-二醛)；Ado(腺苷)；Hcy(高半胱氨酸)；L-met(L-甲硫氨酸)。(B)如A中所述以所示Ado_2‘，3'-dial濃度將WT、M1和M7構(gòu)建體用于報告物測定。值是3次獨立實驗的平均值，誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。圖15顯示了C0G4708RNA基序序列的比對。出現(xiàn)在超過97%和75%的代表物中的核苷酸分別表示為大寫字母和小寫字母(R=A、G；Y=C、U)。由括號標(biāo)記的彩色區(qū)標(biāo)明二級結(jié)構(gòu)元件Pl(藍(lán)色)、P2(綠色)、P3(橙色)和P4(紫色)。描繪的所有序列都是唯一的。然而，一些序列僅在Nx代表的環(huán)區(qū)不同，因此此處顯示是相同的。生物縮寫(Smu)變形鏈求胃(Streptococcusmutants)>(Spn-I)月市Hili求胃(S.pneumoniae)R6>(Spn-2)月市Hil球菌SP18-BS74、(Spn-3)肺炎鏈球菌SP19-BS75、(Spn-4)肺炎鏈球菌SP6-BS73、(Spy)化膿性鏈球菌(S.pyogenes)、(Sag-I)無乳鏈球菌(S.agalactiae)2630V/R、(Sag-2)無乳鏈球菌C0H1、(Ssa)血鏈球菌(S.sanguinis)、(Ssu)豬鏈球菌(S.suis)、(Lla-I)乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactissubsp.lactis)、(Lla_2)乳酸乳球菌乳月旨亞種(L.Iactissubsp.cremoris)SKll、(Lca)干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)。有另夕卜12個Spy序列的實例，都是在不同的化膿性鏈球菌株中。有另外7個Spn-I實例，都是在不同的肺炎鏈球菌株中。有另外6個Sag-I實例，都是在不同的無乳鏈球菌株中。有另外1個Ssu實例，出現(xiàn)在一個不同的豬鏈球菌株中，并且有另外1個Lla-I實例，出現(xiàn)在一個不同的乳酸乳球菌株中。圖16顯示了PreQ1對C0G4708RNA的結(jié)構(gòu)調(diào)變。(A)C0G4708RNA基序的共有序列和二級結(jié)構(gòu)模型。非保守核苷酸由黑實線或空心圓表示，保守的配對元件P1-P4被標(biāo)示出。箭頭標(biāo)識出存在于保持適體功能的截短構(gòu)建體中的核苷酸(見圖17)。陰影核苷酸包含一條Shine-Dalgarno(SD)序列。(B)通過變性PAGE分離的肺炎鏈球菌R6PreQ1-II適體代表物(1-103RNA)的自發(fā)切割產(chǎn)物。NR、Tl、—0H和(-)分別代表未反應(yīng)、RNaseTl的部分消化物、堿的部分消化物及無配體。選擇的RNaseT切割產(chǎn)物(切割3'的G殘基)被識別在左邊。右邊編號的星號表示對PreQ1應(yīng)答中結(jié)構(gòu)調(diào)變的定位。(C)對應(yīng)于預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)上的所述1-103RNA的自發(fā)切割模式。小寫字母g符號表示為提高轉(zhuǎn)錄添加的鳥苷，編號的星號表示B中所描繪的編號的區(qū)域。圖17顯示了野生型和突變17-90RNA的配體結(jié)合親和性。(A)在17_90RNA的數(shù)個核苷酸間鍵合處進(jìn)行直讀探測過程中自發(fā)RNA切割的調(diào)變相對于PreQ1摩爾濃度的對數(shù)的曲線圖。(B)以從左(0.5nM)至右(10μM)的PreQ1濃度孵育的17-90RNA的直讀探測凝膠。右邊的箭頭指出用于生成A中結(jié)合曲線的帶。其他符號如圖16Β的中所述。(C)具有識別出的破壞性和補(bǔ)償性突變Ml至Μ6的17-90RNA的序列和結(jié)構(gòu)。(D)由17-90RNA,33-90RNA和如C中所示突變17-90RNAMl至Μ6給出的PreQ1的Kd值?？招膱A表示真實Kd值高于100μMo圖18顯示了使用平衡透析對所述17-90RNA適體結(jié)合的代謝物的分析。(A)3H-PreQ1和RNA在平衡透析裝置的上樣。槽a和b被一個5，000M0C0膜分開。(B)槽b的平衡透析的結(jié)果缺乏RNA(-)——17-90RNA(1-81)和17-90RNA的截短的且無活性的衍生物。對于競爭實驗，將過量的未標(biāo)記PreQ1和鳥嘌呤添加至包含17-90RNA和3H-PreQ1的預(yù)平衡裝置。誤差棒代表3次獨立實驗的標(biāo)準(zhǔn)差。(C)平衡透析測定未轉(zhuǎn)移的3H-標(biāo)記材料能否被RNA結(jié)合的方法。對于第1次平衡，將H3-PreQ1以17-90RNA(左)或在無RNA的情況下(右)平衡。從所述裝置的每一側(cè)取等分部分，評估氚的分布。對于第2次平衡，將來自缺乏RNA的槽(包含未轉(zhuǎn)移的H3-標(biāo)記物的槽a)的緩沖物轉(zhuǎn)移至一個新裝置并以包含17-90RNA的槽b再次平衡。再次取等分部分，評估氚的分布。(D)C中所描述平衡透析實驗的結(jié)果。誤差棒代表3次獨立實驗的標(biāo)準(zhǔn)差。圖19顯示了對所述17-90PreQ1-II適體的分子識別分析。(A)17_90RNA(圓形)和PreQ1-I核糖開關(guān)(方塊)對于PreQ1和配體類似物的分子識別特征的比較。PreQ1-I核糖開關(guān)的Kd值之前已被發(fā)表(Rothetal.2007)。化學(xué)結(jié)構(gòu)上加陰影表示類似物和PreQ1之間的差異。中空符號表示在直讀探測測定中配體的最高濃度，指示所述Kd值高于該濃度。(B)總結(jié)了從A中數(shù)據(jù)推斷的分子識別接觸。圖20顯示了一個突變型17-90適體對配體辨別的改變。曲線描繪了多種濃度的(A)PreQ1和(B)DAP下，野生型(C41)和突變(U41)17-90RNA直讀探測所得的RNA結(jié)構(gòu)的調(diào)變。點代表多條調(diào)變帶的平均標(biāo)準(zhǔn)切割分?jǐn)?shù)，誤差棒代表該平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。(C)與所述分子識別模型以及對來自肺炎鏈球菌R6的PreQ1-II適體的突變分析數(shù)據(jù)相一致的可能的適體-配體相互作用。圖21顯示了攜帶C0G4708蛋白的基因的物種分類樹。包含兩個拷貝的所述基因的物種以星號標(biāo)記。編碼C0G4708的基因之前有PreQ1-I核糖開關(guān)的物種以I明示，所述基因之前有一PreQ1-II基序的物種以II明示。圖22顯示了源自176種代表物的最通用形式的MocoRNA基序的共有序列和二級結(jié)構(gòu)模型。R代表A或G，Y代表C或U。加框核苷酸表示的RBS被預(yù)測是某些M0c0RNA代表物中鄰近ORF的核糖體結(jié)合位點。圖23顯示了(a)大腸桿菌moaAB⑶E操縱子的結(jié)構(gòu)示意圖。通過將第一轉(zhuǎn)錄起始位點(Si)定義為+1并將第二轉(zhuǎn)錄起始位點(S2)定義為-87，對moaAORF上游基因組區(qū)確立核苷酸編號。Fnr和ModE結(jié)合位點的大致位置以填充的框明示，被指定為MocoRNA基序的區(qū)域以Pl的末端核苷酸開始和終止(圖22)。編號系統(tǒng)和多種特征的定位以前已被報道(Andersonetal.，2000)。(b)真細(xì)菌中鉬輔因子生物合成通路(Schearz，2005)。除了ABC型鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體ModABC外，以縮寫命名的蛋白都是該通路中的酶。結(jié)構(gòu)研究(Sanihvilietal.，2004；Baderetal.，2004)表明，ModABC類似于MogA，因此可能參與至鉬喋呤生物合成中。問號指示該轉(zhuǎn)換的生物合成酶是未知的。列出的其他蛋白為使用Moco衍生物作為輔酶的酶。以黑色陰影突出顯示編碼區(qū)在至少一種生物中位于MocoRNA基序下游附近的蛋白。圖24顯示了MocoRNA的直讀探測測定。(a)描繪了與從比較序列分析數(shù)據(jù)預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)模型(圖22a)相符的大腸桿菌138moaARNA的序列。灰色陰影的核苷酸的自發(fā)3’磷酸二酯斷裂發(fā)生率更高(從b中描繪的數(shù)據(jù))，與在穩(wěn)定的二級或三級結(jié)構(gòu)中存在的核苷酸間鍵合相比，這通常表明提高的結(jié)構(gòu)柔性水平。棒標(biāo)識被預(yù)測作為核糖體結(jié)合位點的嘌呤核苷酸，moaA的翻譯起始密碼子在框中。(b)在來自大腸桿菌的138moaARNA直讀探測測定過程中生成產(chǎn)物的凝膠圖像。1-3道包含上樣至凝膠的未孵育(未反應(yīng)，NR)、以TlRNase部分消化(Tl)或進(jìn)行部分的堿消化(_0H)的5'32P-標(biāo)記的前體RNA(Pre)。4道上樣有在不存在(_)可能的配體化合物的直讀探測條件下孵育后的標(biāo)記的前體RNA。標(biāo)識的凝膠區(qū)域包含在被預(yù)測堿基配對的核苷酸后的切割的放射標(biāo)記RNA片段。圖25顯示了大腸桿菌MocoRNA需要Moco生物合成用于基因遏制。(a)描繪了其相應(yīng)DNA模板融合至β-半乳糖苷酶報告基因的大腸桿菌149moaARNA的P3區(qū)。Ml和M2攜帶如所示的相對于野生型(WT)RNA的核苷酸變化。(b)在不同Moco濃度下，與WT和突變MocoRNA融合的β-半乳糖苷酶報告mRNA的表達(dá)。培養(yǎng)基中存在或不存在阿拉伯糖時Moco濃度分別被提高或降低，這是因為存在受阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子控制的轉(zhuǎn)基因moa操縱子。(c)上文描述的報告基因的表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)可獲得的鉬酸鹽或鎢酸鹽的依賴。示出了在用于分析的大腸桿菌株存在(modC)或不存在(AmodC)功能性鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的情形。細(xì)胞被培養(yǎng)于包含0.2%阿拉伯糖的LB中。報告基因表達(dá)測定重復(fù)進(jìn)行3次并將它們的平均值作圖，誤差棒代表這些重復(fù)值的標(biāo)準(zhǔn)差。圖26顯示了敲除大腸桿菌Moco生物合成通路多個基因?qū)θ诤嫌赪T149moaARNA的DNA模板的半乳糖苷酶報告基因表達(dá)的影響。每個轉(zhuǎn)基因株攜帶有在阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子控制之下的編碼大腸桿菌moaABCDE的質(zhì)粒。圖27顯示了MocoRNA的大小和結(jié)構(gòu)類似于來自大腸桿菌的其他核糖開關(guān)適體。(a)比較了大腸桿菌moaAMoco適體的長度與來自大腸桿菌已知被蛋白結(jié)合或者發(fā)揮核糖開關(guān)適體的功能的調(diào)節(jié)RNA元件的長度。核糖體蛋白的RNA靶不包括在該分析中。(b)a中描繪的RNA的二級結(jié)構(gòu)模型。未顯示的RNA沒有經(jīng)確認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)。圖28顯示了基序SAM-I和SAM-IV的比較情況。莖為標(biāo)記的P1-P5。SAM-IV中的P5經(jīng)常缺失，但其參與假結(jié)體的5'端一直存在。加粗顯示了配體中已公開的5Λ內(nèi)的SAM-I3-D結(jié)構(gòu)(MontangeandBatey2006)中的核苷酸位置，這是它們在SAM-IV中相應(yīng)的推定位置。被認(rèn)為直接接觸所述配體(例如A45)的6個位置依照它們的SAM-I編號(MontangeandBatey2006)在兩個基序中都被標(biāo)記。對保守特征(核苷酸同一性、凸起和莖)加陰影，以指示它們是兩個基序共有的(黃色)>SAM-I特有的(粉紅)或SAM-IV特有的(藍(lán)色)。圖29顯示了SAM-IVRNA選擇性結(jié)合SAM。(A)132ScRNA的序列和推斷的二級結(jié)構(gòu)。(B)直讀探測凝膠。NR=未反應(yīng)(僅RNA)，Tl=RNaseTl的部分消化(切割3'至鳥苷殘基)，—OH=堿的部分消化(切斷所有核苷酸間的鍵，(-)=反應(yīng)中未添加化合物。如所示地添加SAM、SAH、Ade(腺苷)和Met(甲硫氨酸)。G21-G117對應(yīng)于G殘基后被切割的所選帶的鑒定。R1-R5發(fā)生配體介導(dǎo)的調(diào)變的區(qū)域。(C)從具有多個SAM濃度的凝膠(未顯示)定量調(diào)變區(qū)(R1-R5)，并標(biāo)準(zhǔn)化至區(qū)間O(無SAM)至1(飽和SAM濃度)。表觀Kd為其理論二態(tài)結(jié)合曲線與所示數(shù)據(jù)最佳擬合。顯示了Kd=150nM的理論曲線。圖30顯示了SAM-IV是一種基因調(diào)節(jié)元件。(A)在所述適體二級結(jié)構(gòu)中顯示了測試的突變(Ml、M2、M3)，但將整個基因間區(qū)用于報告物測定中(見材料和方法部分)。(B)將XylE報告物活性定量表示為每克總蛋白每分鐘(測量20分鐘以上)的A375變化。細(xì)胞株為“WT”=野生型IGR，“M1”_“M3”=突變IGR，“無載體”=缺乏包含xylE報告基因的載體的細(xì)胞。(C)對選自B的3個典型實驗進(jìn)行吸光度相對于時間的作圖。具體實施例方式通過參考對下文中包括的實施例和具體實施方案的具體描述，以及參考附圖及其上下文的描述，可以更容易地理解所公開的方法和組合物。信使RNA通常被認(rèn)為是遺傳信息的被動載體，它可在翻譯過程中被蛋白調(diào)節(jié)因子或小RNA調(diào)節(jié)因子和核糖體作用。已發(fā)現(xiàn)某些mRNA帶有天然適體結(jié)構(gòu)域，并且特異性代謝物與這些RNA結(jié)構(gòu)域的結(jié)合可導(dǎo)致基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。天然核糖開關(guān)具有天然RNA通常所不具有的兩種功能。其一，mRNA元件可變?yōu)椴煌慕Y(jié)構(gòu)狀態(tài)，其中一種結(jié)構(gòu)可作為其靶標(biāo)代謝物的精確的結(jié)合袋。其二，由代謝物誘導(dǎo)的在結(jié)構(gòu)狀態(tài)之間的變構(gòu)互變可導(dǎo)致通過幾種不同機(jī)制之一的基因表達(dá)水平的改變。核糖開關(guān)通常可被劃分為兩個獨立的結(jié)構(gòu)域一個選擇性地結(jié)合靶標(biāo)(適體結(jié)構(gòu)域)，另一個影響基因控制(表達(dá)平臺)。這兩個結(jié)構(gòu)域之間的動態(tài)相互作用導(dǎo)致對基因表達(dá)的依賴于代謝物的變構(gòu)控制。已識別了不同類別的核糖開關(guān)，這些不同類別的核糖開關(guān)表現(xiàn)出選擇性地識別激活化合物(在本文中被稱為觸發(fā)分子)。例如，輔酶B12、甘氨酸、硫胺素焦磷酸(TPP)和黃素單核苷酸(FMN)激活存在于如下的基因中的核糖開關(guān)，所述基因編碼這些化合物的代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中關(guān)鍵的酶。每一類核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域與高度保守的共有序列和結(jié)構(gòu)相一致。因此，可使用序列同源性檢索來識別相關(guān)的核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)域。已在細(xì)菌、古細(xì)菌(archaea)和真核生物等多種生物中發(fā)現(xiàn)了核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)域。A.核糖開關(guān)RNA的一般性結(jié)構(gòu)細(xì)菌核糖開關(guān)RNA是主要位于特定mRNA主編碼區(qū)域的5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)的基因控制元件。結(jié)構(gòu)性探查研究(下文將詳述)發(fā)現(xiàn)核糖開關(guān)元件通常包括兩個結(jié)構(gòu)域作為配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然適體(T.Hermann,D.J.Patel，Science2000，287，820；L.Gold，etal.，AnnualReviewofBiochemistry1995，64，763)和與參與基因表達(dá)的RNA元件(例如Shine-Dalgarno(SD)元件；轉(zhuǎn)錄終止莖)相接的“表達(dá)平臺”。上述結(jié)論是基于下述觀察結(jié)果體外合成的適體結(jié)構(gòu)域在不存在表達(dá)平臺的條件下與合適的配體相結(jié)合(見美國專利申請公布文本No.2005-0053951的實施例2、3和6)。此外，結(jié)構(gòu)性探查研究表明，在獨立檢測的時候大多數(shù)核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域采用一種特定的二級和三級結(jié)構(gòu)折疊，這基本上與存在完整的5’前導(dǎo)RNA時檢測到的適體結(jié)構(gòu)相同。這表明在許多情況下，適體結(jié)構(gòu)域是獨立于表達(dá)平臺折疊的一個模塊單元(見美國專利申請公布文本No.2005-0053951的實施例2、3和6)。適體結(jié)構(gòu)域的配體結(jié)合狀態(tài)或未結(jié)合狀態(tài)最終通過表達(dá)平臺來反映，表達(dá)平臺可以對基因表達(dá)產(chǎn)生影響。核糖開關(guān)作為一個模塊元件的觀點被以下事實進(jìn)一步支持適體結(jié)構(gòu)域在多種生物之間是高度保守的(TPP核糖開關(guān)甚至在不同生物界之間都是保守的)(N.Sudarsan,etal.，RNA2003，9，644)，而表達(dá)平臺在序列、結(jié)構(gòu)和控制附帶開放閱讀框表達(dá)的機(jī)制方面都有所變化。例如，配體結(jié)合到枯草芽孢桿菌的tenAmRNA的TPP核糖開關(guān)上可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止(A.S.Mironov,etal.，cell2002，111，747)。這種表達(dá)平臺與大腸桿菌thiMmRNA的TPP核糖開關(guān)的表達(dá)平臺在序列和結(jié)構(gòu)上均不同，大腸桿菌thiMmRNA的TPP核糖開關(guān)與TPP結(jié)合時會通過SD阻斷機(jī)制導(dǎo)致對翻譯的抑制(見美國專利申請公布文本No.2005-0053951的實施例2)。這兩種轉(zhuǎn)錄單位的TPP適體結(jié)構(gòu)域很容易被識別，并且具有幾乎相同的功能特征，但是基因控制機(jī)制和實現(xiàn)該機(jī)制的表達(dá)平臺則大不相同。核糖開關(guān)RNA的適體結(jié)構(gòu)域通常長度為約70至170個核苷酸(美國專利申請公布文本No.2005-0053951的附圖11)。這一結(jié)果有些出人意料，因為體外進(jìn)化實驗識別了多種結(jié)合小分子的適體，它們的長度相當(dāng)短，并且結(jié)構(gòu)復(fù)雜(T.Hermarm，D.J.Patel,Science2000,287,820；L.Gold,etal.,AnnualReviewofBiochemistry1995,64,763；M.Famulok,CurrentOpinioninStructuralBiology1999，9，324)。雖然天然適體序列相對于人工適體在復(fù)雜性和信息含量上的顯著增加的原因還需要進(jìn)一步的確證，但是相信這種復(fù)雜性是形成具有高親和力和高選擇性功能的RNA受體所需要的。配體_核糖開關(guān)復(fù)合物的表觀Kd值從低納摩爾量至低微摩爾量不等。還值得注意的是，當(dāng)一些適體結(jié)構(gòu)域與附帶的表達(dá)平臺相分離時，表現(xiàn)出比完整核糖開關(guān)更高的(約10至100倍)對靶配體的親和力(見美國專利申請公布文本No.2005-0053951的實施例2)?？梢酝茰y，對由完整的核糖開關(guān)RNA所需的多種不同的RNA構(gòu)象進(jìn)行的采樣中有消耗能量，這一點通過配體親和力的損失而反映出來。由于適體結(jié)構(gòu)域必須作為分子開關(guān)，這可能提高了天然適體的功能性要求，這一點可能也有助于解釋它們?yōu)槭裁从懈鼜?fù)雜的結(jié)構(gòu)。B.環(huán)二GMP核糖開關(guān)(GEMM基序)包含GEMM基序的環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)(它還可被稱作環(huán)二GMP核糖開關(guān)或GEMM核糖開關(guān))包含兩個被命名為P1和P2的相鄰發(fā)夾(配對區(qū))(圖1和3)。P1的序列和結(jié)構(gòu)是高度保守的，并且由一個被3核苷酸的內(nèi)部環(huán)分隔并被一個末端環(huán)加帽的2堿基對莖和6堿基對莖組成。所述內(nèi)部環(huán)是高度保守的，所述末端環(huán)幾乎總是GNRA四元環(huán)(Hendrix1997)。該P(yáng)I莖在多個位置呈現(xiàn)了相關(guān)變異的重要證據(jù)，并且在大范圍的細(xì)菌中是結(jié)構(gòu)高度保守的。該事實以及P2的更適度的相關(guān)變異和長度可變的莖提供了GEMM作為一種結(jié)構(gòu)化RNA發(fā)揮功能的有力證據(jù)。實施例2證明GEMM基序發(fā)揮核糖開關(guān)的功能。連接P1和P2的序列基本上總是AAA，在322個實例中僅有2個例外。所述P2發(fā)夾顯示了比P1更適度的保守性。如果P1四元環(huán)為GAAA，那么在P2中通常出現(xiàn)一個GNRA四元環(huán)受體。該受體經(jīng)常為公知的11-nt基序，該基序可能是GAAA環(huán)偏愛的，但一些序列可以是新的四元環(huán)受體。如果P1具有一個GYRA四元環(huán)，那么所述受體樣序列幾乎不存在，但是有時會出現(xiàn)一個距所述P2堿基更近的凸起(圖2)。GEMMRNA與被稱為1型和2型的兩種相似結(jié)構(gòu)(圖3B)中的一種相符。兩種類型都攜帶兩個堿基配對區(qū)(P1和P2)，所述堿基配對區(qū)在鑒定的503個代表物中呈現(xiàn)廣泛相關(guān)變異(Weinberg2007)。1型RNA(303個實例)在P1上具有一個在第二位上為嘌呤(R)的GNRA四元環(huán)(Heus1991)。GRRA序列的存在與在P2遠(yuǎn)端存在一個四元環(huán)受體相關(guān)，已知所述四元環(huán)受體可容納該四元環(huán)類型(Costa1995)。相反，2型RNA(171個實例)在所述四元環(huán)的第二位置具有一個嘧啶(Y)，并且在一些例中P2上包括一個有利于容納GYRA四元環(huán)的結(jié)構(gòu)(Costa1995)。另外有29個未分類的代表物，其中24個攜帶一個以非配對核苷酸為側(cè)翼的GNRA四元環(huán)，5個缺乏四元環(huán)序列。GNRA四元環(huán)和它們的受體一般出現(xiàn)在結(jié)構(gòu)化RNA中，并且在以前在核糖開關(guān)適體中被發(fā)現(xiàn)(Regulski2008)。然而，P1和P2發(fā)夾頂端的序列和結(jié)構(gòu)變異性表明，環(huán)二GMP的任何結(jié)合位點可能位于攜帶最保守特征的中央部分或底部分。許多GEMM實例包含一個不依賴P的轉(zhuǎn)錄終止子發(fā)夾。終止子莖的5'側(cè)經(jīng)常與所述P2莖的3'側(cè)重疊(并被推測與之競爭)(圖2B)。如果GEMM是一種核糖開關(guān)，那么配體的結(jié)合可穩(wěn)定提出的P1和P2結(jié)構(gòu)，從而阻止所述競爭性轉(zhuǎn)錄終止子形成。在該模型中，較高配體濃度可增加基因表達(dá)。S-變形細(xì)菌中三分之一的GEMM代表物及其他分類單位中的某些是“串聯(lián)”排列的，其中一例出現(xiàn)在3'端并鄰近于相同UTR中的另一個。這樣的調(diào)節(jié)性RNA排列涉及比簡單的調(diào)節(jié)性RNA構(gòu)型所允許的更復(fù)雜的基因表達(dá)控制(Sudarsan2006；Welz2007；Mandal2006)。GEMM廣泛存在于細(xì)菌中并明顯具有高度保守的序列和結(jié)構(gòu)，這暗示了一種對推定RNA進(jìn)行重要的生物化學(xué)限制的功能。在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)了322種GEMM序列。它在S-變形細(xì)菌中是共有的，特別在地桿菌及相關(guān)屬中。在變形細(xì)菌中，它在交替單胞菌目(Alteromonadales)和弧菌目(Vibrionales)中是普遍存在的。它在厚壁菌門和浮霉菌門(Plantomycetes)的某些目中也是共有的。具有GEMM的主要病原體包括霍亂和炭疽的致病原。在序列數(shù)據(jù)包括基因注釋的309個GEMM實例中，297例的GEMM位于一個基因的5'端調(diào)節(jié)構(gòu)型中，暗示一種順式調(diào)節(jié)功能。推測受GEMM調(diào)節(jié)的基因顯示了大范圍的功能，但大多數(shù)基因與細(xì)胞外環(huán)境或者與膜有關(guān)，且許多與運(yùn)動性有關(guān)。對GEMM生物功能的理解可有助于揭示它似乎進(jìn)行調(diào)節(jié)的多種類的微生物過程。實際上，GEMM在物種霍亂弧菌(Vibriocholerae)和硫還原地桿菌(Geobactersulfurreducens)中涉及已是多項研究目標(biāo)的兩個系統(tǒng)。霍亂弧菌可導(dǎo)致人霍亂，但其生命周期的大部分時間是在水中，它在水中可粘附于多種甲殼類的含幾丁質(zhì)的外骨骼上。幾丁質(zhì)為GlcNAc(N-乙酰葡糖胺)的聚合物，已被表明可影響多種霍亂弧菌基因的表達(dá)(Meibom2004)。GEMM似乎調(diào)節(jié)這些幾丁質(zhì)誘導(dǎo)型基因中的2個的表達(dá)。第1個是gbpA，它不但對于小鼠的感染(Kirn2005)是重要的，而且對粘附于幾丁質(zhì)珠(Meibom2004)和人上皮細(xì)胞(Kirn2005)是重要的。第二幾丁質(zhì)誘導(dǎo)型基因是tfoXve。值得注意地，幾丁質(zhì)可誘導(dǎo)霍亂弧菌的天然感受態(tài)(Meibom2005)，并且丨偽乂^^表達(dá)對這種感受態(tài)是重要的?；魜y弧菌具有匹配⑶D模型C0G3070和pfam04994的兩個基因，所述兩個模型對應(yīng)于分離的tfoX結(jié)構(gòu)域。兩個結(jié)構(gòu)域都產(chǎn)生優(yōu)于1(T25的RPSBLAST(Schaffer2001)E_值。它們中之一是tfoXVG(座位VC1153)。GEMM似乎可調(diào)節(jié)另一個，所述另一個被稱作tfof-^Cn〗〗)。因此，在霍亂弧菌及相關(guān)細(xì)菌中，GEMM可能參與幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的感受態(tài)，或甚至在不包含提高的幾丁質(zhì)濃度的環(huán)境中調(diào)節(jié)感受態(tài)。硫還原地桿菌及相關(guān)變形細(xì)菌可使用金屬離子例如Fe(III)作為電子受體，通過氧化有機(jī)化合物生成ATP(Meth62003)。GEMM在地桿菌屬種中與菌毛組裝基因相關(guān)。硫還原地桿菌的菌毛已被顯示可導(dǎo)電(Reguera2005)，因此是還原金屬離子過程的一部分。而且，GEMM在硫還原地桿菌中似乎調(diào)節(jié)7個細(xì)胞色素c基因。雖然該細(xì)菌有111個可能的細(xì)胞色素c基因，但7個GEMM相關(guān)基因中的5個已經(jīng)在以前的研究中被鑒定，并且可能具有特殊的功能。0mcS(外膜細(xì)胞色素S)是在硫還原地桿菌外膜上高豐度的兩種蛋白的一種，并且是還原不溶Fe(III)氧化物所需的，但非可溶的Fe(III)檸檬酸鹽所需(Mehta2005)。OmcG和OmcH對于產(chǎn)生OmcB是必需的，OmcB在很多情況下是一種必需的細(xì)胞色素c(Kimm2006)。OmcA和OmcT與OmcG、OmcH或OmcS相關(guān)聯(lián)。在硫還原地桿菌中僅剩下4種其他Omc注釋與GEMM無直接關(guān)聯(lián)0mcB、OmcC、OmcE和OmcF。與已知核糖開關(guān)不同，GEMM與大量不同的基因功能相關(guān)聯(lián)(實施例1中表2)。該結(jié)果表明，GEMM核糖開關(guān)不作為控制代謝途徑的典型的反饋傳感器。相反，GEMM可感知一種參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或可能參與細(xì)胞-細(xì)胞通訊的第二信使分子(Bassler2006)。實施例2證明了GEMM基序的第二信使觸發(fā)分子為環(huán)二GMP。在該方式中，不同細(xì)菌使用GEMM及其信號分子來控制不同過程。許多GEMM相關(guān)基因編碼信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，這個事實表明了許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制。實施例2證明了GEMMRNA的確作為一類新發(fā)現(xiàn)的核糖開關(guān)的適體組件。C.S-腺苷高半胱氨酸核糖開關(guān)包含SAH基序的S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)(它還被稱作SAH核糖開關(guān))包括一個分支的莖結(jié)構(gòu)(圖1和9A)。SAH基序的序列和結(jié)構(gòu)是高度保守的(圖1和9A)，顯示了預(yù)測的莖區(qū)(包括模塊和長度變化莖)內(nèi)的相關(guān)變異。SAH核糖開關(guān)在實施例1和3中描述。主要在變形細(xì)菌和一些變形細(xì)菌及特別在假單胞菌屬中，SAH基序出現(xiàn)在與SAH(S-腺苷高半胱氨酸)代謝相關(guān)的基因5'端調(diào)節(jié)構(gòu)型中。SAH是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)代謝循環(huán)的一部分，該代謝循環(huán)的主要組件包括氨基酸甲硫氨酸及其衍生物高半胱氨酸。SAH是使用SAM作為甲基化反應(yīng)的輔因子的酶的副產(chǎn)物。SAH—般被水解成高半胱氨酸和腺苷。然后，高半胱氨酸被用于合成甲硫氨酸及最終的SAM。高水平的SAH對細(xì)胞是有毒的，這是因為SAH可抑制許多SAM依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶(Ueland1982)。因此，在SAH達(dá)到毒性水平之前，細(xì)胞可能需要感知其升高的濃度并除去該化合物。SAH基序相關(guān)的基因為S-腺苷高半胱氨酸水解酶(ahcY)、鈷胺素依賴的甲硫氨酸合酶(metH)及可合成一個用于甲硫氨酸合成中的甲基供體的亞甲基四氫葉酸還原酶(metF)。SAH基序的這種基因排列及其高水平的保守與在感知SAH及激活如下這樣的基因表達(dá)中的作用是一致的，即該基因的產(chǎn)物是SAH破壞所需的。實際上，生物化學(xué)和遺傳證據(jù)表明了該基序為SAH感知核糖開關(guān)。D.PreQi核糖開關(guān)(preQflI或C0G4708基序)包含preQfll(它還可被稱為C0G4708基序)的PreQ!應(yīng)答性核糖開關(guān)(這種核糖開關(guān)還可被稱為preQi核糖開關(guān)、preQrll核糖開關(guān)或C0G4708核糖開關(guān))出現(xiàn)于鏈球菌屬的一些種和乳酸乳球菌中的C0G4708基因的上游，但鏈球菌屬中的C0G4708基因家族的一些實例缺乏推定的RNA基序。C0G4708基因被預(yù)測可編碼膜蛋白。preQfll核糖開關(guān)在實施例1和4中描述。雖然C0G4708基序在系統(tǒng)發(fā)生方面被高度約束并只有6條獨特序列，但它卻顯示了相關(guān)變異、模塊莖和長度可變的莖(圖1、15和16A)。該基序具有一個與C0G4708基因Shine-Dalgarno序列重疊的假結(jié)，這表明所述基序編碼這些基因的順式調(diào)節(jié)子。最近表征了一種可感知修飾的核堿基preQi的核糖開關(guān)(Roth2007)。由于該核糖開關(guān)與C0G4708相關(guān)聯(lián)，C0G4708被提出為與preQ:相關(guān)的代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)體。因此，C0G4708基序被認(rèn)為還是一種卯⑷感知核糖開關(guān)。這一點已獲得了實驗的支持。C0G4708基序與以前表征的口！“⑷工感知核糖開關(guān)無序列和結(jié)構(gòu)的相似性(Roth2007)。E.細(xì)菌中轉(zhuǎn)錄終止的核糖開關(guān)調(diào)控細(xì)菌主要利用兩種方法終止轉(zhuǎn)錄。某些基因包含依賴Rho蛋白的終止信號(J.P.Richardson,BiochimicaetBiophvsicaActa2002，1577，251)。而其他基因利用不依賴Rho的終止子(內(nèi)部終止子)來破壞轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合體(I.Gusarov，E.Nudler,MolecularCell1999,3,495；E.Nudler,M.E.Gottesman,GenestoCells2002,7,755)后一RNA元件由富含GC的莖環(huán)和后面的6-9個尿苷酰殘基段組成。內(nèi)部終止子在整個細(xì)菌基因組中廣泛分布(F.Lillo，etal.，2002，18，971)，并通常位于基因或操縱子的3‘-末端。有趣的是，觀察到的位于5'-UTR的內(nèi)部終止子的實例的數(shù)目在增加。在細(xì)菌采用的多種基因調(diào)控策略中，RNA聚合酶以被調(diào)控方式應(yīng)答5'-UTR的終止信號的一類實例在增加(T.M.Henkin,CurrentOpinioninMicrobiology2000,3,149)在某些條件下，所述RNA聚合酶復(fù)合體受到外部信號指導(dǎo)以感知或忽視終止信號。盡管轉(zhuǎn)錄起始可能不被調(diào)控地出現(xiàn)，但是mRNA合成(和基因表達(dá))最終通過內(nèi)部終止子的調(diào)控而被控制。據(jù)推測，兩種互斥的mRNA構(gòu)象中至少有一種會形成或破壞傳遞轉(zhuǎn)錄終止信號的RNA結(jié)構(gòu)。反式作用因子一在某些情況下是RNA(F.J.Grundy，etal.，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2002,99,11121；T.M.Henkin,C.Yanofsky,Bioessays2002，24，700)而在另外一些情況下是蛋白(J.Stulke,ArchivesofMicrobiology2002，177，433)—對于接受特定細(xì)胞內(nèi)信號和隨后穩(wěn)定一種RNA構(gòu)象通常是必需的。核糖開關(guān)在RNA結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)和被基因調(diào)控機(jī)制解讀的代謝物信號之間建立了直接的聯(lián)系。大多數(shù)臨床抗細(xì)菌的化合物都可靶向僅有的4種細(xì)胞過程的一種(Wolfson2006)。由于細(xì)菌具有進(jìn)化良好的抗性機(jī)制來保護(hù)這些過程(D'Costa2006)，開發(fā)對藥物干涉脆弱的新靶是有用的。一種類型的脆弱過程是核糖開關(guān)對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)(Winkler2005)。一般出現(xiàn)在某些細(xì)菌mRNA的5'-UTR，每個已知核糖開關(guān)類的成員可形成這樣一種結(jié)構(gòu)化受體(或“適體”MMandal2004)，即其已演化為可結(jié)合具體的基本代謝物。在大多數(shù)情形下，配體結(jié)合可調(diào)節(jié)參與所結(jié)合代謝物合成或轉(zhuǎn)運(yùn)的基因或基因組的表達(dá)。因為被核糖開關(guān)調(diào)節(jié)的生物化學(xué)途徑經(jīng)常是細(xì)菌存活必須的，所以對經(jīng)由核糖開關(guān)靶向作用的這些通路的遏制可能是致死的。數(shù)種抗細(xì)菌的代謝物類似物通過靶向核糖開關(guān)發(fā)揮功能(Sudarsan2003；Sudarsan2005；ffoolley1943)。例如，抗細(xì)菌的硫胺類似物吡啶硫胺(Woolley1943)最有可能通過靶向硫胺素焦磷酸結(jié)合的核糖開關(guān)發(fā)揮功能(Sudarsan2005)。類似地，抗細(xì)菌的賴氨酸類似物L(fēng)-氨乙基半胱氨酸(Shiota1958)(AEC，圖lb)可結(jié)合于來自枯草芽孢桿菌的lysC核糖開關(guān)，并抑制lysC調(diào)節(jié)的報告基因的表達(dá)(Sudarsan2006)。而且，lysC核糖開關(guān)在抗AEC的枯草芽孢桿菌株(Lu1991)和大腸桿菌株(Patte1998)中是突變的。應(yīng)理解，如不另外說明，公開的方法和組合物不限于特定合成方法、特定分析技術(shù)或具體試劑，因此可有所改變。還應(yīng)理解本文所用的術(shù)語只是為了描述具體實施方案，而不意欲作出限制。材料本文公開了可用于所公開的方法和組合物、可與之聯(lián)合使用、可用于其制備或作為其產(chǎn)品的材料、組合物和組分。本文公開了這些和其他材料，應(yīng)理解當(dāng)公開這些材料的組合、子集、相互作用、分組等時，雖然可能沒有明確公開具體的這些化合物的各個體的和總體的組合以及排列的每一種，但每種都在本文中明確地考慮和描述。例如，如果公開和討論了核糖開關(guān)或適體結(jié)構(gòu)域并且討論了對包括所述核糖開關(guān)或適體結(jié)構(gòu)域的若干分子作出的若干修飾，那么除非特別作出相反的說明，否則每種核糖開關(guān)或適體結(jié)構(gòu)域的組合和排列以及可能的修飾都會被具體考慮。因此，如果公開了一類分子A、B和C以及一類分子D、E和F，還公開了一個組合分子的實例A-D，那么即使沒有單獨提到每種組合，每種組合也都被獨立和綜合地考慮了。因此，在此實例中，根據(jù)A、B和C；D、E和F；以及實例組合A-D的公開內(nèi)容，A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F組合的每一個都被具體地考慮并應(yīng)認(rèn)為被公開。類似地，它們的任何子集或組合也被特別考慮和公開。因此，例如，根據(jù)A、B和C;D、E和F；以及實例組合A-D的公開內(nèi)容，子集A-E、B-F和C-E被具體地考慮并應(yīng)認(rèn)為被公開。此概念適用于本申請所有方面，包括但不限于制備和使用所公開組合物的方法的步驟。因此，如果有多個可實施的其他步驟，應(yīng)理解每個其他步驟都可與所公開方法的任何具體實施方案或?qū)嵤┓桨附M合一起實施，并且每個這種組合都被具體地考慮且應(yīng)認(rèn)為被公開。A.核糖開關(guān)核糖開關(guān)為表達(dá)控制元件，它是待表達(dá)的RNA分子的一部分，并且在與觸發(fā)分子結(jié)合時改變狀態(tài)。核糖開關(guān)通?？杀粍澐譃閮蓚€獨立的結(jié)構(gòu)域一個選擇性地結(jié)合靶標(biāo)(適體結(jié)構(gòu)域)，另一個影響基因控制(表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域)。這兩個結(jié)構(gòu)域之間的動力學(xué)相互作用導(dǎo)致了對基因表達(dá)的依賴代謝物的變構(gòu)控制。公開了分離的和重組的核糖開關(guān)；含有這類核糖開關(guān)的重組構(gòu)建體；與這類核糖開關(guān)可操作地連接的異源序列；以及含有這類核糖開關(guān)、核糖開關(guān)重組構(gòu)建體和與異源序列可操作地連接的核糖開關(guān)的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因生物。異源序列可以是例如編碼目的蛋白或肽包括報告蛋白或肽的序列。優(yōu)選的核糖開關(guān)為天然存在的核糖開關(guān)或由天然存在的核糖開關(guān)產(chǎn)生，所述天然存在的核糖開關(guān)例如天然存在的環(huán)二GMP核糖開關(guān)。所述核糖開關(guān)可以包括人工適體或者任選地排除人工適體。例如，人工適體包括經(jīng)體外演化和/或體外選擇設(shè)計或選擇的適體。所述核糖開關(guān)可包含天然存在核糖開關(guān)的共有序列，例如環(huán)二GMP核糖開關(guān)、SAH核糖開關(guān)、PreQ1核糖開關(guān)、Moco核糖開關(guān)和SAM-IV核糖開關(guān)的共有序列。環(huán)二GMP核糖開關(guān)的共有序列顯示在圖1和圖3B中。環(huán)二GMP核糖開關(guān)的實例顯示于圖2和3C中。SAH核糖開關(guān)的共有序列顯示于圖1和9A中。PreQ1-II(基序PreQ1-II或C0G4708)核糖開關(guān)的共有序列顯示于圖1、15(序列)和16A(結(jié)構(gòu))中。公開了一種核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)為一種天然存在的核糖開關(guān)的非天然衍生物。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種PreQ1應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種M0c0應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。所公開的核糖開關(guān)，包括它們的衍生物和重組形式，通常可以來自任何來源，包括天然存在的核糖開關(guān)和從頭設(shè)計的核糖開關(guān)。任何這類的核糖開關(guān)都可被用于公開的方法或與公開的方法一起使用。然而，可能識別出不同類型的核糖開關(guān)，某些這樣的亞類可能適用于特定的方法或與特定的方法一起使用(通常如本文中其他部分所述)。核糖開關(guān)的類型包括例如天然存在的核糖開關(guān)、天然存在的核糖開關(guān)的衍生物和經(jīng)修飾的形式、共有核糖開關(guān)、嵌合核糖開關(guān)和重組核糖開關(guān)。天然存在的核糖開關(guān)是這樣一種核糖開關(guān)，它具有自然界中存在的核糖開關(guān)的序列。這類天然存在的核糖開關(guān)可以是自然界中存在的天然存在的核糖開關(guān)的分離形式或重組形式。也就是說，該核糖開關(guān)還具有相同的一級結(jié)構(gòu)，但是已在新的基因背景或核酸背景中被分離或被基因工程改造。共有核糖開關(guān)具有天然存在核糖開關(guān)的共有結(jié)構(gòu)的序列和特征。嵌合核糖開關(guān)可由例如下列的部分構(gòu)成任意或特定類別或類型的核糖開關(guān)的一部分和相同或任意不同類別或類型的核糖開關(guān)中的不同核糖開關(guān)的一部分；任意或特定類別或類型的核糖開關(guān)的一部分和非核糖開關(guān)序列或元件。重組核糖開關(guān)是在新的基因背景或核酸背景中被分離或被基因工程改造的核糖開關(guān)。核糖開關(guān)可有一個或多個適體結(jié)構(gòu)域。具有多個適體結(jié)構(gòu)域的核糖開關(guān)中的各適體結(jié)構(gòu)域可以表現(xiàn)出對觸發(fā)分子的協(xié)同性結(jié)合，或可以不表現(xiàn)出對觸發(fā)分子的協(xié)同性結(jié)合(也就是說適體不必要表現(xiàn)出協(xié)同性結(jié)合)。在后一種情況中，適體結(jié)構(gòu)域可被稱為獨立結(jié)合物。含有多個適體的核糖開關(guān)可含有一個或多個表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域。例如，含有兩個協(xié)同性結(jié)合其觸發(fā)分子的適體結(jié)構(gòu)域的核糖開關(guān)可以與被兩個適體結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)的一個表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域相連接。含有多個適體的核糖開關(guān)可含有一個或多個以接頭相連的適體。當(dāng)這些適體對觸發(fā)分子表現(xiàn)出協(xié)同性結(jié)合時，接頭可為協(xié)同式接頭。對于進(jìn)行協(xié)同性結(jié)合分析的適體結(jié)構(gòu)域而言，如果適體結(jié)構(gòu)域的數(shù)目(或者適體結(jié)構(gòu)域上的結(jié)合位點的數(shù)目)為X，而它們的希爾系數(shù)η在χ和X-I之間，那么就稱這些適體結(jié)構(gòu)域有協(xié)同性結(jié)合。因此，例如，如果具有兩個適體結(jié)構(gòu)域的核糖開關(guān)的希爾系數(shù)在2和1之間，則稱它具有協(xié)同性結(jié)合。應(yīng)當(dāng)理解的是，所用的χ值取決于參與協(xié)同性結(jié)合分析的適體結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，而不一定是核糖開關(guān)中存在的適體結(jié)構(gòu)域的數(shù)目。這一點是有一定意義的，因為一個核糖開關(guān)可能含有多個適體結(jié)構(gòu)域，但只有其中幾個具有協(xié)同性結(jié)合性質(zhì)。還公開了含有異源的適體結(jié)構(gòu)域和表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域的嵌合核糖開關(guān)。也就是說，嵌合核糖開關(guān)有來自一種來源的適體結(jié)構(gòu)域和來自另一種來源的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域。異源來源可來自例如不同的具體核糖開關(guān)、不同類型的核糖開關(guān)或不同類別的核糖開關(guān)。異源適體也可來自非核糖開關(guān)適體。異源表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域也可來自非核糖開關(guān)來源。可以使用體外的篩選和進(jìn)化技術(shù)產(chǎn)生經(jīng)修飾的或衍生的核糖開關(guān)。通常，應(yīng)用于核糖開關(guān)的體外進(jìn)化技術(shù)包括產(chǎn)生一系列的變異體核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)序列的一個或多個部分有所改變而核糖開關(guān)的其他部分保持不變。然后可評估這一系列變異體核糖開關(guān)的激活、滅活或阻斷(或其他的功能性或結(jié)構(gòu)性標(biāo)準(zhǔn))，符合所用標(biāo)準(zhǔn)的那些變異體核糖開關(guān)就被選擇出來備用或用于下一輪進(jìn)化?？捎糜诋a(chǎn)生變異體的基礎(chǔ)核糖開關(guān)是本文公開的那些特定的和共有的核糖開關(guān)?？墒褂霉灿泻颂情_關(guān)來獲知核糖開關(guān)的哪些部分在體外篩選和進(jìn)化中有所變化。還公開了調(diào)節(jié)作用發(fā)生改變的經(jīng)修飾的核糖開關(guān)。可以通過將一個適體結(jié)構(gòu)域和核糖開關(guān)的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域可操作地連接(這就是嵌合核糖開關(guān))，來改變該核糖開關(guān)的調(diào)節(jié)作用。適體結(jié)構(gòu)域可以通過例如適體結(jié)構(gòu)城的觸發(fā)分子的作用來介導(dǎo)核糖開關(guān)的調(diào)節(jié)作用?？捎萌魏魏线m的方式來將適體結(jié)構(gòu)域和核糖開關(guān)的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域可操作地連接，所述方式包括，例如用新的適體結(jié)構(gòu)域代替核糖開關(guān)的正常的或天然的適體結(jié)構(gòu)域。通常，可以激活、滅活或阻斷適體結(jié)構(gòu)域所來源的核糖開關(guān)的任何化合物或條件都可以用來激活、滅活或阻斷嵌合核糖開關(guān)。還公開了滅活的核糖開關(guān)。核糖開關(guān)可通過共價改變核糖開關(guān)的方式來滅活(通過例如使核糖開關(guān)的某部分交聯(lián)或?qū)⒒衔锱悸?lián)至核糖開關(guān))。可通過以下方法導(dǎo)致核糖開關(guān)的這種方式的滅活例如，阻止觸發(fā)分子與核糖開關(guān)結(jié)合的改變，阻止核糖開關(guān)與觸發(fā)分子結(jié)合后狀態(tài)變化的改變，或在核糖開關(guān)與觸發(fā)分子結(jié)合后阻止其表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域影響表達(dá)的改變。還公開了生物傳感器核糖開關(guān)。生物傳感器核糖開關(guān)是經(jīng)過基因工程改造的核糖開關(guān)，它們在存在它們的同種觸發(fā)分子時產(chǎn)生可檢出的信號?？捎玫纳飩鞲衅骱颂情_關(guān)可以在觸發(fā)分子達(dá)到或超過閾值水平時被觸發(fā)。生物傳感器核糖開關(guān)可被設(shè)計為體內(nèi)應(yīng)用或體外應(yīng)用。例如，報告RNA編碼作為信號的蛋白質(zhì)或參與產(chǎn)生信號的蛋白質(zhì)，與該報告RNA可操作地連接的生物傳感器核糖開關(guān)可在體內(nèi)被用于通過基因工程改造細(xì)胞或生物，使其含有編碼核糖開關(guān)/報告RNA的核酸構(gòu)建體。用于體外的生物傳感器核糖開關(guān)的一個實例是包括構(gòu)象依賴性標(biāo)簽的核糖開關(guān)，由該標(biāo)簽產(chǎn)生的信號隨核糖開關(guān)的激活狀態(tài)而變化。優(yōu)選地，這種生物傳感器核糖開關(guān)使用天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或由天然存在的核糖開關(guān)衍生的適體結(jié)構(gòu)域。生物傳感器核糖開關(guān)可用于各種環(huán)境和平臺中。例如，生物傳感器核糖開關(guān)與例如平板、芯片、條帶和孔的固體載體一起使用。還公開了識別新的觸發(fā)分子的經(jīng)修飾的或衍生的核糖開關(guān)。識別新的觸發(fā)分子的新核糖開關(guān)和/或新適體可以從已知核糖開關(guān)中選擇、從已知核糖開關(guān)開始設(shè)計或來源于已知核糖開關(guān)。這可通過下述步驟實現(xiàn)例如，產(chǎn)生核糖開關(guān)中的一系列適體變異體；在存在目的化合物的條件下評估變異體核糖開關(guān)的激活；篩選被激活的變異體核糖開關(guān)(或者例如篩選激活度最高或激活選擇性最強(qiáng)的核糖開關(guān))和重復(fù)上述步驟，直至得到具有所需活性、特異性、活性和特異性的結(jié)合或其他性質(zhì)的結(jié)合的變異體核糖開關(guān)。通常，通過設(shè)計或調(diào)整表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域中的調(diào)節(jié)鏈，使其與適體結(jié)構(gòu)域中的控制鏈互補(bǔ)，可以使任何適體結(jié)構(gòu)域適用于任何表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域?；蛘撸梢哉{(diào)整適體結(jié)構(gòu)域中的適體和控制鏈的序列，使得控制鏈與表達(dá)平臺中有功能意義的序列互補(bǔ)。例如，可調(diào)整控制鏈?zhǔn)蛊渑cRNA中的Shine-Dalgarno序列互補(bǔ)，以使得在控制鏈和SD序列之間形成莖結(jié)構(gòu)后核糖體難以接近SD序列，由此減弱或阻止翻譯的啟動。注意適體鏈在序列上也應(yīng)有相應(yīng)的改變，以使得可以在適體結(jié)構(gòu)域中形成Pl莖。對于含有表現(xiàn)出協(xié)同性結(jié)合的多個適體的核糖開關(guān)的情況，只需要設(shè)計激活的適體(與表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域相互作用的適體)中的Pl莖，使其與SD序列形成莖結(jié)構(gòu)。作為另一個實例，可以在RNA分子上加上一個轉(zhuǎn)錄終止子(最方便的是在RNA的非翻譯區(qū)加入)，使得轉(zhuǎn)錄終止子序列的部分與適體結(jié)構(gòu)域的控制鏈互補(bǔ)(該序列可為調(diào)節(jié)鏈)。這可使得適體結(jié)構(gòu)域的控制序列與適體鏈和調(diào)節(jié)鏈形成可互變的莖結(jié)構(gòu)，由此可在核糖開關(guān)激活或滅活后形成或破壞轉(zhuǎn)錄終止子。通過對互變莖結(jié)構(gòu)的類似設(shè)計方法可以將任意其他表達(dá)元件置于核糖開關(guān)的控制之下。對于由核糖開關(guān)控制的轉(zhuǎn)錄終止子而言，轉(zhuǎn)錄的速度以及核糖開關(guān)和表達(dá)平臺元件的間隔對于合適的控制會十分重要。轉(zhuǎn)錄速度可通過下述方式調(diào)整例如包含聚合酶暫停元件(例如一系列尿苷殘基)以暫停轉(zhuǎn)錄并使得核糖開關(guān)形成和感受觸發(fā)分子。公開了可調(diào)節(jié)的基因表達(dá)構(gòu)建體，包括編碼RNA的核酸分子，所述RNA包括與編碼區(qū)可操作地連接的核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)調(diào)節(jié)RNA的表達(dá)，其中所述核糖開關(guān)和編碼區(qū)域為異源的。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種PreQ1應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種M0c0應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)或這些核糖開關(guān)的衍生物。所述核糖開關(guān)可包含一個適體結(jié)構(gòu)域和一個表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域是異源的。核糖開關(guān)可包括兩個或兩個以上的適體結(jié)構(gòu)域和一個表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域，其中至少一個適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域為異源的。至少兩個所述適體結(jié)構(gòu)域可呈現(xiàn)出協(xié)同性結(jié)合。公開了包含異源核糖開關(guān)和編碼區(qū)的RNA分子。S卩，這種RNA分子由來自一個來源的核糖開關(guān)和來自另一個來源的編碼區(qū)構(gòu)成。所述異源的源可來自例如，不同RNA分子、不同轉(zhuǎn)錄物、來自不同基因的RNA或轉(zhuǎn)錄物、來自不同細(xì)胞的RNA或轉(zhuǎn)錄物、來自不同生物體的RNA或轉(zhuǎn)錄物、來自不同物種的RNA或轉(zhuǎn)錄物、天然序列及人工或工程改造的序列、特定的核糖開關(guān)、不同類型的核糖開關(guān)或者不同類別的核糖開關(guān)。本文公開的術(shù)語“編碼區(qū)”是指編碼氨基酸的核酸的任何區(qū)域。這可以包括包含密碼子或密碼子模板的核酸鏈，以及這種核酸鏈在雙鏈的核酸分子情況下的互補(bǔ)序列。不是編碼區(qū)的核酸區(qū)域可被稱作非編碼區(qū)。轉(zhuǎn)錄的信使RNA分子一般在5'端和3'端都包括非編碼區(qū)。真核mRNA分子還可以包括內(nèi)部非編碼區(qū)，例如內(nèi)含子。一些類型的RNA分子可不包括功能性編碼區(qū)，例如tRNA和rRNA分子。不包括功能性編碼區(qū)的RNA分子(也可以被稱作非編碼RNA分子)的表達(dá)也可以被所公開的核糖開關(guān)調(diào)節(jié)或影響。因此，所公開的核糖開關(guān)可以本文對核糖開關(guān)與編碼區(qū)可操作連接所公開的任意方式可操作地連接于非編碼RNA分子。所述核糖開關(guān)可調(diào)節(jié)這樣的RNA的表達(dá)，如本文公開對包含核糖開關(guān)可操作連接于編碼區(qū)的RNA的調(diào)節(jié)一樣。任何核酸分子的功能也可被所公開的核糖開關(guān)調(diào)節(jié)或影響。實例包括但不限于RNA、DNA和人工核酸，包括肽核酸(PNA)、嗎啉基及鎖核酸(LNA)，以及二醇核酸(GNA)和蘇糖核酸(TNA)。在所公開的方法中，所述核糖開關(guān)可調(diào)節(jié)例如所述編碼區(qū)的表達(dá)、所編碼的蛋白的表達(dá)、所述非編碼RNA分子的表達(dá)、所述RNA的或所述編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄或者所編碼的蛋白的翻譯。1.適體結(jié)構(gòu)域適體是可與特定化合物和特定類別的化合物選擇性結(jié)合的核酸區(qū)段和結(jié)構(gòu)。核糖開關(guān)具有在與觸發(fā)分子結(jié)合時可導(dǎo)致該核糖開關(guān)的狀態(tài)或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的適體結(jié)構(gòu)域。在功能性核糖開關(guān)中，當(dāng)觸發(fā)分子與適體結(jié)構(gòu)域結(jié)合時，連接至所述適體結(jié)構(gòu)域的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域的狀態(tài)或結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變。核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域可從任何來源獲得，包括例如核糖開關(guān)的天然適體結(jié)構(gòu)域，人工適體，經(jīng)工程改造、選擇、演化或衍生得到的適體或適體結(jié)構(gòu)域。核糖開關(guān)中的適體的至少一部分通?？膳c相連的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域的一部分例如通過形成莖結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用。與觸發(fā)分子結(jié)合時可形成或破壞這種莖結(jié)構(gòu)。多種天然核糖開關(guān)的共有適體結(jié)構(gòu)域顯示于美國申請公開文本No.2005-0053951的圖11和本文他處。環(huán)二GMP核糖開關(guān)的共有序列和結(jié)構(gòu)可見于圖1和圖3。SAH核糖開關(guān)的共有序列可見于圖1和9A。PreQ1-II(基序PreQ1-II或C0G4708基序)核糖開關(guān)的共有序列可見于圖1、15(序列)和16A(結(jié)構(gòu))。這些適體結(jié)構(gòu)域(包括其中包含的所有直接變種)可用于核糖開關(guān)。共有序列和結(jié)構(gòu)可明示序列和結(jié)構(gòu)中的變異情況。明示的變異范圍內(nèi)的適體結(jié)構(gòu)域在本文中稱為直接變種。這些適體結(jié)構(gòu)域可被修改以產(chǎn)生被修改的適體結(jié)構(gòu)域或變種適體結(jié)構(gòu)域。保守性修改包括使得堿基對中的核苷酸仍保持互補(bǔ)的堿基配對的核苷酸的任何改變。中度修改包括莖或環(huán)(其長度或長度范圍被明示)的長度改變小于或等于明示長度范圍的20%。在共有結(jié)構(gòu)顯示出特定長度的莖或環(huán)，或列出或示出長度范圍的情況下，環(huán)和莖被認(rèn)為是“明示的”。中度修改包括莖或環(huán)(其長度或長度范圍未被明示)的長度改變小于或等于明示長度范圍的40%。中度修改還包括適體結(jié)構(gòu)域未明示部分的功能性變種。公開的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域也可作為適體用于任何其他目的和任何其他環(huán)境。例如，在結(jié)構(gòu)變化會影響RNA的功能的情況下，適體可被用于控制核酶、其他分子開關(guān)和任何RNA分子。2.表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域是核糖開關(guān)的一部分，其影響含有所述核糖開關(guān)的RNA分子的表達(dá)。表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域通常有至少一部分可與相連的適體結(jié)構(gòu)域的一部分相互作用，如通過形成莖結(jié)構(gòu)。與觸發(fā)分子結(jié)合時可形成或破壞這種莖結(jié)構(gòu)。通常情況下，所述莖結(jié)構(gòu)要么就是表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)，要么防止形成表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)。表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)是可允許、阻止、加強(qiáng)或抑制含有該結(jié)構(gòu)的RNA分子的表達(dá)的結(jié)構(gòu)。實例包括Shine-Dalgarno序列、起始密碼子、轉(zhuǎn)錄終止子，以及穩(wěn)定信號和加工信號，例如RNA剪接點和控制元件。B.觸發(fā)分子觸發(fā)分子是可激活核糖開關(guān)的分子和化合物。這包括核糖開關(guān)的天然或正常的觸發(fā)分子和其他可激活核糖開關(guān)的化合物。天然或正常觸發(fā)分子是給定的天然核糖開關(guān)本來就有的觸發(fā)分子，或者對于某些非天然核糖開關(guān)而言是這樣的觸發(fā)分子該核糖開關(guān)針對該觸發(fā)分子被設(shè)計或該核糖開關(guān)通過該觸發(fā)分子被選擇(正如在例如體外選擇或體外進(jìn)化技術(shù)中那樣)。C.化合物還公開了可激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物和含有這些化合物的組合物。核糖開關(guān)通過結(jié)合或去除觸發(fā)分子來起到控制基因表達(dá)的作用?；衔锟捎糜诩せ睢缁罨蜃钄嗪颂情_關(guān)。核糖開關(guān)的觸發(fā)分子(以及其他激活化合物)可用于激活核糖開關(guān)。觸發(fā)分子以外的化合物通?？捎糜跍缁罨蜃钄嗪颂情_關(guān)。核糖開關(guān)也可通過例如從所述核糖開關(guān)所在處除去觸發(fā)分子而滅活。核糖開關(guān)可通過例如與不激活該核糖開關(guān)的觸發(fā)分子類似物結(jié)合而被阻斷。還公開了用于改變RNA分子或編碼RNA分子的基因的表達(dá)的化合物，其中所述RNA分子包含核糖開關(guān)。這可通過使化合物與所述RNA分子接觸來實現(xiàn)。核糖開關(guān)通過結(jié)合或去除觸發(fā)分子來起到控制基因表達(dá)的作用。因此，將包含核糖開關(guān)的目的RNA分子置于激活、滅活或阻斷所述核糖開關(guān)的條件下，可用于改變所述RNA的表達(dá)。表達(dá)可因例如轉(zhuǎn)錄被終止或核糖體與所述RNA的結(jié)合受到阻斷而改變。與觸發(fā)分子的結(jié)合可減少或阻止所述RNA分子的表達(dá)，或者可促進(jìn)或增加所述RNA分子的表達(dá)，這取決于核糖開關(guān)的性質(zhì)。還公開了用于調(diào)節(jié)RNA分子或編碼RNA分子的基因的表達(dá)的化合物。還公開了通過激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)來調(diào)節(jié)含有所述核糖開關(guān)的天然存在的基因或RNA的表達(dá)的化合物。如果所述基因?qū)兴募?xì)胞或生物體的存活是必需的，那么激活、滅活或阻斷所述核糖開關(guān)可導(dǎo)致所述細(xì)胞或生物體的死亡、瘀滯或虛弱。還公開了通過激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)來調(diào)節(jié)經(jīng)分離、工程改造或重組得到的含有所述核糖開關(guān)的基因或RNA的表達(dá)的化合物。如果基因編碼一種所需的表達(dá)產(chǎn)物，則激活或滅活該核糖開關(guān)可被用于誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，并由此導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)生。如果該基因編碼基因表達(dá)或另一細(xì)胞過程的一種誘導(dǎo)物或抑制物，則激活、滅活或阻斷該核糖開關(guān)可導(dǎo)致其他被調(diào)節(jié)基因或細(xì)胞過程的誘導(dǎo)、抑制或脫抑制。已知多種這樣的次級調(diào)節(jié)效應(yīng)，它們也可適用于核糖開關(guān)。核糖開關(guān)作為這類調(diào)節(jié)的初級控制的一個優(yōu)勢是核糖開關(guān)的觸發(fā)分子可為非抗原性小分子。還公開了識別可激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物的方法。例如，激活核糖開關(guān)的化合物可通過使測試化合物與核糖開關(guān)相接觸并評估所述核糖開關(guān)的激活情況來識另IJ。如果所述核糖開關(guān)被激活，那么所述測試化合物就被識別為可激活所述核糖開關(guān)的化合物?？捎萌魏魏线m的方式評估核糖開關(guān)的激活情況。例如，核糖開關(guān)可被連接至一個報告RNA，然后在存在和不存在所述測試化合物的情況下測量所述報告RNA的表達(dá)、表達(dá)水平或表達(dá)水平的變化。作為另一個實例，所述核糖開關(guān)可包括一個構(gòu)象依賴標(biāo)簽，其信號根據(jù)所述核糖開關(guān)的激活狀態(tài)而改變。這種核糖開關(guān)優(yōu)選地使用取自或衍生自天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域?？梢钥闯觯瑢颂情_關(guān)的激活情況進(jìn)行評估使用或不使用對照測定或測量均可。識別滅活核糖開關(guān)的化合物的方法可按類似方式進(jìn)行。對阻斷核糖開關(guān)的化合物的識別可通過任何合適的方法來完成。例如，可在已知可激活或滅活核糖開關(guān)的化合物存在的情況下和在測試化合物存在的情況下進(jìn)行評估所述核糖開關(guān)的激活或滅活的測定。如果未觀察到在所述測試化合物不存在的情況下可觀察到的激活或滅活，那么所述測試化合物被識別為阻斷所述核糖開關(guān)被激活或滅活的化合物。本文還公開了可與所述環(huán)二GMP.SAH.preQpMoco和SAM-IV核糖開關(guān)相互作用的化合物?？梢酝ㄟ^與RNA結(jié)構(gòu)中其他官能團(tuán)產(chǎn)生新的接觸的方式，使得經(jīng)過進(jìn)一步修飾的上述化合物具有改善的與所述核糖開關(guān)的結(jié)合力。此外，通過在骨架的這兩個區(qū)域加以修飾，可以對生物活性、毒性和合成難度(以及其他特征)進(jìn)行調(diào)節(jié)，因為核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)模型顯示可能在這些位點有多種修飾。高通量篩選還可用于發(fā)現(xiàn)也可與核糖開關(guān)RNA結(jié)合的全新的化學(xué)骨架，所述結(jié)合可以通過標(biāo)準(zhǔn)的或非標(biāo)準(zhǔn)的分子識別模式進(jìn)行。有多種手段都可用于檢測結(jié)合代謝物的RNA，包括使用基于凝膠和基于芯片檢測方法的變構(gòu)核酶測定和直讀探測測定。還公開了由識別可激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物和對識別出的化合物進(jìn)行制備而獲得的化合物。這可以通過例如將本文其他部分公開的化合物識別方法與制備識別出的化合物的方法相結(jié)合使用而實現(xiàn)。例如，可通過下述方法獲得化合物使待測化合物和核糖開關(guān)相接觸，評估核糖開關(guān)的激活，以及如果核糖開關(guān)被待測化合物激活，則制備該激活核糖開關(guān)的待測化合物作為所述化合物。還公開了由核實某種化合物對核糖開關(guān)的激活、滅活或阻斷作用和對經(jīng)核實的化合物進(jìn)行制備而獲得的化合物。這可以通過例如將本文其他部分公開的化合物激活、滅活或阻斷評估方法與對經(jīng)核實的化合物的制備方法結(jié)合使用而實現(xiàn)。例如，可通過下述方法獲得化復(fù)合物使待測化合物和核糖開關(guān)相接觸，評估核糖開關(guān)的激活，以及如果核糖開關(guān)被待測化合物激活，則制備該激活核糖開關(guān)待測化合物作為所述化合物。核實化合物激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的能力指的是對以前并不知道可否激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物鑒定，以及對已知可激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的能力評估。本文中使用的術(shù)語“取代的”意在包括有機(jī)化合物的所有允許的取代基。廣義上講，允許的取代基包括有機(jī)化合物的非環(huán)狀的和環(huán)狀的、分支的和未分支的、碳環(huán)的和雜環(huán)的以及芳香族的和非芳香族的取代基。示例性的取代基包括例如下述的那些基團(tuán)。對于合適的有機(jī)化合物，可有一個或多個相同或不同的允許的取代基。出于本發(fā)明公開的目的，例如氮原子的雜原子可以具有氫取代基和/或滿足雜原子的價位的任何本文所述的允許取代基。有機(jī)化合物的允許取代基并不意在以任何方式限制本發(fā)明的公開內(nèi)容。此外，術(shù)語“取代”或“用......取代”包括下述隱含條件這類取代應(yīng)符合取代原子和取代基的價位，并且這類取代產(chǎn)生的是穩(wěn)定的化合物，例如不會自發(fā)地進(jìn)行例如重排、環(huán)化、消去等轉(zhuǎn)化反應(yīng)的化合物。本文中使用的“A1”、^2”、^3”和“A4”是一般性標(biāo)記，表示各種的具體取代基。這些標(biāo)記可以是任何取代基，并不限于本文公開的那些取代基，在一種情況中它們指代某種取代基，也可能在另一種情況中它們就指代別的取代基。本文中使用術(shù)語“烷基”指的是1至24個碳原子的分支或不分支的飽和烴基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等等。烷基可為取代的或未取代的。烷基可以被一個或多個下述基團(tuán)取代，所述基團(tuán)包括但不限于下文所述的烷基、鹵化烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、鹵化物、羥基、酮、硫代-氧代(sulfo-oxo)、磺?；㈨?、亞砜或巰基。術(shù)語“低級烷基”是具有6個或6個以下碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基等等。在本說明書通篇中，一般用“烷基”指代未取代的烷基和取代的烷基；然而取代的烷基在本文中也以指出烷基上具體的取代基的方式被特別提及。例如，術(shù)語“鹵化烷基”特別指被一個或多個例如氟、氯、溴或碘的鹵化物取代的烷基。術(shù)語“烷氧基烷基”特別指如下所述被一個或多個烷氧基取代的烷基。術(shù)語“烷基氨基”特別指如下所述被一個或多個氨基取代的烷基等等。當(dāng)在一種情況中使用“烷基”而在另一種情況中使用例如“鹵化烷基”的具體術(shù)語時，并非意在暗示術(shù)語“烷基”就不包括例如“鹵化烷基”等的具體術(shù)語。這一習(xí)慣也適用于本文所述的其他基團(tuán)。也就是說，例如術(shù)語“環(huán)烷基”指的是未取代和取代的環(huán)烷基部分，而取代的部分可在本文中另外具體地指明；例如，具體的取代的環(huán)烷基可被稱為例如“烷基環(huán)烷基”。類似地，一種取代的烷氧基可被具體地稱為例如“鹵化烷氧基”，一種具體的取代烯基可被地稱為例如“烯基醇”等等。此外，使用例如“環(huán)烷基”的一般性術(shù)語和例如“烷基環(huán)烷基”的具體術(shù)語，并非意在暗示一般性術(shù)語不包括具體術(shù)語。本文中所使用的術(shù)語“烷氧基”是指通過一個末端醚鍵鍵合的烷基；也就是說“烷氧基”可被定義為-0A1，其中A2為上文定義的烷基。本文中使用的術(shù)語“烯基”為有2至24個碳原子的烴基，它們的結(jié)構(gòu)式中含有至少一個碳-碳雙鍵。例如(A1A2)C=C(A3Ai)的這種不對稱結(jié)構(gòu)意在包括E型和Z型異構(gòu)體。在存在不對稱烯的本文結(jié)構(gòu)式中可假定上述結(jié)構(gòu)，或者由鍵符號C=C明確地表示出來。烯基可被一個或多個下述基團(tuán)所取代，所述基團(tuán)包括但不限于下文所述的烷基、鹵化烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、鹵化物、羥基、酮、硫代-氧代、磺?；?、砜、亞砜或巰基。本文中使用的術(shù)語“炔基”為有2至24個碳原子的烴基，它們的結(jié)構(gòu)式中含有至少一個碳-碳叁鍵。炔基可被一個或多個下述基團(tuán)所取代，所述基團(tuán)包括但不限于下文所述的烷基、鹵化烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、鹵化物、羥基、酮、硫代-氧代、磺?；㈨?、亞砜或巰基。本文中使用的術(shù)語“芳基”為含有任何以碳為基礎(chǔ)的芳香族基團(tuán)的基團(tuán)，包括但不限于苯、萘、苯基、聯(lián)苯基、苯氧基苯等。術(shù)語“芳基”還包括“雜芳基”，“雜芳基”指的是含有的芳基基團(tuán)的環(huán)上至少摻入一個雜原子的基團(tuán)，雜原子的實例包括但不限于氮、氧、硫和磷。類似地，術(shù)語“非雜芳基”也包括在術(shù)語“芳基”之內(nèi)，指的是包括不含雜原子的芳基的基團(tuán)。芳基可為取代的或未取代的。芳基可被一個或多個下述基團(tuán)所取代，所述基團(tuán)包括但不限于本文所述的烷基、鹵化烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、鹵化物、羥基、酮、硫代_氧代、磺酰基、砜、亞砜或巰基。術(shù)語“聯(lián)芳基”是芳基基團(tuán)的一種具體形式，也包括在芳基的定義之內(nèi)。聯(lián)芳基指的是如萘那樣通過稠環(huán)結(jié)構(gòu)鍵合在一起或者如聯(lián)苯那樣通過一個或多個碳碳鍵連接的兩個芳基，。本文中使用的術(shù)語“環(huán)烷基”為由至少三個碳原子組成的非芳香性的以碳為基礎(chǔ)的環(huán)。環(huán)烷基基團(tuán)的實例包括但不限于環(huán)丙烷基、環(huán)丁烷基、環(huán)戊烷基、環(huán)己烷基等等。術(shù)語“雜環(huán)烷基”為前面定義的環(huán)烷基的一種，但是它的環(huán)上至少有一個碳原子被雜原子取代，所述雜原子例如但不限于氮、氧、硫或磷。環(huán)烷基和雜環(huán)烷基可為取代的或未取代的。環(huán)烷基和雜環(huán)烷基可被一個或多個下述基團(tuán)所取代，所述基團(tuán)包括但不限于本文所述的烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、鹵化物、羥基、酮、硫代_氧代、磺酰基、砜、亞砜或巰基。本文中使用的術(shù)語“環(huán)烯基”為由至少三個碳原子組成的非芳香性的以碳為基礎(chǔ)且在環(huán)上含有至少一個雙鍵即C=C的環(huán)。環(huán)烯基基團(tuán)的實例包括但不限于環(huán)丙烯基、環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)戊二烯基、環(huán)己烯基、環(huán)己二烯基等等。術(shù)語“雜環(huán)烯基”為前面定義的環(huán)烷基的一類并且包括在術(shù)語“環(huán)烯基”的含義之內(nèi)，但是它的環(huán)上至少有一個碳原子被雜原子取代，所述雜原子例如但不限于氮、氧、硫或磷。環(huán)烯基和雜環(huán)烯基可為取代的或未取代的。環(huán)烯基和雜環(huán)烯基可被一個或多個下述基團(tuán)所取代，所述基團(tuán)包括但不限于本文所述的烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、鹵化物、羥基、酮、硫代-氧代、磺?；?、砜、亞砜或巰基。本文中使用的術(shù)語“環(huán)狀基團(tuán)”指的是芳基基團(tuán)、非芳基基團(tuán)(即環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基)或二者皆有。環(huán)狀基團(tuán)具有一個或多個可被取代或未取代的環(huán)系統(tǒng)。環(huán)狀基團(tuán)可包括一個或多個芳基基團(tuán)、一個或多個非芳基基團(tuán)，或者一個或多個芳基基團(tuán)、一個或多個非芳基基團(tuán)。本文中所使用的術(shù)語“醛”用通式-C(O)H表示。在本說明書通篇中“C(0)”都是C=O的簡寫形式。本文中使用的術(shù)語“胺”或“氨基”用通式NA1A2A3表示，其中A1、A2和A3可以獨立地為上文所述的氫、烷基、商化烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)烯基。本文中所使用的術(shù)語“羧酸”用通式-C(0)OH表示。本文中所使用的“羧酸根”用通式-C(0)(Γ表示。本文中所使用的術(shù)語“酯”用通式-OC(O)A1或-C(O)OA1表示，其中A1可以為上文所述的烷基、商化烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)烯基。本文中所使用的術(shù)語“醚”用通式A1OA2表示，其中A1和A2可以獨立地為上文所述的烷基、商化烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)烯基。本文中所使用的術(shù)語“酮”用通式A1C(O)A2表示，其中A1和A2可以獨立地為上文所述的烷基、商化烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)烯基。本文中所使用的術(shù)語“鹵化物”指的是鹵素氟、氯、溴和碘。本文中所使用的術(shù)語“羥基”用通式-OH表示。本文中所使用的術(shù)語“硫代-氧代”用下列通式表示^S(O)AHS卩“磺?；?、A1S(O)A2(即“亞砜”)、-S(0)2A\A1SO2A2(即“砜”)、-OS(0)2kl或-OS(0)^A1，其中A1和A2可以為上文所述的氫、烷基、鹵化烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)烯基。在本說明書通篇中“S(0)，，都是S=0的簡寫形式。本文中所使用的術(shù)語“磺酰氨基”或“磺酰胺”用通式-S(0)2NH-表示。本文中所使用的術(shù)語“巰基”用通式-SH表示。本文所使用的“Rn”(其中η為整數(shù))可以獨立地具有一個或多個上述的基團(tuán)。根據(jù)所選擇的基團(tuán)，第一基團(tuán)可能摻入第二基團(tuán)中，或者第一基團(tuán)可能連接于第二基團(tuán)(即附著于第二基團(tuán)上)。例如，使用短語“包括氨基的烷基”時，氨基可能摻入于烷基的主鏈上。或者氨基可能是附著在烷基主鏈上。所選擇的基團(tuán)的性質(zhì)將決定第一基團(tuán)是嵌入第二基團(tuán)中還是附著在第二基團(tuán)上。如果沒有明確指出，化學(xué)鍵只以實線表示而未用楔形線或虛線表示的化學(xué)式考慮了每種可能的異構(gòu)體，例如每種對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體，以及異構(gòu)體的混合物，例如外消旋混合物或非外消旋(scalemic)的混合物。本文公開的某些物質(zhì)、化合物、組合物和組分可以由商購得到，或是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)容易地合成得到。例如，在制備所公開的化合物和組合物中使用的起始物質(zhì)和試劑可以從下述的供應(yīng)商處商購例如AldrichChemicalCo.,(Milwaukee,Wis.)>AcrosOrganics(MorrisPlains,NJ.)、FisherScientific(Pittsburgh,Pa.)或Sigma(St.Louis，Mo.)；或者使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法按照下述文獻(xiàn)中所述的工藝來制備例如，F(xiàn)ieserandFieser'sReagentsforOrganicSynthesis,Volumes1-17(JohnWiley禾口Sons,1991)；Rodd'sChemistryofCarboncompounds,Volumes1-5andSupplementals(ElsevierSciencePublishers,1989)；OrganicReactions,Volumes1-40(JohnWileyandSons,1991)；March'sAdvancedOrganicChemistry,(JohnWileyandSons,4thEdition)禾口Larock'sComprehensiveOrganicTransformations(VCHPublishersInc.，1989)。用于激活所公開的核糖開關(guān)的化合物包括環(huán)二GMP、pGpG、GpG或GpGpG、可激活一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)的環(huán)二GMP、pGpG、GpG或GpGpG的衍生物；S-腺苷高半胱氨酸、可激活一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)的S-腺苷高半胱氨酸的衍生物^reQp可激活一種PreQ1應(yīng)答性核糖開關(guān)的PreQ1的衍生物；Moco、可激活一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)的Moco的衍生物；SAM、可激活一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)的SAM的衍生物。用于激活一種SAM-IV核糖開關(guān)的化合物還可以為MeAzaAdoMet。為了激活一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)，所述化合物可以為S-腺苷高半胱氨酸。所述化合物還可以是能激活S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)的s-腺苷高半胱氨酸的衍生物。例如，所述化合物可以為s-腺苷-L-半胱氨酸(SAC)。圖12B顯示了對于可激活一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)的化合物很重要的結(jié)構(gòu)元件。為了激活preQiS答性核糖開關(guān)(及衍生自preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)的核糖開關(guān))，所述化合物可以是這樣的preQi衍生物，即其中第1位的N可以被C、0或S取代，其中第2位的氨基可被氫鍵供體取代，其中第6位的氧可被氫鍵受體取代，其中第7位的氨基可被氫鍵受體取代，并且所述氮可被氫鍵供體取代或者衍生化。應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)某一具體部分或基團(tuán)可被稱為氫鍵供體或氫鍵受體時，使用這一術(shù)語僅僅是為了便于參照而將各種取代基進(jìn)行分類。這一用語并不應(yīng)被理解為某一具體部分真正參與了與核糖開關(guān)或其他化合物形成氫鍵的過程。也有這種可能，例如，在本文中被稱為氫鍵受體(或氫鍵供體)的某一部分可能是唯一地或另外地參與了與核糖開關(guān)或其他化合物形成疏水相互作用、離子鍵、范德華力或其他類型相互作用。還應(yīng)理解的是，本文公開的某些基團(tuán)在本文中既可以被稱為氫鍵受體，也可以被稱為氫鍵供體。例如，-0H可以通過貢獻(xiàn)一個氫原子而成為氫鍵供體；-0H也可以通過氧原子上的一個或多個非鍵合電子對而成為氫鍵受體。因此，在本說明書通篇中，各個部分可為氫鍵供體和氫鍵受體，并且可照這樣稱謂。上面定義中的每種化合物在本文中意欲并應(yīng)該被認(rèn)為被具體地公開。而且，可在上面定義內(nèi)指出的每一亞類在本文中意欲并應(yīng)該被認(rèn)為被具體地公開。因此，特別考了，任何化合物或化合物亞類或者特別被納入使用或被排除使用，或者被包含于一化合物列表中或被排除在外。作為一個實例，考慮了其中每種化合物都如上所定義并能夠激活一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)的一組化合物。應(yīng)理解，本文所述的與核糖開關(guān)相互作用的化合物的具體接觸和相互作用(如氫鍵供應(yīng)或接受)對于化合物與核糖開關(guān)的相互作用是優(yōu)選但非必需的。例如，化合物可以以比發(fā)生所公開的接觸和相互作用的化合物小的親和力和/或特異性與核糖開關(guān)相互作用。而且，所述化合物上不同的或其他的官能團(tuán)可引入與核糖開關(guān)的新的、不同的和/或補(bǔ)償性接觸。這種官能團(tuán)與所述核糖開關(guān)的其他部分可發(fā)生接觸和相互作用和可被設(shè)計以發(fā)生接觸和相互作用。這種接觸和相互作用可補(bǔ)償觸發(fā)分子與核心結(jié)構(gòu)的接觸和相互作用。D.構(gòu)建體、載體和表達(dá)系統(tǒng)所公開的核糖開關(guān)可在任何合適的表達(dá)系統(tǒng)中使用。重組表達(dá)可以使用例如質(zhì)粒等載體來有效實現(xiàn)。載體可包括與核糖開關(guān)編碼序列可操作地連接的啟動子和待表達(dá)的RNA(例如，編碼蛋白的RNA)。載體還可包括轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的其他元件。本文所述的載體指的是包含外源DNA的任何載體。因此，載體是可將外源核酸不降解地轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中的媒介，它包括可在其轉(zhuǎn)入的細(xì)胞中表達(dá)所述核酸的啟動子。載體包括但不限于質(zhì)粒、病毒核酸、病毒、噬菌體核酸、噬菌體、粘粒和人工染色體?？梢陨a(chǎn)多種適于攜帶核糖開關(guān)調(diào)節(jié)的構(gòu)建體的原核和真核的表達(dá)載體。這類表達(dá)載體包括例如pET、pET3d、pCR2.l、pBAD、pUC和酵母載體。載體可在例如各種體內(nèi)和體外環(huán)境中使用。病毒載體包括腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、AIDS病毒、神經(jīng)營養(yǎng)病毒(neuronaltrophicvirus)、辛德畢斯病毒(Sindbis)和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的那些病毒。還可使用與上述病毒具有共同的使其適于用作載體的性質(zhì)的任何病毒家族。由Verma(1985)描述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括鼠類馬羅尼白血病病毒MMLV和表現(xiàn)MMLV作為載體的理想性質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。通常，病毒載體包括非結(jié)構(gòu)性早期基因、結(jié)構(gòu)性晚期基因、RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄物、復(fù)制和殼體化必需的反向末端重復(fù)序列以及控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的啟動子。當(dāng)被基因工程改造用作載體時，通常要移除病毒的一個或多個早期基因，并將一個基因或基因/啟動子盒插入到病毒基因組中代替被移除的病毒DNA。“啟動子”通常為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點相對固定的位置發(fā)揮功能的一個或多個DNA序列。“啟動子”包括與RNA聚合酶發(fā)生基本相互作用所需的核心元件以及轉(zhuǎn)錄因子，還可包括上游元件和應(yīng)答元件?！霸鰪?qiáng)子”通常指的是位于與轉(zhuǎn)錄起始位點相對不固定的位置發(fā)揮功能的DNA序列，它可以在轉(zhuǎn)錄單位的5，(Laimins，1981)或3，(Luskyetal.，1983)。此外，增強(qiáng)子除了可以在編碼序列本身之中(Osborneetal.，1984)，也可以在內(nèi)含子中(Banerjietal.，1983)。它們的長度通常為IObp至300bp之間，并且以順式方式發(fā)揮作用。增強(qiáng)子的功能是增加鄰近的啟動子的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子與啟動子類似，也經(jīng)常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。增強(qiáng)子經(jīng)常對表達(dá)的調(diào)節(jié)有決定性作用。用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或有核細(xì)胞)中的表達(dá)載體還可包括可以影響mRNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄終止所必需的序列。這些區(qū)域在編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中以多腺苷酸化區(qū)段的形式被轉(zhuǎn)錄。3’非翻譯區(qū)還包括轉(zhuǎn)錄終止位點。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單位也包括多腺苷酸化區(qū)域。這一區(qū)域的一個優(yōu)點是它增加了被轉(zhuǎn)錄的單位像mRNA—樣被加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。多腺苷酸化信號在表達(dá)構(gòu)建體中的鑒定和用途已經(jīng)廣為人知。優(yōu)選地，在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中使用同源的多腺苷酸化信號。載體可包括編碼標(biāo)記物產(chǎn)物的核酸序列。使用這種標(biāo)記物產(chǎn)物來確定基因是否被送遞至細(xì)胞以及在送遞后是否被表達(dá)。優(yōu)選的標(biāo)記物基因為編碼半乳糖苷酶的大腸桿菌IacZ基因和綠色熒光蛋白。在一些實施方案中，標(biāo)記物可為篩選標(biāo)記物。當(dāng)這類篩選標(biāo)記物被成功地轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中時，如果將宿主細(xì)胞置于篩選壓力下，則被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以存活。目前廣泛使用的有兩類不同的篩選策略。第一類是基于細(xì)胞代謝，使用離開添加培養(yǎng)基就不能生長的突變細(xì)胞系。第二類為顯性篩選，它指的是在任何細(xì)胞類型中都可使用而不必使用突變細(xì)胞系的篩選方案。這些方案通常使用抑制宿主細(xì)胞生長的藥物。含有新基因的那些細(xì)胞可以表達(dá)使細(xì)胞具有藥物抗性的蛋白質(zhì)，從而可以在篩選中存活。這類顯性篩選的實例中使用的藥物有新霉素(SouthernandBerg，1982)、霉酚酸(MulliganandBerg,1980)或潮霉素(Sugdenetal.，1985)?？梢允褂眠z傳物質(zhì)的直接轉(zhuǎn)移來獲得基因轉(zhuǎn)移，所述遺傳物質(zhì)包括在質(zhì)粒、病毒載體、病毒核酸、噬菌體核酸、噬菌體、粘粒和人工染色體中，但不限于此，或者通過細(xì)胞或載體例如陽離子脂質(zhì)體中的遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移來獲得基因轉(zhuǎn)移。這類方法為本領(lǐng)域所熟知，并且可以很容易的使之適用于本文所述的方法。轉(zhuǎn)移載體可為任何可將基因送遞至細(xì)胞內(nèi)的核苷酸構(gòu)建體(例如質(zhì)粒)，或者作為送遞基因的總體策略的一部分，例如作為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒或重組腺病毒的一部分(Rametal.CancerRes.53=83-88,(1993))。用于轉(zhuǎn)染的合適手段包括病毒載體、化學(xué)轉(zhuǎn)染子或物理-機(jī)械方法例如電穿孔和DNA的直接擴(kuò)散，這些手段描述于例如，Wolff,J.Α.，etal.，Science，247，1465-1468，(1990)；和Wolff，J.A.Nature,352,815-818,(1991)。1.病毒載體優(yōu)選的病毒載體為腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、AIDS病毒、神經(jīng)營養(yǎng)病毒、辛德畢斯病毒和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的那些病毒。還優(yōu)選的是與上述病毒具有共同的使其適于用作載體的性質(zhì)的任何病毒家族。優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括鼠類馬羅尼白血病病毒MMLV和表現(xiàn)MMLV作為載體的理想性質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以比其他載體病毒攜帶更大的基因載量，即攜帶轉(zhuǎn)基因或標(biāo)記物基因，因此是常用的載體。但是它們不能用于非增殖細(xì)胞。腺病毒載體相對穩(wěn)定并易于操作、具有高滴度、可在氣溶膠制劑中送遞并可以轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞。Pox病毒載體較大并具有多個可插入基因的位點，它們對熱穩(wěn)定，可在室溫下儲存。優(yōu)選的實施方案為經(jīng)過基因工程改造的病毒載體，這樣可以抑制宿主生物由病毒抗原引起的免疫反應(yīng)。優(yōu)選的這種類型的載體應(yīng)攜帶白細(xì)胞介素8或10的編碼區(qū)域。病毒載體與大多數(shù)將基因?qū)爰?xì)胞的化學(xué)或物理方法相比，具有更高的處理能力(導(dǎo)入基因的能力)。通常，病毒載體包括非結(jié)構(gòu)性早期基因、結(jié)構(gòu)性晚期基因、RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄物、復(fù)制和殼體化必需的反向末端重復(fù)序列以及控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的啟動子。當(dāng)被基因工程改造用作載體時，通常要移除病毒的一個或多個早期基因，并將一個基因或基因/啟動子盒插入到病毒基因組中代替被移除的病毒DNA。這種類型的構(gòu)建體可以攜帶最多達(dá)約8kb的外源遺傳物質(zhì)。被移除的早期基因的必需功能通常由經(jīng)過基因工程改造而反式表達(dá)早期基因的基因產(chǎn)物的細(xì)胞系提供。i.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒為屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的動物病毒，包括任何類型、亞科、屬或向性。Verma,I.Μ.,Retroviralvectorsforgenetransfer.InMicrobiology-1985,AmericanSocietyforMicrobiology,pp.229-232，Washington,(1985)總體描述了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，上述文獻(xiàn)以援引的方式納入本文。將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于基因療法的方法的實例描述于美國專利No.4，868，116和4，980，286；PCT申請WO90/02806和W089/07136；以及Mulligan,(Science260:926_932(1993))等文獻(xiàn)中，以上文獻(xiàn)中的教導(dǎo)以援引的方式納入本文。逆轉(zhuǎn)錄病毒本質(zhì)上是一個包裝，它將核酸負(fù)載包裹在內(nèi)。核酸負(fù)載攜帶有包裝信號，這使得復(fù)制出的子代分子可以被有效地包裝在包衣中。除了包裝信號以外，還有許多復(fù)制和復(fù)制病毒的包裝所需要的順式作用分子。通常逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括參與蛋白質(zhì)衣殼形成的gag、pol和env基因。通常使用待轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞的外源DNA來替代gag、pol和env基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常包括用于摻入至包裝包衣的包裝信號，發(fā)出起動gag轉(zhuǎn)錄單位信號的序列，逆轉(zhuǎn)錄必需的元件(包括結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄的tRNA引物的引物結(jié)合位點)，在DNA合成過程中引導(dǎo)RNA鏈轉(zhuǎn)換的末端重復(fù)序列，作為DNA合成中第二鏈合成起始位點的富含嘌呤的序列5’至3’LTR,以及可使DNA狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)錄病毒插入到宿主基因組中的LTR末端附近的特異性序列。gag、pol和env基因的移除可以使得約8kb的外源序列被插入到病毒基因組中、被反轉(zhuǎn)錄以及在復(fù)制后被包裝到新的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。根據(jù)每種轉(zhuǎn)錄物的大小，上述核酸量足夠送遞一至多個基因。優(yōu)選地，在插入物中與其他基因一起含有陽性或陰性的篩選標(biāo)記物。由于在大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，復(fù)制機(jī)制和包裝蛋白(gag、pol和env)已經(jīng)被移除，通常通過將載體置于包裝細(xì)胞系中來生產(chǎn)載體。包裝細(xì)胞系為已被含有復(fù)制和包裝機(jī)制但不含任何包裝信號的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。當(dāng)攜帶所選DNA的載體被轉(zhuǎn)染到這些細(xì)胞系中時，包含目的基因的載體通過輔助細(xì)胞提供的順式機(jī)制而被復(fù)制并包裝到新的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。而具有該機(jī)制的基因組因為沒有必需的信號而不被包裝。ii.腺病毒載體對于復(fù)制缺陷型腺病毒的構(gòu)建，前人已有所描述(Berkneretal.,J.Virology611213-1220(1987)；Massieetal.,mol.Cell.Biol.62872-2883(1986)；Haj-Ahmadetal.,J.Virology51:261_21A(1986)；Davidsonetal.,J.Virology611226-1239(1987)；Zhang"Generationandidentificationofrecombinantadenovirusbyliposome-mediatedtransfectionandPCRanalysis"BioTechniques15=868-872(1993))0使用這些病毒作為載體的優(yōu)點是它們散播至其他細(xì)胞類型的程度是有限的，因為它們可以在初始感染的細(xì)胞中復(fù)制，但是它們不能形成新的感染性病毒顆粒。重組腺病毒直接在體內(nèi)送遞至下列組織時已表現(xiàn)出可獲得很高的基因轉(zhuǎn)移效率氣道上皮、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮、CNS實質(zhì)以及多種其他組織位點(Morsy，J.Clin.Invest.921580-1586(1993)；Kirshenbaum,J.Clin.Invest.92381-387(1993)；Roessler,J.Clin.Invest.921085-1092(1993)；MoulIier,NatureGenetics4154-159(1993)；LaSalle,Science259:988-990(1993)；Gomez-Foix，J.Biol.Chem.267:25129_25134(1992)；Rich,HumanGeneTherapy4461-476(1993)；Zabner,NatureGenetics6:75-83(1994);Guzman,CirculationResearch731201-1207(1993)；Bout,HumanGeneTherapy5:3-10(1994)；Zabner,Cell75207-216(1993)；Caillaud,Eur.J.Neuroscience51287-1291(1993)；和Ragot，J.Gen.Virology74=501-507(1993))。重組腺病毒與野生型或復(fù)制缺陷型腺病毒一樣，通過結(jié)合特異性細(xì)胞表面受體而完成基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后病毒通過受體介導(dǎo)的胞吞作用而內(nèi)化(ChardonnetandDales,Virology40:462—477(1970)；BrownandBurlingham,J.Virology12:386-396(1973)；SvenssonandPersson,J.Virology55442-449(1985)；Seth,etal.，J.Virol.51:650_655(1984)；Seth,etal.，mol.Cell.Biol.4:1528-1533(1984)；Vargaetal.，J.Virology65:6061-6070(1991)；Wickhametal.，Cell73:309_319(1993))。一種優(yōu)選的病毒載體為基于移除了El基因的腺病毒的載體，這些病毒在例如人類293細(xì)胞的細(xì)胞系中產(chǎn)生。在另一個優(yōu)選的實施方案中，El和E3基因都被從腺病毒基因組中移除。另一類病毒載體是基于腺伴隨病毒(AAV)。這種缺陷型細(xì)小病毒是一種優(yōu)選的載體，因為它可以感染許多種細(xì)胞類型，并且對人類沒有致病性。AAV型載體可以轉(zhuǎn)運(yùn)4至5kb的基因，并且已知野生型AAV可以穩(wěn)定地插入到第19號染色體上。具有這種位點特異性整合性質(zhì)的載體為優(yōu)選的。這種載體的一種特別優(yōu)選的實施方案是由Avigen，SanFrancisco,CA生產(chǎn)的P4.IC載體，它可包含單純皰疹病毒胸苷激酶基因、HSV_tk和/或標(biāo)記物基因，例如編碼綠色熒光蛋白GFP的基因。在病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒中插入的基因經(jīng)常含有啟動子和/或增強(qiáng)子以輔助對所需基因產(chǎn)物的表達(dá)的控制。啟動子通常為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點相對固定的位置時可以發(fā)揮功能的一個或多個DNA序列。“啟動子”包含與RNA聚合酶發(fā)生基本相互作用所需的核心元件和轉(zhuǎn)錄因子，還可包含上游元件和應(yīng)答元件。2.病毒啟動子和增強(qiáng)子控制哺乳動物宿主細(xì)胞中的載體轉(zhuǎn)錄的優(yōu)選啟動子可由各種來源獲得，例如，諸如下列病毒的基因組多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒，最優(yōu)選巨細(xì)胞病毒；或者來源于異源哺乳動物啟動子例如β肌動蛋白啟動子。SV40病毒的早期和晚期啟動子可以方便地以同樣包括SV40病毒復(fù)制起始位點的SV40限制性片段的形式獲得(Fiersetal.，Nature，273113(1978))。人類巨細(xì)胞病毒的即時早期啟動子可以方便地以HindIIIE限制性片段的形式獲得(Greenway,PJ.etal.，Gene18355-360(1982))。當(dāng)然，來自宿主細(xì)胞或相關(guān)物種的啟動子也在此有用?！霸鰪?qiáng)子”通常指的是為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點相對不固定的位置發(fā)揮功能的DNA序列，它可以在轉(zhuǎn)錄單位的5，(Laimins,L.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.78:993(1981))或3，(Lusky,M.L.,etal.,Mol.Cellbio.31108(1983))。此外，增強(qiáng)子除了可以在編碼序列本身之中(Osborne,Τ.F.,etal.,mol.Cellbio.4:1293(1984))，也可以在內(nèi)含子中(Banerji，J.L.etal.,Cell33:729(1983))。它們的長度通常為IObp至300bp之間，并且以順式方式發(fā)揮作用。增強(qiáng)子的功能是增加鄰近的啟動子的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子還經(jīng)常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。啟動子也可含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。增強(qiáng)子經(jīng)常對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)有決定性作用。雖然目前許多來自哺乳動物基因的增強(qiáng)子的序列是已知的(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素)，但是通常還是使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。優(yōu)選的實例為在復(fù)制起點下游(lateside)的SV40增強(qiáng)子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子、在復(fù)制起點下游的多瘤病毒增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。啟動子和/或增強(qiáng)子可以被能觸發(fā)它們功能的光或特異性化學(xué)事件特異性地激活?？梢杂美缢沫h(huán)素和地塞米松等試劑來調(diào)節(jié)系統(tǒng)。也有一些方法通過暴露于例如Y輻照的輻照方法或烷基化化療藥物來增強(qiáng)病毒載體的基因表達(dá)。優(yōu)選地，啟動子和/或增強(qiáng)子區(qū)域在所有真核細(xì)胞類型中都是有活性的。這種類型的一種優(yōu)選的啟動子為CMV啟動子(650個堿基)。其他優(yōu)選的啟動子為SV40啟動子、巨細(xì)胞病毒(全長啟動子)和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LTF。已顯示所有的特異性調(diào)節(jié)元件都可被克隆和用于構(gòu)建在特定細(xì)胞類型例如黑素瘤細(xì)胞中選擇性表達(dá)的表達(dá)載體。神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子已被用于在神經(jīng)膠質(zhì)來源的細(xì)胞中選擇性表達(dá)基因。用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或有核細(xì)胞)中的表達(dá)載體還可包含可以影響mRNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄終止所必需的序列。這些區(qū)域在編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中以多腺苷酸化區(qū)段的形式被轉(zhuǎn)錄。3’非翻譯區(qū)還包括轉(zhuǎn)錄終止位點。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單位也包括多腺苷酸化區(qū)域。這一區(qū)域的一個優(yōu)點是它增加了被轉(zhuǎn)錄的單位像mRNA—樣被加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。多腺苷酸化信號在表達(dá)構(gòu)建體中的鑒定和用途已經(jīng)廣為人知。優(yōu)選地，在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中使用同源的多腺苷酸化信號。在轉(zhuǎn)錄單位的一個優(yōu)選實施方案中，多腺苷酸化區(qū)域來自SV40早期多腺苷酸化信號，由大約400個堿基組成。還優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單位單獨包括其他標(biāo)準(zhǔn)序列或包括其他標(biāo)準(zhǔn)序列和上述序列，改進(jìn)構(gòu)建體的表達(dá)或穩(wěn)定性。3.標(biāo)記物載體可包括編碼標(biāo)記物產(chǎn)物的核酸序列。使用這種標(biāo)記物產(chǎn)物來確定基因是否被送遞至細(xì)胞以及在送遞后是否被表達(dá)。優(yōu)選的標(biāo)記物基因為編碼半乳糖苷酶的大腸桿菌IacZ基因和綠色熒光蛋白。在一些實施方案中，標(biāo)記物可為篩選標(biāo)記物。用于哺乳動物細(xì)胞的合適篩選標(biāo)記物的實例為二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素類似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。當(dāng)這類篩選標(biāo)記物被成功地轉(zhuǎn)移至哺乳動物宿主細(xì)胞中時，如果將宿主細(xì)胞置于篩選壓力下，則被轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細(xì)胞可以存活。目前廣泛使用的有兩類不同的篩選策略。第一類是基于細(xì)胞代謝，使用離開添加培養(yǎng)基就不能生長的突變細(xì)胞系。兩個實例為CHODHFR-細(xì)胞和小鼠LTK—細(xì)胞。這些細(xì)胞在不添加如胸苷或次黃嘌呤營養(yǎng)物的情況下就不能生長。由于這些細(xì)胞缺乏完整的核苷酸合成途徑中必需的某些基因，因此除非在添加培養(yǎng)基中提供那種沒有的核苷酸，否則細(xì)胞就不能存活。另一種補(bǔ)充培養(yǎng)基的方式是將完整的DHFR或TK基因?qū)肴狈ο鄳?yīng)基因的細(xì)胞中，由此改變它們的生長需求。未被DHFR或TK基因轉(zhuǎn)化的個體細(xì)胞將不能在非添加培養(yǎng)基上生長。第二類為顯性篩選，它指的是在任何細(xì)胞類型中都可使用而不必使用突變細(xì)胞系的篩選方案。這些方案通常使用抑制宿主細(xì)胞生長的藥物。那些細(xì)胞可以表達(dá)使細(xì)胞具有藥物抗性的蛋白質(zhì)，從而可以在篩選中存活。這類顯性篩選的實例中使用的藥物有新霉素(SouthernP.andBerg,P.，J.Molec.Appl.Genet.1:327(1982))、霉酚酸(Mulligan,R.C.andBerg,P.Science209:1422(1980))或潮霉素(Sugden，B.etal.,mol.Cell.Biol.5=410-413(1985))0這三個實例使用了真核控制下的細(xì)菌基因來分別賦予細(xì)胞對于合適的藥物G418或新霉素(遺傳霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其他的還有新霉素類似物G418和嘌呤霉素。E.生物傳感器核糖開關(guān)還公開了生物傳感器核糖開關(guān)。生物傳感器核糖開關(guān)是經(jīng)過基因工程改造的核糖開關(guān)，它們在存在它們的同種觸發(fā)分子時產(chǎn)生可檢出的信號。可用的生物傳感器核糖開關(guān)可以在觸發(fā)分子達(dá)到或超過閾值水平時被觸發(fā)。生物傳感器核糖開關(guān)可被設(shè)計為體內(nèi)應(yīng)用或體外應(yīng)用。例如，與編碼作為信號的蛋白質(zhì)或參與產(chǎn)生信號的蛋白質(zhì)的報告RNA可操作地連接的環(huán)二GMP生物傳感器核糖開關(guān)可通過基因工程改造細(xì)胞或生物，使其含有編碼該環(huán)二GMP核糖開關(guān)/報告物RNA的核酸構(gòu)建體從而在體內(nèi)應(yīng)用。用于體外的生物傳感器核糖開關(guān)的一個實例是包括構(gòu)象依賴性標(biāo)簽的核糖開關(guān)，由該標(biāo)簽產(chǎn)生的信號隨核糖開關(guān)的激活狀態(tài)而變化。優(yōu)選地，這種生物傳感器核糖開關(guān)使用天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或由天然存在的核糖開關(guān)衍生的適體結(jié)構(gòu)域，例如環(huán)二GMP。F.報告蛋白和報告肽為評估核糖開關(guān)或生物傳感器核糖開關(guān)的激活，可以使用報告蛋白或報告肽。報告蛋白或報告肽可以由通過核糖開關(guān)調(diào)節(jié)其表達(dá)的RNA編碼。實施例中描述了一些特異性報告蛋白的使用。報告蛋白和報告肽的使用已為人所熟知，并可以容易地適于與核糖開關(guān)一起使用。報告蛋白可為任意可檢出的或產(chǎn)生可檢出信號的蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)或肽的存在可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如放射免疫測定、放射性標(biāo)記、免疫測定、酶活性測定、吸附、熒光、發(fā)光和蛋白質(zhì)印跡)檢測。更優(yōu)選地，即使在報告蛋白的水平比較低的情況下，仍然可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對其水平定量?？捎玫膱蟾娴鞍装ㄎ灩馑孛?、綠色熒光蛋白以及它們的衍生物，例如北美螢火蟲(Photinuspyralis)的螢火蟲螢光素酶(FL)和海參(Renillareniformis)的海參螢光素酶(RL)。G.構(gòu)象依賴性標(biāo)簽構(gòu)象依賴性標(biāo)簽指的是具有下述性質(zhì)的所有標(biāo)簽在標(biāo)簽所連接的分子或化合物(例如核糖開關(guān))的形式或構(gòu)象發(fā)生改變的基礎(chǔ)上，該標(biāo)簽可以產(chǎn)生熒光強(qiáng)度或波長的變化。在使用探針和引物的情況下，使用的構(gòu)象依賴性標(biāo)簽的實例包括分子信標(biāo)(molecularbeacon)、Amplifluors、FRET探針、可切割的FRET探針、TaqMan探針、蝎形引物(scorpionprimer)、焚光三聚體寡聚物(fluorescenttriplexoligos)包括但不限于三聚體分子信標(biāo)或三聚體FRET探針、熒光水溶性綴合聚合物、PNA探針和QPNA探針。這類標(biāo)簽——具體而言它們的功能原理一一可適于與核糖開關(guān)一起使用。一些類型的構(gòu)象依賴性標(biāo)簽綜述于SchweitzerandKingsmore,Curr.Opin.Biotech.12:21_27(2001)中。莖淬滅標(biāo)簽是構(gòu)象依賴性標(biāo)簽的一種形式，它是位于核酸上的熒光標(biāo)簽，這樣當(dāng)莖結(jié)構(gòu)形成時淬滅部分會接近熒光標(biāo)簽以使得標(biāo)簽發(fā)出的熒光被淬滅。當(dāng)莖結(jié)構(gòu)被破壞時(例如當(dāng)含有標(biāo)簽的核糖開關(guān)被激活時)，淬滅部分就不再接近熒光標(biāo)簽，熒光就會增強(qiáng)。這種效應(yīng)的實例可見于分子信標(biāo)、熒光三聚體寡聚物、三聚體分子信標(biāo)、三聚體FRET探針和QPNA探針中，它們的操作原理也可適于與核糖開關(guān)一起使用。莖激活標(biāo)簽是構(gòu)象依賴性標(biāo)簽的一種形式，它是通過莖結(jié)構(gòu)的形成可以增強(qiáng)或改變熒光的標(biāo)簽或標(biāo)簽對。莖激活標(biāo)簽可包括受體熒光標(biāo)簽和供體部分，當(dāng)受體和供體相互接近時(當(dāng)包括標(biāo)簽的核酸鏈形成莖結(jié)構(gòu)時)，熒光共振能量由供體向受體的轉(zhuǎn)移會使受體發(fā)熒光。莖激活標(biāo)簽通常為位于核酸分子(例如核糖開關(guān))上的標(biāo)簽對，這樣當(dāng)核酸分子中形成莖結(jié)構(gòu)時受體和供體就會相互接近。如果莖激活標(biāo)簽的供體部分本身就是熒光標(biāo)簽，那么當(dāng)它不與受體接近時(也就是未形成莖結(jié)構(gòu)時)它就會以熒光的形式釋放能量(通常這種熒光的波長與受體熒光的波長不同)。當(dāng)莖結(jié)構(gòu)形成時，總體的效果是供體熒光減少和受體熒光增加。FRET探針為使用莖激活標(biāo)簽的一個實例，它的操作原理也可適于與核糖開關(guān)一起使用。H.檢測標(biāo)簽為幫助對核糖開關(guān)的激活、滅活或阻斷進(jìn)行檢測和量化，或?qū)颂情_關(guān)的激活、滅活或阻斷后產(chǎn)生的核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行檢測和量化，可以在檢測探針或者檢測分子中導(dǎo)入檢測標(biāo)簽，或者在表達(dá)的核酸或蛋白質(zhì)中直接導(dǎo)入檢測標(biāo)簽。本文中所述的檢測標(biāo)簽為可以與核酸或蛋白質(zhì)直接或間接地相連接、并由此直接或間接地產(chǎn)生可以測量的可檢測信號的任何分子。許多這種標(biāo)簽均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知?？捎糜谒_方法的合適的檢測標(biāo)簽的實例為放射性同位素、熒光分子、磷光分子、酶、抗體和配體。合適的熒光標(biāo)簽的實例包括異硫氰酸熒光素(FITC)、5，6-羧甲基熒光素、德克薩斯紅(Texasred)、硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹酰氯、羅丹明、氨基甲基香豆素(AMCA)、曙紅、藻紅、BODIPY、CascadeBlue、OregonGreen、芘、麗絲胺(lissamine)、加氧雜蒽(xanthenes)、吖啶、噁嗪、藻紅蛋白、鑭系金屬離子的大環(huán)螯合物例如量子染料、熒光能量轉(zhuǎn)移染料例如噻唑橙乙啡啶異源二聚體、以及花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。其他特異性熒光標(biāo)簽的實例包括3_羥基芘5，8，10-三磺酸、5_羥色胺(5-HT)、酸性品紅、茜素絡(luò)合酮、茜素紅、別藻藍(lán)蛋白、氨基香豆素、蒽基硬脂酸、阿斯屈拉崇(Astrazon)亮紅4G、阿斯屈拉崇橙R、阿斯屈拉崇紅6B、阿斯屈拉崇黃7GLL、阿的平(Atabrine)、金胺(Auramine)、Aurophosphine、AurophosphineG、BAO9(雙氨基苯基口,惡二唑)、BCECF、硫酸小檗堿、雙苯酰胺、布蘭科福爾(Blancophor)FFG溶液、布蘭科福爾SV、BodipyFl、亮磺基黃素FF(BrilliantSulphoflavinFF)、鈣黃綠素藍(lán)(CalcienBlue)、鈣綠(CalciumGreen)、卡爾科弗盧爾(Calcofluor)RW溶液、卡爾科弗盧爾白(CalcofluorWhite)、爾科弗盧爾白ABT溶液、爾科弗盧爾白標(biāo)準(zhǔn)溶液、Carbostyryl,CascadeYellow、兒茶酚胺、奎納克林(Chinacrine)、科里膦O、香豆素-鬼筆環(huán)肽、CY3.18、CY5.18、CY7、Dans(1-二甲基氨基-萘_5_磺酸)、Dansa(二氨基萘磺酸)、丹酰NH-CH3，二氨基苯基噁二唑(DAO)、二甲基氨基-5-磺酸、二吡咯亞甲基二氟化硼、聯(lián)苯亮黃素7GFF、多巴胺、藻紅ITC、吖啶橙(Euchrysin)、FIF(甲醛誘導(dǎo)熒光)、FlazoOrange、Fluo3、熒光胺、Fura-2、Genacryl亮紅B、Genacryl亮黃10GF、Genacryl粉紅3G、Genacryl黃5GF、GloxalicAcicU粒狀藍(lán)(GranularBlue)、血口卜啉(Haematoporphyrin)、Indo-l>IntrawhiteCf液體、雷可福(Leucophor)PAF、雷可福SF、雷可福WS、麗絲胺羅丹明B200(RD200)、螢黃CH(LuciferYellowCH)、螢黃VS、蘇丹紅(MagdalaRed)、MarinaBlue、麥西隆(Maxilon)亮黃素10GFF、麥西隆亮黃素8GFF、MPS(MethylGreenPyronineStilbene，甲基綠焦寧均二苯乙烯)、光神霉素、NBD胺、硝基苯并噁二唑(Nitrobenzoxadidole)、去甲腎上腺素、核堅牢紅(NuclearFastRed)、核黃(NuclearYellow)、尼龍山(Nylosan)亮黃素E8G、噁二R^>PacificM>MtiS1Jm^X(Feulgen)>PhorwiteARPhorwiteBKL>PhorwiteRev、PhorwiteRPA>I#(Phthalocyanine)R>PolyazaindacenePontochromeBlueBlack、卟啉、Primuline、普施安黃(ProcionYellow)、焦寧(Pyronine)、焦寧B、Pyrozal亮黃素7GF、芥奎吖因(QuinacrineMustard)、羅丹明123、羅丹明5GLD、羅丹明6G、羅丹明B、羅丹明B200、羅丹明BExtra、羅丹明BB、羅丹明BG、羅丹明WT、5-羥色胺、塞夫隆(Sevron)亮紅2B、塞夫隆亮紅4G、塞夫隆亮紅B、塞夫隆橙、塞夫隆黃L、SITS(Primuline)、SITS(均二苯乙烯異硫磺酸，Stilbenelsothiosulphonicacid)、均二苯乙烯、Snarf1、磺基羅丹明BCanC、磺基羅丹明GExtra、四環(huán)素、噻嗪紅R、硫黃素S、硫黃素TCNjt黃素5、Thiolyte、ThiozolOrange^TinopolCBS、純藍(lán)(TrueBlue)、Ultralite、熒光素鈉(Uranine)B、優(yōu)微添(Uvitex)SFC、二甲苯橙(XyleneOrange)和XRITC?？捎玫臒晒鈽?biāo)簽為熒光素(5-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、羅丹明(5，6_四甲基羅丹明)和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。這些熒光染料的最大吸收和發(fā)射波長分別為:FITC(490nm;520nm)、Cy3(554nm;568nm)、Cy3.5(581nm;588nm)、Cy5(652nm；672nm)、Cy5.5(682nm；703nm)、Cy7(755nm；778nm)，這使得它們可以同時被檢測。熒光素染料的其他實例包括6_羧基熒光素(6-FAM)、2’，4’，l，4，_四氯熒光素(ΤΕΤ)、2，，4，，5，，7，，1，4_六氯熒光素(HEX)、2，，7，-二甲氧基-4，，5，-二氯-6-羧基羅丹明(JOE)、2，-氯-5，-氟-7，，8，-稠苯-1，4-二氯-6-羧基熒光素(NED)和2，_氯_7，_苯基-1，4-二氯-6-羧基熒光素(VIC)。熒光標(biāo)簽可由各種來源商購獲得，包括AmershamPharmaciaBiotech，Piscataway,NJ；MoIecuIarProbes,Eugene，OR；禾口ResearchOrganics,Cleveland,Ohio0所關(guān)注的其他標(biāo)簽包括那些僅當(dāng)它們所連接的探針與靶分子特異性結(jié)合時產(chǎn)生信號的標(biāo)簽，其中這類標(biāo)簽包括Tyagi&Kramer，NatureBiotechnology(1996)14:303和EPO070685Bl中所述的“分子信標(biāo)”。所關(guān)注的其他標(biāo)簽包括美國專利No.5，563，037、國際申請WO97/17471和WO97/17076中所述的那些標(biāo)簽。被標(biāo)記的核苷酸是檢測標(biāo)簽的一種可用形式，可以在合成過程中直接導(dǎo)入被表達(dá)的核酸中?？梢灾苯訉?dǎo)入核酸中的檢測標(biāo)簽的實例包括核苷酸類似物例如BrdUrd(5-溴脫ft胃fSHoyandSchimke,MutationResearch290:217_230(1993))、ΜΜ月兌fl胃苷(Henegariuetal,NatureBiotechnology18:345_348(2000))、5_甲基胞嘧啶(Sanoetal.，Biochim.Biophys.Acta951:157_165(1988))、溴尿核苷(ffansicketal,J.CellBiology122:283-293(1993))和經(jīng)生物素修飾的核苷酸(Langeretal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:6633(1981))或經(jīng)過例如地高辛抗原(digoxygenin)的合適的半抗原修飾的核苷酸(Kerkhof，Anal.Biochem.205:359_364(1992))。合適的熒光標(biāo)記的核苷酸有異硫氰酸熒光素-dUTP、花青-3-dUTP和花青-5-dUTP(Yuetal,NucleicAcidsRes.,223226-3232(1994))。對于DNA而言優(yōu)選的核苷酸類似物檢測標(biāo)簽為BrdUrd(溴脫氧尿苷、BrdUrd、BrdU、BUdR，Sigma-AldrichCo)。其他用于將檢測標(biāo)簽導(dǎo)入DNA的可用的核苷酸類似物為AA-dUTP(氨基烯丙基脫氧尿苷三磷酸，Sigma-AldrichCo.)和5-甲基-dCTP(RocheMolecularBiochemicals)。一種用于將檢測標(biāo)簽導(dǎo)入RNA的可用的核苷酸類似物為生物素-16_UTP(生物素-16-尿苷-5，-三磷酸，RocheMolecularBiochemicals)。可將熒光素Cy3和Cy5連接至dUTP上用于直接標(biāo)記。Cy3.5和Cy7可以以抗生物素蛋白或抗地高辛抗原綴合物的形式用于帶有生物素或地高辛抗原標(biāo)簽的探針的二級檢測。被導(dǎo)入核酸的例如生物素的檢測標(biāo)簽，隨后可以使用本領(lǐng)域公知的靈敏方法進(jìn)行檢測。例如，使用鏈親和素-堿性磷酸酶綴合物(Tropix，Inc.)可以檢測生物素，這種綴合物可以與生物素結(jié)合并隨后通過適當(dāng)?shù)孜锏幕瘜W(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(例如，化學(xué)發(fā)光底物CSPD3-(4-甲氧基螺-[1，2，_二環(huán)氧丙烷-3-2，-(5，_氯)三環(huán)[3.3.1.I3'7]癸烷]_4_基)苯基憐酸二鈉(disodium,3-(4_methoxyspiro-[l,2,-dioxetane-3-2'-(5，-chloro)tricyclo[3.3.1.I3'7]decane]-4-yl)phenylphosphate)；Tropix,Inc.)。標(biāo)簽也可以是可檢測的酶，例如堿性磷酸酶、大豆過氧化物酶、辣根過氧化物酶和聚合酶，檢測例如使用化學(xué)信號放大法或使用能發(fā)光的酶的底物(例如化學(xué)發(fā)光的1，2-二環(huán)氧丙烷底物)或能產(chǎn)生熒光信號的酶的底物。結(jié)合了兩個或多個上述檢測標(biāo)簽的分子也可被認(rèn)為是檢測標(biāo)簽。任何已知的檢測標(biāo)簽都可與本發(fā)明公開的探針、標(biāo)簽、分子和方法一起使用，以便標(biāo)記和檢測本發(fā)明公開方法所產(chǎn)生的激活的或滅活的核糖開關(guān)或核酸或蛋白質(zhì)。用于檢測和測量檢測標(biāo)簽產(chǎn)生的信號的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可以通過閃爍計數(shù)或直接顯示法來檢測放射性同位素；可用熒光分光光度計來檢測熒光分子；可用分光光度計或直接照相顯示的方法檢測磷光分子；可通過檢測或可視化酶促反應(yīng)的產(chǎn)物來檢測酶。可通過檢測與抗體偶聯(lián)的二級檢測標(biāo)簽來檢測抗體。本文所使用的檢測分子為偶聯(lián)了一個或多個檢測標(biāo)簽的與待測化合物或組合物相互作用的分子。I.序列相似性應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所使用的術(shù)語同源性和同一性的含義是相同的，都是指相似性。因此，例如，如果在兩個序列(例如非天然序列)之間使用同源性這一詞語，應(yīng)當(dāng)理解這并不一定是指著兩個序列之間的進(jìn)化關(guān)系，而是著眼于它們的核酸序列之間的相似性或關(guān)聯(lián)性。為了測量序列的相似性，確定兩個進(jìn)化上相關(guān)的分子之間相似性的很多方法都可以常規(guī)地應(yīng)用于兩個或多個核酸或蛋白質(zhì)，而無需考慮它們在進(jìn)化上是否相關(guān)?？傮w而言，應(yīng)當(dāng)理解的是，為了定義本文所公開的核糖開關(guān)、適體、表達(dá)平臺、基因和蛋白質(zhì)的任何已知變體和衍生物或可能出現(xiàn)的種類，一種方法是通過定義變體和衍生物與特定已知序列的同源性。本文公開的具體序列的這種同一性在本文其他部分也有所討論?？傮w而言，本文所公開的核糖開關(guān)、適體、表達(dá)平臺、基因和蛋白質(zhì)的變體與指定序列或天然序列通常有至少約70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,8182%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,9192%,93%,94%,95%,96%、97%、98%或99%的同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易明白如何測定兩種蛋白質(zhì)或核酸(例如基因)之間的同源性。例如，可以在兩序列比對并使同源性達(dá)到最高水平后計算同源性。計算同源性的另一種方法可以通過公開的算法進(jìn)行?？墒褂孟铝兴惴ㄟM(jìn)行用于比較的序列優(yōu)化比對SmithandWatermanAdv.Appl.Math.2482(1981)中所述的局部同源性算法；Needlemanandffunsch,J.MoLBiol.48=443(1970)中所述的同源性比對算法；PearsonandLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444(1988)中所述的相似性檢索方法；或者這些算法的計算機(jī)實現(xiàn)形式(WisconsinGenetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison，WI)；或者通過審查的方式進(jìn)行。通過例如Zuker，M.Science244:48_52，1989Jaegeretal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7706-7710,1989Jaegeretal.MethodsEnzymol.183:281_306，1989中公開的算法，可以獲得核酸的相同類型的同源性，上述文獻(xiàn)中至少與核酸比對有關(guān)的素材以援引的方式納入本文。應(yīng)當(dāng)理解的是，通常可以使用任何方法，而在某些情況下這些不同的方法所得到的結(jié)果可能不同，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，如果使用上述方法中的至少一種發(fā)現(xiàn)了同一性，則該序列可被稱為具有指定的同一性。例如，如本文所使用的，所述的具有與另一序列相比的特定百分比同源性的序列，是指具有由上述任意一種或多種計算方法所計算出的所述同源性的序列。例如，如果使用Zuker計算方法，第一序列被計算為與第二序列具有80%的同源性，即使按照其他任何計算方法都計算出該第一序列與第二序列不具有80%的同源性，那么，如本文所定義的，第一序列與第二序列仍具有80%的同源性。另一個實例，如果使用Zuker計算方法和Pearson和Lipman計算方法，第一序列被計算為與第二序列具有80%的同源性，即使通過Smith和Waterman計算方法、Needleman和Wunsch計算方法、Jaeger計算方法或任意其他計算方法計算，第一序列與第二序列不具有80%的同源性，那么，如本文所定義的，第一序列與第二序列仍具有80%的同源性。再一個實例，如果使用每一種計算方法，第一序列都被計算為與第二序列具有80%的同源性(盡管實際上不同的計算方法常得到不同的計算的同源性百分比)，那么如本文所定義的，第一序列與第二序列具有80%的同源性。J.雜交和選擇性雜交術(shù)語雜交通常意為至少兩種核酸分子例如引物或探針與核糖開關(guān)或基因間的序列驅(qū)動的相互作用。序列驅(qū)動的相互作用意為以核苷酸特異性的方式發(fā)生于兩個核苷酸或核苷酸類似物或核苷酸衍生物間的相互作用。例如G與C相互作用或者A與T相互作用即為序列驅(qū)動的相互作用。通常序列驅(qū)動的相互作用發(fā)生于核苷酸的沃森-克里克面或Hoogsteen面。兩種核酸的雜交受到本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的許多條件和參數(shù)的影響。例如鹽濃度、PH和反應(yīng)溫度均會影響兩種核酸分子是否會雜交。兩種核酸分子間的選擇性雜交的參數(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，在一些實施方案中選擇性雜交條件可被定義為嚴(yán)格雜交的條件。例如，雜交的嚴(yán)格性是通過雜交和/或洗滌步驟的溫度和鹽濃度共同控制的。例如實現(xiàn)選擇性雜交的雜交條件可包括在比Tm(解鏈溫度，在該溫度下一半的分子與其雜交配對的另一部分解離)低大約12-25°C的溫度下，在高離子強(qiáng)度溶液(6XSSC或6XSSPE)中雜交，然后在所選的溫度和鹽濃度的組合的條件下洗滌，此時洗滌溫度為比Tm低大約5°C至20°C。在預(yù)實驗中，可根據(jù)經(jīng)驗容易地確定溫度和鹽濃度條件，在該實驗中使固定在濾膜上的參照DNA的樣品與帶標(biāo)記的目的核酸雜交，然后在不同嚴(yán)格度的條件下洗滌。對于DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交而言雜交溫度通常較高一些?？墒褂萌缟纤龅幕虮绢I(lǐng)域已知的(Sambrooketal.,MolecularCloningALaboratoryManual,2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989；Kunkeletal.MethodsEnzymol.1987:154:367，1987，上述文獻(xiàn)中至少與核酸雜交相關(guān)的素材通過援引的方式納入本文)條件以達(dá)到嚴(yán)格度。優(yōu)選的DNA:DNA雜交的嚴(yán)格條件可以是在約68°C(水溶液中)，在6XSSC或6XSSPE中雜交，之后在68°C洗滌。如果需要，當(dāng)所需的互補(bǔ)程度降低時，雜交和洗滌的嚴(yán)格性可作相應(yīng)減小，并且還根據(jù)尋找可變性的任何區(qū)域中的G-C或A-T的豐富程度而定。同樣，如果需要，當(dāng)所需的同源性增大時，雜交和洗滌的嚴(yán)格性可作相應(yīng)增加，并且還根據(jù)需要高同源性的任何區(qū)域中的G-C或A-T的豐富程度而定，所有這些均為本領(lǐng)域已知。另一種定義選擇性雜交的方法是通過著眼于一種核酸與另一核酸結(jié)合的量(百分比)。例如，在一些實施方案中選擇性雜交的條件可以為至少約60%、65%、70%、71%、72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的限量核酸與非限量核酸結(jié)合時的條件。通常非限量核酸要過量例如10或100或1000倍。這類測定可在限量核酸和非限量核酸均比它們的kd低例如10倍或100倍或1000倍時的條件下進(jìn)行，或者只是一種核酸分子為比它的kd低例如10倍或100倍或1000倍時的條件下進(jìn)行，或兩種核酸分子之一或兩者均在kd之上時的條件下進(jìn)行。另一種定義選擇性雜交的方法是通過著眼于這樣一種核酸的百分比，所述核酸是在需要雜交以促進(jìn)所需的酶操作的條件下得到酶操作的核酸。例如，在一些實施方案中選擇性雜交條件可以是至少約60%,65%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,9193%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的核酸在促進(jìn)酶操作的條件下進(jìn)行酶操作時的條件，例如，如果酶操作是DNA延伸，那么選擇性雜交條件可以是至少約60%、65%、85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,100%的核酸分子被延伸時的條件。優(yōu)選的條件還包括廠商所建議的或本領(lǐng)域所指出的適于酶進(jìn)行操作的條件。正如同源性一樣，應(yīng)當(dāng)理解本文公開的用于確定兩種核酸分子間的雜交水平的方法有許多種。應(yīng)當(dāng)理解這些方法和條件可提供兩種核酸分子間的不同雜交百分比，但是除非另外指明，否則滿足任何方法的參數(shù)都是足夠的。例如，如果需要80%雜交并且只要在這些方法的任意一種中所要求的參數(shù)內(nèi)發(fā)生雜交，就認(rèn)為它在本文得到了公開。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，如果組合物或方法滿足用于單獨或聯(lián)合確定雜交的這些標(biāo)準(zhǔn)的任意一條，那么它就是本文所公開的組合物或方法。K.核酸本文公開了基于核酸的多種分子，包括例如核糖開關(guān)、適體以及編碼核糖開關(guān)和適體的核酸。所公開的核酸由例如核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物構(gòu)成。本文討論了這些分子及其他分子的非窮盡性實例。應(yīng)當(dāng)理解，例如當(dāng)載體在細(xì)胞中表達(dá)時，表達(dá)的mRNA通常由A、C、G和U組成。同樣，應(yīng)當(dāng)理解，如果核酸分子通過例如外源性送遞被導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞環(huán)境中，那么核酸分子由核苷酸類似物構(gòu)成是有利的，這樣可減少核酸分子在細(xì)胞環(huán)境中的降解。只要保留了它們相關(guān)的功能，核糖開關(guān)、適體、表達(dá)平臺以及任何其他寡核苷酸和核酸都可以由經(jīng)修飾的核苷酸(核苷酸類似物)構(gòu)成或含有經(jīng)修飾的核苷酸(核苷酸類似物)。很多經(jīng)修飾的核苷酸是已知的，并可被用于寡核苷酸和核酸之中。核苷酸類似物是含有對堿基、糖或磷酸部分的一些類型的修飾的核苷酸。對堿基部分的修飾可以包括對A、C、G和T/U的天然性或合成性修飾，以及使用不同的嘌呤或嘧啶堿，例如尿嘧啶-5-基、次黃嘌呤-9-基(I)和2-氨基腺嘌呤-9-基。經(jīng)修飾的堿基包括但不限于5_甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基或其他烷基衍生物；腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基或其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-鹵素尿嘧啶和5-鹵素胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮基尿嘧啶、6-偶氮基胞嘧啶和6-偶氮基胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；腺嘌呤和鳥嘌呤的8-鹵素、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羥基以及其他8-取代物；尿嘧啶和胞嘧啶的5-鹵素特別是5-溴、5-三氟甲基和其他的5-取代物；7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤；7-脫氮鳥嘌呤(7-deazaguanine)和7-脫氮腺嘌呤和3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。其他的堿基修飾物可見于例如美國專利No.3，687，808、Englischetal.,AngewandteChemie,InternationalEdition,1991,30,613、Sanghvi,Y.S.,Chapter15,AntisenseResearchandApplications,第289-302頁、Crooke,S.Τ.andLebleu,B.ed.，CRCPress,1993。某些核苷酸類似物例如5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶可以增加雙鏈體形成的穩(wěn)定性。其他經(jīng)修飾的堿基是那些有通用堿基功能的堿基。通用堿基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用堿基可取代正常的堿基，但在堿基配對上沒有偏好性。也就是說通用堿基可以與其他任何堿基進(jìn)行堿基配對。堿基修飾經(jīng)?？膳c例如糖修飾結(jié)合使用，例如2’-0-甲氧基乙基，以獲得獨特的屬性例如提高的雙鏈體穩(wěn)定性。有多個美國專利具體描述了很多堿基修飾，例如4，845，205,5,130，302,5,134，066,5,175，273,5,367，066,5,432，272,5,457，187、5，459，255,5，484，908,5，502，177,5，525，711,5，552，540,5，587，469,5，594，121,5，596，091,5,614，617和5，681，941。以上各專利文獻(xiàn)的每一篇的全部內(nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻(xiàn)中關(guān)于堿基修飾及其合成、使用和將其導(dǎo)入寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。核苷酸類似物還可包括糖部分的修飾。對糖部分的修飾可包括核糖和脫氧核糖的天然性修飾及合成性修飾。糖修飾包括但不限于在2’位置的下列修飾0H;F;0-烷基、S-烷基或N-烷基；0-烯基、S-烯基或N-烯基；0-炔基、S-炔基或N-炔基；或0-烷基-ο-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的Cl至ClO烷基或C2至ClO烯基和炔基。2，糖修飾還包括但不限于-0[(CH2)n0]mCH3、-0(CH2)n0CH3、_0(CH2)nNH2、-0(CH2)nCH3、-O(CH2)n-ONH2禾口-O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中η和m在1至大約10之間。在2’位置的其他修飾包括但不限于C1至ClO低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或0-芳烷基、SH、SCH3、0CN、Cl、Br、CN、CF3>OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2,N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團(tuán)、報告基團(tuán)、插入劑、可提高寡核苷酸藥物動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)或可提高寡核苷酸藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)和其他具有類似性質(zhì)的基團(tuán)。還可以在糖的其他位置進(jìn)行類似的修飾，特別是在3’端核苷酸上或2’-5’連接的寡核苷酸中的糖的3’位置，和在5’端核苷酸的5’位置。經(jīng)修飾的糖可含有那些在環(huán)氧橋位置用例如CH2和S進(jìn)行的修飾。核苷酸糖類似物還可具有糖模擬物，例如用環(huán)丁基部分代替五碳呋喃糖。有許多美國專利都教導(dǎo)了這類經(jīng)修飾的糖結(jié)構(gòu)的制備，例如4，981，957,5,118，800,5,319，080,5,359，044,5,393，878,5,446，137、5，466，786,5，514，785,5，519，134,5，567，811,5，576，427,5，591，722,5，597，909,5，610，300,5,627，053,5,639，873,5,646，265,5,658，873,5,670，633和5，700，920，以上各專利文獻(xiàn)的每一篇的全部內(nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻(xiàn)中關(guān)于經(jīng)修飾的糖結(jié)構(gòu)及其合成、使用和將其導(dǎo)入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。核苷酸類似物可以在磷酸部分加以修飾。經(jīng)修飾的磷酸部分包括但不限于可經(jīng)過修飾而使得在兩個核苷酸之間的連接部分含有下列結(jié)構(gòu)的磷酸部分，所述結(jié)構(gòu)包括硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨烷基磷酸三酯；磷酸甲酯和其他磷酸烷基酯，包括磷酸3’-烯基酯和手性磷酸酯；次膦酸酯(phosphinate)；氨基磷酸酯，包括3’-氨基氨基磷酸酯(3’-aminophosphoramidate)和氨烷基氨基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidate)、硫代氨基磷酸酉旨(thionophosphoramidates)、硫代燒基磷酸酉旨(thionoalkylphosphonates)、硫代燒基粦酸三酉旨(thionoalkylphosphotriesters)和硼烷磷酸酯(boranophosphates)。應(yīng)當(dāng)理解的是，在兩個核苷酸之間的這些磷酸連接或經(jīng)修飾的磷酸連接可以通過3’-5’連接或2’-5’連接，連接可以包括極性的倒轉(zhuǎn)，例如3’-5’至5’-3’或者2’-5’至5’-2’。還包括各種鹽形式、混合鹽形式和游離酸形式。許多美國專利教導(dǎo)了如何制備和使用含有經(jīng)修飾磷酸的核苷酸，包括但不限于3，687，808、4，469，863,4，476，301,5，023，243,5，177，196,5，188，897,5，264，423,5，276，019,5，278，302、5，286，717,5,321,131,5,399，676、5，405，939、5，453，496、5，455，233、5，466，677、5，476，925、5，519，126、5，536，821、5，541，306、5，550，111,5,563，253、5，571,799,5,587，361和5，625，050，以上各專利文獻(xiàn)的每一篇的全部內(nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻(xiàn)中關(guān)于經(jīng)修飾的磷酸及其合成、使用和將其導(dǎo)入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。應(yīng)當(dāng)理解的是，核苷酸類似物僅需要包括一種修飾，但是也可以在一個部分或幾個不同部分中包括多種修飾。核苷酸替代物為與核苷酸具有類似功能特性但不含有磷酸部分的分子，例如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物分子可以以Watson-Crick方式或Hoogsteen方式識別互補(bǔ)性核酸并與互補(bǔ)性核酸雜交(堿基配對)，但是它們通過非磷酸的部分連接起來。核苷酸替代物在與合適的靶核酸相互作用時能夠形成雙螺旋型結(jié)構(gòu)。核苷酸替代物為磷酸部分和/或糖部分被替換的核苷酸或核苷酸類似物。核苷酸替代物不包括標(biāo)準(zhǔn)的磷原子。磷酸的替代物可為例如短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間連接物、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間連接物、或一個或多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連接物。這些連接物可包括具有下列結(jié)構(gòu)的連接物嗎啉代連接物(形成核苷的糖部分的一部分)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲?；?formacetyl)和硫甲酰基(thioformacetyl)骨架；亞甲基甲?；土蚣柞；羌?；含烯烴骨架；氨基磺酸鹽骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基胼基骨架；磺酸和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其他帶有混合的N、0、S和CH2組成部分的連接物。許多美國專利公開了如何制備和使用這些種類的磷酸替換物，包括但不限于5，034，506,5,166，315,5,185，444,5,214，134,5,216，141,5,235，033,5,264，562、5，264，564,5，405，938,5，434，257,5，466，677,5，470，967,5，489，677,5，541，307,5，561，225,5，596，086,5，602，240,5，610，289,5，602，240,5，608，046,5，610，289,5，618，704,5,623，070,5,663，312,5,633，360,5,677，437和5，677，439，以上各專利文獻(xiàn)的每一篇的全部內(nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻(xiàn)中關(guān)于磷酸替換物及其合成、使用和將其導(dǎo)入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。應(yīng)當(dāng)理解的是，在核苷酸替代物中核苷酸的糖部分和磷酸部分都可以被例如酰胺型連接物(氨基乙基甘氨酸)(PNA)所替換。美國專利5，539，082、5，714，331和5，719，262教導(dǎo)了如何制備和使用PNA分子，上述文獻(xiàn)的每一篇都以援引的方式納入本文。(還可參見Nielsenetal.，Science254:1497-1500(1991))。寡核苷酸和核酸可以由核苷酸構(gòu)成，并可以由不同類型或相同類型的核苷酸構(gòu)成。例如，在寡核苷酸中，一個或多個核苷酸可以是核糖核苷酸、2’-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2’-0_甲基核糖核苷酸的混合物；大約10%至約50%的核苷酸可以是核糖核苷酸、2’-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2’-0-甲基核糖核苷酸的混合物；大約50%或50%以上的核苷酸可以是核糖核苷酸、2’-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2’-0_甲基核糖核苷酸的混合物；或者全部核苷酸是核糖核苷酸、2’-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2’-0_甲基核糖核苷酸的混合物。這類寡核苷酸和核酸可被稱為嵌合寡核苷酸和嵌合核酸。L.固體支持物固體支持物為可連接分子(例如觸發(fā)分子)和核糖開關(guān)(或其他由所公開的方法產(chǎn)生的或在所公開的方法中使用的組件)的固態(tài)基質(zhì)或支持物。核糖開關(guān)和其他分子可以直接或間接地與固體支持物相連接。例如，分析物(例如觸發(fā)分子，待測化合物)可以結(jié)合到固體支持物表面或與固定在固體支持物上的捕獲試劑(例如結(jié)合分析物的化合物或分子)相連接。作為另一個實例，核糖開關(guān)可以結(jié)合到固體支持物表面或與固定在固體支持物上的探針相連接。多個核糖開關(guān)、探針或其他分子以陣列、網(wǎng)格或其他組織形式連接到固體支持物上構(gòu)成陣列?？捎糜诠腆w支持物的固態(tài)基質(zhì)可以包括可以與組件直接或間接連接的任何固體材料。這包括下述材料，例如丙烯酰胺、瓊脂糖、纖維素、硝酸纖維素、玻璃、金、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚氧乙烯、聚硅酸鹽、聚碳酸酯、特氟隆(聚四氟乙烯樹脂)，碳氟化合物、尼龍、硅橡膠、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、官能化硅烷、聚丙基延胡索酸鹽(polypropylfumerate)、膠原、糖胺聚糖和聚氨基酸。固態(tài)基質(zhì)可為任何可用的形式，包括薄膜、膜、瓶、盤、纖維、編織纖維、成型聚合物、顆粒、珠粒、微顆?；蛩鼈兊慕M合。固態(tài)基質(zhì)和固體支持物可為有孔的和無孔的。芯片是一小片長方形或正方形的材料。優(yōu)選的固態(tài)基質(zhì)的形式為薄膜、珠?；蛐酒?。一種可用于固態(tài)基質(zhì)的形式是微量滴定板。在一些實施方案中，可以使用多孔載玻片。陣列可包括多個固定于固體支持物的確定位置或預(yù)定位置的核糖開關(guān)、觸發(fā)分子、其他分子、化合物或探針。固體支持物上的每個預(yù)定位置通常具有一種類型的組件(即在該位置的所有組件都是相同的)?；蛘?，在固體支持物上的同一預(yù)定位置可以固定化多種類型的組件。每一位置可以具有給定組件的多個拷貝。在固體支持物上的不同組件的空間隔離使得可以進(jìn)行分別的檢測和識別。固體支持物為一個單獨的單位或結(jié)構(gòu)雖然是有用的，但不是必需的。一系列的核糖開關(guān)、觸發(fā)分子、其他分子、化合物和/或探針可以分布于任意數(shù)目的固體支持物上。例如，一種極端的情況是每一個組件可被固定于分離的反應(yīng)管或容器中，或在分離的珠?；蛭㈩w粒上。將寡核苷酸固定化于固態(tài)基質(zhì)的方法已很成熟?？墒褂靡阎呐悸?lián)方法將包括定位探針(addressprobe)和檢測探針的寡核苷酸偶聯(lián)至基質(zhì)上。例如，合適的附著方法描述于Peaseetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(11):5022_5026(1994)禾口Khrapkoetal.，MolBiol(Mosk)(USSR)25:718_730(1991)。一種將3，-胺寡核苷酸固定于酪蛋白包被的載玻片上的方法描述于Stimpsonetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6379_6383(1995)。一種將寡核苷酸附著于固態(tài)基質(zhì)上的可用的方法描述于Guoetal,NucleicAcidsRes.225456-5465(1994)。固定于固體支持物上的每一組件(例如，核糖開關(guān)、觸發(fā)分子或其他分子)可以位于固體支持物的不同預(yù)定區(qū)域。不同的位置可以是不同的反應(yīng)室。每一不同的預(yù)定區(qū)域可以與其他不同的預(yù)定區(qū)域在物理上彼此分離。固體支持物上的不同預(yù)定區(qū)域之間的距離可以是固定的，也可以是可變的。例如，在陣列中每一組件可以彼此之間以固定距離排列，而與珠粒相連接的組件就不會有固定的空間關(guān)系。特別地，多個固體支持物單位(例如多個珠粒)的使用方式會導(dǎo)致不同的距離。組件可以以任何密度連接于或固定于固體支持物上。組件固定于固體支持物上的密度可以超過每立方厘米400個不同組件。組件的陣列可以有任何數(shù)目的組件。例如，陣列可以具有至少1，000個固定于固體支持物的不同組件、至少10，000個固定于固體支持物的不同組件、至少100，000個固定于固體支持物的不同組件或至少1，000,000個固定于固體支持物的不同組件.M.試劑盒上文所述的材料和其他材料可以以任意合適的組合被包裝在一起，作為用于進(jìn)行或輔助進(jìn)行所公開方法的試劑盒。如果給定試劑盒中的試劑盒組件被設(shè)計和調(diào)整為在所公開的方法中一起使用則是有用的。例如公開了用于檢測化合物的試劑盒，該試劑盒包括一種或多種生物傳感器核糖開關(guān)。該試劑盒還可包括檢測核糖開關(guān)的激活的試劑和標(biāo)簽。N.混合物公開了通過實施或準(zhǔn)備實施所公開方法而形成的混合物。例如，公開了包括核糖開關(guān)和觸發(fā)分子的混合物。不論何時，只要方法包括使組合物或組件或試劑混合或相接觸，實行該方法就會產(chǎn)生多種不同的混合物。例如，如果方法包括3個混合步驟，如果各步驟分別進(jìn)行，則在上述步驟的每一步之后都會形成一種特有的混合物。此外，不論各步驟如何進(jìn)行，在所有步驟完成之后也會形成一種混合物。本發(fā)明的公開內(nèi)容考慮了由實施所公開方法所獲得的這些混合物，以及含有任何公開(例如本文所公開)的試劑、組合物或組件的混合物。0.系統(tǒng)公開了用于實施或輔助實施所公開方法的系統(tǒng)。系統(tǒng)通常包括制造的物品的組合例如結(jié)構(gòu)、機(jī)械、裝置等，以及組合物、化合物、材料等。這些組合為已公開的或從公開的內(nèi)容可以顯而易見，這些組合均被考慮。例如，公開了和考慮了包括生物傳感器核糖開關(guān)、固體支持物和信號讀取裝置的系統(tǒng)。P.數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和計算機(jī)控制公開了所公開方法中使用的、由所公開方法產(chǎn)生的或從所公開方法中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)通常為在組合物或介質(zhì)中采集、編組、儲存和/或體現(xiàn)的任何形式的數(shù)據(jù)、信息和/或?qū)ο?。以例如RAM或存儲磁盤的電子形式儲存的核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)和激活測量結(jié)果就是一種類型的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。所公開的方法或其任意部分或由該方法制備的制品，都可以通過計算機(jī)控制來進(jìn)行控制、管理或輔助。這類計算機(jī)控制可以通過計算機(jī)控制過程或方法來實現(xiàn)，可以使用和/或產(chǎn)生數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，并可以使用計算機(jī)程序。這類計算機(jī)控制、計算機(jī)控制的過程、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和計算機(jī)程序都被考慮到并應(yīng)理解為在本文中被公開。方法公開了用于激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的方法。這類方法可包括例如使核糖開關(guān)和可激活、滅活或阻斷該核糖開關(guān)的化合物或觸發(fā)分子相接觸。核糖開關(guān)通過觸發(fā)分子的結(jié)合或移除來發(fā)揮控制基因表達(dá)的功能?；衔锟捎糜诩せ?、滅活或阻斷核糖開關(guān)。核糖開關(guān)的觸發(fā)分子(以及其他的激活化合物)可被用于激活核糖開關(guān)。通?？墒褂糜|發(fā)分子以外的化合物來滅活或阻斷核糖開關(guān)。還可以通過例如從核糖開關(guān)所在處移除觸發(fā)分子來滅活核糖開關(guān)。因此，所公開的滅活核糖開關(guān)的方法可以包括例如從核糖開關(guān)所在的位置或與核糖開關(guān)接觸的位置移除觸發(fā)分子(或其他激活化合物)。可以通過不會激活核糖開關(guān)的觸發(fā)分子類似物的結(jié)合來阻斷核糖開關(guān)。還公開了通過使化合物與RNA分子相接觸，從而改變RNA分子表達(dá)或改變編碼RNA分子的基因表達(dá)的方法，其中所述RNA分子包括核糖開關(guān)。核糖開關(guān)通過結(jié)合或移除觸發(fā)分子而實現(xiàn)控制基因表達(dá)的功能。因此，將包括核糖開關(guān)的目的RNA分子置于可激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的條件下就可用來改變RNA的表達(dá)。例如轉(zhuǎn)錄終止或核糖體與RNA的結(jié)合被阻斷可以導(dǎo)致表達(dá)被改變。根據(jù)核糖開關(guān)的性質(zhì)，與觸發(fā)分子的結(jié)合可以減少或阻止RNA分子的表達(dá)或者促進(jìn)或增加RNA分子的表達(dá)。還公開了通過激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)，來調(diào)節(jié)含有核糖開關(guān)的天然存在的基因或RNA的表達(dá)的方法。如果該基因?qū)性摶虻募?xì)胞或生物的存活而言十分重要，那么激活、滅活或阻斷該核糖開關(guān)可導(dǎo)致細(xì)胞或生物的死亡、停滯或虛弱。例如(如果該核糖開關(guān)的激活關(guān)閉或抑制表達(dá))，激活某個對微生物的存活而言十分重要的天然存在的基因中的天然存在的核糖開關(guān)，可能導(dǎo)致該微生物的死亡。這是所公開的化合物和方法用于抗微生物和抗生素作用的一個理論基礎(chǔ)。具有這些抗微生物作用的化合物被認(rèn)為是抑菌的或殺菌的。還公開了選擇和識別可激活、滅活或阻斷調(diào)節(jié)剪接的核糖開關(guān)的化合物的方法。核糖開關(guān)的激活是指核糖開關(guān)結(jié)合觸發(fā)分子時其狀態(tài)的變化。核糖開關(guān)可由除觸發(fā)分子以外的化合物并以不同于與觸發(fā)分子結(jié)合的方式被激活。術(shù)語觸發(fā)分子在本文中用來指可激活核糖開關(guān)的分子和化合物。這包括核糖開關(guān)的天然或正常的觸發(fā)分子以及其他可以激活核糖開關(guān)的化合物。天然或正常的觸發(fā)分子是給定的天然核糖開關(guān)本來就有的觸發(fā)分子，或者對于某些非天然核糖開關(guān)而言是這樣的觸發(fā)分子該核糖開關(guān)針對該觸發(fā)分子被設(shè)計或該核糖開關(guān)通過該觸發(fā)分子被選擇(正如在例如體外選擇或體外進(jìn)化技術(shù)中那樣)。不是天然的觸發(fā)分子可被稱為非天然觸發(fā)分子。還公開了殺滅或抑制細(xì)菌的方法，包括將所述細(xì)菌與本文公開的或通過本文公開的方法識別的化合物相接觸。還公開了識別激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物的方法。例如，激活核糖開關(guān)的化合物可通過將一待測試化合物和核糖開關(guān)相接觸并評估所述核糖開關(guān)的激活情況來識另IJ。如果所述核糖開關(guān)被激活，則該測試化合物被識別為激活核糖開關(guān)的化合物。核糖開關(guān)的激活可以任何合適的方式被評估。例如，核糖開關(guān)可被連接到一報告RNA上，并在存在或不存在所述測試化合物的情況下測量所述報告RNA的表達(dá)、表達(dá)水平或表達(dá)水平的變化。再如，核糖開關(guān)可包含一個構(gòu)象依賴標(biāo)記，來自該構(gòu)象依賴標(biāo)記的信號隨該核糖開關(guān)的激活狀態(tài)而改變。這種核糖開關(guān)優(yōu)選使用來自或者源自天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域?？梢钥闯?，對核糖開關(guān)的激活情況進(jìn)行評估使用或不使用對照試驗或者測量均可。識別滅活核糖開關(guān)的化合物的方法可用類似方式執(zhí)行。除了本文別處公開的方法，對阻斷核糖開關(guān)的化合物的識別可以任何合適的方法完成。例如，在已知可激活或者滅活核糖開關(guān)的化合物存在時或者在測試化合物存在時可進(jìn)行評估核糖開關(guān)的激活或滅活的測定。如果未觀察到在所述測試化合物不存在時可觀察到的激活或滅活，那么所述測試化合物被確定為阻斷所述核糖開關(guān)被激活或者滅活的化合物。還公開了使用生物傳感器核糖開關(guān)檢測化合物的方法。該方法可包括使待測樣品和生物傳感器核糖開關(guān)相接觸，并評估生物傳感器核糖開關(guān)的激活。生物傳感器核糖開關(guān)的激活表明在待測樣品中存在該生物傳感器核糖開關(guān)的觸發(fā)分子。生物傳感器核糖開關(guān)是經(jīng)過基因工程改造的核糖開關(guān)，它們在存在它們的同種觸發(fā)分子時產(chǎn)生可檢出的信號?？捎玫纳飩鞲衅骱颂情_關(guān)可以在觸發(fā)分子達(dá)到或超過閾值水平時被觸發(fā)。生物傳感器核糖開關(guān)可被設(shè)計為體內(nèi)應(yīng)用或體外應(yīng)用。例如，報告RNA編碼作為信號的蛋白質(zhì)或參與產(chǎn)生信號的蛋白質(zhì)，與該報告RNA可操作地連接的環(huán)二GMP生物傳感器核糖開關(guān)可在體內(nèi)被用于通過基因工程改造細(xì)胞或生物，使其含有編碼核糖開關(guān)/報告RNA的核酸構(gòu)建體。用于體外的生物傳感器核糖開關(guān)的一個實例是包括構(gòu)象依賴性標(biāo)簽的環(huán)二GMP核糖開關(guān)，由該標(biāo)簽產(chǎn)生的信號依賴于核糖開關(guān)的激活狀態(tài)。優(yōu)選地，這種生物傳感器核糖開關(guān)使用天然存在的環(huán)二GMP核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或由天然存在的環(huán)二GMP核糖開關(guān)衍生的適體結(jié)構(gòu)域。還公開了通過識別激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物以及生產(chǎn)所述被識別化合物制成的化合物。這可通過例如將如文中別處所公開的化合物識別方法與生產(chǎn)被識別化合物的方法相結(jié)合來完成。例如，化合物可通過如下步驟制備使一測試化合物和一核糖開關(guān)相接觸，評估所述核糖開關(guān)的激活情況，以及，如果所述核糖開關(guān)被所述測試化合物激活，則將所述激活核糖開關(guān)的測試化合物作為所述化合物來制備。還公開了通過檢查一化合物對一核糖開關(guān)的激活、滅活或阻斷并生產(chǎn)所述被檢的化合物所制備的化合物。這可以通過例如結(jié)合本文他處所公開的化合物激活、滅活或阻斷的評估方法與生產(chǎn)被檢出化合物的方法來完成。例如，制備化合物可通過如下步驟使一測試化合物和一核糖開關(guān)接觸，評估所述核糖開關(guān)的激活情況，且如果所述核糖開關(guān)被所述測試化合物激活，則將所述激活核糖開關(guān)的測試化合物作為所述化合物制備。檢查化合物激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的能力既指識別之前未知可激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物，也指在已知某種化合物可激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)時，評估所述化合物激活、滅活或者阻斷核糖開關(guān)的能力。還公開了檢測目的化合物的方法，該方法包括使一樣品和核糖開關(guān)接觸，其中所述核糖開關(guān)由所述目的化合物激活，其中當(dāng)所述目的化合物激活所述核糖開關(guān)時，所述核糖開關(guān)會產(chǎn)生一信號，其中當(dāng)所述樣品含有所述目的化合物時所述核糖開關(guān)產(chǎn)生一信號。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種PreQ1S答性核糖開關(guān)、一種M0c0應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。當(dāng)目的化合物激活所述核糖開關(guān)時，所述核糖開關(guān)可改變構(gòu)象，其中所述構(gòu)象變化通過構(gòu)象依賴標(biāo)記產(chǎn)生信號。當(dāng)目的化合物激活核糖開關(guān)時，所述核糖開關(guān)可改變構(gòu)象，其中所述構(gòu)象變化會引起連接所述核糖開關(guān)的RNA表達(dá)的變化，其中所述表達(dá)變化產(chǎn)生一信號。信號可由連接所述核糖開關(guān)的RNA表達(dá)的報告蛋白產(chǎn)生。還公開了檢測目的化合物的方法，該方法包括使一樣品和核糖開關(guān)接觸，其中所述核糖開關(guān)由所述目的化合物激活，其中當(dāng)所述目的化合物激活所述核糖開關(guān)時，所述核糖開關(guān)會產(chǎn)生一信號，其中當(dāng)所述樣品含有所述目的化合物時所述核糖開關(guān)產(chǎn)生一信號，其中所述核糖開關(guān)包括一種核糖開關(guān)或一種核糖開關(guān)的衍生物。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種PreQ1應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。當(dāng)目的化合物激活所述核糖開關(guān)時，所述核糖開關(guān)可改變構(gòu)象，其中所述構(gòu)象變化通過構(gòu)象依賴標(biāo)記產(chǎn)生信號。當(dāng)目的化合物激活核糖開關(guān)時，所述核糖開關(guān)可改變構(gòu)象，其中所述構(gòu)象變化會引起連接所述核糖開關(guān)的RNA表達(dá)的變化，其中所述表達(dá)變化產(chǎn)生一信號。信號可由連接所述核糖開關(guān)的RNA表達(dá)的報告蛋白產(chǎn)生。具體地，公開了一種檢測樣品中環(huán)二GMP的方法，包括將一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)與所述樣品相接觸；以及檢測環(huán)二GMP和所述環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)之間的相互作用，其中環(huán)二GMP和所述環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)所述相互作用可表明環(huán)二GMP的存在。所述環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)可以是被標(biāo)記的。還公開了一種方法，包括(a)測試抑制編碼含有核糖開關(guān)的RNA的基因的基因表達(dá)的化合物，其中所述抑制通過所述核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)包括一種核糖開關(guān)或一種核糖開關(guān)的衍生物；(b)通過使一細(xì)胞和步驟(a)中抑制基因表達(dá)的一種化合物相接觸來抑制基因表達(dá)，其中所述細(xì)胞含有編碼含有核糖開關(guān)的RNA的基因，其中所述化合物通過結(jié)合到所述核糖開關(guān)抑制所述基因的表達(dá)。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種PreQ1應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。還公開了一種方法，包括(a)測試脫抑制編碼含有核糖開關(guān)的RNA的基因的基因表達(dá)的化合物，其中所述脫抑制通過所述核糖開關(guān)實現(xiàn)，其中所述核糖開關(guān)包括一種核糖開關(guān)或一種核糖開關(guān)的衍生物；(b)通過使一細(xì)胞和步驟(a)中脫抑制基因表達(dá)的一種化合物相接觸來脫抑制基因表達(dá)，其中所述細(xì)胞含有編碼含有核糖開關(guān)的RNA的基因，其中所述化合物通過結(jié)合到所述核糖開關(guān)脫抑制所述基因的表達(dá)。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種PreQ1應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種M0c0應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。還公開了一種改變基因表達(dá)的方法，所述方法包括使一種化合物和一個細(xì)胞相接觸，其中所述化合物為環(huán)二GMP、pGpG、GpG或GpGpG。所述化合物還可以為可激活一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)的環(huán)二GMP、pGpG、GpG或GpGpG的衍生物。還公開了一種改變基因表達(dá)的方法，所述方法包括使一種化合物和一個細(xì)胞相接觸，其中所述化合物為S-腺苷高半胱氨酸。所述化合物還可以為可激活一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)的S-腺苷高半胱氨酸衍生物。還公開了一種改變基因表達(dá)的方法，所述方法包括使一種化合物和一個細(xì)胞相接觸，其中所述化合物為PreQ115所述化合物還可以是能夠激活一種PreQ1應(yīng)答性核糖開關(guān)的PreQ1S生物。還公開了一種改變基因表達(dá)的方法，所述方法包括使一種化合物和一個細(xì)胞相接觸，其中所述化合物為Moco。所述化合物還可以是能夠激活一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)的Moco衍生物。還公開了一種改變基因表達(dá)的方法，所述方法包括使一種化合物和一個細(xì)胞相接觸，其中所述化合物為SAM。所述化合物還可以是能夠激活一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)的SAM衍生物。用于激活一種SAM-IV核糖開關(guān)的化合物還可以為MeAzaAdoMet。為了激活一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)，所述化合物可以為S-腺苷高半胱氨酸。所述化合物還可以是能激活S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)的S-腺苷高半胱氨酸的衍生物。例如，所述化合物可以為S-腺苷-L-半胱氨酸(SAC)。圖12B顯示了對于可激活一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)的化合物重要的結(jié)構(gòu)元件。為了激活PreQ1S答性核糖開關(guān)(及衍生自PreQ1應(yīng)答性核糖開關(guān)的核糖開關(guān))，所述化合物可以是這樣的PreQ1衍生物，即其中第1位的N可以被C、O或S取代，其中第2位的氨基可被氫鍵供體取代，其中第6位的氧可被氫鍵受體取代，其中第7位的氨基可被氫鍵受體取代，并且所述氮可被氫鍵供體取代或者衍生化。所述細(xì)胞可以被鑒定為需要改變的基因表達(dá)。所述細(xì)胞可以是一種細(xì)菌細(xì)胞。所述化合物可殺滅所述細(xì)菌細(xì)胞或抑制所述細(xì)菌細(xì)胞的生長?？梢酝ㄟ^將所述化合物給予一個受試者，使所述化合物和所述細(xì)胞相接觸。所述細(xì)胞是所述受試者中的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述化合物殺滅所述細(xì)菌細(xì)胞或抑制所述細(xì)菌細(xì)胞的生長。所述受試者可具有細(xì)菌感染。所述細(xì)胞可包含一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種PreQ1應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種M0c0應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。所述化合物可與另一種抗微生物化合物聯(lián)合給藥。所述化合物可抑制細(xì)菌在生物膜中的生長。還公開了一種改變細(xì)胞生理狀態(tài)的方法，所述方法包括使一種化合物和一個細(xì)胞相接觸，其中所述化合物為環(huán)二GMP、pGpG、GpG或GpGpG。所述化合物還可以為可激活一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)的環(huán)二GMP、pGpG、GpG或GpGpG的衍生物。公開了一種鑒定核糖開關(guān)的方法，所述方法包括在存在和不存在觸發(fā)分子的條件下評估RNA分子的直讀探測的自發(fā)切割，其中所述RNA分子由被所述觸發(fā)分子調(diào)節(jié)的基因所編碼，其中RNA分子的直讀探測的自發(fā)切割模式的改變表明了存在一種對所述觸發(fā)分子有應(yīng)答的核糖開關(guān)。所述觸發(fā)分子可以是環(huán)二GMP、S-腺苷高半胱氨酸、preQpMoco或SAM。還公開了一種方法，包括(a)測試抑制編碼含有核糖開關(guān)的RNA的基因的基因表達(dá)的化合物，其中所述抑制通過所述核糖開關(guān)實現(xiàn)，其中所述核糖開關(guān)包括一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)或一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)的衍生物；(b)通過使一細(xì)胞和步驟(a)中抑制基因表達(dá)的一種化合物相接觸來抑制基因表達(dá)，其中所述細(xì)胞含有編碼含有核糖開關(guān)的RNA的基因，其中所述化合物通過結(jié)合到所述核糖開關(guān)抑制所述基因的表達(dá)。還公開了一種方法，包括通過以下方式抑制一個編碼包含核糖開關(guān)的RNA的基因的基因表達(dá)使一個細(xì)胞與這樣的一種化合物相接觸，即通過測驗該化合物對所述基因的基因表達(dá)的抑制情況，該化合物被鑒定為一種抑制所述基因的基因表達(dá)的化合物，其中所述抑制經(jīng)由所述核糖開關(guān)實現(xiàn)，其中所述核糖開關(guān)包括一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)或一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)的衍生物。A.鑒定抗微生物化合物核糖開關(guān)是一類新的已為用于結(jié)合小的有機(jī)分子而進(jìn)化的結(jié)構(gòu)明確的RNA。核糖開關(guān)的天然結(jié)合袋可用代謝物類似物打靶或用模擬天然代謝產(chǎn)物的樣態(tài)空間的化合物打靶。核糖開關(guān)的小分子配體提供了有用的衍生位點從而產(chǎn)生候選藥物。一些核糖開關(guān)的分布如美國專利申請公開文本No.2005-0053951的表1所示。一旦一類核糖開關(guān)被鑒定且其作為藥物靶標(biāo)的潛力被評估，如環(huán)二GMP核糖開關(guān)，則候選分子可被鑒定。藥物抗性菌株的出現(xiàn)加強(qiáng)了對鑒定新類別抗生素的需求。抗核糖開關(guān)藥物代表了因下列原因而被相當(dāng)關(guān)注的一種抗菌作用形式。核糖開關(guān)控制對于基本代謝過程非常重要的基因的表達(dá)。因此用藥物操縱這些基因控制元件會生產(chǎn)新的抗生素。這些抗微生物試劑可被認(rèn)為是抑菌劑或者殺菌劑。核糖開關(guān)也攜帶已經(jīng)進(jìn)化成選擇性結(jié)合代謝產(chǎn)物的RNA結(jié)構(gòu)，因此這些RNA受體正如蛋白酶和受體一樣是好的藥物標(biāo)靶。如果存在某一化合物時的核糖開關(guān)分析與不存在該化合物時同樣的核糖開關(guān)試驗相比(即與對照分析相比)，信號增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%，則該化合物可鑒定為可激活核糖開關(guān)或確定具有核糖開關(guān)激活活性。該核糖開關(guān)試驗可使用任何合適的核糖開關(guān)構(gòu)建體進(jìn)行。對于核糖開關(guān)激活試驗特別有用的核糖開關(guān)構(gòu)建體在本文其他地方描述。鑒定一化合物能激活核糖開關(guān)或具有核糖開關(guān)激活活性可依據(jù)一個或多個特殊核糖開關(guān)、核糖開關(guān)構(gòu)建體或者核糖開關(guān)類別進(jìn)行。為方便起見，鑒定為能激活一類核糖開關(guān)或?qū)τ谝活惡颂情_關(guān)具有核糖開關(guān)激活活性的化合物可依此針對具體的核糖開關(guān)如存在于具體物種中的核糖開關(guān)類別而被鑒定。例如，被鑒定為激活環(huán)二GMP核糖開關(guān)或?qū)Νh(huán)二GMP核糖開關(guān)的核糖開關(guān)具有激活活性的化合物可照這樣針對具體環(huán)二GMP核糖開關(guān)例如出現(xiàn)在例如霍亂弧菌或木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterxylinus)中的激活環(huán)二GMP核糖開關(guān)而被鑒定。B.使用抗微生物化合物的方法本文公開了體內(nèi)和體外抗菌方法?！翱咕币馕吨种苹蜃柚辜?xì)菌生長，殺滅細(xì)菌或者減少細(xì)菌數(shù)。因此，公開了抑制或阻止細(xì)菌生長的方法，包括用有效量的本文公開的一個或多個化合物接觸細(xì)菌。被公開的化合物的其他結(jié)構(gòu)在本文被提供。公開了一種抑制細(xì)菌細(xì)胞生長的方法，該方法包括使一個細(xì)胞和可結(jié)合核糖開關(guān)的化合物相接觸，其中所述細(xì)胞包含編碼包含對所述化合物應(yīng)答的核糖開關(guān)的RNA基因，其中所述化合物通過結(jié)合于所述核糖開關(guān)而抑制細(xì)菌細(xì)胞生長，從而改變所述基因的表達(dá)。所述核糖開關(guān)可以是一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種PreQ1應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種M0c0應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)。該方法可使細(xì)菌細(xì)胞生長與未接觸所述化合物的細(xì)胞相比至少降低10%。所述化合物和所述細(xì)胞可通過將所述化合物給予受試者而相接觸。所述細(xì)胞可以為所述受試者中的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述化合物殺滅或抑制所述細(xì)菌細(xì)胞生長。所述受試者可具有細(xì)菌感染。所述化合物可與另一種抗微生物化合物聯(lián)合給藥。所述細(xì)菌可以是任何細(xì)菌，例如來自如下的屬的細(xì)菌芽孢桿菌屬(Bacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)，彎曲桿菌屬(Campylobacter)、梭菌屬(Clostridium)、脫亞硫酸菌屬(Desulfitobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、歐文氏菌屬(Erwinia)、±矣希氏桿菌屬(Escherichia)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、梭菌屬(Fusobacterium)、地芽抱桿菌屬(Geobacillus)、地桿菌屬(Geobacter)、葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)lifM(Heliobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、Idiomarina、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、李其Jf特菌屬(Listeria)、禾裹爾氏菌屬(Moorella)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、Oceanobacillus、酒球菌屬(Oenococcus)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、片球菌屬(Pediococcus)、假單胞菌屬、希瓦氏菌屬(Shewanella)、志賀氏菌屬(Shigella)、Solibacter,葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬、熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)、熱袍菌屬(Thermotoga)和弧菌屬(Vibrio)。所述細(xì)菌可以是例如胸膜肺炎放線桿胃(Actinobacilluspleuropneumoniae)>炭SiIf胃(Bacillusanthracis)>ifa#芽胞桿菌(Bacilluscereus)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、耐鹽芽孢桿菌(Bacillushalodurans)、地衣芽包桿菌(Bacilluslicheniformis)、古草芽包桿菌(Bacillussubtilis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、艱難梭菌(Clostridiumdificile)、產(chǎn)氣英膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)、熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)>Desulfitobacteriumhafniense、!^腸球菌(Enterococcusfaecalis)、軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)、大腸桿菌、微小桿菌屬種、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)、嗜熱地芽胞桿菌(Geobacilluskaustophilus)、硫還原地桿菌、木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterxylinus)、杜克雷嗜血桿菌(Haemophilusducreyi)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、睡目民嗜血桿菌(Haemophilussomnus)、Idiomarinaloihiensis、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、干酷乳桿菌、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)、力口氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)、救ΕξIflif(Lactobacillusjohnsonii)、·？LIflif(Lactobacillusplantarum)、乳酸乳球菌、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、無害李斯特菌(Listeriainnocua)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、熱醋穆爾氏菌(Moorellathermoacetica)、Oceanobacillusiheyensis>酒酒球菌(Oenococcusoeni)、多殺性巴斯德氏菌屬(Pasteurellamultocida)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、綠月農(nóng)假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、Solibacterusitatus、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、騰沖嗜熱厭氧胃(Thermoanaerobactertengcongensis)>lif(Thermotogamaritima)>MSL^iH菌、費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)或創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)。細(xì)菌存在的任何環(huán)境中的細(xì)菌生長也可被抑制。例如，在液體、生物膜中和表面上的細(xì)菌生長可被抑制。本文公開的化合物可與任何其他化合物或組合物聯(lián)合給藥或使用。例如，本文公開的化合物可與另一種抗微生物化合物聯(lián)合給藥或使用?！耙种萍?xì)菌生長”被定義為減少單個細(xì)菌分裂成子細(xì)胞的能力，或減少細(xì)菌群形成子細(xì)胞的能力。細(xì)菌繁殖的能力可減少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或100%或更高。還提供了一種抑制細(xì)菌或細(xì)菌群生長及/或殺滅細(xì)菌或細(xì)菌群的方法，包括將所述細(xì)菌與本文所公開和描述的一種或多種化合物接觸。“殺滅細(xì)菌”被定義為使單個細(xì)菌死亡或減少多個細(xì)菌如集落中的細(xì)菌的數(shù)量。當(dāng)以復(fù)數(shù)形式提及細(xì)菌時，“殺滅細(xì)菌”被定義為既定菌群的細(xì)胞死亡率為10%菌群、20%菌群、30%菌群、40%菌群、50%菌群、60%菌群、70%菌群、80%菌群、90%菌群或低于等于100%菌群。本文公開的化合物和組合物具有體內(nèi)或體外抗菌活性，且可與其他化合物和組合物結(jié)合使用，所述其他化合物和組合物也可以是殺菌劑。術(shù)語“治療有效量”的本文所提供的化合物是指無毒的、但足以將一個或多個癥狀根據(jù)需要減輕的量。如將在下文指出，所需化合物的確切量因受試者而異，這取決于受試者的物種、年齡和一般情況、所治療疾病的嚴(yán)重程度，使用的具體化合物，其給藥方式等等。因此，不可能指定一個確切的“有效量”。但是，適當(dāng)?shù)挠行Я靠捎杀绢I(lǐng)域的普通技術(shù)人員只使用常規(guī)實驗確定。本文公開的化合物和組合物可以可藥用載體形式體內(nèi)給藥?！翱伤幱玫摹笔侵肝镔|(zhì)不是生物學(xué)方面或者其他方面不合乎需要的，即該物質(zhì)可在不引起任何不良生物反應(yīng)的情況下或在不會以有害方式與藥物組合物所含有的任何其他組分相互作用的情況下被給予受試者。載體自然會被選擇以使活性成分的任何降解最小并使在受試者中的有害副作用最小，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的那樣。本文公開的組合物或者化合物可以口服給藥、胃腸外給藥(如靜脈內(nèi)給藥)、肌內(nèi)注射給藥、腹膜內(nèi)注射給藥、經(jīng)皮給藥、體外給藥(extracorporeally)、局部給藥等等，包括局部鼻內(nèi)給藥或者通過吸入器給藥。本文所用“局部鼻內(nèi)給藥”表示通過一個或者兩個鼻孔將組合物送遞到鼻和鼻道(nasalpassage)，并可包括通過噴霧裝置或者滴化裝置送遞，或通過霧化核酸或載體送遞。組合物通過吸入器給藥可通過鼻或嘴經(jīng)由噴霧或滴化裝置送遞。也可通過插管直接送遞到呼吸系統(tǒng)的任何區(qū)域(如肺部)。所需要的組合物的確切量因受試者而異，這取決于受試者的物種、年齡、體重和一般情況、所治療變態(tài)反應(yīng)異常的嚴(yán)重程度，使用的具體核酸或者載體，其給藥方式等等。因此，不可能為每一種組合物指定一個確切量。但是，適當(dāng)?shù)牧靠捎杀绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員在參考本文的教導(dǎo)下只使用常規(guī)實驗確定。如果使用胃腸外給予組合物或者化合物，一般通過注射給藥。注射劑被制備為常規(guī)形式，或者為液體溶液或者懸浮液、注射之前適合溶于或懸浮于液體中的固體形式，或者為乳劑。最近改進(jìn)的胃腸外給藥方法包括使用一個緩慢釋放或持續(xù)釋放系統(tǒng)，從而使得恒定劑量得以維持。見如美國專利No.3，610，795，其以引用的方式被納入本文中。本文公開的化合物和組合物可與可藥用的載體聯(lián)合用于治療中。合適的載體及其制齊II描述于RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy(19thed.)ed.A.R.Gennaro,MackPublishingCompany,Easton,PA1995。通常情況下，合適量的可藥用的鹽用于制劑中從而使該制劑等張。可藥用的載體的實例包括但不限于鹽溶液、Ringer氏液和右旋葡萄糖溶液。溶液的PH值優(yōu)選為約5到約8，且更優(yōu)選為約7至約7.5。其他載體包括緩釋制劑如含有抗體的固體疏水性聚合物的半透基質(zhì)，該基質(zhì)是特型制品形式，例如薄膜、脂質(zhì)體或微粒。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，某些載體更優(yōu)選，這取決于例如給藥組合物的給藥途徑和濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道藥學(xué)載體。這些藥學(xué)載體最常用的是用于將藥物給予人的標(biāo)準(zhǔn)載體，包括溶液如無菌水、鹽水以及在生理PH的緩沖液。組合物可通過肌內(nèi)或皮下方式給藥。其他化合物根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的標(biāo)準(zhǔn)程序給藥。除了所選分子外，藥物組合物還可包含載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑等等。藥物組合物可還包括一種或多種如抗微生物劑、抗炎劑、麻醉藥等等的活性成分。藥物組合物可以多種方式給藥，這取決于是需要局部治療還是全身治療，以及治療區(qū)域。給藥可通過局部(包括眼、陰道、直腸、鼻內(nèi))、口服、吸入或胃腸外例如通過靜脈滴注、皮下注射、腹膜內(nèi)注射或肌內(nèi)注射進(jìn)行。本公開的抗體可靜脈內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、皮下給藥、腔內(nèi)給藥或經(jīng)皮給藥。胃腸外給藥制劑包括無菌水或非水溶液、懸浮液和乳劑。非水溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，以及可注射有機(jī)酯類如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外載體包括氯化鈉溶液、Ringer氏右旋葡萄糖、右旋葡萄糖和氯化鈉、乳酸Ringer氏液或不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)載體包括液體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如那些基于Ringer氏右旋葡萄糖的電解質(zhì)補(bǔ)充液)等。防腐劑和其他添加劑也存在，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑以及惰性氣體等。局部給藥制劑包括膏劑、洗劑、霜劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)藥學(xué)載體(以水、粉末或油為基礎(chǔ))、增稠劑等是必要的或可取的。口服給藥的組合物包括粉末或顆粒、水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、囊劑或片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑是可取的。有些組合物可能作為可藥用的酸或堿加成的鹽形式給藥，所述酸加成鹽是與無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，和有機(jī)酸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸和富馬酸反應(yīng)所形成，所述堿加成鹽是與無機(jī)堿如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀，和有機(jī)堿如單烷基胺、雙烷基胺、三烷基胺和芳胺和取代乙醇胺反應(yīng)所形成。本文所公開的治療性組合物也可通過使用單克隆抗體作為與化合物分子偶聯(lián)的各載體給藥。本公開的治療性組合物還可與作為可打靶的藥物載體的水溶性聚合物偶聯(lián)。這種聚合物可包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥丙基甲基丙烯酸-氨基苯酚、聚羥乙基天冬氨酸苯酚或由棕櫚酰殘基取代的聚乙基-環(huán)氧乙烷聚賴氨酸。此外，本公開的治療性組合物還可與一類用于實現(xiàn)控制藥物釋放的可生物降解聚合物例如聚乳酸、聚ε己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫_吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交聯(lián)或兩親的水凝膠嵌段共聚物偶聯(lián)。優(yōu)選由于化合物的給藥至少約3%，更優(yōu)選約10%、更優(yōu)選約20%、更優(yōu)選約30%、更優(yōu)選約50%、更優(yōu)選約75%甚至更優(yōu)選約100%的細(xì)菌感染被降低。感染降低是由諸如白細(xì)胞計數(shù)減少、燒熱下降、炎癥減輕、細(xì)菌數(shù)減小或其他細(xì)菌感染指標(biāo)下降的參數(shù)決定。為了增加細(xì)菌感染降低的百分比，可將劑量增加到對受試者保持無毒的最有效水平。如在整個說明書中所用的，“受試者”是指某一個體。優(yōu)選地，該受試者是哺乳動物如除人外的哺乳動物或靈長類，且更優(yōu)選為人。“受試者”可包括家養(yǎng)動物(如貓、狗等)、牲畜(如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)、實驗動物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和魚類?！凹?xì)菌感染”被定義為受試者或者樣品內(nèi)存在細(xì)菌。這種細(xì)菌感染可以是天然存在的細(xì)菌在受試者或者樣品內(nèi)或上的生長所致，或由于外來生物入侵所致。本文公開的化合物可以與抗生素同樣的方式使用?？股氐氖褂迷诒绢I(lǐng)域已被接受?？股厥褂玫囊粋€例子包括對動物的治療。在必要時，所公開的化合物可通過注射或經(jīng)飼料或水給予動物，通常在獸醫(yī)或者營養(yǎng)師的專業(yè)指導(dǎo)下進(jìn)行。視情況如疾病嚴(yán)重程度和動物物種，將化合物給予單個動物或動物群體。如果所有的動物都處于類似的免疫狀態(tài)且所有動物都暴露于引起相同疾病的微生物中，那么對整個群體的治療和護(hù)理可能是必要的。另一個使用化合物的實例包括減少水生動物的微生物感染，包括如下步驟選擇微生物感染的水生動物，提供含有如本公開的化合物、螯合劑如EDTA、TRIENE的抗微生物溶液，將PH緩沖劑加入該溶液中并調(diào)整其ρΗ值至約7.0-約9.0之間，將該水生動物浸泡在該溶液中并保持動物在溶液中達(dá)有效減少該動物的微生物負(fù)載的一段時間，將該水生動物從該溶液中取出并放回不含該溶液的水中。水生動物可重復(fù)浸泡在含EDTA、本公開的化合物、TRIENE和ρΗ緩沖劑的溶液中，直到該動物負(fù)載的微生物被清除(美國專利6，518，252)。本文公開的化合物的其他用途包括但不限于牙科治療和水凈化(這可包括如城市供水、污水處理系統(tǒng)、飲用水和非飲用水的供應(yīng)以及孵化場)。C.產(chǎn)生觸發(fā)分子的方法本文公開了一種產(chǎn)生觸發(fā)分子的方法，所述方法包括培養(yǎng)能夠產(chǎn)生所述觸發(fā)分子的突變細(xì)菌細(xì)胞，其中所述突變細(xì)菌細(xì)胞在一種對所述觸發(fā)分子應(yīng)答的核糖開關(guān)中包含一突變，相對于不具有所述突變的細(xì)胞，所述突變可增加由突變細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的觸發(fā)分子；以及從所述細(xì)胞培養(yǎng)物分離觸發(fā)分子，從而產(chǎn)生所述觸發(fā)分子。所述觸發(fā)分子可為環(huán)二GMP、S-腺苷高半胱氨酸、PreQ1,Moco或SAM。所述突變細(xì)菌細(xì)胞可以為一種敲除突變體，其中所述細(xì)胞不能產(chǎn)生對所述觸發(fā)分子應(yīng)答的核糖開關(guān)?？蓪⑺黾?xì)胞編碼所述核糖開關(guān)的區(qū)域被完全去除。所述觸發(fā)分子的產(chǎn)生量可提高10、20、30、40、50、60、70、80、90%或更高。這一點可通過將觸發(fā)分子的總量與具有完整核糖開關(guān)的細(xì)胞產(chǎn)生的總量進(jìn)行比較來測量。還公開一種在對一種觸發(fā)分子應(yīng)答的核糖開關(guān)中包含一突變的細(xì)菌細(xì)胞，所述突變將所述細(xì)胞產(chǎn)生的所述觸發(fā)分子與不具有所述突變的細(xì)胞相比提高至可測量的程度?！翱蓽y量的提高”是指所述觸發(fā)分子的產(chǎn)量提高10、20、30、40、50、60、70、80、90%或更多。實施例A.實施例1使用CMfinder比較基因組流程(pipeline)在細(xì)菌中鑒定22個候選的結(jié)構(gòu)化RNA將一種基于比較基因組學(xué)的計算流程用于細(xì)菌，鑒定了22個候選的RNA基序。6個被認(rèn)為是核糖開關(guān)，它們是可在結(jié)合一種具體的代謝物時調(diào)節(jié)基因表達(dá)的mRNA元件。在各獨立的研究中，已確認(rèn)它們中的2個為新的核糖開關(guān)。3個另外的核糖開關(guān)候選物為乳桿菌目中推定的轉(zhuǎn)運(yùn)體基因、伯克氏菌目中的檸檬酸循環(huán)基因和數(shù)個門中的鉬輔因子生物合成基因之一的上游區(qū)。剩下的核糖開關(guān)候選物——廣泛分布的GEMM(環(huán)境、膜及運(yùn)動性基因)基序與對霍亂弧菌中天然感受態(tài)及硫還原地桿菌中金屬離子用作電子受體很重要的基因有關(guān)。在其他基序中，一個具有類似于以前發(fā)表的候選核糖開關(guān)ykkC/yxkD的基因分布，但具有不同的結(jié)構(gòu)。已在5個門中鑒定了可能的非編碼RNA，并且另外多種順式調(diào)節(jié)RNA被鑒定，包括ε-變形細(xì)菌中的1種(purD上游，參與嘌呤生物合成)，藍(lán)細(xì)菌中的1種(在ATP合酶操縱子內(nèi))。這些候選RNA增加了不斷增加的參與多細(xì)胞過程的RNA基序的名錄，并表明許多另外的RNA有待于被發(fā)現(xiàn)。最近新的結(jié)構(gòu)化RNA的發(fā)現(xiàn)(He2006；Storz2005；Kima2006；Claverie2005)表明這樣的RNA在細(xì)胞中是常見的。為了有助于發(fā)現(xiàn)另外的結(jié)構(gòu)化RNA，已經(jīng)開發(fā)了一種能夠鑒定細(xì)菌中的保守RNA的自動化流程(Yao2007)。該流程集合了同源基因mRNA的可能的5‘UTR(非翻譯區(qū))，并使用CMfinder(Yao2006)程序來預(yù)測每組UTR內(nèi)的保守RNA結(jié)構(gòu)，或“基序”。然后應(yīng)用自動同源性搜索來發(fā)現(xiàn)這些基序的另外的實例，CMfinder利用該結(jié)果來提高每種基序的二級結(jié)構(gòu)模型和序列比對。輸出是一組具有預(yù)測的RNA二級結(jié)構(gòu)的比對結(jié)果，隨后對這些比對結(jié)果進(jìn)行人工分析，以改良模型并評估哪些基序值得進(jìn)一步研究。雖然已經(jīng)對RNA進(jìn)行了其他自動搜索(Barrick2004；Corbino2005；Axmann2005；Seliverstov2005；McCutcheon2003；Coventry2004；Washietl2005；Pedersen2006；Torarinsson2006)，但該流程(Yao2007)與這些搜索有3個區(qū)別特征。第一，該流程使用了CMfinder，CMfinder甚至在如下情況仍能發(fā)現(xiàn)基序一些輸入序列不包含所述基序或包含攜帶無關(guān)序列結(jié)構(gòu)域的基序代表物時。CMfinder還甚至可以以低的序列保守性產(chǎn)生有用比對結(jié)果，但該比對結(jié)果將采用任何存在的序列相似性。第二，該流程整合了同源性搜索，以對每個基序自動提煉比對結(jié)果和結(jié)構(gòu)模型。第三，由于該流程比對了同源基因的UTR,它很適合于發(fā)現(xiàn)順式調(diào)節(jié)RNA，并且它對序列保守的依賴被進(jìn)一步降低。實際上，使用厚壁菌門細(xì)菌作為一試驗例，以前已證明該流程可用于預(yù)測幾乎所有已知的順式調(diào)節(jié)RNA(Yao2007)。該流程還發(fā)現(xiàn)了這樣的基序，即當(dāng)這些基序出現(xiàn)在同源基因上游時可能為反式編碼RNA或“非編碼RNA”(ncRNA)。該流程可用于在基因組已被測序的所有細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)化RNA。描述了22種可能為保守的結(jié)構(gòu)化RNA的基序。該研究主要關(guān)注核糖開關(guān)(Winkler2005；Batey2006)，核糖開關(guān)是一種通常出現(xiàn)在直接感知具體小分子及調(diào)節(jié)基因表達(dá)的mRNA中的結(jié)構(gòu)化RNA類型。后來的實驗已確認(rèn)，這些基序中的2種為新的核糖開關(guān)。第一種結(jié)合SAH(S-腺苷高半胱氨酸)(圖1)，第二種為天藍(lán)色鏈霉菌(Sti^ptomycescoelicolor)及相關(guān)物種中的SAM(S-腺苷甲硫氨酸)結(jié)合核糖開關(guān)。另一個核糖開關(guān)候選物的實驗證據(jù)表明它可感知鉬輔因子或“Moco”。一個特別受關(guān)注的候選物為GEMM(環(huán)境、膜及運(yùn)動性基因)基序，該基序為典型核糖開關(guān)。例如，GEMM是一種廣泛分布且高度保守的基因元件，其在309例中的297例中的定位使得它很可能存在于鄰近開放閱讀框(ORF)的5'UTR中。這些被推定受GEMM調(diào)節(jié)的基因一般與感知或應(yīng)答于細(xì)胞外條件相關(guān)聯(lián)，這說明GEMM可感知一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞_細(xì)胞通訊產(chǎn)生的代謝物。1.材料和方法i.對候選RNA基序的鑒定將分類在保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(Marchler-Bauer2005)版本2.08中的基因的可能5'UTR作為計算流程(Yao2007)的輸入。從RefSeq(Pruitt2005)版本14獲取完整的基因組序列和基因位置，但刪除含有的基因與其他基因組高度類似的基因組。UTR提取算法(Neph2006)解釋這樣的事實，即UTR由于操縱子結(jié)構(gòu)可能不總是緊接在基因的上游。對于每個保守結(jié)構(gòu)域，將收集的可能的UTR序列作為輸入給予CMfinder版本0.2，CMfinder產(chǎn)生所述UTR組內(nèi)結(jié)構(gòu)保守基序的局部多序列比對。然后，除了將基因間區(qū)域在兩端延長50個核苷酸以解釋注釋缺失的ORF之外，將這些比對用于搜索注釋的基因間區(qū)域內(nèi)的其他同源物。其同源性搜索以具有ML啟發(fā)式過濾件(Weinberg2006),Infernal(Eddy2005)版本0.7執(zhí)行的全局模式協(xié)方差模型(Eddy1994)和截止值為10的E-值(Klein2003)的RAVENNA程序版本0.2f(Weinberg2004；Weinberg2004ii；Weinberg2006)進(jìn)行。CMfinder然后使用這些新同源物改進(jìn)其初始比對?；赗fam數(shù)據(jù)庫(Griffiths-Jones2005)版本7.0檢測已知RNA?；诙绦蛄械南到y(tǒng)發(fā)生保守性、物種的多樣性和結(jié)構(gòu)的判據(jù)對預(yù)測打分。該流程算法更具體地描述于別處(Yao2007)。將細(xì)菌基因組序列數(shù)據(jù)分成組，進(jìn)行UTR提取，分別對每組進(jìn)行基序預(yù)測和同源性搜索。這受到這樣的事實的啟發(fā)，即不同門中UTR經(jīng)常不包含相同的基序。然而，將測序的成員較少的門根據(jù)分類學(xué)進(jìn)行合并，以嘗試匯集足夠的序列數(shù)據(jù)來預(yù)測基序。忽略僅具有一個或兩個測序的成員的門(例如綠彎菌門(Chloroflexi))。使用了如下8個組(1)厚壁菌、(2)放線菌(Actinobacteria)、(3)α-變形細(xì)菌、(4)β-變形細(xì)菌、(5)γ-變形細(xì)菌、(6)δ-和ε-變形細(xì)菌、(7)藍(lán)細(xì)菌及(8)擬桿菌(Bacteroidetes)、綠菌(Chlorobi)、衣原體(Chlamydiae)、撫微菌(Verrucomicrobia)禾口螺旋體(Spirochaetes)。ii.對候選基序的分析以及同源性搜索策略然后選擇有希望的基序，之后通過進(jìn)行另外的同源性搜索進(jìn)一步分析它們，并以RALEE(Griffiths-Jones2005)編輯它們的比對結(jié)果。使用NCBIBLAST(Altschul1997)、Mfold(Zuker2003)、Rnall(Wan2004)(以鑒定依賴P的轉(zhuǎn)錄終止子)、CMfinder和RAVENNA輔助這些分析。與基序相關(guān)的代謝通路的信息提取自KEGG(Kanehisa2006)。為了擴(kuò)展通過鑒定另外的結(jié)構(gòu)化元件的比對，將比對在它們的5'和3'端延長50-100個核苷酸，如有需要，使用CMfinder或通過人工審查再次比對。對同源物的另外的搜索以多種方式使用了RAVENNA。全局模式和局部模式(Eddy2005)協(xié)方差模型搜索給出了互補(bǔ)的結(jié)果。在人工指導(dǎo)的搜索中使用的序列數(shù)據(jù)庫為RefSeq版本19(Pruitt2005)的“微生物”子集以及來自酸礦井排水(Tyson2004)(GenBank登錄號AADLO1000000)和馬尾藻海(Venter，2004)(AACY01000000)的環(huán)境鳥槍序列。在合適時，搜索4種類型的這些序列的子集。第一，不總是使用環(huán)境序列數(shù)據(jù)。第二，僅搜索所述基序最初源自的細(xì)菌組的基因組(如變形細(xì)菌)。第三，僅搜索基因間序列(如前文延伸50個核苷酸)。第四，將BLAST程序tblastn用于搜索與所述基序相關(guān)基因同源的基因。然后在匹配序列上游2Kb(預(yù)測包含5'UTR)和下游200個核苷酸進(jìn)行RAVENNA搜索(這是因為明顯的編碼同源性可能在真正ORF的上游延伸，導(dǎo)致BLAST錯誤鑒定起始密碼子)。使用基序的細(xì)菌組作為BLAST數(shù)據(jù)庫以利于發(fā)現(xiàn)高度變化的同源物。例如，ε"變形細(xì)菌PurD基因的上游搜索顯示為具有一截短莖的purD基序(見下文)的同源物。另外，以這樣的小數(shù)據(jù)庫，在RAVENNA之前進(jìn)行ML啟發(fā)式過濾。如果將全序列組用作BLAST數(shù)據(jù)庫，則有助于發(fā)現(xiàn)其他門中的同源物。iii.基序的排除如果基序不顯示結(jié)構(gòu)化RNA的特征，將它們從進(jìn)一步的研究中排除。為了幫助排除具有假的結(jié)構(gòu)預(yù)測的基序，通過去除所述預(yù)測的結(jié)構(gòu)中所有堿基對，僅使用序列信息進(jìn)行同源性搜索。結(jié)構(gòu)不保守的基于序列的匹配結(jié)果表明預(yù)測的結(jié)構(gòu)是不正確的。然而，這樣的同源物可被協(xié)方差模型丟失，協(xié)方差模型呈現(xiàn)的結(jié)構(gòu)是保守的。當(dāng)序列同源物顯示所提出的結(jié)構(gòu)實際上很不保守時，使用該策略排除多種基序。iv.確定共有圖(consensusdiagram)的保守和變異的程度為了確立共有圖(例如在圖1中)中反映的保守程度，序列被加權(quán)以不再看重高度相似的同源物。使用通過Infernal(Eddy2005)執(zhí)行的GSC算法(Gerstein1994)進(jìn)行加權(quán)，然后在所述多序列比對中的每個位置計算加權(quán)的核苷酸頻率。為按照相關(guān)變異將堿基對分類，計算Watson-Crick對或G-U對的加權(quán)頻率。但將如下這樣的比對序列丟棄，即在這些序列中兩個核苷酸都缺失，或者兩核苷酸之一的類別不定(例如為“N”，表示4種堿基的任一種)。如果兩條序列具有在攜帶所述基序的序列中的兩個位置都不同的Watson-Crick對或G-U對，那么被歸為一種相關(guān)變異位置。如果僅一個位置不同，那么該現(xiàn)象被歸為一種相容突變。然而，如果非Watson-Crick對或G-U對的頻率不超過5%，那么不將這些位置注釋為相關(guān)變異或相容突變。2.結(jié)果i.新的RNA基序的評價和分析人工檢查通過CMfinder流程預(yù)測的有希望的結(jié)構(gòu)化RNA基序，以改進(jìn)所述共有序列和結(jié)構(gòu)模型(見“材料和方法”)及提供關(guān)于可能的功能的信息。每種候選物的關(guān)鍵結(jié)果總結(jié)于表1中。對于所鑒定的22種基序，7種描繪于圖1中。表1.推定的結(jié)構(gòu)化RNA基序的概述。“RNA”=以RNA發(fā)揮功能(這與dsDNA相對)，“ciS”=順式調(diào)節(jié)，“開關(guān)”=核糖開關(guān)。評價:“r,=確定是，“y”=可能是，“？”=可能，“η”=可能為否，“N”=確定為否。在實驗檢查前進(jìn)行這些評價。剩下的列為“門/綱”(包含基序的門，或者變形細(xì)菌的綱)，“M，V”(“Μ”=具有模塊莖，這種莖僅有時出現(xiàn)，“V”=長度可變的莖)，“Cov.，，=相關(guān)變異配對位置的數(shù)目(見“方法”；注意不建議僅通過該數(shù)目進(jìn)行基序排序，而應(yīng)從整體上評價比對結(jié)果)，“#，，=代表物的數(shù)目，“非順式”=X/Y其中X為不位于基因5'調(diào)節(jié)構(gòu)型中的代表物數(shù)目且Y為具有已注釋基因的序列(某些RefSeq序列缺乏注釋)中的代表物數(shù)目。Moco和SAM-IV核糖開關(guān)數(shù)據(jù)將在后面的記錄中給出。Gamma-150和coccus-1僅出現(xiàn)在補(bǔ)充材料中。選擇候選RNA基序用于進(jìn)一步研究的決策是基于對序列和結(jié)構(gòu)的保守性、相關(guān)變異以及基因前后序列(例如基序是否一致地位于具體基因家族的上游)的定性評價。保守序列是重要的，這是因為結(jié)構(gòu)化RNA通常在形成復(fù)合物三級結(jié)構(gòu)或在其他限制之下的區(qū)域具有許多保守核苷酸。結(jié)構(gòu)化RNA有時具有長度可變的莖或“模塊莖”(存在于一些但非全部代表物中的莖)。一個莖的兩側(cè)要么同時出現(xiàn)要么都不出現(xiàn)，該事實類似于相關(guān)變異并且是結(jié)構(gòu)保守的證據(jù)。順式調(diào)節(jié)RNA例如核糖開關(guān)是調(diào)節(jié)mRNA基因的mRNA區(qū)域。在細(xì)菌中，大多數(shù)順式調(diào)節(jié)RNA出現(xiàn)于受調(diào)節(jié)mRNA的5'UTR0雖然不可能可靠地預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始點，但是當(dāng)一種基序可能位于mRNA的5‘UTR時(如果該元件位于轉(zhuǎn)錄起始位點5‘端)，該元件的代表物被稱為位于基因的“5'端調(diào)節(jié)構(gòu)型”中。如果一種基序的大多數(shù)或所有代表物都在一個基因的5'端調(diào)節(jié)構(gòu)型中，那么這是該基序具有順式調(diào)節(jié)功能的證據(jù)。順式調(diào)節(jié)RNA經(jīng)常具有2個顯著的結(jié)構(gòu)特征中的一個依賴P的轉(zhuǎn)錄終止子或重疊SD序列(細(xì)菌的核糖體結(jié)合位點)(Winkler2005)的莖。依賴P的轉(zhuǎn)錄終止子由一個強(qiáng)發(fā)夾及之后的4個或更多個U殘基組成(Henkin2002)。調(diào)節(jié)RNA結(jié)構(gòu)域可通過有條件地形成終止子莖控制基因表達(dá)。類似地，有條件形成的莖可與SD序列重疊，從而在翻譯水平調(diào)節(jié)基因(Winkler2005)。該研究中鑒定的一些基序由單個的或串聯(lián)的發(fā)夾組成。有可能它們中的一些是這樣的蛋白結(jié)合基序，即其中一種同源二聚體蛋白可結(jié)合于相對鏈中的基于DNA的既定元件。為了方便起見，縱使這樣的基序可能不形成結(jié)構(gòu)化RNA或者在mRNA水平發(fā)揮功能，它們也被描述為具有一種5'端調(diào)節(jié)構(gòu)型。ii.GEMM基序GEMM廣泛存在于細(xì)菌中并似乎具有高度保守的序列和結(jié)構(gòu)，暗示了一種可對推定的RNA進(jìn)行重要的生物化學(xué)限制的功能。在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)了322種GEMM序列。它在δ-變形細(xì)菌中是共有的，特別在地桿菌及相關(guān)屬中。在γ-變形細(xì)菌中，它在交替單胞菌目和弧菌目中是普遍存在的。它在厚壁菌門和浮霉菌門的某些目中也是共有的。具有GEMM的主要病原體包括霍亂和炭疽的致病原。在序列數(shù)據(jù)包括基因注釋的309個GEMM實例中，297例的GEMM位于一個基因的5'端調(diào)節(jié)構(gòu)型中，暗示一種順式調(diào)節(jié)功能。推測受GEMM調(diào)節(jié)的基因顯示了大范圍的功能，但大多數(shù)基因與細(xì)胞外環(huán)境或者與膜有關(guān)，且許多與運(yùn)動性有關(guān)。GEMM由兩個被命名為Pl和Ρ2的相鄰發(fā)夾(配對區(qū))組成(圖1和3)。Pl的序列和結(jié)構(gòu)是高度保守的，并且由一個3核苷酸的內(nèi)部環(huán)分隔的并被一個末端環(huán)加帽的2堿基對莖和6堿基對莖組成。所述內(nèi)部環(huán)是高度保守的，所述末端環(huán)幾乎總是GNRA四元環(huán)(Hendrix1997)。該P(yáng)l莖在多個位置呈現(xiàn)了相關(guān)變異的重要證據(jù)，并且在大范圍的細(xì)菌中是結(jié)構(gòu)高度保守的。該事實以及Ρ2的更適度的相關(guān)變異和長度可變的莖提供了GEMM作為一種結(jié)構(gòu)化RNA發(fā)揮功能的有力證據(jù)。實施例2證明GEMM基序在核糖開關(guān)中發(fā)揮功能。連接Pl和Ρ2的序列基本上總是AAA，在322個實例中僅有2個例外。所述P2發(fā)夾顯示了比Pl更適度的保守型。如果Pl四元環(huán)為GAAA，那么在P2種通常出現(xiàn)一個GNRA四元環(huán)受體。該受體經(jīng)常為公知的Ilnt基序，該基序可能是GAAA環(huán)偏愛的，但一些序列可以是新的四元環(huán)受體。如果Pl具有一個GYRA四元環(huán)，那么所述受體樣序列幾乎不存在，但是有時會出現(xiàn)一個距所述P2堿基更近的凸起(圖2)。許多GEMM實例包含一個依賴P的轉(zhuǎn)錄終止子發(fā)夾。終止子莖的5'側(cè)經(jīng)常與所述P2莖的3'側(cè)重疊(并被推測與之競爭)(圖2B)。如果GEMM是一種核糖開關(guān)，那么配體的結(jié)合可穩(wěn)定提出的Pl和P2結(jié)構(gòu)，從而阻止所述競爭性轉(zhuǎn)錄終止子形成。在該模型中，較高配體濃度可增加基因表達(dá)。S-變形細(xì)菌中三分之一的GEMM代表物及其他分類單位中的某些是“串聯(lián)”排列的，其中一例出現(xiàn)在3'端并鄰近于相同UTR中的另一個。這樣的調(diào)節(jié)RNA的排列涉及比簡單調(diào)節(jié)RNA構(gòu)型所允許的更復(fù)雜的基因表達(dá)控制(Sudarsan2006；Welz2007；Mandal2006)。對GEMM生物功能的理解可有助于揭示它似乎進(jìn)行調(diào)節(jié)的多種類的微生物過程。實際上，GEMM在物種霍亂弧菌和硫還原地桿菌中涉及已是多項研究目標(biāo)的兩個系統(tǒng)。霍亂弧菌可導(dǎo)致人霍亂，但其生命周期大部分時間在水中，它在水中可粘附于多種甲殼類的含幾丁質(zhì)的外骨骼上。幾丁質(zhì)為GIcNAC(N-乙酰葡糖胺)的聚合物，已被表明可影響多種霍亂弧菌基因的表達(dá)(Meibom2004)。GEMM似乎調(diào)節(jié)這些幾丁質(zhì)誘導(dǎo)型基因中的2個的表達(dá)。第1個是gbpA，它不但對于小鼠的感染(Kirn2005)是重要的，而且對粘附于幾丁質(zhì)珠(Meibom2004)和人上皮細(xì)胞(Kirn2005)是重要的。第二個幾丁質(zhì)誘導(dǎo)型基因是tfoXTC。值得注意地，幾丁質(zhì)可誘導(dǎo)霍亂弧菌的天然感受態(tài)(Meibom2005)，并且tfoXVG表達(dá)對這種感受態(tài)是重要的?；魜y弧菌具有匹配⑶D模型C0G3070和pfam04994的兩個基因，所述兩個模型對應(yīng)于分離的tfoX結(jié)構(gòu)域。兩個結(jié)構(gòu)域都產(chǎn)生優(yōu)于1(Γ25的RPSBLAST(Schaffer2001)E_值。它們中之一是tfoXVG(座位VC1153)。GEMM似乎可調(diào)節(jié)另一個，所述另一個被稱作tf0XeEMM(VC1722)。因此，在霍亂弧菌及相關(guān)細(xì)菌中，GEMM可能參與幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的感受態(tài)，或甚至在不包含提高的幾丁質(zhì)濃度的環(huán)境中調(diào)節(jié)感受態(tài)。硫還原地桿菌及相關(guān)δ-變形細(xì)菌可使用金屬離子例如Fe(III)作為電子受體，通過氧化有機(jī)化合物生成ATP(Meth62003)。GEMM在地桿菌屬種中與菌毛組裝基因相關(guān)。硫還原地桿菌的菌毛已被顯示可導(dǎo)電(Reguera2005)，并因此是還原金屬離子過程的一部分。而且，GEMM在硫還原地桿菌中似乎調(diào)節(jié)7個細(xì)胞色素c基因。雖然該細(xì)菌有111個推定的細(xì)胞色素c基因，但7個GEMM相關(guān)基因中的5個已經(jīng)在以前的研究中被鑒定，并且可能具有特殊的功能。0mcS(外膜細(xì)胞色素S)是在硫還原地桿菌外膜上高豐度的兩種蛋白的一種，并且是還原不溶Fe(III)氧化物所需的，但非可溶的Fe(III)檸檬酸鹽所需的(Mehta2005)。OmcG和OmcH對于產(chǎn)生OmcB是必需的，OmcB在很多情況下是一種必需的細(xì)胞色素c(Kimm2006)。OmcA和OmcT與OmcG、OmcH或OmcS相關(guān)聯(lián)。在硫還原地桿菌中僅剩下4種其他Omc注釋與GEMM無直接關(guān)聯(lián)0mcB、OmcC,OmcE和OmcF。與已知核糖開關(guān)不同，GEMM與大量不同的基因功能相關(guān)聯(lián)(表2)。該結(jié)果表明，GEMM核糖開關(guān)不作為用于代謝途徑控制的典型的反饋傳感器。相反，GEMM可感知一種參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或可能細(xì)胞_細(xì)胞通訊的第二信使分子(Bassler2006)。實施例2證明了GEMM基序的第二信使觸發(fā)分子為環(huán)二GMP。在該方式中，不同細(xì)菌使用GEMM及其信號傳導(dǎo)分子來控制不同過程。許多GEMM相關(guān)基因編碼信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，這個事實表明了許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制。實施例2證明了GEMMRNA的確作為一類新發(fā)現(xiàn)的核糖開關(guān)的適體組件。表2.在多個實例中顯示出被GEMM調(diào)節(jié)的基因家族功能作用基因家族__菌毛和鞭毛cpaA,JlgB’flgC,flgG,fliE,JliG,fliM,motA,motB,papC,papD，pilM,pilO,pilQ,pulF.分泌(與菌毛/fhaC,fliF,fliI,ho/Q鞭毛相關(guān))趨化作用調(diào)節(jié)ckeW，cheY,曱基接收趨化性蛋白，Cache結(jié)構(gòu)域(典劑型地與細(xì)茵中趨化性受體相關(guān))。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)PAS結(jié)構(gòu)域，組氨酸激酶，HAMP(組氨酸激酶、腺苷酰環(huán)化酶、曱基結(jié)合蛋白、磷酸酶)，HD-GYP結(jié)構(gòu)域，GGDEF結(jié)構(gòu)域幾丁質(zhì)幾丁質(zhì)/纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，幾丁質(zhì)酶，糖結(jié)合蛋白膜溶素結(jié)構(gòu)域(參與細(xì)胞壁重塑，但可能具有一般的肽聚糖結(jié)合功能)，未被表征的外膜蛋白和脂蛋白，推定的膠原結(jié)合蛋白肽非核糖體狀合酶，縮合結(jié)構(gòu)域(肽類抗生素的合成)，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶樣半胱氨酸蛋白酶，枯草桿菌酶(subtilase)(細(xì)胞外肽酶的超家族)。其他(感受態(tài)的調(diào)節(jié)劑)、細(xì)胞色素ciii.SAH基序SAH基序的序列和結(jié)構(gòu)是高度保守的(圖1)，顯示了預(yù)測的莖區(qū)(包括模塊莖和長度變化莖)內(nèi)的相關(guān)變異。主要在變形細(xì)菌和一些Y-變形細(xì)菌，特別是在假單胞菌屬中，SAH基序出現(xiàn)在與SAH(S-腺苷高半胱氨酸)代謝相關(guān)的基因5'端調(diào)節(jié)構(gòu)型中。SAH是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)代謝循環(huán)的一部分，該代謝循環(huán)的主要組件包括氨基酸甲硫氨酸及其衍生物高半胱氨酸。SAH是使用SAM作為甲基化反應(yīng)的輔因子的酶的副產(chǎn)物。SAH—般被水解成高半胱氨酸和腺苷。然后，高半胱氨酸被用于合成甲硫氨酸及最終的SAM。高水平的SAH對細(xì)胞是有毒的，這是因為SAH可抑制許多SAM依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶(Ueland1982)。因此，在SAH達(dá)到毒性水平之前，細(xì)胞可能需要感知其升高的濃度并除去該化合物。SAH基序相關(guān)的基因為S-腺苷高半胱氨酸水解酶(ahcY)、鈷胺素依賴的甲硫氨酸合酶(metH)及可合成一個用于甲硫氨酸合成中的甲基供體的亞甲基四氫葉酸還原酶(metF)。SAH基序的這種基因排列及其高水平的保守與在感知SAH及激活基因產(chǎn)物為SAH破壞所需的基因的表達(dá)方面的作用是一致的。實際上，生物化學(xué)和遺傳證據(jù)可支持該基序為SAH感知核糖開關(guān)的假設(shè)。iv.C0G4708基序該基序出現(xiàn)于鏈球菌屬的某些種及乳酸乳球菌的C0G4708基因的上游，但是在鏈球菌屬C0G4708基因家族的某些實例中缺少該推定的RNA基序。C0G4708基因被預(yù)測編碼膜蛋白。雖然C0G4708基序(還可以將它稱為PrcQ1-II基序)在系統(tǒng)發(fā)生方面被高度約束并僅具有6個獨特的序列，但它卻顯示了相關(guān)變異、模塊莖和長度可變的莖(圖1)。該基序具有一個與C0G4708基因Shine-Dalgarno序列重疊的假結(jié)，這表明所述基序編碼這些基因的順式調(diào)節(jié)子。最近表征了一種可感知修飾的核堿基PreQ1的核糖開關(guān)(Roth2007)。由于該核糖開關(guān)與C0G4708相關(guān)聯(lián)，C0G4708被提出為與PreQ1相關(guān)的代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)體。因此，C0G4708基序被認(rèn)為還是一種PreQ1感知核糖開關(guān)。這一點已獲得了實驗的支持。C0G4708基序與以前表征的PreQ1感知核糖開關(guān)無序列和結(jié)構(gòu)的相似性(Roth2007)。v.sucA基序sucA基序僅出現(xiàn)于sucA基因的5'端調(diào)節(jié)構(gòu)型中，它們可能與相關(guān)的下游基因sucB/aceF和Ipd共轉(zhuǎn)錄。這3個基因的產(chǎn)物在檸檬酸循環(huán)中從2-酮戊二酸合成琥珀酰-CoA。所有檢測的sucA基序的實例在β-變形細(xì)菌的伯克氏菌目中。雖然sucA基序中的許多核苷酸是嚴(yán)格保守的，但它們不顯示相關(guān)變異并且包含很少的非標(biāo)準(zhǔn)堿基配對(圖1)。該基序具有與推定Shine-Dalgarno序列重疊的莖，所以sucA基序可對應(yīng)于一種順式調(diào)節(jié)RNA。sucA基序相對復(fù)雜的結(jié)構(gòu)表明它可以是一種核糖開關(guān)。vi.23S_甲基基序該基序總是在可作用于23SrRNA并被注釋為rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因的上游。一個例外是，23S-甲基RNA距離23SrRNA甲基轉(zhuǎn)移酶ORF大約3Kb，在間插序列的相對鏈上有其他基因。23S-甲基基序局限于乳桿菌目，該目屬于厚壁菌門。23S-甲基基序由兩個大的發(fā)夾組成。第二發(fā)夾以一串U結(jié)束，并可為一個依賴P的轉(zhuǎn)錄終止子。兩個莖都具有顯著的相關(guān)變異，這有力證明了它們?yōu)楣δ苄訰NA的一部分。雖然該結(jié)構(gòu)模型表明許多配對的位置有時具有非標(biāo)準(zhǔn)的堿基配對，但是每個基序?qū)嵗饕捎欣谀芰康呐鋵M成。推定的轉(zhuǎn)錄終止子的存在表明它是順式調(diào)節(jié)RNA。由于23SrRNA甲基轉(zhuǎn)移酶可與RNA底物相互作用，它可以類似于核糖體蛋白基因自身調(diào)節(jié)的方式使用該23S-甲基基序自動調(diào)節(jié)其表達(dá)(Zengel1994)。vii.hemB/反hemB基序該基序出現(xiàn)于多種β-變形細(xì)菌尤其伯克霍爾德氏菌中。對于它可能從哪條DNA鏈轉(zhuǎn)錄是不清楚的，這是因為它的結(jié)構(gòu)在兩個方向都呈現(xiàn)相當(dāng)?shù)南嚓P(guān)變異和保守。在一個方向上，它經(jīng)常在hemB基因上游。它在該方向上可能是順式調(diào)節(jié)RNA，但有兩個互相不同源的基因緊接hemB基序代表物的下游，它們位于錯誤的鏈上而無法被以順式調(diào)節(jié)RNA的通常方式控制。在另一個方向(反hemB)上，該基序通常地不在基因的5'UTR中。該反hemB基序以一個轉(zhuǎn)錄終止子發(fā)夾結(jié)束。反hemB實例下游的許多基因位于相對鏈上，因此表明反hemB可能編碼一種非編碼RNA。viii.MAEB(伯克霍爾德氏菌中代謝相關(guān)元件)該基序由具有數(shù)個保守位置的單個發(fā)夾組成(圖1)。它廣泛存在于β_變形細(xì)菌的伯克霍爾德氏菌屬中。它一般通過保守連接子序列連接以多次連續(xù)出現(xiàn)(2-6個拷貝)，但在2例中達(dá)到12個拷貝之多。在141個單MAEB基序或重復(fù)MAEB基序的事件中，132個在基因的5'端調(diào)節(jié)構(gòu)型中。實際上，這些基因的許多直接參與初級代謝(例如參與小分子生物合成、代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)的基因)，而非諸如DNA修復(fù)、復(fù)制、信號傳遞或運(yùn)動性的基因。在多于1例的MAEB下游的46個保守結(jié)構(gòu)域(除去假設(shè)的基因)中，至少42例被注釋為參與初級代謝。有許多細(xì)菌基因參與初級代謝，因此這些數(shù)據(jù)表明了一種與代謝基因控制的功能關(guān)聯(lián)。MAEB和細(xì)胞對豐富甘氨酸應(yīng)答之間可存在關(guān)聯(lián)。MAEB經(jīng)常與gcvP和gcvT相關(guān)聯(lián)，gcvP和gcvT為甘氨酸切割系統(tǒng)的一部分，其中過量甘氨酸被注入至檸檬酸循環(huán)中。MAEB還與數(shù)個檸檬酸循環(huán)基因相關(guān)聯(lián)。然而，MAEB與一些與甘氨酸或檸檬酸循環(huán)相關(guān)性更弱的其他基因相關(guān)聯(lián)。可存在一種與甘氨酸切割系統(tǒng)的相關(guān)性，這是因為最大的MAEB重復(fù)數(shù)目與該系統(tǒng)中的gcv基因相關(guān)。而且，存在至少一個可結(jié)合甘氨酸的核糖開關(guān)類，但是該類在具有MAEB的生物的每個基因組僅存在1個拷貝，這可使MAEB有甘氨酸調(diào)節(jié)的功能。雖然MAEB基序的代表物呈現(xiàn)了保持堿基配對的相關(guān)變異，但其他成員攜帶破壞配對的突變。這個事實表明，事實上它可以是這樣的一條DNA序列，即該DNA序列結(jié)合蛋白二聚體，使得每個蛋白單元結(jié)合相對鏈。在所述莖的兩側(cè)，對稱位置的一對核苷酸都保守地為嘌呤(A或G)。由于嘌呤不能是Watson-Crick對，它們不可能同時出現(xiàn)在相對鏈上。雖然可預(yù)測DNA結(jié)合基序的實例可不同，但對稱嘌呤暗示所述基序本身(并不僅這些實例)在相對鏈上具有不同模式。ix.小ykkC基序小ykkC基序由兩個串聯(lián)發(fā)夾組成，所述發(fā)夾的莖顯示了顯著的相關(guān)變異并且它們的環(huán)具有特征性的ACGR基序(圖1)。小ykkC廣泛存在于α-、β-和Y-變形細(xì)菌，另外的實例在其他類中。該基序被命名為小ykkC，這是因為它似乎是與以前描述的ykkC/yxkD基序(Barrick2004)(下文稱為“ykkC”)的基因類似的一組基因的順式調(diào)節(jié)子。ykkC和小ykkC共有的所有8個保守結(jié)構(gòu)域在下文列出。ykkC和小ykkC的結(jié)構(gòu)顯示不相關(guān)。ykkC基序是一種能夠高度結(jié)構(gòu)化的且廣泛保守的基序。然而，小ykkC的簡單結(jié)構(gòu)是大多數(shù)其他核糖開關(guān)沒有的特征，但其廣泛的系統(tǒng)發(fā)生表明了一種需要廣泛保守的功能。小ykkC似乎為一種順式調(diào)節(jié)元件，這是因為它與一組相對窄的基因功能相關(guān)聯(lián)，并且它在這些基因的編碼序列附近(90%在Shine-Dalgarno序列的33個核苷酸內(nèi))。小ykkC可起到與所述ykkC基序相同的功能，但用于控制基因表達(dá)的機(jī)制可以不同?？勺⒁獾接袃H具有一個發(fā)夾的小ykkC的情況。χ.purD基序purD基序出現(xiàn)在完全測序的ε-變形細(xì)菌(例如彎曲菌屬和螺桿菌屬(Helicobacter))所有purD基因中。purD基因編碼GAR(磷酸核糖甘氨酰胺)合成酶，該合成酶參與嘌呤生物合成。purD基序顯示了相關(guān)變異和模塊莖，但它還呈現(xiàn)了一些破壞堿基配對的突變(圖1)。xi.6C基序該基序廣泛存在于放線菌門中，由兩個發(fā)夾組成，其中每個發(fā)夾的環(huán)包含至少6個C的串。6C基序在其莖中呈現(xiàn)顯著的相關(guān)變異。6C基序一般適度地靠近(200-300個核苷酸)被預(yù)測與染色體分配和菌毛組裝相關(guān)的基因。xii.轉(zhuǎn)座子和切除酶相關(guān)基序還發(fā)現(xiàn)了在α_變形細(xì)菌中的一種轉(zhuǎn)座酶相關(guān)基序及在放線菌門中與Xis切除酶相關(guān)的另一基序。兩種基序都主要由一個具有10至15個堿基對的莖的單個發(fā)夾組成。兩種基序也都呈現(xiàn)了顯著的相關(guān)變異，這表明它們可形成功能性的結(jié)構(gòu)化RNA。所述切除酶基序在所述切割酶基因的5'端調(diào)節(jié)構(gòu)型中。xiii.ATPC基序ATPC基序出現(xiàn)在某些藍(lán)細(xì)菌的ATP合酶操縱子中位于編碼A和C亞基的基因之間。ATPC基序例出現(xiàn)在所有測序的海洋原綠球藻(Prochlorococcusmarinus)株中及一些聚球菌屬(Synechococcus)種中。該基序主要由一個三莖交叉點組成。以前的研究已提出在藍(lán)細(xì)菌ATP合酶操縱子中的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，但非更復(fù)雜的形狀，并位于距ATPC基序的不同位置(Curtis1988)。xiv.cyano-30S基序該基序出現(xiàn)在某些藍(lán)細(xì)菌中并在編碼30S核糖體蛋白Sl的基因的5'端調(diào)節(jié)構(gòu)型中。它由兩個互不相似的發(fā)夾和一個假結(jié)組成，所述假結(jié)中Pl環(huán)中的5個核苷酸與緊接P2的3'端外的核苷酸進(jìn)行堿基配對。雖然有破壞Pl和P2中配對的數(shù)個突變，但在這些莖中還有許多補(bǔ)償性突變。而且，所述假結(jié)中的配對有相關(guān)變異并存在于所有代表物中?？紤]到基因的前后序列，該基序可模擬下游核糖體蛋白基因的配體(Zengel1994)，從而該基因的產(chǎn)物可調(diào)控它自己的表達(dá)。該cyanO-30S基序的識別支持了這樣的觀點，即這樣的RNA存在于在很多不同的門中。XV.乳桿菌基序Iacto-I基序和lacto-2基序只限于乳桿菌目中。lacto-Ι基序具有一些相關(guān)變異，但一些突變會破壞堿基配對。一些實例與主發(fā)夾和Shine-Dalgarno序列之間的S(MK)(或SAM-III)(Fuchs2006)核糖開關(guān)的可變區(qū)相交。lacto_2基序由具有許多內(nèi)環(huán)的大發(fā)夾組成，其中的一些環(huán)具有高度保守的序列。雖然一些突變會破壞配對，但這是一種大量的相關(guān)變異，這表明lacto-2基序例是結(jié)構(gòu)化RNA。xvi.TD(齒垢密螺旋體)基序兩種預(yù)測基序在齒垢密螺旋體(Tr印onemadenticola)中有數(shù)例，但沒有在任何其他測序的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)。這些基序(TD-1和TD-2)分別有28和36個代表物。7個TD-I基序代表物與TD-2例的反向互補(bǔ)序列重疊，并共享兩個5'-末端發(fā)夾。兩種基序都顯示相關(guān)變異，以及長度變化的或模塊的莖。TD-I基序通常在基因5'端調(diào)節(jié)構(gòu)型中。TD-2基序不共享5'端調(diào)節(jié)構(gòu)型，因此它可能對應(yīng)于一種非編碼RNA。3.討論使用該基于CMfinder的比較基因組流程，發(fā)現(xiàn)了22種新的推定RNA基序。兩種已被通過實驗確證為核糖開關(guān)。對于其他的數(shù)種，相關(guān)變異和其他特征表明它們是功能性的結(jié)構(gòu)化RNA，并已對許多這些基序提出了可能的功能。因此，該流程對于發(fā)現(xiàn)新RNA似乎是有用的。這些結(jié)果表明基于CMfinder的流程能夠發(fā)現(xiàn)這樣的RNA，即這些RNA是廣泛存在的，具有高度保守及廣泛的二級結(jié)構(gòu)，長度大約60個核苷酸或更長，并且與同源基因相關(guān)聯(lián)。3種候選核糖開關(guān)具有這些特征(GEMM、M0C0和SAH)。剩下的3種候選物——SAM-IV、C0G4708基序和sucA基序——的分布比大多數(shù)已知核糖開關(guān)窄，這是因為在分類水平的單個的目以外均未發(fā)現(xiàn)這些基序。B.實施例2真細(xì)菌中的核糖開關(guān)類感知第二信使環(huán)二GMP環(huán)二GMP是一種環(huán)形RNA二核苷酸，它作為第二信使發(fā)揮功能以在多個細(xì)菌的種中觸發(fā)大范圍的生理變化?？刂频倪^程包括細(xì)胞分化、運(yùn)動生活方式和生物膜生活方式之間的轉(zhuǎn)換及毒性基因表達(dá)。然而，從20多年前發(fā)現(xiàn)環(huán)二GMP以來，該化合物用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制仍是未知的。數(shù)據(jù)表明，許多細(xì)菌種中的環(huán)二GMP被這樣的一類核糖開關(guān)感知，即該核糖開關(guān)類可控制參與多個基本細(xì)胞過程的基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)了許多種的環(huán)二GMP調(diào)節(jié)子，包括一些與毒性基因表達(dá)、菌毛形成和鞭毛細(xì)胞器生物合成的核糖開關(guān)。另外，與環(huán)二GMP核糖開關(guān)共有序列匹配的序列存在于噬菌體基因組中。第二信使環(huán)二GMP(圖3A)被發(fā)現(xiàn)可作為來自細(xì)菌木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterxylinus)的纖維素合酶的激活劑(Ross1985；Rossl987)。后續(xù)的研究揭示了環(huán)二GMP在細(xì)菌中幾乎是普遍存在的，其中它對細(xì)胞生理具有廣泛的效應(yīng)(Jenal2006；Ryan2006；Tamayo2007)。環(huán)二GMP是一種環(huán)形的RNA二核苷酸，它通過具有GGDEF氨基酸結(jié)構(gòu)域特征的二鳥苷酸環(huán)化酶(DGC)由鳥苷-5'-三磷酸分子形成。一旦形成后，該化合物被包含EAL或HD-GYP氨基酸結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶(PDE)選擇性地降解(Jenal2006；Ryan2006；Tamayo2007;Simm2004及本文的參考文獻(xiàn))。包括病原體霍亂弧菌的許多細(xì)菌的種具有許多種不同的DGC和PDE蛋白(Galperin2001；Ulrich2005；Romling2005)這些蛋白的活性被特定的刺激激發(fā)，以調(diào)節(jié)細(xì)胞環(huán)二GMP濃度(Riimling2005)，并且該第二信使在霍亂弧菌中的濃度變化已知可控制粗糙性、生物膜形成和毒力(Lim2006c；Beyhan2007；Tischler2005；Waters2008)。環(huán)二GMP用來在細(xì)菌中引起多種生理變化的機(jī)制長期以來一直是不清楚的。除了被切割環(huán)二GMP的PDE靶向之外，該第二信使可被一些DGC蛋白結(jié)合以變構(gòu)地抑制其自身的合成(Chan2004；Wassman2007)0唯一已知的其他蛋白靶是木葡糖酸醋桿菌纖維素合酶(Ross1985；Ross1987)，綠膿假單胞菌PelD蛋白(Lee2007)和PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白(Ryjenkov2006)。然而，環(huán)二GMP與這些蛋白的結(jié)合沒有完全地解釋這種全局性細(xì)胞效應(yīng)(Tamayo2007；Wolfe2008)。因此，仍然需要發(fā)現(xiàn)環(huán)二GMP的關(guān)鍵調(diào)節(jié)靶。環(huán)二GMP的核糖開關(guān).已經(jīng)假設(shè)(Tamayo2007)環(huán)二GMP核糖開關(guān)的存在可能用來解釋該第二信使怎樣控制許多基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。最近報道了對某些生物中緊接DGC和PDE蛋白開放閱讀框(ORF)上游被稱為GEMM的高度保守的RNA結(jié)構(gòu)域的識別(Weinberg，2007)。該RNA結(jié)構(gòu)域還經(jīng)常與很可能受環(huán)二GMP控制的基因相關(guān)聯(lián)。GEMMRNA的高度保守和基因組分布是這樣的代謝物感知核糖開關(guān)的特征，即該核糖開關(guān)可控制對它們的靶配體濃度改變進(jìn)行應(yīng)答的基因表達(dá)(Winkler2005；Breaker2008(Science))。GEMMRNA符合被稱為1型和2型的兩種相似結(jié)構(gòu)(圖3B)中的一種。兩種類型都攜帶兩個堿基配對區(qū)(Pl和P2)，所述堿基配對區(qū)在識別的503個代表物中呈現(xiàn)廣泛相關(guān)變異(Weinberg，2007)。1型RNA(303個實例)在Pl上具有一個在第二位上為嘌呤(R)的GNRA四元環(huán)(Heus1991)。GRRA序列的存在與在P2遠(yuǎn)端存在一個四元環(huán)受體相關(guān)，已知所述四元環(huán)受體可容納該四元環(huán)類型(Costa1995)。相反，2型RNA(171個實例)在所述四元環(huán)的第二位置具有一個嘧啶(Y)，并且在一些例中P2上包括一個有利于容納GYRA四元環(huán)的結(jié)構(gòu)(Costa1995)。另外有29個未分類的代表物，其中24個攜帶一個以非配對核苷酸為側(cè)翼的GNRA四元環(huán)，5個缺乏四元環(huán)序列。GNRA四元環(huán)和它們的受體一般出現(xiàn)在結(jié)構(gòu)化RNA中，并且在以前在核糖開關(guān)適體中被發(fā)現(xiàn)(Regulski2008)。然而，Pl和P2發(fā)夾頂端的序列和結(jié)構(gòu)變異性表明，環(huán)二GMP的任何結(jié)合位點可能位于攜帶最保守特征的中央部分或底部分。GEMMRNA可選擇性地結(jié)合環(huán)二GMP.病原菌霍亂弧菌的基因組在不同染色體上攜帶兩個GE匪RNA序列。在I號染色體上，1型GE匪RNA(被命名為Vcl)位于霍亂弧菌gbpA基因的上游，gbpA基因編碼結(jié)合幾丁質(zhì)或其基本單體單元N-乙酰-D-葡糖胺的蛋白因子。GbpA已被發(fā)現(xiàn)參與人的霍亂感染(Kirn，2005)。在II號染色體上，另一個1型RNA(被命名為Vc2)位于一個與tfoX同源的基因(VC1722)的上游(Mandal2003；Meibom2005)。tfoX基因(在一些生物中被命名為sxy;Cameron2008)編碼一個負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)這樣的基因的因子，即這些基因在霍亂弧菌暴露于幾丁質(zhì)時可提高感應(yīng)性?？紤]到這種序列相似性，VC1722蛋白還可能作為一轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能。以兩個GEMMRNA進(jìn)行生物化學(xué)分析和遺傳分析，以確定它們是否作為環(huán)二GMP的適體發(fā)揮功能。在不存在或存在100μM環(huán)二GMP的情況下對110-核苷酸Vc2RNA構(gòu)建體(圖3D)進(jìn)行直讀探測(Soukupl999)(110Vc2；圖3C)。在莖Pl和P2的基部的自發(fā)切割模式變化表明，在發(fā)生結(jié)構(gòu)調(diào)變的區(qū)域(標(biāo)記為1至3)附近保守核苷酸對于第二信使結(jié)合是重要的。從涵蓋VclRNA的結(jié)構(gòu)體及從來自蠟樣芽胞桿菌和艱難梭菌(Clostridiumdifficile)的代表性環(huán)二GMP適體得到了類似的結(jié)果。通過以多種環(huán)二GMP濃度對110Vc2RNA進(jìn)行的直讀探測，確立了一個大約InM的表觀解離常數(shù)(Kd)。所形成曲線(圖4A)與在RNA適體及其配體之間的1比1飽和相互作用是一致的(Welz2007)。雖然所述適體可結(jié)合多種已報道的多聚環(huán)二GMP復(fù)合體(Egli1990；Zhang2006)中的一個，但這些分子間環(huán)二GMP復(fù)合體的形成出現(xiàn)在遠(yuǎn)高于測量Kd值的濃度下。而且，當(dāng)直讀探測反應(yīng)中的K+被Na+代替時沒有出現(xiàn)Kd的變化，縱使這些單價金屬可影響形成的該類環(huán)二GMP復(fù)合體。在110Vc2適體和環(huán)二GMP之間形成的復(fù)合體比對大腸桿菌PilZ蛋白結(jié)構(gòu)域(Kd=840nM；Ryjenkov2006)結(jié)合環(huán)二GMP所測量的親和性高3個數(shù)量級。而且，Vc2適體對所述第二信使的多種類似物的作用顯著不同(圖4B)。通過所試驗的類似物可知，所述第二信使的環(huán)形結(jié)構(gòu)及其鳥嘌呤核堿基似乎對于配體識別有重要作用。例如，環(huán)二GMP通過EALPDE的線性分解產(chǎn)物(被命名為pGpG)被所述適體結(jié)合的強(qiáng)度幾乎低3個數(shù)量級。類似地，甚至在比環(huán)二GMP的Kd高5個數(shù)量級的濃度下，HD-GYPPDE的pG(5‘GMP)產(chǎn)物都未被所述適體結(jié)合。因此，該適體類的生物相關(guān)配體似乎是環(huán)二GMP，而不是該第二信使的分解產(chǎn)物。環(huán)二GMP是一種包括兩個結(jié)構(gòu)受限的3',5'-磷酸二酯鍵的RNA二核苷酸(圖3A)。在一些情況下，具有受限幾何形狀的核苷酸間鍵合可呈現(xiàn)出加速的RNA鏈切割(Soukup1999)。為了評估環(huán)二GMP在直讀探測條件下是否穩(wěn)定，測定了它自發(fā)降解的速率常數(shù)。在直讀探測條件下，環(huán)二GMP以3.2X10_6分鐘―1的速率常數(shù)被切割(圖4C)，這相當(dāng)于約150天的半衰期。該速率常數(shù)類似于對存在于自由線性多核苷酸中的RNA鍵在孵育于類似條件下時預(yù)測的速率常數(shù)(Li1999)。因此，所述第二信使可能在直讀探測測定中是穩(wěn)定的，并且甚至細(xì)胞中都更為穩(wěn)定，除非有PDE酶的作用。環(huán)二GMP核糖開關(guān)的基因控制.細(xì)菌的核糖開關(guān)一般攜帶一個緊挨一個不很保守的表達(dá)平臺上游的保守適體。細(xì)菌中大多數(shù)的表達(dá)平臺可形成控制轉(zhuǎn)錄終止或翻譯起始的結(jié)構(gòu)(Barrick2007)。類似的構(gòu)架與許多GEMMRNA代表物相關(guān)，表明環(huán)二GMP適體很可能是核糖開關(guān)的組件。選擇來自霍亂弧菌、蠟狀芽孢桿菌和艱難梭菌的4個5‘UTR來評估環(huán)二GMP適體是否在體內(nèi)作為核糖開關(guān)的感知結(jié)構(gòu)域發(fā)揮功能。對于Vc2，將包含預(yù)測的固有啟動子、適體或其變體的DNA(圖5A)和鄰接的表達(dá)平臺用于制備與大腸桿菌IacZ報告基因的翻譯融合物。將攜帶適體_報告物融合構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并測定半乳糖苷酶活性。攜帶所述野生型(WT)Vc2適體的報告物構(gòu)建體呈現(xiàn)了高水平的基因表達(dá)(圖5Β)。相反，攜帶破壞Pl的突變或改變P2凸起中嚴(yán)格保守核苷酸的突變的構(gòu)建體Ml和M3以低于WT的10%的水平表達(dá)所述報告基因。此外，攜帶可恢復(fù)Pl結(jié)構(gòu)的4個突變的適體(M2)呈現(xiàn)出接近WT的基因表達(dá)。這些結(jié)果表明，整合Vc2適體的核糖開關(guān)作為一個“開啟，，開關(guān)通過激活鄰接ORF的翻譯發(fā)揮功能。類似地，對來自蠟狀芽孢桿菌(Bcl和Bc2)和艱難梭菌(Cdl)的環(huán)二GMP核糖開關(guān)制備轉(zhuǎn)錄融合物。WT和M3變體的表達(dá)模式與Bcl的“開啟”開關(guān)功能及Bc2和Cdl的“關(guān)閉”開關(guān)功能是一致的(圖5B)。變化的環(huán)二GMP濃度可調(diào)變核糖開關(guān)介導(dǎo)的基因表達(dá).環(huán)二GMP核糖開關(guān)對基因表達(dá)的調(diào)變通過如下方式確立檢查CdlRNA的“關(guān)閉”開關(guān)作用，同時操作所述第二信使的細(xì)胞濃度。環(huán)二GMP濃度受表達(dá)霍亂弧菌vieA基因產(chǎn)物的調(diào)變。VieA是一種EAL磷酸二酯酶(PDE)，該酶被預(yù)測通過促進(jìn)所述第二信使水解成其線性pGpG形式來降低環(huán)二GMP的細(xì)胞濃度(Li1999)。預(yù)測如下這樣的細(xì)胞可保持對在所述條件下培養(yǎng)的細(xì)胞來說正常的環(huán)二GMP濃度，即這種細(xì)胞攜帶空白載體或表達(dá)具有消除PDE活性的突變E170A的VieA蛋白(Tamayo2005)。在與空質(zhì)粒載體或者編碼無活性E170AVieA突變體的載體共轉(zhuǎn)化時，攜帶WTCdl核糖開關(guān)與IacZ的轉(zhuǎn)錄融合物并在具有X-gal的瓊脂板上培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌細(xì)胞呈現(xiàn)出低的β-半乳糖苷酶活性(圖6A)。相反，在以所述報告物構(gòu)建體和編碼VieAPDE的載體共轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中出現(xiàn)了強(qiáng)β-半乳糖苷酶活性。當(dāng)從液體培養(yǎng)物中測定這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞時觀察到類似的趨勢，而在所述Cdl適體中攜帶Μ3突變的報告物構(gòu)建體很大程度上保持不受vieA表達(dá)影響(圖6Β)。這些結(jié)果再次與所述Cdl核糖開關(guān)的“關(guān)閉”開關(guān)功能一致，其中所述PDE的作用是通過降低細(xì)胞中環(huán)二GMP濃度減輕遏制作用。環(huán)二GMP核糖開關(guān)在多種細(xì)菌中的作用.雖然霍亂弧菌僅具有兩個環(huán)二GMP核糖開關(guān)代表物(圖7)，這些RNA的生理作用是顯著的。與Vcl核糖開關(guān)相關(guān)的gbpA基因產(chǎn)物是一種糖結(jié)合蛋白，該蛋白被報道是使該細(xì)菌在哺乳動物腸定殖、導(dǎo)致霍亂疾病的關(guān)鍵性決定物(Kirn，2005)。已表明，霍亂弧菌在定殖于哺乳動物宿主腸時可降低其環(huán)二GMP水平(Tamayo2005)。在本研究中用于證明對環(huán)二GMP水平變化應(yīng)答的Cdl核糖開關(guān)(圖6A)的霍亂弧菌vieA基因已知是細(xì)菌感染必需的。因此由VieA的作用帶來的環(huán)二GMP水平降低可能被Vcl核糖開關(guān)感知，以有利于GbpA的表達(dá)及霍亂弧菌感染。與所述Vc2核糖開關(guān)相關(guān)的VC1722基因編碼類似于已知對感受態(tài)重要的轉(zhuǎn)錄因子的蛋白(Meibom2005)。前人已經(jīng)表明，產(chǎn)生粗糙表型的霍亂弧菌突變體具有升高的環(huán)二GMP水平，并呈現(xiàn)較高的VC1722mRNA表達(dá)(Lim2006c；Beyhan2007)。這與如下這樣的數(shù)據(jù)是一致的，即該數(shù)據(jù)表明了與VC1722mRNA相關(guān)的Vc2核糖開關(guān)是當(dāng)環(huán)二GMP濃度升高時產(chǎn)生較高基因表達(dá)的基因“開啟”開關(guān)(圖5B)。一些生物具有顯著高數(shù)目的環(huán)二GMP核糖開關(guān)代表物(圖7)。具有30個已識別的代表物的鈾還原地桿菌(Geobacteruraniumreducens)在已被基因組測序的細(xì)菌種中具有最大數(shù)目的環(huán)二GMP適體RNA0它們分布在25種不同轉(zhuǎn)錄單元的上游，具有5種攜帶串聯(lián)環(huán)二GMP適體的RNA。已發(fā)現(xiàn)，一些協(xié)同性地結(jié)合兩個氨基酸的甘氨酸適體有類似的串聯(lián)排列(Mandal2004c)。然而，更常見的串聯(lián)排列涉及對相同配體應(yīng)答的完整核糖開關(guān)(Welz2007；Sudarsan2006)。兩種串聯(lián)構(gòu)架排列都使核糖開關(guān)對更小的配體濃度變化更敏感地發(fā)生反應(yīng)(Welz2007)，并作為更數(shù)字化的基因開關(guān)發(fā)揮功能。雖然與許多環(huán)二GMP核糖開關(guān)相關(guān)的基因功能是未知的，但是艱難梭菌中的數(shù)個代表物的位置是值得注意的(圖7)。Cdl核糖開關(guān)是一種位于這樣的大操縱子5'UTR中的基因“關(guān)閉”開關(guān)(圖5和6)，所述大操縱子即該大操縱子編碼構(gòu)建該物種的整個鞭毛裝置所需的蛋白。這種排列表明，一些細(xì)菌使用核糖開關(guān)來感知環(huán)二GMP濃度的變化并調(diào)節(jié)細(xì)胞器生物合成，以控制運(yùn)動與固定生活方式轉(zhuǎn)換。還引人注意的是對存在于整合至艱難梭菌基因組內(nèi)的Phi⑶119噬菌體DNA中的環(huán)二GMP核糖開關(guān)代表物的識別。位于所述噬菌體基因組溶菌模塊中的所述核糖開關(guān)序列還明顯出現(xiàn)在被包裝于噬菌體顆粒的DNA中(Govind2006)。雖然已經(jīng)報道了超過20個代謝物感知核糖開關(guān)類別，并且已經(jīng)鑒定了這些類的數(shù)千個代表物，但環(huán)二GMPRNACd2、Cdl2及來自噬菌體的相關(guān)RNA是噬菌體相關(guān)核糖開關(guān)僅有的已知實例。病毒也許很少需要感知基本的代謝產(chǎn)物，但有可能通過監(jiān)測第二信使環(huán)二GMP濃度改變帶來的細(xì)菌細(xì)胞的生理轉(zhuǎn)換而獲得進(jìn)化優(yōu)勢。1.材料和方法i.生物信息學(xué)通過使用已經(jīng)確立的多序列比對(Weinberg2007)進(jìn)行額外的同源性搜索來擴(kuò)大已知的環(huán)二GMP核糖開關(guān)的組。這些搜索是使用RAVENNA(Weinberg2006)對RefSeq版本25(Pruitt2005)的微生物序列以及如下來源的環(huán)境序列進(jìn)行的礦井排水(Tyson2004)、土壤及鯨沉積物(Tringe2005)、人消化道(Gill2006)、小鼠消化道(Turnbaugh2006)、無腸海蟲(Woyke2006)、污泥群落(GarciaMartin2006)和全球海洋勘查(globaloceansurvey)(Venter2004；Rusch2007)。使用以前確立的方法(Weinberg2007)計算反映在共有序列圖(圖3)中的保守統(tǒng)計。使用來自RefSeq和DOE聯(lián)合基因組研究所(JointGenomeInstitute)或全球海洋勘查的基因注釋生成圖7?；诒Ｊ亟Y(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(Marchler-Bauer2005)版本2.08進(jìn)行基因分類。ii.寡核苷酸、化學(xué)物、質(zhì)粒和細(xì)菌株DNA寡核苷酸購自Sigma-Genosys或耶魯大學(xué)的W.M.Keck基金生物技術(shù)資源實驗室(FoundationBiotechnologyResourceLaboratory)。環(huán)二GMP、pGpG禾口3‘,5'-環(huán)GMP購自BioLog生命科學(xué)研究所(LifeScienceInstitute)(Germany),3'-鳥苷單磷酸購自MPBiomedicals。ApG、GpG、GpA、pGpA和GpGpG購自O(shè)ligosEtc。所有其他化學(xué)品購自Sigma-AldrichopDGl66l和pDG148獲自桿菌品種中心(BacillusGeneticStockCenter)(BGSC；俄亥俄州立大學(xué)(TheOhioStateUniversity))。pRS414由Dr.R.Simons(UCLA)饋贈?；魜y弧菌01生物變型eltor株附6961基因組DNA由Dr.B.Bassler(PrincetonU.)提供?？莶菅挎邨U菌株1A1、蠟狀芽孢桿菌株6A5(ATCC14579)和蠟狀芽孢桿菌株6A15(ATCC10987)也獲自BGSC。ATCC菌株9689的艱難梭菌基因組DNA來自ATCC。感受態(tài)DH5-α大腸桿菌購自NewEnglandBiolabs。iii.環(huán)二GMP降解的動力學(xué)在存在直讀探測緩沖物(50mMTris-HCl[pH8.3,23°C],IOOmMKCl,20mMMgCl2)的情況下將500μM環(huán)二GMP溶液孵育多個時長。通過添加環(huán)二GMP起始反應(yīng)，并且當(dāng)將10μL的整分試樣注入至一個裝配有AgilentZorbaxOligo柱(5μM，6.2mmX80mm)的AgilentTechnologies1200系列HPLC上時淬滅反應(yīng)。使用由95%0.IMNaHPO4[pH6.0，230C]和5%的乙腈至100%的IMNaCl組成的梯度流動相洗脫所述化合物。在254nm下監(jiān)測吸光度。通過將剩余未切割的環(huán)二GMP部分的自然對數(shù)相對于時間作圖確立環(huán)二GMP的速率常數(shù)，其中所形成線的負(fù)斜率可反映所述速率常數(shù)。iv.環(huán)二GMP類似物的純度分析和完整性使用AgilentTechnologies1200系列HPLC監(jiān)測洗脫化合物在254nm下的吸光度，檢查環(huán)二GMP的二核苷酸類似物和三核苷酸類似物的純度。通過使用95%水、5%乙腈和0.三氟乙酸至100%乙腈和0.的三氟乙酸的梯度流動相的AgilentExtendC18柱(3.5μM，4.6mmX150mm)分離所述化合物。HPLC跟蹤表明，50%-95%的UV吸收物質(zhì)對應(yīng)于所需的類似物。對每個類似物進(jìn)行高分辨率質(zhì)譜分析，以確認(rèn)它們的準(zhǔn)確質(zhì)量。對C20H25N10O11P(GpA)計算的HRMS(ES)及建立的(M-H)-612.1442,611.1375；C20H25N10O11P(ApG)612.1442,611.13723；C20H25N10O12P(GpG)628.1391,627.13207；C20H26NioO14P2(PGpA)692.1105,691.10410；C30H37N15O19P2(GpGpG)973.1865,972.1825及(Μ-2ΗΓ2485.58597。v.RNA的制備DNA模板的制備是通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行，使用了野生型或突變pRS414質(zhì)粒DNA與這樣的引物，即這些引物在轉(zhuǎn)錄起始位點添加T7RNA聚合酶(T7RNAP)的啟動子序列和兩個鳥嘌呤殘基以提高RNA產(chǎn)率。RNA分子的制備是通過體外轉(zhuǎn)錄進(jìn)行，在20mMTris-HCl(23°C下，pH8.0)、20mMNaClU4mMMgCl2禾口100μMEDTA中使用了合適的DNA模板和Τ7RNAP。在變性(8Μ脲)10%聚丙烯酰胺凝膠上純化RNA，并在IOmMTris-HCl(23°C下，pH7.5)、200mMNaCl和ImMEDTA(pH8.0)中從所述凝膠洗脫RNA。將RNA以乙醇沉淀，使用堿性磷酸酶(RocheDiagnostics)脫磷酸化，并使用[Y-32P]ATP和T4多核苷酸激酶(NewEnglandBiolabs)依照制造商的方案標(biāo)記5'端。如上所述對標(biāo)記的RNA進(jìn)行凝膠純化。vi.直讀探測使用類似于以前描述的方法(Soukup1999)進(jìn)行直讀探測測定。簡而言之，在20mMMgCl2UOOmMKCl和50mMTris(23°C下，pH8.3)中將5'32P標(biāo)記的RNA(環(huán)二GMPKd測定約50pM，所有其他測定約5nM)與指定化合物在23°C下孵育大約40小時。將RNA切割產(chǎn)物通過變性10%PAGE分離，使用Phosphorimager(MolecularDynamics)顯示，并且使用SAFAvl.1軟件(Das2005)或ImageQuant(MolecularDynamics)分析。將SAFA軟件用于標(biāo)準(zhǔn)化，以修正每一泳道上加樣的RNA量的差異，并且確定每條帶的強(qiáng)度。將強(qiáng)度表現(xiàn)出顯著變化的帶鑒定為發(fā)生結(jié)構(gòu)調(diào)變。為了確定110Vc2對環(huán)二GMP的KD，以多種濃度的環(huán)二GMP進(jìn)行上述的直讀探測。由于使用了濃度格外低的放射標(biāo)記110Vc2RNA，所以在所上樣的樣品中補(bǔ)充已經(jīng)被單獨地經(jīng)過直讀探測的另外的未標(biāo)記RNA。這降低了非特異地結(jié)合于凝膠基質(zhì)的放射標(biāo)記RNA的量并在成像過程中提高帶分辨率。使用ImageQuant軟件(MolecularDynamics)確定離解常數(shù)(Kd)以比較結(jié)構(gòu)調(diào)變位點的個體帶強(qiáng)度，假定在沒有配體時無調(diào)變并且在最高試驗配體濃度時具有完全調(diào)變。離解常數(shù)的確定是通過將調(diào)變的部分(F)相對于在標(biāo)明的調(diào)變位點的配體濃度的對數(shù)[L]作圖，并使用SigmaPlot9(SystatSoftware)將數(shù)據(jù)擬合于方程F=[L]/([L]+Kd)。vii.質(zhì)粒和細(xì)菌株的制備將Vc2——C0G3070(Tfox樣基因)的5'UTR——從霍亂弧菌基因組DNA擴(kuò)增為EcoRI-BamHI片段，克隆至翻譯報告載體pRS414中，并使用類似于以前描述的方法(Nahvi2002)確立其在大腸桿菌中的基因控制功能。具體地，將相對于該ORF起始的-348nt至+21nt區(qū)域克隆為IacZ報告載體中的翻譯融合物，其中C0G3070ORF的第7密碼子與IacZ報告基因的第9密碼子在閱讀框內(nèi)融合。使用QuikChange定向誘變試劑盒(Stratagene)依照制造商的說明從該質(zhì)粒生成調(diào)節(jié)區(qū)中的突變。通過PCR將蠟狀芽孢桿菌和艱難梭菌中推定的ORF上游的5‘UTR區(qū)擴(kuò)增為EcoRI-BamHI片段，克隆至載體pDG1661中以得到和無啟動子IacZ基因的轉(zhuǎn)錄融合物。所擴(kuò)增的片段包含UTR上游的預(yù)測啟動子元件及與相應(yīng)基因上游核糖開關(guān)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄終止子。將所形成的構(gòu)建體整合入以前描述的枯草芽孢桿菌的amyE座位(Sudarsan2003)中。使用上述的定向誘變生成突變構(gòu)建體。通過PCR從基因組DNA擴(kuò)增霍亂弧菌環(huán)二GMP特異性磷酸二酯酶基因(vieA)。使用以前描述的不依賴于連接作用的克隆過程(Jos印h2001)，將VieA基因克隆至位于改良PDG148載體中Pspac啟動子下游的stul位點中。該載體中的IacI基因已被突變，使得所述VieA基因被預(yù)測進(jìn)行組成型表達(dá)。使用如上述的定向誘變形成VieA敲除突變體E170A。viii.β-半乳糖苷酶測定將野生型和突變Vc2-pRS414構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)NEB5_α(NewEnglandBiolabs)大腸桿菌細(xì)胞中。將各個集落在含50μg/mL羧芐青霉素的Luria-Bertani肉湯中于37°C下?lián)u晃培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物稀釋至OD6tltl為約0.1并培養(yǎng)至0D_為約0.6，然后依照標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行β-半乳糖苷酶測定(Miller1992)。將以含Bel、Bc2和Cdl的pDG1661轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌株的過夜培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)至OD6tltl約0.2并接著培養(yǎng)大約3小時至0D_為約1，然后進(jìn)行如上述的半乳糖苷酶測定。通過在37°C下培養(yǎng)劃線細(xì)胞至少16小時，使用上述的轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌細(xì)胞在固體瓊脂平板上進(jìn)行基因表達(dá)測定。根據(jù)需要，瓊脂(TBAB)含有400μgmL—1X-gal以及5μgmL—1的氯霉素和/或卡那霉素。C.實施例3感知S-腺苷高半胱氨酸及激活參與輔酶循環(huán)的基因的核糖開關(guān)在許多革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)菌種中已經(jīng)鑒定了出現(xiàn)在參與S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)循環(huán)的基因上游的高度保守RNA基序。該基序代表物的系統(tǒng)發(fā)生分布和保守的結(jié)構(gòu)特征可指示核糖開關(guān)功能。核糖開關(guān)是廣泛存在的代謝物感知基因控制元件，通常出現(xiàn)在細(xì)菌mRNA的5'端非翻譯區(qū)(UTR)。該RNA基序的實例被鑒定出可在無蛋白的體外測定中特異地識別S-腺苷高半胱氨酸(SAH)，并且已經(jīng)確認(rèn)這些RNA明顯區(qū)分出SAM及其他緊密相關(guān)的類似物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一個代表性的SAH基序當(dāng)結(jié)合代謝物時可在體內(nèi)激活下游基因的表達(dá)。這些結(jié)果確認(rèn)了SAH基序RNA不同于如下這樣的核糖開關(guān)類別的配體結(jié)合適體，即該類核糖開關(guān)可選擇性地結(jié)合SAH及控制對于循環(huán)所消耗的SAM輔酶必要的基因。RNA適體是高度結(jié)構(gòu)化的多核苷酸，可形成對具體配體的選擇性結(jié)合袋(Goldetal.,1995；OsborneandEllington，1997)。工程化的適體可被制備成對它們靶呈現(xiàn)高親和性和選擇性，并且具有相當(dāng)大可能性可被應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、生物技術(shù)和治療中(Breaker，2004；BunkaandStockley，2006)。RNA適體還天然出現(xiàn)在許多細(xì)菌信使RNA的5‘UTR中，它們在此作為被稱作核糖開關(guān)的基因控制元件的感受器結(jié)構(gòu)域(MandalandBreaker,2004a；SoukupandSoukup,2004；WinklerandBreaker,2005)與其工程化對應(yīng)物類似，天然適體可以高親和性和特異性結(jié)合它們的靶，這是細(xì)胞使用的RNA適體精確地調(diào)節(jié)關(guān)鍵代謝基因的表達(dá)所需的。然而，天然適體一般遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于(在34和200個核苷酸之間變化)工程化的適體(Breaker，2006)，這可能使得天然適體呈現(xiàn)與由蛋白構(gòu)成的基因控制因子競爭所需的高水平的性能。每個核糖開關(guān)通常均通過適體結(jié)構(gòu)域控制代謝物結(jié)合，以帶來鄰接的表達(dá)平臺中的結(jié)構(gòu)變化。這些結(jié)構(gòu)變化可確立來自所述開放閱讀框(ORF)或位于下游的多個ORF的蛋白生產(chǎn)水平。然而，代謝物結(jié)合不是總能帶來折疊變化。例如，一個核糖開關(guān)類可將所述靶代謝物用作其作用是抑制下游ORF表達(dá)的自切割核酶的輔酶(Winkleretal.,2004；Cochraneetal.，2007)。不管所使用的機(jī)制如何，核糖開關(guān)經(jīng)?？煽刂迫缦逻@樣的基因，即這些基因的蛋白產(chǎn)物參與至其細(xì)胞濃度被所述適體結(jié)構(gòu)域感知的代謝物或代謝物前體的合成、降解或轉(zhuǎn)運(yùn)中。除非涉及修飾的堿基或支持蛋白因子，否則核糖開關(guān)適體必須使用僅4個常規(guī)核苷酸形成它們的靶代謝物的精確結(jié)合口袋。這對每種適體施加了很大的選擇壓力，以在整個進(jìn)化中保持某些結(jié)構(gòu)特征，但一些配體例如SAM(Corbinoetal.,2005；Fuchsetal.，2006)和PreQ1(Weinbergetal.，2007)可被具有完全不同適體結(jié)構(gòu)的多核糖開關(guān)類檢測。從甚至遠(yuǎn)親緣生物鑒定出的核糖開關(guān)適體類的代表物可呈現(xiàn)相當(dāng)保守的序列和二級結(jié)構(gòu)。這種保守性以及被所述適體結(jié)合的配體具體種類形成了將核糖開關(guān)組織成不同類的基礎(chǔ)。核糖開關(guān)適體的保守特征已被計算機(jī)輔助搜索算法利用，以擴(kuò)大已知核糖開關(guān)類的代表物的數(shù)目(例如Rodionovetal.,2002；Rodionovetal.,2003a；Nahvietal.，2004；Rodionovetal.，2004)，以及以發(fā)現(xiàn)以前未知的核糖開關(guān)類(例如Rodionovetal.，2003b；Barricketal.，2004；Corbinoetal.，2005；Weinbergetal.，2007)。相反，表達(dá)平臺的序列和結(jié)構(gòu)變化很大，甚至在相同核糖開關(guān)類中也是這樣。例如，TPP核糖開關(guān)可整合具有不同表達(dá)平臺構(gòu)架的共有適體，以在細(xì)菌中控制轉(zhuǎn)錄終止和翻譯起始(Winkleretal.,2002；Mironovetal.,2002；Rentmeisteretal.，2007)，及在真核生物中控制RNA剪接(Sudarsanetal.,2003a；Kuboderaetal.,2003；Bocobzaetal.,2007；Cheahetal.，2007；Wachteretal.，2007)。如上文指出的，具有來自不同結(jié)構(gòu)類的適體的核糖開關(guān)可識別相同靶代謝物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了特異性識別輔酶SAM(或AdoMet)的4個核糖開關(guān)類，它們被命名為SAM-I(Epshteinetal.,2003；McDanieletal.,2003；Winkleretal.,2003)>SAM-II(Corbinoetal.，2005，Limetal.，2006b)、SAM-III^Smk(Fuchsetal.，2006)以及SAM-IV(Weinbergetal.，2007；未發(fā)表數(shù)據(jù))。在這些類中，SAM-I核糖開關(guān)具有最廣泛存在的已知系統(tǒng)發(fā)生分布，在許多細(xì)菌組中都有其實例(Rodionovetal.，2004)。SAM-II核糖開關(guān)大量出現(xiàn)在革蘭氏陰性的變形細(xì)菌和擬桿菌中(Corbinoetal.,2005),而SAM-III核糖開關(guān)僅被報道在革蘭氏陽性菌乳酸菌中(Fuchsetal.，2006)。所有所述4類適體對SAM結(jié)合都優(yōu)先于SAH(或AdoHcy)，SAH是SAM依賴的甲基轉(zhuǎn)移的副產(chǎn)物(Takusagawaetal.，1998)。例如，SAM-I和SAM-II適體的代表物對SAH的結(jié)合力分別低約80倍和超過1000倍(Limetal.，2006b)?？紤]到所述化合物僅相差一個單甲基，這種差異水平是顯著的。此處描述了對如下這樣的細(xì)菌RNA元件的發(fā)現(xiàn)，即該RNA元件具有高度保守的一級序列和二級結(jié)構(gòu)，并總是出現(xiàn)在負(fù)責(zé)將SAH轉(zhuǎn)換成L-甲硫氨酸的基因的上游。所述RNA元件代表一個不同的適體類，該適體類可選擇性地結(jié)合SAH并且與SAM相差至少1000倍，這完全不同于所述4種已知SAM適體的分子識別特征。在細(xì)菌丁香假單孢桿菌的ahcYmRNA中，由代謝物結(jié)合SAH適體帶來的結(jié)構(gòu)變化可在體內(nèi)激活下游基因的表達(dá)，這證明了所述SAH適體可形成SAH應(yīng)答性核糖開關(guān)獨特類的感知組件。1.結(jié)果i.與SAH循環(huán)相關(guān)的保守RNA基序的鑒定在鑒定另外的核糖開關(guān)類和其他結(jié)構(gòu)化調(diào)節(jié)RNA基序的嘗試中，使用CMfinder比較基因組流程(Yaoetal.，2007)在多種細(xì)菌類中進(jìn)行了基因家族的基因間區(qū)(IGR)的系統(tǒng)搜索(Weinbergetal.，2007)。使用該搜索策略在細(xì)菌中鑒定了多種RNA基序，并且數(shù)個具有預(yù)測的作為代謝物感知核糖開關(guān)起作用的RNA的特征。—種候選核糖開關(guān)被命名為SAH基序，這是因為大多數(shù)通常與該RNA的代表物相關(guān)的基因為S-腺苷高半胱氨酸水解酶(ahcY，C0G0499)、鈷胺素依賴的甲硫氨酸合酶(metH,C0G1410)和亞甲基四氫葉酸還原酶(metF，C0G0685)(圖8)。SAH基序代表物的基因組前后序列及它們高度的保守情況與以下的作用是一致的感知SAH并激活其產(chǎn)物是SAH循環(huán)以再合成SAM所需的基因的表達(dá)。SAM依賴的甲基化反應(yīng)(Takusagawaetal.,1998)的SAH副產(chǎn)物可以類似于SAM甚或比SAM更大的親和力結(jié)合于多種SAM依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶，因此作為這些酶的一種強(qiáng)抑制劑發(fā)揮功能(Ueland，1982)。在甲基轉(zhuǎn)移酶高活性的時間過程中，除非SAH被轉(zhuǎn)變成較低毒性的產(chǎn)物，否則細(xì)胞可能會積聚毒性水平的SAH。因此，快速感知SAH及激活再循環(huán)SAH以更新SAM的基因很重要。在真細(xì)菌中有兩種主要的SAH分解代謝途徑，它們都將SAH轉(zhuǎn)換成高半胱氨酸(圖8)。在許多細(xì)菌的種中，SAH核苷酶(EC3.2.2.9)可催化SAH的N-糖苷鍵斷裂，以產(chǎn)生腺嘌呤和S-核糖基高半胱氨酸(DeliaRagioneetal.，1985)。后一種化合物隨后可被IuxS的基因產(chǎn)物水解，以形成高半胱氨酸(Schauderetal.，2001)。另一種途徑涉及通常與SAH基序代表物相關(guān)的ahcY基因。SAH水解酶——ahcY基因的產(chǎn)物——可催化SAH的硫醚鍵斷裂以產(chǎn)生腺苷和高半胱氨酸(Shimizuetal.，1984)。隨后使用5-甲基四氫葉酸(5-甲基THF)作為甲基供體，metH的基因產(chǎn)物將高半胱氨酸甲基化成L-甲硫氨酸(Oldetal.，1988)，5-甲基THF由metF的基因產(chǎn)物從5，10-甲基THF生成(Sh印pard，1999)。由metK基因編碼的SAM合酶從甲硫氨酸和ATP再生成SAM，以完成該循環(huán)(TaborandTabor,1984)。有趣地注意到，所述metK基因在β-變形細(xì)菌和Y_變形細(xì)菌的一些種中位于SAHRNA基序的鄰近上游，并且可以在相同操縱子中。在發(fā)現(xiàn)所述保守RNA元件的基因組中沒有鑒定出IuxS基因產(chǎn)物(C0G1854)的同源物，因此SAH在這些生物中的分解代謝可僅僅通過涉及SAH水解酶的途徑進(jìn)行。總體來說，出現(xiàn)了95個與修改的結(jié)構(gòu)模型相符的SAHRNA基序，并且這些匹配中的68個是非雙份重復(fù)的。除了從環(huán)境序列或者從與該RNA基序相鄰的基因身份未知的未完全測序的基因組鑒定的那些之外，所有被鑒定的SAHRNA基序?qū)嵗寂cSAH循環(huán)基因鄰接。在大多數(shù)情況下，SAHRNA代表物位于似乎是這樣的操縱子的上游，即這些操縱子幾乎無例外地編碼SAH水解酶(ahcY)、亞甲基四氫葉酸還原酶(metF)及有時編碼甲硫氨酸合酶(metH)。在伯克霍爾德氏菌、脫氯單胞菌和雷爾氏菌(Ralstonia)的一些種中，所述操縱子包括一種未知功能的預(yù)測膜蛋白(C0G1950)。其他很少出現(xiàn)在SAHRNA相關(guān)操縱子中的基因包括那些編碼rRNA甲基化酶(C0G1189)、感受態(tài)特異性基因的調(diào)節(jié)物(tfoX，C0G3070)和涉及鳥苷多磷酸代謝的酶(spoT，C0G0317)的基因?；诒葘χ械?8個非雙重復(fù)序列構(gòu)建了RNA基序的共有序列和結(jié)構(gòu)模型(圖9A)。該共有RNA基序由一個以被命名為Pl和P2的堿基配對區(qū)域為側(cè)翼的高度保守核苷酸中心構(gòu)成，其中P2的帽端是一個序列可變的環(huán)(L2)。該RNA還在所述中心和該RNA的3'末端高度保守核苷酸之間形成一個假結(jié)(P4)。在某些代表物的Pl莖和P4莖之間出現(xiàn)一個發(fā)夾(P3和L3)。所述二級結(jié)構(gòu)元件都得到相關(guān)變異的支持。除了β-變形細(xì)菌和Y-變形細(xì)菌之外，匹配該共有序列和結(jié)構(gòu)的RNA實例還出現(xiàn)在δ-變形細(xì)菌的一個種及在一些革蘭氏陽性放線菌門中(圖9Β)。該RNA元件在大多數(shù)生物中都出現(xiàn)一次，例外的是嗜酸菌屬種(Acidovoraxsp.)、芳香脫氯單胞菌、固氮弧菌屬禾中(Azoarcussp.)、Polaromonasnaphthalenivorans、極地單胞菌屬種(Polaromonassp·)、鐵還原紅育菌(Rhodoferaxferrireducens)禾口膠狀紅長命菌(Rubrivivaxgelatinosus)，它們中在位于不同的基因組區(qū)域的預(yù)測ahcY和metH編碼序列兩者的前面鑒定到2次。ii.所述68metHRNA對SAH的選擇性結(jié)合SAHRNA的結(jié)構(gòu)特征和基因組排列表明，它們可作為感知SAH的核糖開關(guān)的適體。尋找了這樣的RNA基序?qū)嵗?，即這些實例可在無蛋白的體外系統(tǒng)中特異性地識別代謝物及發(fā)揮基因控制元件的功能，這些是核糖開關(guān)的兩個定義特征。選擇了一個包含在芳香脫氯單胞菌metH基因上游被鑒定的SAHRNA的68核苷酸RNA(命名為68metH，圖10A)。芳香脫氯單胞菌68metHRNA差不多是幾乎對應(yīng)于該基序的共有序列和結(jié)構(gòu)的最短序列。它長度的縮短部分地是由于不存在任選的P3莖(圖9A)。將直讀探測測定(SoukupandBreaker,1999)用于確認(rèn)預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)(圖10A)，及用于確定68metHRNA與SAH直接結(jié)合。該測定利用了這樣的事實，即RNA的自發(fā)切割在未結(jié)構(gòu)化的核苷酸間鍵合處出現(xiàn)得更快，從而可顯示RNA的結(jié)構(gòu)特征及它們在結(jié)合配體時發(fā)生的變化。將5'端32P標(biāo)記的68metHRNA孵育在包含濃度逐漸升高的SAH的反應(yīng)中，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離所形成的自發(fā)切割產(chǎn)物(圖10B)。在不存在任何配體的情況下，在被預(yù)測形成L2的RNA、分隔Pl和P2的內(nèi)部環(huán)和所述RNA的3'末端部分這些區(qū)域觀察了較高的帶強(qiáng)度。這些結(jié)果表明可形成Pl和P2，但在所述RNA核心及在3'端尾的絕大多數(shù)高度保守的核苷酸(包括P4假結(jié)的核苷酸)在不存在配體時結(jié)構(gòu)化較少。在存在升高濃度的SAH時，在整個RNA的數(shù)個位置出現(xiàn)了帶強(qiáng)度的漸進(jìn)變化，這確認(rèn)了SAH可導(dǎo)致RNA折疊的變化，這如假設(shè)所述RNA作為該代謝物的適體的情況時所預(yù)測的。而且，所述結(jié)構(gòu)變化主要出現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)生保守的區(qū)域(圖9A、圖10A)，這一般出現(xiàn)于許多其他核糖開關(guān)適體。對SAH結(jié)合響應(yīng)的最顯著變化是假結(jié)P4的穩(wěn)定化及所述核心其他保守核苷酸的柔性降低。這表明高度保守的核苷酸在形成SAH的結(jié)合袋中起作用。通過在一個SAH濃度范圍定量測定數(shù)個核苷酸位置的自發(fā)切割程度，估計68metHRNA對SAH的表觀離解常數(shù)Kd為約20nM(圖IOB和10C)。該表觀Kd值是核糖開關(guān)適體的典型值，所述典型值被發(fā)現(xiàn)在約200μM(Winkleretal.,2004)至約200pM(WelzandBreaker,2007；Sudarsanetal.，2006)的范圍內(nèi)。以來自丁香假單孢桿菌ahcY基因的122核苷酸SAH適體構(gòu)建體獲得了直讀探測測定顯示的類似的SAH介導(dǎo)的形狀變化。雖然122ahcYRNA攜帶任選的P3莖，但是在配體結(jié)合時該RNA在適體核心會發(fā)生關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)變化，并且表觀Kd值類似于對68metHRNA的測量值。對于發(fā)揮SAH應(yīng)答性核糖開關(guān)感受器的功能的SAH適體，必須能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)類似于SAH的生物學(xué)相關(guān)化合物。也許最重要地，所述適體必須區(qū)分SAM，SAM與SAH差別僅僅是硫中心的單甲基基團(tuán)及相關(guān)正電荷。使用直讀探測及市售的SAM，發(fā)現(xiàn)了68metHRNA及其他的SAH適體呈現(xiàn)的表觀Kd值比針對SAH確立的表觀Kd值高不超過10倍。然而，SAM自發(fā)地降解會產(chǎn)生很高水平的SAH污染，甚至新制備的市售SAM樣品也包含約10%的SAH(Sigma-AldrichTechnicalService)。因此，68metHRNA對SAM的更高水平的區(qū)分可被SAM樣品中SAH的存在弱化。為了得到SAH適體區(qū)分SAM的能力的更準(zhǔn)確估計值，進(jìn)行了使用如下這樣的SAH砜類似物的直讀探測，即該SAH砜類似物在以前已經(jīng)被表明可近似模擬SAM與一個SAM-I類核糖開關(guān)適體的結(jié)合性質(zhì)(Limetal.，2006b)。具體地，該SAH砜類似物缺少在SAM中存在的硫上的甲基基團(tuán)，但攜帶兩個從硫吸取電子密度以增加該原子的類似于天然輔酶的相對正電荷的電負(fù)性氧原子。直讀探測結(jié)果(圖10C)可顯示，68metHRNA對砜類似物的結(jié)合的表觀Kd比對SAH低大約3個數(shù)量級。還使用平衡透析評估了68metH適體對SAM的Kd值，以比較SAH適體與以前報道的名稱為156metA的SAM-II適體(Corbinoetal.,2005)的功能。將68metHRNA或156metARNA(IOyM)加入平衡透析裝置的一個槽中，并將IOOnM的[3H]SAM(圖11A)加入另一個槽中。所述槽被截留分子量為5000道爾頓的透性膜隔開。由于在[3H]SAM的硫中心的甲基基團(tuán)是被放射標(biāo)記的，污染的SAH是無放射性的，因此不影響放射性在兩個槽之間的平衡分布。與68metHRNA存在時相同測定條件下的無轉(zhuǎn)移相比，156metARNA將[3H]SAM的分布向包含SAM-II適體的槽促進(jìn)轉(zhuǎn)移約1.5倍(圖11B)。如通過直讀探測(Corbinoetal.，2005)測定的，156metARNA對SAM具有約1μM的表觀KD。因此，68metH對SAM的Kd值大于1μΜ。再者，無放射性轉(zhuǎn)移等同于針對SAM-II核糖開關(guān)使用25μM68metHRNA時的觀測情況，這表明它對SAM的Kd可能幾乎不超過25μΜ。這表明68metHRNA對SAH識別的親和性可能優(yōu)于對SAM的超過1000倍(圖11C)。即使在所述核糖開關(guān)被暴露于與SAH相當(dāng)甚或輕度過量的SAM濃度時，SAH和SAM之間的這種區(qū)別將足以精確地控制SAH循環(huán)基因在應(yīng)答變化的SAH水平時的表達(dá)。通過確立68metHRNA對15種SAH類似物的表觀Kd值，更詳細(xì)地評估了SAH適體的分子識別特征(圖12A)。氨基酸的羧基和氨基、糖環(huán)和核堿基上多個位置以及硫酯鍵被改變。除S-腺苷半胱氨酸(SAC)之外的所有類似物都呈現(xiàn)了親和性降低至少3個數(shù)量級。值得關(guān)注的是，SAC的較短氨基酸側(cè)鏈僅導(dǎo)致親和性的輕度降低，這不同于對SAM感知核糖開關(guān)的觀測結(jié)果(Limetal.，2006b)。SAH的砜衍生物(化合物3)和氮雜衍生物(化合物4)中硫原子處的改變也會將親和性降低3個數(shù)量級，這表明該位置對于配體識別的重要性?；衔?在用于直讀探測條件下大致不帶電荷(Limetal.，2006b)。因此，它與所述RNA的弱相互作用可能來自于甲基基團(tuán)的存在造成的立體干擾?；衔?在硫原子處更高的正電荷密度(Limetal.,2006b)可能促成了該化合物與化合物4相比相對稍弱的結(jié)合。另外，SAH中硫中心的兩組孤對電子在所述RNA的配體識別中可能起到一個關(guān)鍵作用?？梢韵胂骃AH(及SAC)的硫原子可能經(jīng)電荷轉(zhuǎn)移或范德華相互作用與所述適體形成多相互作用。最后，腺苷可較弱地與所述SAH適體相互作用(Kd約100μM)，但高半胱氨酸或甲硫氨酸在高至ImM的濃度均不導(dǎo)致RNA結(jié)構(gòu)的任何調(diào)變。這些結(jié)果已經(jīng)被用于形成68metHRNA對SAH分子識別的一個模型(圖12B)。該模型表明，所述配體上的基本上每個功能基團(tuán)均作為關(guān)鍵的分子識別決定因素，這一點在數(shù)個其他核糖開關(guān)適體類中已被觀測到(例如Mandaletal.,2003；Sudarsanetal.，2003b；Mandaletal.，2004c；Limetal.，2006a；Limetal.，2006b)。iii.SAH結(jié)合可激活報告基因的表達(dá)丁香假單孢桿菌的SAH元件和ahcYmRNA的起始密碼子之間的序列被預(yù)測可形成一個額外的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中在P4莖3'末端的兩個核苷酸之一可能與核糖體結(jié)合位點或Shine-Dalgarno(SD)序列發(fā)生堿基配對(圖13A)。后一種相互作用將所述額外的莖環(huán)結(jié)構(gòu)延長兩個堿基對，因此可能作為一個SD收納莖(sequesteringstem)發(fā)揮功能。因此，可能通過暴露SD序列以有利于核糖體與mRNA相互作用，該RNA作為一個激活配體結(jié)合時的基因表達(dá)的SAH應(yīng)答性核糖開關(guān)發(fā)揮功能。雖然對來自芳香脫氯單胞菌metH基因的SAH適體可預(yù)測一種類似的SAH介導(dǎo)的重排，但是與該RNA結(jié)合的配體似乎可控制一個轉(zhuǎn)錄終止子莖的形成。進(jìn)行了一個體內(nèi)基因控制測定，其中包含丁香假單孢桿菌ahcY基因5'UTR的IGR被融合至IacZ編碼序列的鄰接上游。該構(gòu)建體保留了ahcY基因的起始密碼子，它在閱讀框內(nèi)融合于所述報告基因0RF。將所形成的翻譯融合載體轉(zhuǎn)化至丁香假單孢桿菌中，以產(chǎn)生野生型(WT)報告株。類似地，構(gòu)建被預(yù)計可破壞或恢復(fù)適體功能的一系列突變體報告株(圖13A)。隨后將轉(zhuǎn)化的丁香假單孢桿菌株培養(yǎng)于金氏培養(yǎng)基B(King’smediumB)(豐富)或Vogel-Bormer培養(yǎng)基(基本)中，并將突變構(gòu)建體的報告物表達(dá)水平與來自WT報告物構(gòu)建體的結(jié)果比較(圖13B)。在豐富培養(yǎng)基中，預(yù)測SAH濃度較高，這是因為細(xì)胞應(yīng)利用需要將SAM作為一種輔因子使用的代謝途徑。如預(yù)測的，與攜帶破壞莖Pl和P2或J1-2之間連接部位中兩個保守核苷酸的突變(圖13A)的構(gòu)建體Ml(圖13B，上圖)相比，WT構(gòu)建體的β-半乳糖苷酶活性被提高。該發(fā)現(xiàn)與這樣的觀點一致，即SAH結(jié)合可激活基因表達(dá)，破壞配體結(jié)合的突變可造成所述核糖開關(guān)默認(rèn)為關(guān)閉狀態(tài)。不幸地是，盡管由Μ2攜帶的突變對Ρ2莖的脫穩(wěn)定化被預(yù)計可破壞核糖開關(guān)功能，但是Μ2和Μ3都表現(xiàn)為WT樣基因表達(dá)。然而，直讀探測(有或無SAH存在)表明所述M2構(gòu)建體是嚴(yán)重錯折疊的，這可導(dǎo)致所述報告物構(gòu)建體默認(rèn)為高基因表達(dá)。檢查了P2中可產(chǎn)生無過多錯誤折疊的構(gòu)建體的其他突變。如預(yù)測的，突變體M4(P2破壞)和M5(P2恢復(fù))分別表現(xiàn)出了基因表達(dá)的消失和隨后基因表達(dá)的恢復(fù)。這些結(jié)果再次表明，該適體的破壞可導(dǎo)致所述核糖開關(guān)默認(rèn)為基因表達(dá)的關(guān)閉狀態(tài)，并表明M2突變確在其錯誤折疊和基因表達(dá)的結(jié)果方面是異常的。類似地，由構(gòu)建體M6、M7和M8攜帶的突變的效應(yīng)與涉及SD收納的基因控制機(jī)制是一致的。這些構(gòu)建體每個均攜帶兩個降低P4穩(wěn)定性的突變，并通過使用直讀探測觀測這些構(gòu)建體失去SAH結(jié)合親和性的情況。此外，具有破壞的SAH結(jié)合的構(gòu)建體還可以產(chǎn)生較低的β-半乳糖苷酶報告物活性。對于Μ6和Μ8確實觀測到了該結(jié)果，但Μ7產(chǎn)生近乎WT的表達(dá)(圖13Α)。雖然Μ7突變會破壞Ρ4形成，但是它們還可以破壞與SD序列重疊的收納莖。因此，所述Μ7核糖開關(guān)將不再能夠默認(rèn)成關(guān)閉狀態(tài)，并且所述核糖開關(guān)_報告物融合構(gòu)建體的基因表達(dá)可如觀察到的一樣高。以在基本培養(yǎng)基(Vogel-Bormer培養(yǎng)基)中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了一組類似的報告基因測定。雖然以在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)的多種構(gòu)建體觀察到了相同的趨勢(圖13Β，下圖)，但是報告物表達(dá)的絕對值在豐富培養(yǎng)基中更高。報告物在基本培養(yǎng)基中總體表達(dá)的這種減少可以歸因于總體代謝活性和蛋白合成的降低。將直讀探測用于確定是否可觀察到Ρ4莖和SD收納莖形成之間的競爭。使用基于151ahcYRNA的較長構(gòu)建體(類似于圖13A中描繪的)的直讀探測顯示，當(dāng)存在SAH時WT構(gòu)建體中的SD收納莖確被破壞。相反，不管是否存在SAH，該構(gòu)建體的M6版本可形成SD收納莖，而M7變體不能形成該莖。因此，全長P4莖和全長SD收納莖的相互排斥形成可能是來自丁香假單孢桿菌ahcY基因的SAH核糖開關(guān)的表達(dá)平臺的一個關(guān)鍵組件。為了進(jìn)一步證實SAH在體內(nèi)作為代謝物效應(yīng)物，對培養(yǎng)在添加有已知可提高細(xì)胞SAH水平的效應(yīng)物的基本培養(yǎng)基中的WT株測量報告物的表達(dá)(圖14)。腺苷-2',3'-二醛(SAH水解酶的抑制劑)和腺苷外加高半胱氨酸以前都被報道可顯著地提高細(xì)胞SAH水平(Hermesetal.，2004)。以SAH水解酶抑制劑或腺苷/高半胱氨酸混合物添加的培養(yǎng)基可將WT核糖開關(guān)-報告物融合構(gòu)建體的表達(dá)提高約10至20倍(圖14A)，提高腺苷-2‘，3'-二醛濃度可導(dǎo)致WT但非缺陷突變體Ml和M7的基因表達(dá)的升高(圖14B)。向培養(yǎng)基中添加甲硫氨酸可導(dǎo)致類似的核糖開關(guān)介導(dǎo)的表達(dá)的提高。生長培養(yǎng)基中過量甲硫氨酸可引起較高的細(xì)胞SAM濃度(Winkleretal.，2003)，細(xì)胞SAH濃度也會被升高。相反，向培養(yǎng)基中添加250μMSAH僅稍微地提高報告物的表達(dá)。完整分子的SAH不能通過細(xì)胞膜(Ueland，1982)，這可解釋添加該化合物對報告物表達(dá)水平幾乎沒有效應(yīng)的原因。報告物表達(dá)的上調(diào)似乎是核糖開關(guān)依賴性的，這是因為以攜帶破壞P4形成并改變所述適體核心共有序列的突變的M6核糖開關(guān)-報告物融合構(gòu)建體幾乎沒有出現(xiàn)基因表達(dá)(圖13A)。2.討論SAH不但作為SAM依賴的甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的產(chǎn)物普遍存在于活體系統(tǒng)中，而且在高濃度存在時還作為這些反應(yīng)的抑制劑發(fā)揮作用(Ueland，1982)。因此，許多細(xì)胞需求選擇性感知SAH及除去過量SAH。在一些生物中，SAH被一種調(diào)節(jié)硫代謝中涉及基因的蛋白遺傳因子感知(Reyetal.，2005)。這些結(jié)果顯示，RNA分子可發(fā)揮類似的功能以感知SAH及控制其分解代謝所需的關(guān)鍵基因。對SAH元件的鑒定提供了選擇性結(jié)合SAH的高度保守及廣泛分布的細(xì)菌RNA的第一個實例。該RNA可作為這樣的一種核糖開關(guān)類的適體結(jié)構(gòu)域，即該核糖開關(guān)類總是位于那些預(yù)測蛋白產(chǎn)物參與SAH分解代謝的ORF的鄰接上游。這表明絕大多數(shù)的SAH核糖開關(guān)對配體結(jié)合的反應(yīng)可能是開啟基因表達(dá)。事實上，RNA元件的直接配體結(jié)合可穩(wěn)定某些二級或三級結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可使鄰接ORF可接近SD序列，以允許核糖體的結(jié)合及隨后的翻譯。雖然有數(shù)個不同類的已知顯著區(qū)分SAH結(jié)合的SAM感知核糖開關(guān)(Limetal.，2006b；Fuchs,2006)，但是SAH核糖開關(guān)是第一類所鑒定出的將該區(qū)分逆轉(zhuǎn)向有利于SAH結(jié)合及排斥SAM的RNA。在用其他核糖開關(guān)類時，配體結(jié)合的高度選擇性可能是需要的，以防止其他密切相關(guān)的化合物對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。SAH適體的有效分子區(qū)分可能會防止其他化合物例如SAM不必要地激活SAH分解代謝基因表達(dá)，所述SAH分解代謝基因表達(dá)僅當(dāng)SAH積聚至高水平時才是需要的。SAH適體的該區(qū)分力是特別重要的，這是因為SAH的代謝前體SAM在正常條件下具有比SAH更大的細(xì)胞積蓄(cellularpool)(Ueland，1982)。SAH核糖開關(guān)的基因前后序列及它們對SAM區(qū)分的約3個數(shù)量級的能力都表明，SAH在體內(nèi)是被RNA元件感知的代謝物。因此，SAH核糖開關(guān)提供了具有一類如下這樣的感知器和基因控制元件的細(xì)胞，即該感知器和基因控制元件僅當(dāng)SAH濃度有利于適當(dāng)基因的表達(dá)時才允許細(xì)胞消耗資源用于SAH降解。如天然SAM適體一樣，在本研究中最詳細(xì)檢查的SAH適體基本上將配體上的每個官能團(tuán)用于分子識別。一個顯著的例外是觀察到SAH適體可允許從配體的氨基酸部分除去一個亞甲基基團(tuán)，而基本不損失親和性。S-腺苷半胱氨酸(SAC;圖12A，化合物2)攜帶與存在于SAH中相同的官能團(tuán)陣列，但這些基團(tuán)的一些必須在適體的結(jié)合袋中移動一?；蚨喟?。對于允許所述更短SAC類似物的一個可能的解釋是，所述RNA適體可能形成兩個分開的結(jié)合袋，其中每個袋與配體的一側(cè)相互作用。這可允許某一水平的適應(yīng)性，所述適應(yīng)性使得結(jié)合位點可識別不同長度的配體。在該類型的核糖開關(guān)適體之前，已經(jīng)報道了TPP結(jié)合核糖開關(guān)的這樣的功能，即TPP結(jié)合核糖開關(guān)可結(jié)合不斷變短的硫胺素單磷酸酯和硫胺化合物，盡管表觀Kd值不斷變小(Winkleretal.，2002)。TPP核糖開關(guān)適體的原子分辨模型(EdwardsandFerre-D'Amare,2006；Serganovetal.,2006；Thoreetal.,2006)顯示一個兩部分的配體結(jié)合袋，所述結(jié)合袋可調(diào)整它們的位置從而以相對高的親和性結(jié)合所述更短的硫胺素單磷酸酯配體。SAH適體中最高度保守的核苷酸主要位于Ρ4中及橋接PI、Ρ2和Ρ4結(jié)合部位中(圖9Α)。這些核苷酸可參與針對SAH的結(jié)合袋的形成，這一點被通過直讀探測觀察到的這些殘基的大量結(jié)構(gòu)調(diào)變證實(圖IOA和10Β)。這些核苷酸可形成一個可結(jié)合在硫中心缺乏電荷的配體的袋，因此它們可形成一個以不同于SAM-I適體的方式與該原子中心相互作用的結(jié)構(gòu)。SAH適體排斥在本研究中試驗的攜帶硫中心修飾的兩個化合物(圖12Α，化合物3和4)。對化合物4的區(qū)分特別引人注意，這是因為代替SAH的硫的氮中心同樣不荷電。因此，SAH核糖開關(guān)似乎可通過諸如SAM、3和4等在與SAH的硫等效的原子上攜帶其他化學(xué)部分的化合物的立體排斥進(jìn)行區(qū)分。除了擴(kuò)大核糖開關(guān)類的列表之外，對SAH適體的鑒定會引起作為高選擇性SAH感受器應(yīng)用。例如，SAH為一種高半胱氨酸源，而高半胱氨酸可被用作心血管疾病的標(biāo)記物(Nygardetal.，1999)。在被測序的細(xì)菌基因組中鑒定的與SAH元件共有序列一致的最短實例的長度略微超過50個核苷酸(出現(xiàn)在芳香脫氯單胞菌ORFDarO_0186上游)。將對SAH的納摩爾的親和性、對緊密相關(guān)類似物例如SAM的數(shù)個數(shù)量級的區(qū)分以及易于獲得的表達(dá)平臺聯(lián)系在一起，SAH元件擁有所需的體外及體內(nèi)應(yīng)用的性質(zhì)。3.實驗步驟i.寡核苷酸、化學(xué)品和細(xì)菌合成的DNA寡核苷酸購自耶魯大學(xué)的W.M.Keck基金生物技術(shù)資源實驗室或Sigma-Genosys，除非另外聲明否則不進(jìn)一步處理即使用。[3H]SAM或S-(5‘-腺苷)-L-甲硫氨酸_(甲基-3H)購自Sigma-Aldrich，[γ-32Ρ]ΑΤΡ購自AmershamBiosciences?；衔?由TheUniversityofSheffield的G.MichaelBlackburn教授饋贈。所有其他化學(xué)品購自Sigma-Aldrich，例外是SAH類似物3、5、6和9_16，它們的制備記載于他處(Limetal.，2006b)。丁香假單孢桿菌番茄變種株DC3000由康奈爾大學(xué)的GregoryB.Martin教授饋贈。ii.RNA的制備68metH和122ahcYRNA的制備是通過使用T7RNA聚合酶和相應(yīng)DNA模板的體外轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。使用superscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)依照制造商的說明書，通過延伸雜交至合成的模板DNA的攜帶T7啟動子序列的引物生成68metH的DNA模板。在延伸之前通過使用變性(8M脲)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化合成的模板DNA。使用如下文所述的適當(dāng)質(zhì)粒從PCR擴(kuò)增產(chǎn)生野生型和突變122ahcYRNA的DNA模板。將所述RNA轉(zhuǎn)錄物通過變性PAGE純化，并使用包含IOmMTris-HCl(23°C下，pH7.5)、200mMNaCl和ImMEDTA的溶液從凝膠片段上洗脫。將RNA以乙醇沉淀濃縮，使用堿性磷酸酶(RocheDiagnostics)脫磷酸化，并使用[Y-32P]ATP和T4多核苷酸激酶(NewEnglandBiolabs)依照制造商的說明書標(biāo)記5'端。如上述將放射標(biāo)記的RNA通過變性PAGE純化并分離。如上述制備并純化用于平衡透析的野生型和突變68metHRNA，但不進(jìn)行脫磷酸化及放射標(biāo)記。使用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)株GV2260的全細(xì)胞PCR生成的DNA模板，如上述制備了用于平衡透析的156metARNA(Corbinoetal.,2005)iii.直讀探測分析基本如以前的描述(SoukupandBreaker,1999)進(jìn)行直讀探測測定。在包含50mMTris-HCl(25°C下，pH8.3)、20mMMgCl2UOOmMKCl的10μ1體積中將5'32P-標(biāo)記的RNA在室溫下孵育大約40個小時，并包含指定濃度的試驗化合物。將自發(fā)切割產(chǎn)物通過變性10%PAGE分離，使用PhosphorImager(MolecularDynamics)顯示，并且使用SAFAvl.1軟件(Dasetal.，2005)定量。在每個核苷酸位置處切割的RNA的量從SAFA分析得到，SAFA分析自動地測定具有水平不變的自發(fā)切割的參考核苷酸位置，以對每個泳道中不同的上樣量進(jìn)行校正。對每個調(diào)變位點的各個帶強(qiáng)度求和并標(biāo)準(zhǔn)化，以得到結(jié)構(gòu)上被調(diào)變的RNA部分的值，這假定沒有配體存在時無調(diào)變且配體濃度最高時有調(diào)變最大。使用SigmaPlot9軟件(SystatSoftware,Inc.)將所有3個標(biāo)識的調(diào)變位點處的所述調(diào)變部分(F)相對于所述配體濃度[L]的曲線與等式F=[L]/([L]+Kd)擬合，確定表觀離解常數(shù)(Kd)的值。iv.平衡透析通過將20μ1樣品送遞至Dispo-EquiIibrium生物透析儀(TheNestGroup，Inc.，Southboro,MA,USA)的每側(cè)進(jìn)行平衡透析，其中通過一個截留分子量5000道爾頓的透析膜保持槽之間的分隔狀態(tài)。一個槽包含IOOmMTris-HCKpH8.3，24°C)、20mMMgCl2UOOmMKCl和IOOnM[3H]SAM的緩沖溶液。相對槽包含相同的緩沖溶液加指定濃度的156metA或68metHRNA。在25°C下孵育11.5小時之后，從兩個槽都取出5μ1的整分試樣并通過液體閃爍計數(shù)器測量放射性。v.體內(nèi)報告基因表達(dá)測定通過丁香假單孢桿菌番茄變種株DC3000的全細(xì)胞PCR將相對于預(yù)測ahcY翻譯起始位點(GenBank登記號:NC_004578.1；核苷酸5，771，072至5，771，444)-367至+6的核苷酸擴(kuò)增為BamHI-HindIII片段。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆至IacZ報告基因的鄰接上游的翻譯融合載體PRA301(AkakuraandWinans,2002)中。該報告物載體穩(wěn)定地維持于假單胞菌中，這是因為它帶有源自綠膿假單胞菌載體PVSl(Itohetal.，1984)的復(fù)制起點r印和穩(wěn)定區(qū)域sta。使用所產(chǎn)生的作為模板的質(zhì)粒、合適的誘變引物和QuikChange定向誘變試劑盒(Stratagene)依照制造商的說明書，生成突變體M1-M8。通過測序確認(rèn)所有重組質(zhì)粒的完整性。通過電穿孔依照標(biāo)準(zhǔn)步驟(Ausubeletal.,1992)完成pRA301變體向丁香假單孢桿菌的轉(zhuǎn)化。通過選擇大觀霉素(75μgπιΓ1)和利福平(50μgπιΓ1)抗性鑒定正確的轉(zhuǎn)化。為了測量IacZ基因在野生型(WT)和突變丁香假單孢桿菌報告物株中的表達(dá)水平，在28°C下將細(xì)胞在金氏培養(yǎng)基B(Kingetal.,1954)(20gΓ1示蛋白胨3號、IOgΓ1甘油、1.5gΓ1K2HPO4U.5gF1MgSO4‘7H20,pH7.2),50μgπιΓ1利福平和75μgιΓ1大觀霉素中或者在Vogel-Bormer基本培養(yǎng)基(0.2gΓ1MgSO4·7H20、2gΓ1一水合檸檬酸、IOgΓ1K2HPO4,3.5gΓ1NH4NaHPO4·4Η20，ρΗ7.0),0.5%w/v葡萄糖、50μgπιΓ1利福平和75ygπιΓ1大觀霉素中搖晃培養(yǎng)過夜。向用相同培養(yǎng)基將該過夜培養(yǎng)物稀釋成A_=0.1至0.2，并補(bǔ)充另外指定的化合物。將培養(yǎng)物另外孵育4.5小時(金氏培養(yǎng)基B)或6小時(Vogel-Bormer培養(yǎng)基)，然后依照標(biāo)準(zhǔn)步驟(Miller，1992)進(jìn)行β-半乳糖苷酶測定。報告物的Miller單位是3次重復(fù)實驗的平均值。D.實施例4在鏈球菌中確認(rèn)第二天然PreQ1適體類對真細(xì)菌基因組的生物信息學(xué)搜索已經(jīng)產(chǎn)生了許多核糖開關(guān)候選物，其中在檢查相關(guān)基因后并不直接就知道了配體的具體種類。這些基序的一個只出現(xiàn)在鏈球菌科編碼被分類為C0G4708或DUF988的假定膜蛋白的基因的5'非翻譯區(qū)(UTR)中。在鏈球菌之外的細(xì)菌——許多厚壁菌(Firmicute)物種的同源基因的5'UTR中鑒定了結(jié)合Q核苷(queuosine)生物合成中間體Q核苷前體i(PreQ1)的核糖開關(guān)。本文中已表明，來自肺炎鏈球菌(Sti^ptococcuspneumoniae)R6的C0G4708RNA基序代表物也可結(jié)合PreQ1。而且,該RNA代表物具有不同于以前記載的PreQ1核糖開關(guān)類的結(jié)構(gòu)和分子識別特征。PreQ1存在兩種或多種不同的天然適體類的第二代謝物，表明天然適體利用不同結(jié)構(gòu)來結(jié)合相同代謝物可能是通常現(xiàn)象。另外，結(jié)合RNA的PreQ1與大多數(shù)編碼被分類為C0G4708的蛋白的基因的關(guān)聯(lián)可表明，這些蛋白作為PreQ1或另一種Q核苷生物合成中間體的轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮功能。核糖開關(guān)是結(jié)合小分子代謝物以調(diào)節(jié)基因表達(dá)的結(jié)構(gòu)化RNA(MandalandBreaker2004a；SoukupandSoukup2004；TuckerandBreaker2005；WinklerandBreaker2005)。它們一般由一個配體結(jié)合適體和一個將配體結(jié)合翻譯成基因調(diào)節(jié)的表達(dá)平臺組成。由于配體結(jié)合位點所施加的限制，每個核糖開關(guān)類的適體通常是很保守的。這種適體序列和適體結(jié)構(gòu)的保守性使得基因組序列的生物學(xué)分析成為一種鑒定新核糖幵關(guān)候選物的有效工具(例如Rodionovetal.2002；Rodionovetal.2003；Barricketal.2004；Abreu-GoodgerandMerino2005；Corbinoetal.2005；Weinbergetal.2007)。相反，表達(dá)平臺可相當(dāng)大程度地變化及利用不同的基因調(diào)節(jié)機(jī)制例如轉(zhuǎn)錄終止和翻譯抑制(MandalandBreaker2004a)。雖然通?？梢酝ㄟ^檢查單個核糖開關(guān)的序列分辨表達(dá)平臺，但是它們相對缺乏序列和結(jié)構(gòu)保守性妨礙了它們被用作生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)新核糖開關(guān)類的靶。生物信息學(xué)搜索已被用于發(fā)現(xiàn)許多的核糖開關(guān)和核糖開關(guān)候選物(例如Barrieketal.2004；Corbinoetal.2005)。最近，使用在搜索數(shù)百個細(xì)菌基因組(Weinbergetal.2007)中應(yīng)用的CMfinder流程(Yaoetal.2006)的22個RNA基序的發(fā)現(xiàn)結(jié)果被使用。22個基序中的6個呈現(xiàn)了順式調(diào)節(jié)RNA例如核糖開關(guān)共有的特征。例如，這些基序一貫地位于一個基因或不同組基因的正上游。另外，這些基序的代表物可具有兩個特征的一個依賴P的轉(zhuǎn)錄終止子或者與位于正下游的基因的核糖體結(jié)合位點或Shine-Dalgarno序列(SD)重疊的莖。對于所述的數(shù)種基序，從RNA基因組前后序列推斷出配體種類(Weinbergetal.2007；Wangetal.2008；Regulskietal.，已投稿)。對于其他基序,基因組前后序列之前未提供或幾乎未提供關(guān)于配體種類的信息。一種這樣的RNA基序被發(fā)現(xiàn)僅與在厚壁菌門中發(fā)現(xiàn)被分類為C0G4708或DUF988的保守假定膜蛋白的基因相關(guān)。已經(jīng)描述了對應(yīng)于Q核苷(Q)生物合成前體PreQ1(Rothetal.2007)的核糖開關(guān)。Q是在大多數(shù)細(xì)菌Tyr、Asn,Asp和His的tRNA的GUN反密碼子擺動位置出現(xiàn)的超修飾堿基(HaradaandNishimura1972)。Q修飾已知對于翻譯忠實性是重要的(Meieretal.1985；BienzandKublil981；Urbonaviciusetal.2001)。Q生物合成起始于GTP，并在一系列酶促步驟中前進(jìn)經(jīng)過中間體PreQtlG-氰基-7-脫氮鳥嘌呤)和PreQ1(7-氨甲基-7-脫氮鳥嘌呤)(Kuchinoetal.1976；Okadaetal.1978；Iwata-Reuyl2003；GaurandVarshney2005；VanLanenetal.2005)。PreQ1優(yōu)先調(diào)換特定的鳥嘌呤tRNA，剩下的生物合成步驟在原位發(fā)生(Okadaetal.1979；Slanyetal.1993)。因此，PreQ1是在插入至tRNA之前以游離形式存在的最后一種Q前體。已知PreQ1核糖開關(guān)類(Rothetal.2007)的代表物經(jīng)常位于Q生物合成操縱子上游(Readeretal.2004)，但一些也被鑒定為編碼另外與Q無關(guān)的蛋白的其他基因上游，這些基因類型的一種被分類為C0G4708。因此，可以推測C0G4708蛋白可能參與Q生物合成前體的轉(zhuǎn)運(yùn)。在本研究中已確定，與編碼C0G4708蛋白的基因相關(guān)的RNA可緊緊地及選擇性地結(jié)合PreQ1，并顯示與基因“關(guān)閉”開關(guān)一致的特征。因此提出了，該RNA基序的代表物的確可作為第二類的PreQ1核糖開關(guān)，下文稱作PreQ1-II。PreQ1-II核糖開關(guān)適體具有與現(xiàn)在稱為PreQ1-I的以前描述的PreQ1核糖開關(guān)(Rothetal.2007)基本不同的結(jié)構(gòu)和分子識別譜。因此，PreQ1可聯(lián)合S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(Corbinoetal.2005)作為被至少兩類天然RNA適體識別的代謝物的第二實例。而且，通過在其同源物被已知核糖開關(guān)控制的mRNA的非編碼區(qū)中進(jìn)行搜索可幫助發(fā)現(xiàn)新核糖開關(guān)類。1.結(jié)果和討論LC0G4708RNA基序的生物信息學(xué)最初描述的C0G4708RNA基序包括來自鏈球菌科的22條序列，其中6條是唯一的(Weinbergetal.2007)。為了鑒定另外的C0G4708RNA基序?qū)嵗褂蒙壍男蛄袛?shù)據(jù)發(fā)布版本(RefSeq25)進(jìn)行了同源性搜索。鑒定了匹配該基序的另外18條序列，使得序列總數(shù)目變成40條，唯一序列數(shù)目為13條(圖15)。大多數(shù)的新代表物在例如肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌或乳酸乳球菌的生物中被鑒定，它們的代表株在以前已被測序。因此，所述另外C0G4708RNA中的一些與已被描述的那些很類似或相同。該基序在豬鏈球菌、血鏈球菌和干酪乳桿菌中的序列匹配也被鑒定。該基序的所有代表物都出現(xiàn)在編碼被注釋為C0G4708或DUF988的蛋白的基因5'-UTR。以前描述的該基序的保守特征(Weinbergetal.2007)包括適體內(nèi)的假結(jié)、環(huán)序列和SD序列都出現(xiàn)在所有的新代表物中(圖16A)。這類的結(jié)構(gòu)化RNA與以前已經(jīng)確定的相比在更大范圍的細(xì)菌中是保守的。另外，所述RNA的共有序列模式和二級結(jié)構(gòu)模型與出現(xiàn)于PreQ1-I適體類(Rothetal.2007)的那些相比基本上更復(fù)雜。ii.C0G4708RNA基序代表物很可能作為PreQ1感知核糖開關(guān)發(fā)揮功能基于編碼C0G4708蛋白的基因與以前描述的PreQ1-I核糖開關(guān)(Rothetal.2007)的關(guān)聯(lián)，假設(shè)了與C0G4708基因相關(guān)的第二保守RNA基序還可感知PreQ1。為了確定C0G4708RNA在對PreQ1結(jié)合的響應(yīng)中是否發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，在存在和不存在PreQ1的情況下對該基序的代表物進(jìn)行了直讀探測測定(SoukupandBreaker1999；Winkleretal.2002)。直讀探測測定利用了由內(nèi)部磷酸酯轉(zhuǎn)移引起的自發(fā)RNA切割的不同速率。RNA鏈不受限區(qū)域一般具有比受限區(qū)域更快的切割速率，使得代謝物結(jié)合時RNA結(jié)構(gòu)的變化通常可導(dǎo)致RNA片段化模式的變化(SoukupandBreaker1999；LiandBreaker1999)。將與包含來自肺炎鏈球菌R6的C0G4708RNA基序的103核苷酸構(gòu)建體(下文中被稱為1-103RNA)對應(yīng)的5‘32P-標(biāo)記的RNA與不同濃度的PreQ1孵育，并通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離自發(fā)切割產(chǎn)物。所述1-103RNA的片段化模式呈現(xiàn)了濃度依賴的變化，因此顯示會出現(xiàn)PreQ1依賴的RNA結(jié)構(gòu)變化(圖16B)。這些結(jié)果還確認(rèn)了C0G4708RNA為本發(fā)明人命名為PreQ1-II的不同類的PreQ1適體。全長1-103RNA構(gòu)建體的切割模式與基于系統(tǒng)發(fā)生分析預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)(Weinbergetal.2007)一致。環(huán)和連接區(qū)顯示了切割的跡象，而預(yù)測的堿基配對區(qū)大多保持免于被切割(圖16C)。呈現(xiàn)切割速率降低的大多數(shù)核苷酸對應(yīng)于最大保守的核苷酸(圖16C)。包含P3的SD序列和反SD在不存在PreQ1的情況下顯示一些切割。該切割在配體結(jié)合時減少，表明SD和反SD在存在被預(yù)測可收納SD及阻止翻譯起始的PreQ1的情況下是穩(wěn)定的。相反，出現(xiàn)在第16號及以下核苷酸的高水平自發(fā)切割表明，1-103RNA構(gòu)建體的5'區(qū)大多保持未被結(jié)構(gòu)化。該結(jié)果與保守核苷酸在PreQ1-II適體代表物中相對零星的分布一塊表明了該區(qū)域不參與所述適體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分的形成?；谏镄畔W(xué)和結(jié)構(gòu)探測數(shù)據(jù)已經(jīng)表明，來自肺炎鏈球菌的PreQ1-IIRNA基序可作為基因關(guān)閉的開關(guān)發(fā)揮功能，其中配體結(jié)合可穩(wěn)定P3二級結(jié)構(gòu)以掩蔽SD序列及阻止基因表達(dá)。這種基因控制機(jī)制以前已經(jīng)對多種其他核糖開關(guān)發(fā)現(xiàn)(Rodionovetal.2002；MandalandBreaker2004a；Fuchsetal.2006；Wangetal.2008)。類似地，PreQ1-I核糖開關(guān)的代表物被預(yù)測可下調(diào)同源的C0G4708基因?qū)reQ1響應(yīng)中的表達(dá)(Rothetal.2007)。iii.最小PreQ1-II二級結(jié)構(gòu)被生物信息學(xué)正確地預(yù)測構(gòu)建了一系列5'和3'截短的RNA及用于確定截短構(gòu)建體是否保持PreQ1結(jié)合活性的直讀探測。包含成對元件Pl至P4(核苷酸17-90)的RNA具有大約IOOnM的對PreQ1的表觀Kd(圖17A、B)。這種親和性位于對其他核糖開關(guān)適體觀測的范圍內(nèi)，因此證明了在直讀探測中5'末端保持相對未結(jié)構(gòu)化的核苷酸對于高親和性代謝物結(jié)合是非必需的(圖16C)。缺失Pl的甚至更短的RNA構(gòu)建體(核苷酸33-90)具有與17-90RNA構(gòu)建體大約相同的KD，表明了雖然相關(guān)變異出現(xiàn)在多個位置(Weinbergetal.2007)，但保守的Pl元件也不可能參與PreQ1配體的分子識別。Pl有可能在RNA折疊中起作用或者在體內(nèi)發(fā)揮未被本發(fā)明人的體外直讀探測測定捕獲的功能。為了進(jìn)一步檢查所提出的二級結(jié)構(gòu)模型，形成了在17-90RNA的每個配對元件中攜帶破壞突變和補(bǔ)償突變的構(gòu)建體(圖17C)，并通過使用直讀探測評估這些構(gòu)建體的配體結(jié)合活性(圖17D)。如預(yù)測的，P2中的破壞突變(Ml)會將配體結(jié)合親和性降低約100倍(Kd約10μM)，并且補(bǔ)償突變(Μ2)可部分地恢復(fù)配體結(jié)合親和性(Kd約250ηΜ)。自發(fā)切割產(chǎn)物的模式與其中Ρ2在Ml中未配對且在Μ2中配對的結(jié)構(gòu)是一致的。破壞突變Μ3和Μ5分別位于Ρ3和Ρ4，兩者都破壞了PreQ1結(jié)合(圖17D)。然而，補(bǔ)償突變Μ6(在Ρ4中)如預(yù)測完全恢復(fù)了配體結(jié)合，攜帶補(bǔ)償變化以恢復(fù)Ρ3堿基配對的Μ4突變不會產(chǎn)生PreQ1結(jié)合的恢復(fù)。該補(bǔ)償突變的失敗可能是由于多種原因所致。Μ3和Μ4在直讀探測中都呈現(xiàn)自發(fā)切割的模式，不同于在不存在配體的情況下的野生型RNA的模式，這表明這些突變可導(dǎo)致相當(dāng)多的錯誤折疊。另外，突變的Ρ3核苷酸由于存在SD和反SD序列而是嚴(yán)格保守的，該區(qū)域在配體結(jié)合時會調(diào)變(圖16B、C)。這些特征表明，改變P3中的堿基類型可導(dǎo)致廣泛的錯誤折疊，以及對PreQ1結(jié)合(直接或間接)重要的分子接觸在M4構(gòu)建體中可能是缺乏的。iv.平衡透析確認(rèn)PreQ1結(jié)合使用不同的方法以3H-PreQ1和17_90RNA構(gòu)建體進(jìn)行平衡透析實驗，以確認(rèn)配體結(jié)合及分子識別的特異性。對于平衡透析，將3H-PreQ1添加至平衡透析裝置的槽a中，并將過量的RNA添加至槽b中。兩個槽被一個5，000道爾頓分子量截留的透析膜分隔(圖18A)。使溶液平衡，隨后通過液體閃爍計數(shù)測量每個槽中的氚部分。在以17-90RNA平衡3H-PreQ1以得到兩個槽(b/a)約1.75的放射性信號比時(圖18B)，出現(xiàn)了氚向RNA的轉(zhuǎn)移，表明RNA結(jié)合于3H-PreQ1并將其收納至槽b。當(dāng)無RNA或以缺乏形成P3莖能力的RNA(1_81RNA)平衡3H-PreQ1(1μΜ)時，3H標(biāo)記物平均地分布(b/a約1)。在以3H-PreQ1使17-90RNA平衡并確立放射性的非對稱分布時，向槽a添加過量未標(biāo)記的PreQ1可再次導(dǎo)致3H標(biāo)記物再分布。然而，添加過量未標(biāo)記的鳥嘌呤對3H的分布沒有影響，表明試驗濃度的鳥嘌呤不能與3H-PreQ1競爭17-90RNA中的配體結(jié)合位點。雖然在平衡透析過程中觀察到的趨勢與通過直讀探測觀察到的PreQ1-II適體的結(jié)合功能是一致的，但是3H標(biāo)記物轉(zhuǎn)移的程度不及預(yù)測的大。所使用的RNA濃度應(yīng)提供過量的3H-PreQ1結(jié)合位點，并且鑒于測量的適體對其配體的KD，應(yīng)已足夠以RNA飽和所有PreQ1分子。因此，當(dāng)平衡發(fā)生在不存在未標(biāo)記的PreQ1競爭劑的情況下時，b/a比率應(yīng)已是較大。為了進(jìn)一步檢查該差異，進(jìn)行實驗，將在以17-90RNA平衡后包含剩余未轉(zhuǎn)移3H-標(biāo)記材料的槽a內(nèi)含物轉(zhuǎn)移至一個新裝置的相對槽是新制備的17-90RNA樣品的槽a中，使兩個槽再平衡(圖18C)。如預(yù)測的，3H-標(biāo)記的材料在兩個槽之間均勻分布(圖18D)，表明3H未轉(zhuǎn)移部分的分子源不被所述RNA結(jié)合，它們不太可能是PreQ115從該分析估計僅大約25%的3H-標(biāo)記材料為PreQ1。與該結(jié)論一致的是對用于平衡透析的3H-標(biāo)記PreQ1樣品的純度分析結(jié)果。大約82%的3H標(biāo)記物源自溶劑，并且無其他UV吸收化合物存在于所述混合物中?？傊?，平衡透析實驗還表明了攜帶C0G4708RNA基序核心的RNA構(gòu)建體可作為PreQ1的選擇性適體發(fā)揮功能。v.17-90RNA對PreQ1的選擇性識別通過測量17-90RNA對一系列PreQ1類似物的結(jié)合親和力，確定了來自肺炎鏈球菌的PreQ1-II適體的分子識別決定物。為了評估對氨甲基基團(tuán)的識別，本發(fā)明人試驗了PreQ0(7-氰基-7-脫氮鳥嘌呤)、7_(N，N'-二甲基氨甲基)_7_脫氮鳥嘌呤和7-羧酰胺-7-脫氮鳥嘌呤。二甲基氨甲基類似物和PreQtl都呈現(xiàn)約500nM的Kd值，表明基本上沒有立體阻礙出現(xiàn)在烷基胺基團(tuán)的末端，及該基團(tuán)不可能作為氫鍵供體發(fā)揮功能(圖19A)。相反，對氨乙基基團(tuán)的多相互作用可能涉及氨基作為一個氫鍵受體。雖然不多見，但氨基的氮原子可(Luisietal.1998)在一些其他核酸結(jié)構(gòu)中作為氫鍵受體。如通過使用平衡透析觀察到的(圖18B)，17-90RNA可顯著區(qū)分鳥嘌呤(Kd約10μM)。鳥嘌呤類似物7-脫氮鳥嘌呤僅被以稍高的親和性結(jié)合，表明對PreQ1幾乎沒有選擇性是源于在第7位缺乏氮原子。在濃度高達(dá)ImM時缺乏7-甲基鳥嘌呤結(jié)合可能是由于在第9位缺乏氫鍵供體，而不是由于在第7位任何分子識別接觸的破壞。根據(jù)剩下的試驗嘌呤化合物，顯然，第2位的胺對配體結(jié)合是至關(guān)重要的(圖19Α)。2，6_二氨嘌呤(DAP)是僅有的這樣的化合物，即這種化合物缺乏鳥嘌呤樣Watson-Crick堿基配對邊緣，但保持被試驗濃度的RNA可測量地結(jié)合的能力。值得注意的是，在嘌呤環(huán)的第6位攜帶酮氧(ketooxygen)(鳥嘌呤)或胺(DAP)的化合物可得到幾乎相同的Kd值。然而，對于在第6位缺乏外環(huán)功能基團(tuán)而與鳥嘌呤和DAP不同的2-氨嘌呤沒有檢測到結(jié)合。因此，在第6位處鳥嘌呤的酮基和DAP的氨基似乎可等同地促進(jìn)分子識別。雖然有更復(fù)雜的可能性，但對該結(jié)果的最簡單解釋是在第6位處PreQ1的酮基和DAP胺的氮原子都作為氫鍵受體。對17-90RNA及其PreQ1配體產(chǎn)生的推定分子識別接觸的總結(jié)(圖19B)顯示了與針對PreQ1-I適體鑒定的分子識別接觸(Rothetal.2007)相比的差異。對第7位的氨甲基部分的識別基本上是不同的，這是因為7-二甲基氨甲基和7-羧甲基類似物對于兩個適體類的相對特異性是相反的。另外，PreQ1-I核糖開關(guān)可與鳥嘌呤形成更緊的相互作用，使得其對PreQ1的特異性比鳥嘌呤明顯低。與PreQ1-I核糖開關(guān)類似，在第2位的胺似乎對于17-90RNA的配體結(jié)合是至關(guān)重要的。然而，類似物結(jié)合數(shù)據(jù)表明，PreQ1-II適體不會形成與嘌呤環(huán)的m位置的接觸。這不同于被提出在配體和PreQ1-I適體之間形成的Watson-Crick堿基對(Rothetal.2007)。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，很清楚，PreQ1-II適體的特有的序列和結(jié)構(gòu)元件可折疊形成一個結(jié)合袋，它不同于由PreQ1-I適體形成的結(jié)合袋。vi.Watson-Crick堿基配對不大可能是配體識別的原因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)合鳥嘌呤和腺嘌呤的核糖開關(guān)使用經(jīng)典的Watson-Crick堿基對用于選擇性配體結(jié)合(Gilbertetal.2006；MandalandBreaker2004b；Bateyetal.2004；Serganovetal.2004；Noeskeetal.2005)。嘌呤核糖開關(guān)適體的單個點突變足以在鳥嘌呤和腺嘌呤之間變換適體特異性(MandalandBreaker2004b)。類似地，核糖開關(guān)結(jié)合2'-脫氧鳥苷的特異性可被相似突變改變(Kimetal.2007)?？梢詫⒁环N類似機(jī)制用于PreQ1-I核糖開關(guān)適體中，此處保守的胞苷向尿苷的突變會將配體特異性從PreQ1變成DAP(Rothetal.2007)。為了評估17-90RNA是否使用一種相似的機(jī)制來促進(jìn)配體特異性，將唯一的普遍保守的非配對胞苷(C33)(圖15、圖16A)突變成尿苷。雖然在PreQ1-II適體中存在另外的嚴(yán)格保守胞苷殘基(C32和C51)，但是它們位于預(yù)測的堿基配對元件中，因此不可能與配體形成經(jīng)典的堿基對。然而已發(fā)現(xiàn)，在第33位攜帶U的突變RNA的表現(xiàn)與野生型RNA很類似，并表現(xiàn)出對preQ^々250nM的KD。因此，該殘基不可能與配體形成經(jīng)典的堿基對?？紤]到該RNA區(qū)在配體結(jié)合時不發(fā)生調(diào)變(圖16B、C)及Pl不是配體結(jié)合必需的，該結(jié)果并不在意料之外。核苷酸C41也被發(fā)現(xiàn)可作為與PreQ1形成堿基對的候選物。該核苷酸在所述適體保守核心的近端，并在在配體結(jié)合時發(fā)生調(diào)變(圖16)。在40個已知C0G4708RNA中僅發(fā)現(xiàn)一個代表物其中C41突變成U殘基(圖15)。在該位置攜帶C至U的改變的17-90RNA構(gòu)建體呈現(xiàn)出對PreQ1親和性損失兩個數(shù)量級(圖20A)，表明該殘基對于配體結(jié)合的確是重要的。然而，該突變體構(gòu)建體不發(fā)生特異性的改變，以有利于具有腺嘌呤堿基配對面的類似物。這些結(jié)果表明，C41也可能不與配體形成經(jīng)典的堿基對。雖然U41突變體對PreQ1W結(jié)合比野生型17-90RNA更弱，但是該突變體可與野生型基本相同的親和性結(jié)合DAP(圖20B)。相反，用U41突變體將不再能檢測到鳥嘌呤結(jié)合。這些結(jié)果表明，在第41位的核苷酸以與PreQ1-II適體的分子識別模型一致的方式與配體形成接觸(圖19B)。C41的外環(huán)氨基可向PreQ1的酮基貢獻(xiàn)一個氫，但在U41中代替該胺的所述酮基不能形成一個等效的氫鍵(圖20C)。因此，如觀察到的，所述突變體RNA應(yīng)比野生型RNA更弱地結(jié)合PreQ1(圖20A)。相反，C41的外環(huán)氨基可向DAP第6位置處的外環(huán)胺的氮原子貢獻(xiàn)一個氫，以形成一個氫鍵。同樣，U41的相應(yīng)酮基可作為一個氫鍵受體，并使得可與DAP第6位置處的相同外環(huán)胺形成一個等價氫鍵(圖20C)。該排列可解釋為什么出現(xiàn)了C41和U41RNA對DAP結(jié)合呈幾乎相同的Kd值(圖20B)。2.結(jié)論P(yáng)reQ1是被多于一類天然適體識別的代謝物的第二實例。迄今為止已鑒定了4個不同的識別S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet或SAM)的適體類。SAM-I或S_box(Epshteinetal.2003；McDanieletal.2003；Winkleretal.2003)、SAM-II(Corbinoetal.2006)、SAM-III或SMK-盒(Fuchsetal.2006)以及SAM-IV(Weinbergetal.2007)經(jīng)常調(diào)節(jié)不同生物中的相同基因(例如SAM合酶、高絲氨酸0-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶)。第二天然？！“⑷工適體類的發(fā)現(xiàn)表明，SAM不是一個特例，并且另外的代謝物可被多種不同RNA結(jié)構(gòu)結(jié)合以在不同生物中控制相似組的基因。兩個PreQ1結(jié)合的RNA與被分類為C0G4708或DUF988的膜蛋白的關(guān)聯(lián)表明，該蛋白是Q核苷生物合成中間體的轉(zhuǎn)運(yùn)體。隨后已證明其基因與TPP核糖開關(guān)相關(guān)的功能未知的膜蛋白參與TPP和硫胺轉(zhuǎn)運(yùn)(Rodionovetal.2002；Winkleretal.2002；Schynsetal.2005)，顯示了通過對RNA基因控制元件的表征可如何獲得對蛋白功能的描述。同樣，由mRNA編碼的蛋白的功能信息可有助于確立相關(guān)核糖開關(guān)的配體種類。有意思的是，在許多細(xì)菌中有多個基因同源于那些與PreQ1生物合成或轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因，但這些基因還沒有確定的控制機(jī)制。因此猜測這些基因的mRNA可能攜帶其他的PreQ1核糖開關(guān)類。為了評估發(fā)現(xiàn)新PreQ1適體的可能性，在缺乏PreQ1-I和PreQ1-II適體且其基因組已經(jīng)被測序的生物中觀測了數(shù)個C0G4708基因上游的基因間區(qū)。C0G4708基因很窄地分布于細(xì)菌中，全部3個實例出現(xiàn)在芽孢桿菌綱和梭菌綱中(圖21)。一個實例C0G4708在Y-變形細(xì)菌(Rubrobacterxylanophilus)中，兩個實例出現(xiàn)在古生菌(依賴熱絲菌(Thermophilumpendens)和海生葡萄狀嗜熱菌(Staphylothermusmarinus))中。在46種情形的30種中，與C0G4708蛋白對應(yīng)的基因與PreQ1適體相關(guān)(圖21)。數(shù)種生物包含兩個拷貝的該基因，核糖開關(guān)一般僅與這些拷貝中的一個關(guān)聯(lián)，但在Alkaliphilusmetalliredigens中該基因的兩個拷貝都在一個PreQ1-I核糖開關(guān)之后。在C0G4708基因不與已知的PreQ1感知RNA相關(guān)的許多生物中，該ORF的鄰接上游的基因間區(qū)大于50個堿基對。該空間足夠一個RNA適體位于該mRNA的5‘UTR中。然而，這些區(qū)域一般顯示與任何其他序列很少至無可檢測的同源性，表明他們?nèi)狈Y(jié)構(gòu)化RNA或者它們不攜帶一個在許多其他細(xì)菌中具有同源性的適體。將直讀探測測定用于檢查熱醋穆爾氏菌、艱難梭菌、酒酒球菌、嗜熱地芽胞桿菌中編碼C0G4708蛋白的ORF上游的基因間區(qū)，以及嗜熱鏈球菌(Str印tococcusthermophilus)中兩個C0G4708拷貝上游基因間區(qū)。所試驗RNA在存在PreQ1的情況下沒有一個顯示結(jié)構(gòu)的調(diào)變，表明它們不包含PreQ1結(jié)合核糖開關(guān)。然而，不但包括體內(nèi)條件和體外條件之間的差異而且包括由外源5'或3'序列干涉引起的RNA錯誤折疊的數(shù)個不同因素可使直讀探測測定變得復(fù)雜。與大多數(shù)其他鑒定的核糖開關(guān)不同，PreQ1-II適體的分布很窄，主要出現(xiàn)在鏈球菌科的細(xì)菌中。這種窄分布是有先例的，如SAM-III也似乎局限在同組細(xì)菌中(Fuchsetal.2006)。3.材料和方法i.化學(xué)品和DNA寡核苷酸PreQ1,preQ0,7-(N,N'-二甲基氨甲基)_7_脫氮鳥嘌呤、7_羧酰胺_7_脫氮鳥嘌呤和7-氨甲基-7-脫氮腺嘌呤的化學(xué)合成在以前被描述(Rothetal.2007)。除非另外指出，否則其余嘌呤化合物和其他化學(xué)品購自Sigma-Aldrich。3H-PreQ1的獲得如前所述(Hurtetal.2007)。合成的DNA由Sigma-Genosys制備。ii.RNA制備從肺炎鏈球菌R6將對應(yīng)于PreQ1-II(Cog4708RNA)基序的編碼C0G4708的基因5'UTR部分PCR擴(kuò)增，使用的是以下引物5'-GGAATTCAACAAGTCTAACAGAAAAGTAGAAAGGCGGGC-3‘(SEQIDNO:1)和5'-TTTTGTCATTTTTTCTCCTTTAACGTCTGGATAACTCTCAAAAGC-3‘(SEQIDNO:2)。隨后使用Τ0Ρ0TA克隆試劑盒(Invitrogen)將所形成的雙鏈DNA克隆至pCR2.1中。將質(zhì)粒插入物測序(耶魯大學(xué)的W.M.Keck基金生物技術(shù)資源中心)，并用作這樣的DNA片段的PCR擴(kuò)增的模板，即該DNA片段編碼之前有T7啟動子序列的所需RNA并包括兩個鳥苷殘基以提高轉(zhuǎn)錄效率。使用PCR的突變體引物將破壞突變及補(bǔ)償突變引入至PCR產(chǎn)物中。使用T7RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物，并使用類似于別處描述的方法(Seetharamanetal.2001)通過變性6%PAGE純化所形成的RNA?；诨蚪M序列從合成寡核苷酸的組通過PCR(DillonandROSenl990)構(gòu)建了對應(yīng)于從嗜熱鏈球菌描述的構(gòu)建體的DNA片段。使用各自的基因組DNA及在合適位置包含T7啟動子序列的引物，通過PCR擴(kuò)增了對應(yīng)于來自熱醋穆爾氏菌、酒酒球菌(PSU-I)、艱難梭菌、嗜熱地芽胞桿菌中編碼C0G4708蛋白的基因上游基因間區(qū)的DNA片段。酒酒球菌和艱難梭菌基因組DNA樣品獲自ATCC。通過如上述的體外轉(zhuǎn)錄制備RNA分子。iii.直讀探測測定將通過體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA分子使用堿性磷酸酶(RocheDiagnostics)脫磷酸化，并使用[Y-32PJATP(GEBiosciences)和T4多核苷酸激酶(NewEnglandBiolabs)依照制造商的說明書放射性標(biāo)記。如上述通過PAGE純化5'32P-標(biāo)記的RNA。在有和無如以前描述的配體(SoukupandBreaker,1999)時，安排包含約InM的5'32P-標(biāo)記的RNA的直讀探測反應(yīng)。在25°C下將包含50mMTris-HCl(23°C下，pH8.3)、20mMMgCl2和IOOmMKCl的反應(yīng)混合物孵育大約40小時。對于源自熱醋穆爾氏菌和嗜熱地芽胞桿菌的RNA，還分別將孵育在58°C下進(jìn)行30分鐘和在60°C下進(jìn)行15分鐘。通過變性10%PAGE分離樣品，并使用MolecularDynamicsPhosphorImager禾口ImageQuaNT軟件進(jìn)亍成像禾口定量。使用一系列配體濃度通過進(jìn)行直讀探測測定確定Kd值。在每個配體濃度下對每個分析計算在指定的位點切割的RNA的標(biāo)準(zhǔn)化分?jǐn)?shù)，并對這些點擬合標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合曲線。所檢查的多數(shù)化合物的濃度在InM和ImM之間變化，例外的有PreQ1、鳥嘌呤、7-羧酰胺-7-脫氮鳥嘌呤、7-氨甲基-7-脫氮腺嘌呤，它們的試驗的最高濃度分別是100μΜ、100μΜ、10μM禾口30μΜ。iv.平衡透析將包含50mMTris-HCl(23°C下，pH8.3)、20mMMgCl2、IOOmMKCl和1μM的3H-標(biāo)idPreQ1^30μ1混合物置于DispoEquilibrium透析儀(ED_l，HarvardBioscience)的一個槽中，并將包含相同組分減3H-標(biāo)記PreQ1的相同體積添加至對側(cè)中。注意，后一種溶液還包含5μΜ17-90RNA或5μΜ1-81RNA。在平衡14小時后，從該裝置的每一側(cè)取出5μ1的整分試樣，以通過液體閃爍計數(shù)確定3H標(biāo)記物在兩個槽中的分布。對于競爭結(jié)合實驗，將上述包含ImM未標(biāo)記化合物的3μL緩沖混合物添加至無RNA的槽中，并將相同體積的緩沖物添加至含RNA的槽中。使這些槽再平衡8小時，然后如上述再次評估3H標(biāo)記物的分布。3H-標(biāo)記PreQ1的HPLC顯示了與PreQ1—致的單UV活動峰。為了評估這里3H標(biāo)記物未整合至最初的PreQ1中，將40μL整分試樣的3H-PreQ1溶液(約2mM)與8mg的脫色碳和200yL水混合。隨后通過離心分離所述漿體，將上清液取出并過濾(0.22微米)。上清液的HPLC分析顯示在水部分中不存在PreQ1，表明碳已完全吸收雜環(huán)。通過液體閃爍計數(shù)測量存在于上清液部分中的氚和殘?zhí)贾怠.生物信息學(xué)在RefSeq25(Pruittetal.2007)上進(jìn)行同源性搜索，并如以前的描述(Weinbergetal.2007)確定C0G4708RNA基序共有序列。通過PFAM數(shù)據(jù)庫(發(fā)布版本22.0)(Finnetal.2006)鑒定了C0G4708(DUF988)基因的實例。對來自數(shù)個生物的C0G4708蛋白序列相對于NCBI基因組數(shù)據(jù)庫的BLAST搜索沒有得到任何另外的序列。實例限于完全測序的基因組，并確定了PreQ1-I或PreQ1-II核糖開關(guān)是否存在于編碼C0G4708蛋白的ORF上游的基因間區(qū)。將相同物種的高度相似株或分離株從列表除去，以減少冗余度。E.實施例5—種廣泛存在的可控制參與鉬輔因子和鎢輔因子代謝的細(xì)菌基因的核糖開關(guān)的候選物已經(jīng)鑒定了一種高度保守的RNA基序，該RNA基序位于編碼鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體、鉬輔因子(Moco)生物合成酶和利用Moco作為輔酶的蛋白的基因的上游。生物信息學(xué)搜索已經(jīng)在Y-變形細(xì)菌、S-變形細(xì)菌、梭菌、放線菌門、恐球菌-棲熱菌(Deinococcus-Thermus)種和來自環(huán)境樣品的DNA中鑒定了176個代表物。使用基因測定已證明，在大腸桿菌中與Moco生物合成操縱子有關(guān)的MocoRNA在對Moco生成產(chǎn)生應(yīng)答時可控制基因表達(dá)。另外，已經(jīng)提供了證據(jù)表明該保守RNA可區(qū)分Moco的緊密相關(guān)類似物。這些結(jié)果與廣泛的系統(tǒng)發(fā)生保守性和接近一些實例的典型基因控制結(jié)構(gòu)一塊表明了，該結(jié)構(gòu)化RNA的代表物可代表一個可感知Moco的核糖開關(guān)的新類。此外，已經(jīng)鑒定了可能會被相關(guān)鎢輔因子(Tuco)觸發(fā)的這種RNA的變體，它攜帶鎢代替鉬作為金屬組分。核糖開關(guān)是可選擇性結(jié)合代謝物或金屬離子并且作為基因控制元件發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)化RNA結(jié)構(gòu)域(MandalandBreaker,2004；SoukupandSoukup,2004；WinklerandBreaker,2005；Winkler，2005)。核糖開關(guān)通常出現(xiàn)于真細(xì)菌mRNA非翻譯區(qū)，一般通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延長或翻譯起始對基因表達(dá)實施控制(BreakerandBarrick，2007)。除幾個例外(ffinkleretal.,2004；Baricketal.,2004)之外，核糖開關(guān)由兩個模塊區(qū)——一個適體結(jié)構(gòu)域和一個表達(dá)平臺組成。所述適體可形成靶代謝物的選擇性結(jié)合袋，并且該結(jié)合事件可變構(gòu)地調(diào)節(jié)鄰接表達(dá)平臺的折疊，以控制基因表達(dá)。甚至在從遠(yuǎn)親緣生物鑒定的代表物(BreakerandBarrick,2007)中，每個核糖開關(guān)類的代謝物結(jié)合袋在序列和結(jié)構(gòu)上仍是高度保守的。核糖開關(guān)為使用生物信息學(xué)搜索進(jìn)行發(fā)現(xiàn)研究的優(yōu)良靶。例如，CMfinder比較基因組流程(Yaoetal.，2007；Weinbergetal.，2007)代表了一種用于鑒定新的功能性RNA元件的生物信息學(xué)方法。它可鑒定同源基因的推定5'非翻譯區(qū)(5'UTR)，隨后檢查這些區(qū)域在來自不同生物的UTR中序列和二級結(jié)構(gòu)保守的證據(jù)。將序列和結(jié)構(gòu)保守的模式用于鑒定另外的同源性，對初始預(yù)測的基序進(jìn)行精揀。CMfinder流程已鑒定了大量有希望的核糖開關(guān)候選物，所述候選物最近已經(jīng)被證實(Wangetal.，2008)或者有待于被驗證。一種被報道的新基序是一種大且復(fù)雜的RNA結(jié)構(gòu)域，通常出現(xiàn)在編碼參與鉬輔因子(Moco)代謝的蛋白的開放閱讀框(ORF)上游(Weinbergetal.，2007)。Moco是一種與一個鉬(Mo)原子配位的三環(huán)吡喃蝶呤(Schwartz，2005;Baughetal.，1998)，鉬是一種在元素周期表中位于與鉻和鎢同一列的過渡金屬。在生物合成后，Moeo被插入至Mo依賴的酶的活性位點，該酶利用Mo的氧化還原活性以在碳、氮和硫代謝循環(huán)中催化關(guān)鍵反應(yīng)(Baughetal.，1998)。已經(jīng)在包括Y-變形細(xì)菌、δ-變形細(xì)菌、梭菌、放線菌門和恐球菌-棲熱菌廣大真細(xì)菌種中以及在環(huán)境序列中鑒定了該基序的176個實例(Weinbergetal.，2007)。該基序顯示了典型的代謝物感知核糖開關(guān)的特征，包括廣泛的序列保守、預(yù)測的堿基配對元件中的核苷酸相關(guān)變異的跡象和混有保守非配對核苷酸的堿基配對元件的精細(xì)集合。本文提供的證據(jù)是，來自大腸桿菌的代表性MocoRNA可選擇性地感知Moco，并對該輔酶水平改變有響應(yīng)而控制相鄰基因的表達(dá)。此外，已經(jīng)表明MocoRNA涉及Moco和緊密相關(guān)類似物Tuco之間的調(diào)節(jié)性區(qū)分，因此提供了進(jìn)一步的證據(jù)，即Moco可被由MocoRNA形成的適體特異地識別。這些實驗結(jié)果與某些RNA變體和輔酶代謝特征之間的相關(guān)性一塊表明，該結(jié)構(gòu)化RNA類可包括特殊的Moco感知核糖開關(guān)和Tuco感知核糖開關(guān)。1.結(jié)果和討論i.Moco基序廣泛存在且高度保守當(dāng)將比較基因組流程(Yaoetal.，2007)用于檢查Y_變形細(xì)菌中編碼鉬輔因子生物合成蛋白A的基因的UTR時，鑒定了一種呈現(xiàn)相關(guān)變異和暗示結(jié)構(gòu)化RNA的其他特征的基序(Weinbergetal.，2007)。這些搜索致使在變形細(xì)菌、變形細(xì)菌、梭菌、放線菌門、恐球菌-棲熱菌種和環(huán)境DNA序列中鑒定了該基序(被稱為“MocoRNA”)的176個實例。以推定的共有結(jié)構(gòu)為指導(dǎo)，使用RALEE(Griffiths-Jones，2005)通過人工比對比較了這些序列。該比對顯示在該基序的中心多莖連接部位附近的序列保守性最高(圖22)，所述基序攜帶的大多數(shù)核苷酸呈現(xiàn)75%至100%的序列保守性。多至5種堿基配對元件(標(biāo)記為P1至P5)可形成MocoRNA的二級結(jié)構(gòu)構(gòu)架。在該保守二級結(jié)構(gòu)中的是分別出現(xiàn)在P4遠(yuǎn)端和P2凸出物中心的一個GNRA四元環(huán)(HeusandPardi,1991)和一個四元環(huán)受體(CostaandMichel，1995)。所述四元環(huán)序列在全部5種MocoRNA中都是GAAA。然而，全部四種攜帶GCAA四元環(huán)的MocoRNA缺乏受體，而僅兩種具有GAAA四元環(huán)的MocoRNA缺乏受體。對于另一種稱作GEMM基序的新發(fā)現(xiàn)的RNA基序的代表物，以前觀察到了一種類似的關(guān)聯(lián)(Weinbergetal.，2007)。根據(jù)是否存在P3莖可將Moco基序的代表物分類成兩組。對所有已知代表物的比對揭示了一個高度保守的表觀適體區(qū)，其后的序列似乎可形成不同類型的表達(dá)平臺，所述表達(dá)平臺是典型的已知代謝物感知核糖開關(guān)。例如，moaABCDE操縱子上游的大腸桿菌MocoRNA的可能的表達(dá)平臺(圖23a)似乎在形成P1莖的核苷酸中包含下游開放閱讀框(0RF)的核糖體結(jié)合位點。該排列可表明，適體結(jié)構(gòu)域的配體結(jié)合可抑制基因表達(dá)。還存在這樣的實例，即其中所述推定適體結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)在與細(xì)菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄終止子的預(yù)測序列和結(jié)構(gòu)一致的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的上游(GusarovandNudler,1999；YarnellandRoberts，1999)。而且，一些生物攜帶超過一個MocoRNA代表物，并且兩種類型的表達(dá)平臺出現(xiàn)在同一生物中。雖然大多數(shù)生物每個基因組攜帶一個MocoRNA代表物，但是其基因組被完全測序的一些生物具有多至4例或5例該基序。攜帶最大數(shù)目的MocoRNA代表物的是Desulfitobacteriumhafniense(有8禾中形式)禾口沃而夫氏]！[營單胞菌(Syntrophomonaswolfei)(至少有15種形式)。有趣地是，串聯(lián)排列的MocoRNA基序存在于沃而夫氏互營單胞菌和金屬還原地桿菌(Geobactermetallireducens)中。雖然不多見，但是串聯(lián)排列的核糖開關(guān)或它們的子結(jié)構(gòu)域已在其他的代謝物感知核糖開關(guān)類中被鑒定(MandalandBreaker，2004；Famulok，2004；Sudarsanetal.，2006；StoddardandBatey,2006)。這些更復(fù)雜的構(gòu)架可被核糖開關(guān)用來實現(xiàn)更復(fù)雜的功能例如對多信號傳遞輸入響應(yīng)的能力(Sudarsanetal.，2006)，或者對更小的配體濃度變化更敏感(MandalandBreaker,2004；WelzandBreaker，2007)。沃而夫氏互營單胞菌中的一個操縱子攜帶了連續(xù)的3個MocoRNA。ii.Moco基序與Moco生物合成基因關(guān)聯(lián)大多數(shù)已知的核糖開關(guān)順式地發(fā)揮功能，以對它們的同源配體的結(jié)合響應(yīng)從而調(diào)節(jié)近端基因的表達(dá)。被所述核糖開關(guān)適體感知的配體一般是由受控mRNA編碼的一種或多種酶催化的途徑的終產(chǎn)物。或者，小分子配體有時被需要作為其表達(dá)受核糖開關(guān)控制的基87因產(chǎn)物的輔因子或底物。因為核糖開關(guān)通常應(yīng)用順式調(diào)節(jié)機(jī)制，所以由位于核糖開關(guān)下游的基因編碼的蛋白的功能可提供許多有關(guān)配體種類的信息。在確立MocoRNA的功能的嘗試中，考慮了攜帶該保守RNA代表物的鄰接基因組位置的基因的功能。在變形細(xì)菌(包括大腸桿菌)中，該基序出現(xiàn)在moaABCDE操縱子上游(圖23a)，moaABCDE操縱子編碼負(fù)責(zé)鉬喋呤(MPT)生物合成的蛋白(Schwarz，2005)。在一些細(xì)菌中，代表物還位于modABC上游，modABC編碼高親和性鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體復(fù)合體(GrundenandShanmugam,1997)。有Y-變形細(xì)菌的3個種(睡眠嗜血桿菌、杜克雷嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌血清變種1)，其Moco基序同時位于鉬喋呤生物合成操縱子上游和預(yù)測編碼鉬喋呤氧化還原酶的基因上游。Moco基序還出現(xiàn)于不同排列的Moco生物合成酶基因、高親和性鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因及使用Moco來催化反應(yīng)的酶基因的上游。一般而言，這些基因組前后序列將Moco或該輔因子的生物合成中間體指向為該核糖開關(guān)候選物的可能的配體。數(shù)個已知的核糖開關(guān)類感知并響應(yīng)其他共同的輔酶，因此Moco被看作是該核糖開關(guān)候選物的最有可能的配體。鉬輔因子生物合成是一種復(fù)雜且古老的通路，它從真細(xì)菌至人保守。僅有的不需要鉬或Moco的生物利用鎢和類似輔酶Tuco來替代(Schwarz，2005)。在大腸桿菌中，有5個已知操縱子參與Moco代i射moa、mob、mod、moe禾口mog(Shanmugametal.,1999),它們編碼共15種蛋白。Moco生物合成的最初兩個步驟由moa操縱子編碼的基因催化(圖23b)。具體地，在由S-腺苷甲硫氨酸依賴的酶MoaA和未表征的同源六聚體MoaC催化的反應(yīng)中，鳥苷-5’-三磷酸(GTP)被轉(zhuǎn)化成環(huán)吡喃蝶呤單磷酸(cPMP)(ffuebbensandRajagopalan,1995)。cPMP有不到1小時的半衰期，它是最穩(wěn)定的Moco生物合成中間體(Santamaria-Araugoetal.，2004)。然后，由MoaD和MoaE形成的異源四聚體MPT合酶復(fù)合體可催化向cPMP轉(zhuǎn)移兩個硫原子，形成MPT二硫醇鹽(Pitterleetal.，1993)。隨后通過mogA和moeA的產(chǎn)物從MPT合成Moco，這經(jīng)過涉及MPT腺苷化及Mo插入以形成鉬輔因子的一系列獨立步驟(NicholsandRajagopalan，2002)。在大腸桿菌中，Moco可被MobA進(jìn)一步修飾成二鉬喋呤鳥嘌呤二核苷酸輔因子(二MGD)(Lakeetal.，2000)。二MGD然后被插入至包含鉬的酶中。在其他真細(xì)菌中，可修飾Moco以得到也可用作輔酶的其他衍生物(Schwarz，2005)。所有以上提及的Moco生物合成基因，以及編碼將Moco或其衍生物用作輔酶的酶的數(shù)個基因，都至少在一些細(xì)菌中與MocoRNA基序有關(guān)聯(lián)(圖23b)。iii.MocoRNA的結(jié)構(gòu)特征的生物化學(xué)分析考慮到Moco及其生物合成中間體的化學(xué)不穩(wěn)定性，在體外測試這些化合物的直接結(jié)合相互作用是不現(xiàn)實的。因此，進(jìn)行了一系列生物化學(xué)實驗和遺傳實驗，以確定來自大腸桿菌的MocoRNA是否具有與核糖開關(guān)功能一致的特征。為了評估對該MocoRNA代表物提出的結(jié)構(gòu)模型，138核苷酸的RNA構(gòu)建體(被稱為138moaA,Fig.24a)包含Moco基序，從堿基配對PI元件5'起始的上游9個核苷酸伸出至P1的3'端之外10個核苷酸。138moaA包含一個P3莖(它在一些代表物中不存在)、預(yù)測的核糖體結(jié)合位點和moaA0RF的AUG翻譯起始密碼子。該RNA在5'末端還攜帶2個另外的G殘基，以有利于通過體外轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)生。用痕量的5'32P-標(biāo)記的138moaARNA進(jìn)行直讀探測分析(SoukupandBreaker,1999)，這利用了由RNA結(jié)構(gòu)差異造成的不同核苷酸間鍵的自發(fā)切割頻率的差異，以鑒定結(jié)構(gòu)剛性和柔性的區(qū)域。在通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離時，在直讀探測過程中生成的RNA切割產(chǎn)物所形成的模式(圖24b)與基于比較序列分析預(yù)測的大多數(shù)主要二級結(jié)構(gòu)特征(圖22)是一致的。具體地，呈現(xiàn)高水平自發(fā)磷酸酯轉(zhuǎn)移的大多數(shù)位點局限于莖P3和P5的環(huán)，還聚簇于在預(yù)測的堿基配對莖之間進(jìn)行橋聯(lián)的連接部位。然而，自發(fā)切割的模式與對P2莖大部提出的二級結(jié)構(gòu)是不一致的。雖然該莖可具有兩個可能呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)柔性的內(nèi)凸起，但是所觀測的一些RNA片段是在可被堿基配對的核苷酸處進(jìn)行切割的結(jié)果。這些直讀探測結(jié)果表明，P2莖和攜帶數(shù)個高度保守核苷酸的連接部位可能發(fā)生一個構(gòu)象變化，以形成一個配體結(jié)合袋。這與其他已知的核糖開關(guān)適體的表現(xiàn)是一致的，通過直讀探測測定發(fā)現(xiàn)這些其他核糖開關(guān)適體的一些在加入靶代謝物時會發(fā)生實質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化(Nahvietal.，2002；Winkleretal.，2002；Mandaletal.,2003)。iv.MoeoRNA作為基因控制元件發(fā)揮功能在大腸桿菌中，已知有兩個啟動子位點和伴隨蛋白因子結(jié)合位點調(diào)節(jié)moa操縱子的轉(zhuǎn)錄(圖23a)。S2啟動子位點依賴于厭氧的蛋白轉(zhuǎn)錄因子Fnr(Andersonetal.，2000；SpiroandGuest，1990)。該操縱子對厭氧條件響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄上調(diào)可使得Moco的生物合成增加，參與厭氧呼吸的某些蛋白需要Moco用作輔酶。moa操縱子的S1啟動子位點可被鉬酸鹽結(jié)合的ModE(Andersonetal.，2000)激活，鉬酸鹽結(jié)合的ModE是一種在細(xì)胞中結(jié)合鉬酸鹽的轉(zhuǎn)錄因子，并可上調(diào)modAB⑶操縱子的轉(zhuǎn)錄(Grudenetal.，1999)。這確保了在細(xì)胞內(nèi)可獲得足夠的鉬酸鹽以合成Moco。另外，雖然有moa操縱子中的一些基因受銅應(yīng)答性因子CueR控制的證據(jù)(YamamotoandIshihama,2005)，但是對CueR預(yù)測的結(jié)合位點出現(xiàn)在Moco元件的下游。除了該多層次轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)之外，還已知的是，在S1啟動子和moaA起始密碼子之間131-nt的伸出物促成了一個第三調(diào)節(jié)體系(Andersonetal.,2000)0具體地，該區(qū)域的存在使得細(xì)胞中存在Moco時moa操縱子被抑制(Andersonetal.,2000；BakerandBoxer,1991)。Fnr和ModE轉(zhuǎn)錄因子在大腸桿菌中對moa操縱子表達(dá)的作用僅出現(xiàn)在當(dāng)該5'非翻譯區(qū)(UTR)部分被缺失之時。引人注意的是，該131-nt區(qū)明確地包含MocoRNA基序。再者，沒有鑒定到作用于該DNA部分或相應(yīng)RNA轉(zhuǎn)錄物的蛋白調(diào)節(jié)因子，保留了該mRNA部分可能作為Moco的直接感受器的可能性。MocoRNA的構(gòu)架特征與大腸桿菌moa操縱子的已知基因控制特征一塊表明了MocoRNA代表物是代謝物感知核糖開關(guān)。為了確認(rèn)MocoRNA作為一種基因控制元件發(fā)揮功能，用PCR擴(kuò)增對應(yīng)于野生型moaA5'UTR的大腸桿菌基因組部分。該基因組段編碼一個這樣的149核苷酸RNA(被稱為149moaA)，即該RNA從P1的5'起始處上游9_nt開始且在P1的3'端之外延伸21-nt至moaA編碼區(qū)。同時，生成了表達(dá)149moaARNA的兩個突變體DNA，在P3莖中具有破壞(Ml)堿基配對及之后恢復(fù)(M2)堿基配對的突變(圖25a)。將這些序列克隆至翻譯融合質(zhì)粒中，在0-半乳糖苷酶報告基因上游并與它在相同閱讀框內(nèi)。將該融合物置于組成活性的lacUV5啟動子控制下，以消除天然限制moaA操縱子表達(dá)的厭氧及鉬酸鹽依賴的上游啟動子調(diào)節(jié)的作用。將這些質(zhì)粒系列置于其中所述moaA基因被缺失的大腸桿菌株中。將所形成轉(zhuǎn)化體以包含受控于阿拉伯糖誘導(dǎo)型及葡萄糖抑制型啟動子的moaAB⑶E操縱子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(Guzmanetal.，1995)。這些雙轉(zhuǎn)化株使得本發(fā)明人能夠在Moco濃度高或低時確定149moaARNA對報告基因表達(dá)的作用。當(dāng)在存在阿拉伯糖的情況下培養(yǎng)時，攜帶野生型149moaA構(gòu)建體(WT)的細(xì)胞呈現(xiàn)了較低的0-半乳糖苷酶基因表達(dá)(預(yù)測Moco濃度升高)(圖25b)。相反，當(dāng)在存在葡萄糖的情況下培養(yǎng)時，具有WT構(gòu)建體的細(xì)胞的報告基因的表達(dá)呈現(xiàn)超過3倍的升高(預(yù)測Moco濃度降低)。該結(jié)果表明MocoRNA元件可抑制基因表達(dá)最可能通過對Moco生物合成通路中的小分子產(chǎn)物的響應(yīng)實現(xiàn)。該MocoRNA作為基因“關(guān)閉”開關(guān)的功能與通過生物信息學(xué)預(yù)測的機(jī)制是一致的。通過在P3莖中引入突變(Ml)破壞MocoRNA的保守二級結(jié)構(gòu)可造成基因表達(dá)的脫抑制。相反，使用恢復(fù)堿基配對的另外的突變(M2)改變P3序列也可對阿拉伯糖誘導(dǎo)的Moco生物合成恢復(fù)基因表達(dá)。這些變體呈現(xiàn)的基因控制的破壞及恢復(fù)成野生型報告基因表達(dá)水平表明了MocoRNA是一種活性需要其保守二級結(jié)構(gòu)的基因控制元件。v.鉬轉(zhuǎn)運(yùn)會影響MocoRNA的基因控制功能鉬酸鹽經(jīng)mod操縱子編碼的高親和性蛋白依賴的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)至大腸桿菌細(xì)胞(GrundenandShanmugam,1997；Maupin-Furlowetal.，1995)。在未補(bǔ)充鉬酸鹽的培養(yǎng)基中，估計野生型大腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)鉬酸鹽濃度為l.OyM，而在鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體缺陷株中的細(xì)胞內(nèi)鉬酸鹽濃度據(jù)估計為0.2iiM(ScottandAmy，1989)。然而，這種鉬酸鹽不足及其引起的不利效應(yīng)可通過向培養(yǎng)基中添加鉬酸鈉克服。在細(xì)胞外高鉬酸鈉濃度下，硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體系能夠輸入鉬酸鹽，使野生型和鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體缺陷株的細(xì)胞內(nèi)鉬酸鹽濃度達(dá)至大約5uM(ScottandAmy,1989；Rosenteletal.,1995)。為了確定鉬酸鹽對于149moaARNA的基因調(diào)節(jié)是否是至關(guān)重要的，制備了大腸桿菌的modC敲除株以消除高親和性鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。然后將該株以moaAB⑶E誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒以及野生型和突變149moaA報告物融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。當(dāng)在包含痕量鉬酸鹽的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(SambrookandRussell,2001)上培養(yǎng)時，modC的缺失可造成WT149moaA報告物融合物呈現(xiàn)高水平的基因表達(dá)(圖25c)。相反，當(dāng)相同的株培養(yǎng)于補(bǔ)充10mM鉬酸鈉的LB中時，表達(dá)被抑制至類似于攜帶功能性ModC的轉(zhuǎn)化體的水平。這表明，除非在細(xì)胞中可獲得適當(dāng)量的鉬酸鹽，否則存在的經(jīng)MocoRNA觸發(fā)基因遏制所需的分子濃度是不足的。有意思的是，當(dāng)細(xì)胞在補(bǔ)充10mM鎢酸鈉的LB中培養(yǎng)時，攜帶modC缺失的轉(zhuǎn)化體中的野生型149moaA報告物融合構(gòu)建體變成被脫抑制。如上文指出的，鎢可進(jìn)入細(xì)胞并代替鉬作為所述輔因子的金屬離子組件。然而，如果149moaARNA作為代謝物感知核糖開關(guān)發(fā)揮功能(例如Moco)，它有能力在與鉬配位的化合物及與鎢配位的類似化合物之間進(jìn)行區(qū)分。在所有情況中，攜帶破壞(Ml)突變和補(bǔ)償(M2)突變的報告物融合構(gòu)建物產(chǎn)生了預(yù)測的基因表達(dá)譜。vi.生物合成基因中的突變表明Moco是調(diào)節(jié)配體基于以上的結(jié)果，Moco被推測是可被MocoRNA直接感知的調(diào)節(jié)因子。為了進(jìn)一步提供Moco生物合成通路中的具體化合物負(fù)責(zé)基因表達(dá)控制的證據(jù)，對該通路中的多種基因進(jìn)行了敲出突變。除了先前檢查過moaA敲除之外(圖25b)，制備了mogA、modC或moeA被敲除的株(A)，并以moaAB⑶E誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒和野生型149moaA報告物融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。不論是否有moaAB⑶E表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)，AmogA、AmodC和AmoeA敲除株都呈現(xiàn)出脫抑制(圖26)。這些結(jié)果表明，這3種蛋白對于小分子信號的產(chǎn)生是必要的，并且moa操縱子的誘導(dǎo)不能補(bǔ)償這些蛋白的缺失。AmodC株的基因表達(dá)特征類似于以前觀測的特征(圖25c)，這證明了鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)是形成信號傳遞化合物所需的。然而，AmoeA株的特征表明僅鉬酸鹽不可能為所述信號傳遞化合物。MoeA催化鉬插入至鉬喋呤(Moco生物合成通路的最后步驟)，并且該活性是149moaARNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)所需的。對于大量的核糖開關(guān)類，核糖開關(guān)適體感知的配體是被調(diào)節(jié)的生物合成通路中最后的輔酶或代謝產(chǎn)物(WinklerandBreaker，2005)。Moco是一種在生命所有結(jié)構(gòu)域中廣泛存在的化合物，而一些細(xì)菌生成可插入至Mo依賴酶的活性位點中的Moco衍生物。Moco是該核糖開關(guān)類的最合邏輯的配體。在大腸桿菌中，在Moco可以插入至一個蛋白之前，它必須被MobA進(jìn)一步修飾(Iobbi-Nivoletal.，1995Johnsonetal.，1991)。然后，所產(chǎn)生的二MGD形式的Moco(圖23b)可插入至鉬蛋白(molybdoprotein)中。為了確定Moco的衍生物是否可能為核糖開關(guān)配體，如上所述構(gòu)建AmobA株并評估它對報告基因表達(dá)的作用。當(dāng)在含葡萄糖的LB中培養(yǎng)的時候，會出現(xiàn)如在所有其他轉(zhuǎn)化體中的同樣的脫抑制(圖26)。然而，當(dāng)細(xì)胞被培養(yǎng)在補(bǔ)充有阿拉伯糖的LB中時，對所述報告物融合構(gòu)建體的抑制會恢復(fù)。甚至在無MobA的情況下，細(xì)胞能夠產(chǎn)生對于抑制受moaA149RNA控制的基因表達(dá)所需的小分子。這些結(jié)果與Moco是負(fù)責(zé)MocoRNA依賴的基因調(diào)節(jié)的小分子是一致的。vii.MocoRNA可區(qū)分Moco和Tuco的證據(jù)核糖開關(guān)由于其分辨生物合成通路中密切有關(guān)的中間體的能力而為人所知。梭菌的種及數(shù)個嗜熱古細(xì)菌種將鎢而非鉬整合至鉬喋呤中，致使密切相關(guān)的化合物Tuco形成(Johnsonetal.，1993)。Mo和W的原子半徑和離子半徑基本相同，它們的電子親和力也基本相同(KletzinandAdams,1996)。對本研究重要的是，已經(jīng)證明(Bucetal.，1999)大腸桿菌能夠?qū)整合至最終的W-二MGD輔因子中，然后將該輔因子插入至三甲胺N-氧化物還原酶中。在以前的研究(Andersonetal.,2000)中，131-nt上游區(qū)對moaABCDE操縱子的明顯抑制出現(xiàn)在存在Moco的情況下，但它在存在Tuco的情況下脫抑制。該以前的結(jié)果與這些數(shù)據(jù)是一致的(圖25c)，這證明了攜帶MocoRNA-報告物融合構(gòu)建體的細(xì)胞不受在培養(yǎng)基中添加鎢酸鹽的影響。因此，MocoRNA可區(qū)分這兩種幾乎相同的輔因子。在檢查MocoRNA代表物的系統(tǒng)發(fā)生分布和序列比對后，逐漸清楚的是，有兩個主要的基序類型。在MocoRNA基序的176個實例中，58個缺乏P3莖。然而，該分組不是嚴(yán)格地沿系統(tǒng)發(fā)生的分類分開，這與識別相同配體的核糖開關(guān)適體的結(jié)構(gòu)變體繁多(propagation)i一至jl的。值得注意的是，兩個結(jié)構(gòu)類型的MocoRNA在細(xì)菌(表3)中呈現(xiàn)幾乎完全相當(dāng)?shù)腗oco和Tuco的利用，表明2個RNA類型使得可選擇性識別Moco或Tuco。通過編碼被預(yù)測使用或轉(zhuǎn)運(yùn)與這些輔因子相關(guān)的化合物的蛋白基因的存在情況，可試驗性地鑒定使用Moco或Tuco的生物。包含P3莖的MocoRNA僅與編碼合成鉬喋呤或Moco的蛋白的基因相關(guān)聯(lián)，并且還僅與編碼已知或預(yù)測使用Moco作為輔酶的酶的基因相關(guān)聯(lián)。相反，攜帶缺乏P3莖的MocoRNA代表物的19個生物中的17個還攜帶預(yù)示Tuco代謝的基因。再者，缺乏P3的RNA幾乎只與編碼與鉬喋呤生物合成(鉬喋呤是Tuco和Moco生物合成的前體)的酶的基因，或者與編碼已知或預(yù)測使用Tuco作為輔酶的酶的基因相關(guān)聯(lián)。Pelobactercarbinolicus顯然是按照Moco和Tuco代謝來加以分離的各MocoRNA類型的一個明顯例外，Pelobactercarbinolicus具有與預(yù)測鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)的缺乏P3的RNA(表3，注解a)。然而，該轉(zhuǎn)運(yùn)體類的成員不能區(qū)分鎢酸鹽，因此該生物中的該轉(zhuǎn)運(yùn)體對于Tuco生物合成實際上可能是重要的。甚至在攜帶MocoRNA的兩種結(jié)構(gòu)變異的生物中，基本上保持了包含P3及缺乏P3的RNA分別針對Moco和Tuco代謝過程的分離。兩個類型的MocoRNA的顯著分離可解釋為存在兩個差異為存在或不存在P3莖的MocoRNA類型，它們選擇性地分別感知Moco或Tuco。然而，已經(jīng)使大腸桿菌MocoRNA缺失P3莖，但該變化在所有試驗的生長條件下都完全地破壞了基因調(diào)節(jié)?？赏茰y地，僅該缺失不足以將MocoRNA的專一性從Moco轉(zhuǎn)換成Tuco。如上文指出的，RNA元件的三重排列存在于沃而夫氏互營單胞菌的一個表觀7基因操縱子中。該操縱子中的基因被預(yù)測編碼參與鉬喋呤合成、鉬酸鹽或鎢酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，及其他功能未知的基因。該系列中的所有3個RNA都缺乏P3莖。另外，推定的內(nèi)在轉(zhuǎn)錄終止子出現(xiàn)在前兩個RNA基序以及在第3基序和所述操縱子的第一0RF之間的長間隔之后。如果每個核糖開關(guān)實際上經(jīng)獨立的表達(dá)平臺發(fā)揮功能，并且如果不存在P3莖指示了Tuco結(jié)合，那么三重排列可使細(xì)胞對較小的Tuco濃度變化格外敏感，與以前描述的串聯(lián)核糖開關(guān)(WelzandBreaker,2007)相比具有更“數(shù)字化的”基因控制特征。2.結(jié)論在大腸桿菌中，ModE和FNR都可上調(diào)moaAB⑶E操縱子的轉(zhuǎn)錄。然而，該操縱子的翻譯在存在MocoRNA和Moco時被阻止。ModE和FNR調(diào)節(jié)確保了，moaAB⑶E轉(zhuǎn)錄物僅在細(xì)胞中存在需要(被FNR感知的厭氧培養(yǎng)條件)和允許(足以被ModE感知的鉬酸鹽水平)Moco產(chǎn)生的條件時生成。如果MocoRNA的確為核糖開關(guān)，那么它可增加另一層面的調(diào)節(jié)。Moeo感知核糖開關(guān)將確保，如果已存在有足夠水平的Moco——這通過游離Moco結(jié)合至moaAB⑶E轉(zhuǎn)錄物指示，那么就不會制造Moco生物合成蛋白。該體系使得能快速而有效地對細(xì)胞內(nèi)需求Moco的變化進(jìn)行響應(yīng)。本文給出的實驗數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)表明，與MocoRNA基序一致的RNA可作為Moco感知核糖開關(guān)適體或Tuco感知核糖開關(guān)適體。該RNA具有與核糖開關(guān)功能一致的基因組分布，且149moaARNA呈現(xiàn)了依賴于其二級結(jié)構(gòu)的基因控制功能。然而，Moco及其代謝中間體的不穩(wěn)定性使本發(fā)明人不能以通常使用的技術(shù)例如直讀探測、平衡透析或基于熒光的測定證明這些輔酶對RNA的直接結(jié)合。這些后述的實驗一般被用于證明配體結(jié)合出現(xiàn)在完全無蛋白因子的情況下。數(shù)組證據(jù)表明蛋白因子不參與代謝物感知及所述RNA作為一個直接感受器。以前的研究已經(jīng)鑒定了在大腸桿菌中調(diào)節(jié)Moco生物合成基因的應(yīng)答于氧和鉬酸鹽的蛋白因子(Andersonetal.,2000；SpiroandGuest,1990；Grudenetal.，1999)。然而，在該生物中對于位于moaA基因鄰接上游的的調(diào)節(jié)區(qū)沒有鑒定到因子。而且，MocoRNA代表物可被分類成兩個不同的構(gòu)架(有和無P3)，并且這些基序類型的分布與生物使用Moco和/或Tuco相關(guān)(表3)。如果RNA作為Moco和Tuco的直接感受器，那么這些結(jié)構(gòu)不同的RNA的這種分類可被預(yù)測。MocoRNA還與其他核糖開關(guān)代表物共有數(shù)種重要的特征。例如，在大腸桿菌中已知存在有另外4類的核糖開關(guān)適體對輔酶B12(Nahvietal.，2004)、硫胺素焦磷酸(Winkleretal.，2002a)、黃素單核苷酸(ffinkleretal.，2002b)和賴氨酸(Sudarsanetal.，2003)產(chǎn)生應(yīng)答。如用MocoRNA(Weinbergetal.，2007)—樣，這些核糖開關(guān)與RNA組成的非核糖開關(guān)基因控制元件(圖27)相比都較大，并且它們都具有高水平的核苷酸序列和結(jié)構(gòu)保守性(BarrickandBreaker，2007)。MocoRNA和來自大腸桿菌的已知核糖開關(guān)適體的大小都超過100個核苷酸，并攜帶這樣的4至6個莖，即這些莖呈現(xiàn)甚至在來自遠(yuǎn)親緣生物的代表物中保持堿基配對事件的核苷酸相關(guān)變異的跡象。來自大腸桿菌結(jié)合RNA的已知代謝調(diào)節(jié)蛋白例如CspA(PhadtareandInouye,1999)、BglG(Houmanetal.，1990)和其他(Liuetal.,1997；Torres-Lariosetal.，2002；Vecereketal.,2005；RichardsonandRichardson,1996；TangandGuest,1999)可識別小得多的RNA伸展區(qū)。如果在這些蛋白結(jié)合序列中存在任何的二級結(jié)構(gòu)，那么該二級結(jié)構(gòu)通常由單發(fā)夾組成。該趨勢的一個例外是ThrRSRNA元件(Torres-Lariosetal.，2002)，ThrRSRNA元件已形成一個有利于正常結(jié)合較大結(jié)構(gòu)化tRNA的氨?；鵷RNA合成酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)。與大多數(shù)結(jié)合蛋白的RNA基序不同，來自大腸桿菌moaARNA的MocoRNA跨138個核苷酸并形成至少5個保守的莖環(huán)元件。因此，與被蛋白因子結(jié)合的大多數(shù)RNA基因調(diào)節(jié)元件相比，MocoRNA的廣泛保守的大結(jié)構(gòu)更具有來自大腸桿菌的已知核糖開關(guān)RNA的特征。這些特征表明MocoRNA是新發(fā)現(xiàn)的代謝物感知核糖開關(guān)類的成員。3.實驗步驟i.寡核苷酸和化學(xué)品合成DNA由耶魯大學(xué)的HowardHughesMedicalInstituteKeck基金生物技術(shù)資源中心合成。如下化學(xué)品購自Sigma-Aldrich羧芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、甘油、鉬酸鈉和鎢酸鈉。ii.細(xì)菌株和培養(yǎng)基大腸桿菌株DJ480(MG1655AlacX74)(CabreraandJin,2001)獲自D.J.Jin(NationalInstitutesofHealth),NEB5aMM^i^NewEnglandBiolabs。于Wanner基因破壞組的質(zhì)粒(pKD46、pKD13和pCP20)(DatsenkoandWanner,2000)獲自耶魯大學(xué)的大腸桿菌遺傳原種中心。如指出的，對每個實驗的添加培養(yǎng)基補(bǔ)充物羧芐青霉素，50iigmL—1；氯霉素，5iigmL—1；卡那霉素，50iigmL—1;L-阿拉伯糖，0.2%(w/v)；D-葡萄糖，0.2%(w/v)在添加阿拉伯糖的時候?qū)?.2%甘油(w/v)添加至培養(yǎng)基(Guzmanetal.，1995)。iii.MocoRNA的制備使用通過連續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的模板通過體外轉(zhuǎn)錄制備用于直讀探測的138moaARNA構(gòu)建體。通過PCR從大腸桿菌K12基因組DNA擴(kuò)增moaA上游的基因間區(qū)，使用的引物為5'-GAATTCCCTGGAGTCAGATTATCCGC(SEQIDN0:4)和5'-CTGGATCCAGTTGTGAAGCCATGTACAC(SEQIDNO:5)。在經(jīng)EcoRI和BamHI消化后，將PCR產(chǎn)物克隆至pRS414中，并通過DNA測序確認(rèn)所形成質(zhì)粒的完整性。將該質(zhì)粒用作模板對編碼138moaA構(gòu)建體(包括對應(yīng)于RNA轉(zhuǎn)錄物的5'末端的GG插入)的DNA構(gòu)建體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中用于非模板鏈的引物包括T7RNA聚合酶的啟動子序列。如以前的描述(Rothetal.，2006)，使用T7RNA聚合酶通過體外轉(zhuǎn)錄制備RNA分子，并使用變性PAGE純化所制備的RNA分子。iv.138moaARNA的直讀探測分析將通過體外轉(zhuǎn)錄制備的40皮摩爾RNA以堿性磷酸酶(RocheDiagnostics)脫磷酸化，并將20皮摩爾使用T4多核苷酸激酶(NewEnglandBiolabs)依照制造商提供的步驟以Y-32P[ATP]放射標(biāo)記。如以前的描述(Mandaletal.，2003)安排使用通過PAGE純化的放射性標(biāo)記RNA的直讀探測反應(yīng)，并在25°C下于包含50mMTris-HCl(23°C下pH8.3)UOOmMKCl、20mMMgCl2和約5nM前體RNA的10yL體積中孵育40小時。將所產(chǎn)生的RNA通過使用10%變性PAGE分離，并使用MolecularDynamicsPhosphorlmager成像及使用ImageQuaNT軟件定量。v.moaA、mogA、modC、moeA禾口mobA高支除的生成如別處的描述(DatsenkoandWanner,2000)使用X-red重組方法和適當(dāng)?shù)腜CR產(chǎn)物生成具有具體基因缺失的E.coliDJ480株。簡而言之，使用質(zhì)粒pKD13和如下引物通過PCR擴(kuò)增制備突變體moaA,5'-AGGAAGAAATGACTTCGCCTCCCGTATCTGGAAAGGTGTACATGGCTATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQIDNO6)禾口5‘-ACCTGACTCATCTGATCTCTCCTTTTGACGTTTTAGCCGCCAATGTACGATGTAGGCTGGAGCTGCTTCG；mogA(SEQIDNO7),5'-TGTATCATTCTGTTTAACGAGACTGTTTAAACGGAAAAATCTTGATGAATATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQIDNO8)禾口5‘-TTGAGATCCCCCCGCTCGGGGGGATTTTTTTATTCGCTAACGTCGCGTCTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG；moeA(SEQIDN09),5'-GACATAATAGGCAAATTCGATTTTGCCTCCGCAGGAGTGTTTTCATGGAAATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQIDNO10)禾口5'-CAGCATCTCCTGATCGCTGAGTTCCGCCATTACAGGCCTCCGAACAACGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQIDNO11)；modC,5'-GAATGGCTGGCCAGAATCAGCCGTGAACGGGCGGGGCGCTAATCATGCTGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQIDNO:12)禾口5'-TTGCCCAGTTCATTTATAGCCACCTGATTAATCAGGCGGTTATCGACACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQIDNO13)；mobA，5'-GACACGTTAGCAGGGTCAATCCCACAATAAAAGAGGCGATATCGGTGAATATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQIDNO:14)禾口5'-ACTCCACGCGGCAAAGGCGAGTAACGGTATCATCGTTTTTCCTGCCATCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQIDN0:15)。將所產(chǎn)生約1.4kb長的PCR產(chǎn)物純化并進(jìn)行Dpnl消化，該P(yáng)CR產(chǎn)物包含一個卡那霉素抗性盒，該盒側(cè)翼為FLP識別靶位點和與相鄰染色體序列相同的50-核苷酸序列種類。將DJ480細(xì)胞以Red輔助質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)化，該質(zhì)粒編碼來自噬菌體\的促進(jìn)同源重組的Red重組酶。對重組體篩選氨芐西林(ampicillin)抗性。將以L-阿拉伯糖培養(yǎng)的DJ480/PKD46細(xì)胞以該基因特異的/pKD13PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。通過選擇卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體確定PCR產(chǎn)物在DJ480染色體中的重組。通過以對卡那霉素盒均特異的兩個內(nèi)部引物的PCR驗證所有產(chǎn)生的缺失突變體(k15‘-CAGTCATAGCCGAATAGCCT,SEQIDN0:16禾口k25‘-CGGTGCCCTGAATGAACTGC,SEQIDNO17)和側(cè)翼基因特異性引物(moaA5‘-CGCTAGTATCGGCATAACCAC,SEQIDNO:18禾P5‘-GAATCGCGCAGATAGTGACCG,SEQIDNO19,mogA5'-GCTACCTCTTCTGAAGCCTGTCTGT,SEQIDN0:20禾P5'-ATGGGTGAAGTACTGAACGAGCAGT,SEQIDNO:21,moeA5'-GATGGATATGGCATGTAAAGGCAGG,SEQIDNO22禾P5'-AGCACGCGAGAATCTTTCAGCGCCT,SEQIDNO:23，modC5'-GAGCGGCGAGACTGTGCATTASEQIDNO:24和5'-GCAACGCCGATGACGCGGTASEQIDNO:25，以及mobA5'-CTTCATTCAGACGTTTACATTTCATAGSEQIDNO26和5'-CATCCATATCATGGTGCGTATGCTTA,SEQIDNO:27)。然后通過使用FLP質(zhì)粒pCP20，通過位點特異性重組除去卡那霉素盒。通過以與驗證pre-FLP相同的引物的PCR驗證所產(chǎn)生的卡那霉素敏感性轉(zhuǎn)化體。vi.0-半乳糖苷酶翻譯融合物和突變體的構(gòu)建由缺乏操縱基因結(jié)合位點的組成活性的lacUV5啟動子驅(qū)動的MocoRNA-報告物融合構(gòu)建體的制備按如下進(jìn)行。通過PCR從大腸桿菌株K12擴(kuò)增相對于大腸桿菌moaABCDE操縱子S1轉(zhuǎn)錄起始位點第1至145位的核苷酸序列(圖23a)，使用包含56ntlacUV5啟動子序列(下劃線)(Dicksonetal.，1975)的引物5'GAATTCCTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGAACCACTAAACACTCTAGCCTC(SEQIDNO28)和引物5'-CTGGATCCAGTTGTGAAGCCATGTACAC(SEQIDNO:29)。在以EcoRI和BamHI消化后，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至包含lacZ的無啟動子拷貝的pRS414質(zhì)粒(Simonsetal.，1987)中，從而在lacZ的第9密碼子和moaA的第5密碼子之間的閱讀框內(nèi)融合。將NEB-5a細(xì)胞以所產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。對轉(zhuǎn)化體篩選氨芐西林抗性，并通過DNA測序確認(rèn)laCUV5-M0C0基序-lacZ翻譯融合物的完整性。使用QuikChange定向誘變試劑盒(Stratagene)和合適的誘變DNA引物，將所有定向誘變引入至Moco核糖開關(guān)中。通過DNA測序確認(rèn)所有突變。vii.MoaABCDEpBAD33過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將moaABCDE操縱子克隆至pBAD33質(zhì)粒(Guzmanetal.，1995)中，以使得可在細(xì)胞內(nèi)對Moco水平進(jìn)行阿拉伯糖誘導(dǎo)型控制。通過PCR從大腸桿菌K12擴(kuò)增2.7kbKpnI-Hindl11moaABCDE片段，使用的是引物5'-CTAGGTACCTCTGGAAAGGTGTACATGGCTTCACAAC(SEQIDNO30)和5'-TAGAAGCTTAACTACCAGCGTTTTGCCGCCTGCTG(SEQIDN031)。將PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳純化并進(jìn)行Kpnl和Hindlll消化，如pBAD33—樣。然后將消化的片段連接至阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子下游的PBAD33中，并轉(zhuǎn)化至NEB-5ci細(xì)胞中。對篩選轉(zhuǎn)化體的氯霉素抗性，并通過DNA測序確認(rèn)融合體。viii.突變體株的生成將moaA、mogA、modC、moeA和mobA敲除DJ480株同時以包含野生型或突變體149moaA-報告物融合體的lacUV5-Moco基序-lacZ融合pRS414質(zhì)粒以及moaABCDEpBAD33過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。對轉(zhuǎn)化體篩選氨芐西林抗性和氯霉素抗性。ix.大腸桿菌149moaARNA的基因控制的體內(nèi)分析為了測量來自大腸桿菌的野生型和突變報告物株中l(wèi)acZ的基因表達(dá)，將細(xì)胞在14mL培養(yǎng)瓶中在37°C下于3mL含所述補(bǔ)充物的LB中搖晃培養(yǎng)過夜。然后在96孔板中將細(xì)胞稀釋為150iiL的LB中時OD600為0.05，并在37°C下?lián)u晃培養(yǎng)至A600達(dá)到0.5和0.7之間，然后收獲用于基因表達(dá)實驗。使用別處描述的96孔微量培養(yǎng)板方案(Blountetal.,2007)測定半乳糖苷酶活性。x.Moco和Tuco代謝的生物信息學(xué)分析通過序列同源分析對多種生物進(jìn)行Moco和Tuco代謝歸屬以及對參與3個過程(鉬喋呤生物合成、Moco生物合成或利用以及Tuco生物合成或利用；表3)的基因進(jìn)行MocoRNA基序類型歸屬。為了鑒定使用但未被實驗證明使用Tuco的生物，將BLAST用于搜索與tupA和tupB同源的基因。在嗜氨基酸真桿菌(Eubacteriumacidaminophilum)中已表明這些基因編碼對鎢酸鹽特異的轉(zhuǎn)運(yùn)體(Makdessietal.,2001)Pelobactercarbinolicus和Desulfotaleapsychrophilia中的Tuco代謝基于存在wtpA同源物而被指定歸屬，所述wtpA同源物已被表明是鎢酸鹽的特殊但選擇性的轉(zhuǎn)運(yùn)體(Beversetal.，2006)。通過檢查鄰接基因的蛋白產(chǎn)物的注釋功能或者如果沒有注釋則通過使用序列同源性進(jìn)行功能歸屬，對以上列出的三個過程進(jìn)行MocoRNA基序歸屬。表3存在或不存在P3與存在Moco相關(guān)基因或Tuco相關(guān)基因之間的關(guān)聯(lián)。通過在每種生物的基因組中搜索與已知Moco依賴性蛋白及參與鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白同源的基因，鑒定了攜帶Moco相關(guān)基因的生物。如上針對Moco的描述以及如別處公開的(Beversetal.,2006；Iyeretal.，2006)，鑒定了攜帶Tuco相關(guān)基因的生物。由于對鉬喋呤(moly)的生物合成重要的基因可能參與Moco或Tuco產(chǎn)生，這些基因的存在在不同列中被示出。沒有星號不表示該生物缺乏與所指定化合物相關(guān)的基因，而是表示本發(fā)明人在文獻(xiàn)中或基因組數(shù)據(jù)庫搜索中沒有發(fā)現(xiàn)存在這些基因的證據(jù)。對基因的基因組搜索是基于來自NCBIEntrezGenomeProject數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi)的基因組。注陰影框a至c標(biāo)識出似乎違背RNA類型和Moco或Tuco基因控制之間關(guān)聯(lián)性的僅有實例。然而，a指示了這樣的情況，即缺乏P3的RNA與modA關(guān)聯(lián)，所述modA的蛋白產(chǎn)物為一種不能區(qū)分鉬酸鹽和鎢酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)體(Chanetal.，1995)。對于b，缺乏P3的RNA與攜帶Tuco關(guān)聯(lián)基因C0G2414(編碼一種鎢依賴的醛鐵氧還蛋白還原酶)(Harborneetal.,1992)和nirB(編碼一種硝酸鹽還原酶，并且通常需要Moco)(Clarkeetal.，2000)的2基因操縱子相關(guān)聯(lián)。在c中，缺乏P3的RNA與編碼推定的利用Moco的亞硫酸鹽氧化酶的兩個基因相關(guān)聯(lián)。因此，a和b不違背該關(guān)聯(lián)性，同時需要借用其他可能性來解釋c中的結(jié)果(見正文)。還是在沃而夫氏互營單胞菌中，一個包含P3的RNA與troA相關(guān)聯(lián)，troA被預(yù)測編碼一種金屬轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體的組件。一種類似的排列存在于DesulfitobacteriumhafnienseDCB-2中。然而，TroA和一種固氮酶MoFe蛋白(它是一種包含Moco的蛋白)的結(jié)構(gòu)組織是類似的(Chanetal.，1995)。因此，包含P3的RNA似乎與MoFe固氮酶的一個基因相關(guān)聯(lián)。表3注YES是；NO否。F.實施例6:SAM-IV核糖開關(guān)的適體核心可模擬SAM-I核糖開關(guān)的配體結(jié)合位點被稱為“SAM-IV”的新核糖開關(guān)家族是第4組不同的mRNA元件，其被報道經(jīng)直接感知S-腺苷甲硫氨酸(SAM或AdoMet)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。盡管具有以家族特異性核苷酸類型重新排列結(jié)構(gòu)和核苷酸位置，SAM-IV核糖開關(guān)與以前描述的SAM-I核糖開關(guān)共享保守核苷酸位置。序列分析和分子識別實驗表明，SAM-I和SAM-IV核糖開關(guān)共享相似的配體結(jié)合位點，但具有不同的支架(scaffolds)。這些結(jié)果表明RNA具有相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)多樣性，并顯示核糖開關(guān)利用該潛力來擴(kuò)展RNA在基因調(diào)節(jié)中的范圍。核糖開關(guān)為特異性結(jié)合一種具體代謝物的mRNA元件，并對響應(yīng)于代謝物濃度改變的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)(MandalandBreaker2004；WinklerandBreaker2005；Batey2006；Coppinsetal.2007)。許多甲基化酶的輔因子的S_腺苷甲硫氨酸可被3種已公開的核糖開關(guān)類識別SAM-I(Winkleretal.2003；McDanieletal.2003；Epshteinetal.2003)、SAM-II(Corbinoetal.2005)和SAM-III(或Sj(Fuchsetal.2006)核糖開關(guān)。雖然所有3個核糖開關(guān)家族都特異性地識別SAM，但是它們沒有明顯的序列或結(jié)構(gòu)的相似性。像例如發(fā)現(xiàn)多種自切割核酶一樣，多種不同SAM結(jié)合核糖開關(guān)的發(fā)現(xiàn)支持了這樣的觀點，即RNA具有足夠的結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度來以多種方式解決相同的生物化學(xué)難題。此外，兩類大核酶——I型內(nèi)含子和RNasePRNA——的結(jié)構(gòu)研究和序列分析表明在這些RNA中的不同支架可支持核苷酸在催化核心中的同樣定位(Michelandffesthof1990；Krasilnikovetal.2004；Torres-Lariosetal.2006；VicensandCech2006)。在使用生物信息學(xué)(Yaoetal.2007；Weinbergetal.2007)搜索細(xì)菌中新核糖開關(guān)時，鑒定了一種被歸類為一組新的結(jié)合SAM的核糖開關(guān)的保守的結(jié)構(gòu)化RNA基序。這些“SAM-IV”核糖開關(guān)主要出現(xiàn)在放線菌目例如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)(結(jié)核病的病因)中。SAM-IV核糖開關(guān)與SAM-I核糖開關(guān)的配體結(jié)合核心具有相似性，但別處的構(gòu)架和核苷酸類型有許多不同。因此，SAM-I和SAM-IV核糖開關(guān)具有不同支架，但具有高度相似的配體結(jié)合核心。SAM-IV核糖開關(guān)的結(jié)果表明結(jié)構(gòu)模擬并不局限于大的核酶，這又表明它廣泛存在于多種類型的結(jié)構(gòu)化RNA中。1.結(jié)果和討論i.SAM-IV基序的鑒定使用CMfinder比較基因組流程(Weinbergetal.2007；Yaoetal.2007)發(fā)現(xiàn)了SAM-IV基序。大多數(shù)SAM-IV實例位于參與硫代謝的基因上游并推測在其5'UTR中，這表明SAM-IV與結(jié)合SAM的核糖開關(guān)相符。幾乎所有已知的SAM-IVRNA都出現(xiàn)在放線菌目中。ii.SAM-IV基序核心與SAM-I的核心相似比較了SAM-IV的高度保守區(qū)與SAM-I、SAM-II和SAM-III核糖開關(guān)的高度保守區(qū)。SAM-IV共享SAM-I結(jié)合核心的關(guān)鍵序列和結(jié)構(gòu)特征，但別處出現(xiàn)核苷酸類型的顯著差異，并且總體構(gòu)架有大量偏差(圖28)。SAM-I3-D結(jié)構(gòu)(MontangeandBatey2006)中所有核苷酸具有一個在配體原子5人范圍內(nèi)(圖28，黑體字母)的原子的核心被鑒定，并基于保守的結(jié)構(gòu)特征的表觀相似性將SAM-I位置對映至類似的SAM-IV位置。當(dāng)周圍保守的核苷酸類型或其他特征表明共有類型不可能偶然出現(xiàn)時，將核苷酸類型分類為兩基序共有(圖28，陰影)。兩基序都具有多莖連接部分，及P3莖中廣泛的核苷酸類型的相似性(圖28)。P1和P2的結(jié)合部分也具有相似性，并且兩基序似乎可在P2的末端環(huán)和P33'的結(jié)合部分之間可形成一個假結(jié)。為了容納該假結(jié)，SAM-I中的P2具有一個標(biāo)準(zhǔn)的扭結(jié)反轉(zhuǎn)(kink-turn)(Lescouteetal.2005；MontangeandBatey2006)。值得注意的是，SAM-IV中P2的內(nèi)部環(huán)可起到類似于所述扭結(jié)反轉(zhuǎn)的作用，使得這些RNA采用一種假結(jié)結(jié)構(gòu)。然而，這兩種基序具有不同的構(gòu)架元件及在許多位置(圖28，淺陰影)不同的核苷酸保守模式。在SAM-IV中缺少SAM-I核心中的P4發(fā)夾，但在SAM-IV的P1之外出現(xiàn)了一種不同的P4發(fā)夾。這些P4發(fā)夾具有不相似的保守核苷酸類型。除了在該核心外的附加P4之外，SAM-IV可形成SAM-I缺乏的另外的假結(jié)。同時，SAM-IV具有與SAM-I很大差異的P2，這是因為它的環(huán)和莖長不同于SAM-I，并且序列的相似性似乎很小。實際上，P2中的扭結(jié)反轉(zhuǎn)在SAM-I核糖開關(guān)中是高度保守的(BarrickandBreaker2007)，但沒有SAM-IV核糖開關(guān)序列具有該結(jié)構(gòu)的基序。SAM-I和SAM-IV之間的保守核苷酸類型中的其他差異在P3尖端、P1底部和P33'結(jié)合部分中。因為這些差異，至少在3項以前的研究中基于SAM-I的同源性搜索已經(jīng)漏檢了SAM-IV核糖開關(guān)。在第一項研究中，使用PAT程序(Seliverstovetal.2005)對放線菌門基因組搜索了包含SAM-I適體的調(diào)節(jié)RNA。第二，使用RNA-PATTERN程序(Rodionovetal.2004)對革蘭氏陽性菌搜索了SAM-I適體和硫代謝中的其他基因控制元件。第三，使用SequenceSniffer和RAVENNA(WeinbergandRuzzo2006)在所有細(xì)菌中搜索了已知核糖開關(guān)的同源物，這里采用了統(tǒng)計譜技術(shù)以對保守的序列和二級結(jié)構(gòu)建立概率模型。所有工作都沒有檢測到SAM-IV核糖開關(guān)，但許多放線菌在不同的基因組同等位處攜帶SAM-I和SAM-IV兩種核糖開關(guān)。98SAM-I和SAM-IV相似性主要局限于它們的核心，因此SAM-I和SAM-IV核糖開關(guān)可共享相似的結(jié)合位點和分子識別特征。這一點得到了SAM-I原子分辨率模型(MontangeandBatey2006)的支持，在該模型中6個核苷酸被提出直接與配體相互作用(圖28)。這6個位置的核苷酸類型在除一個之外的所有SAM-I代表物中是嚴(yán)格保守的。在SAM-IV中被提出對應(yīng)于這些接觸配體的位置的6個位置中，5個在所有已知SAM-IV代表物中是保守的，具有與SAM-I核糖開關(guān)中相同的核苷酸類型。第6個——U88——在SAM-IV中一般為胞嘧啶，但所有4種核堿基都可出現(xiàn)在該位置。iii.SAM-IVRNA的分子識別特征為了評估SAM-IVRNA的分子識別，將直讀探測測定(SoukupandBreaker1999)應(yīng)用于一種包含在天藍(lán)色鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的SAM-IV的132核苷酸RNA(被稱為132ScRNA)。在這些測定中，132ScRNA可以以約150nM的表觀離解常數(shù)(Kd)結(jié)合于SAM，不同于對S-腺苷高半胱氨酸(SAH)的20μΜ。腺苷和甲硫氨酸具有弱于ImM的Kd值(圖29)。這些值證明132ScRNA適體可以以與其他類SAM核糖開關(guān)適體相似的親和性和特異性結(jié)合于SAM。SAM-IV核糖開關(guān)的對應(yīng)于SAM-I中U88的核苷酸不保守(圖28)。因為在SAM-I核糖開關(guān)中該位置的02羧基氧被預(yù)測可感知SAM配體中硫處的正電荷(MontangeandBatey2006)，所以比較了SAM-I和SAM-IV核糖開關(guān)對硫位置處有差異的化合物的親和性SAM、SAH、SAH砜(BorchardtandWu1974)以及兩種氮雜衍生物-AzaAdoMet和MeAzaAdoMet(Thompsonetal.1999)。132ScRNA以胞嘧啶代替尿嘧啶，作為與U88類似的位置的核堿基。雖然胞嘧啶保留了02羧基，但是由Watson-CrickG-C對形成的另外的氫鍵可能會破壞與配體正電荷的相互作用，這可解釋U88在SAM-I核糖開關(guān)中的完全保守。將132ScRNA的分子識別與以前研究的被稱為124yitj的SAM-I核糖開關(guān)的分子識別(Winkleretal.2003)比較。為了測量核糖開關(guān)對配體中修飾的區(qū)分，將修飾的配體的Kd除以SAM的Kd的比值。測量了結(jié)合SAM及SAM衍生物以產(chǎn)生相似Kd比值的SAM-I和SAM-IV核糖開關(guān)(表4)。這些數(shù)據(jù)表明，雖然SAM-IV中U88保守較弱，但是SAM-IV分子識別類似于SAM-I。iv.SAM-IV是一種基因調(diào)節(jié)元件為了確定SAM-IV是否在體內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，將包含SAM-IV的天藍(lán)色鏈霉菌座位SC02146上游基因間區(qū)克隆為一個xylE報告基因的翻譯融合物。因為不能容易地在SAM-IV基因間區(qū)鑒定到啟動子，所以將該區(qū)域至于甘油誘導(dǎo)型啟動子(Kieseretal.2000)控制下。大多數(shù)已知SAM核糖開關(guān)在結(jié)合SAM時降低基因表達(dá)，從而降低在高水平SAM時無需其蛋白產(chǎn)物的基因的表達(dá)。為了試驗SAM-IV是否為一種基因調(diào)節(jié)元件，進(jìn)行了預(yù)測會破壞或恢復(fù)SAM-IV核糖開關(guān)功能的突變。第一突變(Ml)改變了預(yù)測可直接接觸SAM的位置，這一點的進(jìn)行是通過推測這些核苷酸類似于SAM-I適體中的那些核苷酸。第二突變(M2)可破壞保守二級結(jié)構(gòu)中的堿基配對。第三突變(M3)經(jīng)可恢復(fù)野生型活性的補(bǔ)償突變恢復(fù)了M2中失去的堿基配對。在復(fù)雜培養(yǎng)基中生長后，在攜帶4種核糖開關(guān)_報告物融合體的每一種的天藍(lán)色鏈霉菌細(xì)胞中測量了XylE活性，其中SAM的細(xì)胞濃度被預(yù)測是充足的。如預(yù)測的，具有Ml和M2核糖開關(guān)的株顯示了比具有野生型或M3核糖開關(guān)的株更高的報告基因表達(dá)(圖30)。這些結(jié)果表明，來自天藍(lán)色鏈霉菌的SAM-IVRNA是一種基因控制元件，分子識別實驗表明SAM-IVRNA應(yīng)對SAM應(yīng)答。在細(xì)胞SAM濃度逐漸耗盡的條件下測量了報告基因表達(dá)，但由于所使用構(gòu)建物的報告基因表達(dá)水平非常低而使這些結(jié)果是不確定的。硫代謝的基因調(diào)節(jié)在鏈霉菌中是特別受到關(guān)注，這是因為SAM水平可影響這些物種中的抗生素產(chǎn)生和孢子形成(Kimetal.2003；Okamotoetal.2003)。一些明顯被SAM-IV調(diào)節(jié)的基因(如SC02146)被預(yù)測為硒代半胱氨酸(selenocysteine)裂合酶。例如，它們可在硫代謝中起作用。v.SAM-IV的進(jìn)化歷史本文給出了一種可解釋趨異進(jìn)化的模型。在該模型中，一種SAM-I樣祖先失去其P4莖，之后由失去P4造成的任何負(fù)面效應(yīng)都通過將不同的P4莖3'增加至Pl莖被補(bǔ)償，最終形成SAM-IV樣RNA。3個事實與該模型相符。第一，SAM-IV幾乎局限于放線菌目，而SAM-I存在于該分類群和許多其他分類群中，這表明如果它們共有一個祖先，那么它將可能與SAM-I相似。第二，P4被發(fā)現(xiàn)僅參與形成支架(MontangeandBatey2006)，因此它更容易被替換。第三，一些SAM-I核糖開關(guān)完全缺乏P4莖和環(huán)，因此P4缺失是可允許的。vi.SAM-IV核糖開關(guān)的分類和重要性通過多種標(biāo)準(zhǔn)將蛋白分類成家族和超家族(OrengoandThornton2005)。最初的標(biāo)準(zhǔn)僅僅是基于序列同源性(Dayhoffetal.1976)。其他小組繼承了該先例(例如Barkeretal.1996)，但一些小組還考慮結(jié)構(gòu)或功能相似性(Murzinetal.1995)。一般而言，按家族分類的蛋白具有明顯的同源性，而按超家族分組的蛋白似乎親緣更遠(yuǎn)并且同源性僅被認(rèn)為是“可能的”(Murzinetal.1995；Dayhoffetal.1976)?？紤]到SAM-I和SAM-IV核糖開關(guān)之間不相容的保守和重排列結(jié)構(gòu)的模式，并且由于它們的相似性避開了現(xiàn)有技術(shù)的序列分析方法，本發(fā)明人提出它們構(gòu)成不同的家族。然而，它們的核心的相似性足以暗示可將它們分類為單個的超家族。對SAM-IV核糖開關(guān)的3-D結(jié)構(gòu)研究可能有助于細(xì)化它們的分類。核糖開關(guān)已形成“類(class)”和“類型(type)”。類定義一組共享結(jié)構(gòu)和功能特征的核糖開關(guān)，而類型被用于對屬于同一類但攜帶不同亞結(jié)構(gòu)的RNA分組。為了將該術(shù)語與對同源蛋白分組的術(shù)語關(guān)聯(lián)，“類”對應(yīng)于“家族”，“類型”對應(yīng)于“亞家族”。其他的核糖開關(guān)家族顯示出了結(jié)構(gòu)多樣性，但可能是與SAM-I和SAM-IV核糖開關(guān)之間相關(guān)性不同的性質(zhì)。例如，可基于環(huán)序列將PreQ1-I核糖開關(guān)分至各亞家族(Rothetal.2007)0同時，以前報道的腺苷鈷胺素結(jié)合的核糖開關(guān)(Nahvietal.2004)缺乏正常的保守結(jié)構(gòu)域，而其3'側(cè)翼序列對于配體識別是必需的。該變體對嘌呤基鈷胺素呈現(xiàn)了比典型腺苷鈷胺素核糖開關(guān)更優(yōu)的親和性，因此該變體的結(jié)合核心是可改變的。這些結(jié)果證明了核糖開關(guān)RNA可使用多種構(gòu)架來將關(guān)鍵核苷酸定位至同一結(jié)合位點上?？紤]到對I型內(nèi)含子和RNasePRNA的類似結(jié)果，本文得出大范圍的RNA會呈現(xiàn)這種現(xiàn)象的結(jié)論。RNA的結(jié)構(gòu)集合的這種穩(wěn)定的天然用途支持了這樣的結(jié)論，即RNA是分子感知和基因控制的有效且多能的聚合物。2.材料和方法i.生物信息學(xué)使用CMfinder比較基因組流程鑒定了SAM-IV基序，并使用以前確立的策略(Weinbergetal.2007；Yaoetal.2007)推斷其比對，但使用了版本21的RefSeq(Pruittetal.2005)。SAM-I比對數(shù)據(jù)公布于別處(BarrickandBreaker2007)。如以前的報道(Weinbergetal.2007)計算了圖28中呈現(xiàn)的保守性統(tǒng)計值。ii.微生物遺傳和質(zhì)粒為了試驗核糖開關(guān)對基因表達(dá)的控制，本發(fā)明人克隆了編碼鄰苯二酚2，3_雙加氧酶的xylE報告基因(Kieseretal.2000)上游包含SAM-IV的天藍(lán)色鏈霉菌基因間序列。鄰苯二酚2，3-雙加氧酶將鄰苯二酚轉(zhuǎn)變成2-羥粘康酸半醛，其在375nm下的吸光度使得可進(jìn)行比色測定。本發(fā)明人使用了PMT3226(Kieseretal.2000)，這是一種在大腸桿菌中復(fù)制并包括阿泊拉霉素(apramycin)抗性基因和甘油誘導(dǎo)型啟動子下游的xylE報告基因的整合性鏈霉菌質(zhì)粒。為了構(gòu)建xylE基因的翻譯融合體，以引物5'-GAAGAGGTGACGTCATGGATCCGAACAAAGGTGTAATGC(SEQIDNO:32)及其反向互補(bǔ)序列通過QuikChange(Stratagene)將第二BamHI位點添加至pMT3226。通過PCR從基因組DNA擴(kuò)增了包含SAM-IV的天藍(lán)色鏈霉菌基因間區(qū)，使用的引物是5'-CTAGGATCCGCCACGCGTAGCGGCCCTGGTGTGT(SEQIDNO:33)和5'-GTAGGATCCACAGCGGTGGGTACGGACATGGCG(下劃線為BamHI位點，SEQIDNO:34)。為了幫助高G+CDNA產(chǎn)物的擴(kuò)增，PCR反應(yīng)包含1.3M甜菜堿(Sigma-Aldrich)和5%DMSO(Frackmanetal.1998)。為了組裝“pEZ35，，，以BamHI切割PMT3226和PCR產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠純化從pMT3226除去小片段并連接DNA分子，通過測序驗證正確的序列和方向。通過QuikChange制備了包含突變體核糖開關(guān)(M1、M2、M3)的載體。通過結(jié)合(Kieseretal.2000)將質(zhì)粒導(dǎo)入至天藍(lán)色鏈霉菌M145中。從在28°C下培養(yǎng)于MS瓊脂(Kieseretal.2000)上的細(xì)胞收獲接合后體的孢子原種，并在_20°C下保存于15%的甘油中。將硫酸阿泊拉霉素(Sigma-Aldrich)以100μg/mL用于大腸桿菌，或以50μg/mL用于天藍(lán)色鏈霉菌。為了開始遺傳實驗，將孢子原種在冰上解凍，用ImL的曲通X-100(tritonX-100)緩沖物(Hodgson1982)洗滌，并再懸浮于ImLdH20中。將該混合物接種至25mL培養(yǎng)物中至相對于H2O測得A45tl(HodgSon1982)為約0.03。培養(yǎng)基為無右旋糖的24g/L胰酶大豆肉湯(TSB)(BectonDickinson)、4%甘油、20μg/mL硫酸阿泊拉霉素(除缺乏載體的細(xì)胞之外)和12.5μg/mL萘啶酸鈉(Sigma-Aldrich)，以降低污染的風(fēng)險。將培養(yǎng)物在28°C下于250mL燒瓶中搖晃培養(yǎng)50.5小時。然后測量無細(xì)胞的提取物中的XylE活性(Kieseretal.2000)。由于粗提取物中剩余的細(xì)胞碎片會增加XylE酶曲線的噪音，將上清液在離心兩次后提取，然后通過0.2μm孔膜(Whatman)過濾，之后離心20分鐘。反應(yīng)包括ImL無鄰苯二酚的測定緩沖物、100μL無細(xì)胞提取物、10μL20mM鄰苯二酚，并且在Varian50Bio分光光度計上每6秒測量375nm下的吸光度持續(xù)20分鐘。盡管進(jìn)行了過濾，但有時仍存在吸收可見光全波長的剩余碎片，包括375nm。當(dāng)在480nm(不被XylE反應(yīng)產(chǎn)物顯著吸收的波長)下經(jīng)20分鐘的變化超過0.0004并且大小與375nm的變化量相當(dāng)時，本發(fā)明人丟棄該結(jié)果并制備新的反應(yīng)。使用A375下經(jīng)完整20分鐘的變化估計XylE活性，如以前報道的(Kieseretal.2000)，這比僅使用線性區(qū)間的可重復(fù)性強(qiáng)。iii.直讀探測測定以引物5‘-TAATACGACTCACTATAGGTTTTTCGACAGGTCATGAGTGACAGTC(下劃線為T7RNA聚合酶啟動子序列，SEQIDN0:35)和5'-AGGGGTCCGCGCTTGCCGTGGACCTTGCTG(SEQIDN0:36)，通過PCR擴(kuò)增對應(yīng)于pEZ35質(zhì)粒(上文)中適體的DNA。通過體外轉(zhuǎn)錄、脫磷酸化以及使用以前描述的方案(Rothetal.2007)以[Y-32P]ATP放射標(biāo)記，從PCR產(chǎn)物制備5'32P-標(biāo)記的RNA分子。制備了直讀探測反應(yīng)，將5'32P-標(biāo)記片段通過變性PAGE進(jìn)行分辨并如以前的描述(Rothetal.2007)進(jìn)行成像。表4.SAM-I和SAM-IV的分子識別。列出了SAM衍生物的Kd值，為給定化合物與SAM的Kd比值。在以前計算了SAM-IKd值(Limetal.2006)。在以前描繪了化合物結(jié)構(gòu)(Limetal.2006)，使用了如下的編號方案:SAM(化合物1)、SAH(2)、SAH砜(4)、AzaAdoMet(5)禾口MeAzaAdoMet(6)。表4應(yīng)理解，所公開的方法和組合物不限于所述的具體方法、方案和試劑，因而它們可有所變化。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語只是為了描述具體實施方案而不意欲限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只被所附的權(quán)利要求書所限制。必須注意的是，除非上下文中另外明確指出，在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式的“一”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代對象。因此，例如，提及“一種核糖開關(guān)”時包括多個這樣的核糖開關(guān)，提及“該核糖開關(guān)”時是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一個或多個核糖開關(guān)及其等價物，等等?！叭芜x的”或“任選地”是指后面描述的事件、情況或材料可能發(fā)生或存在，也可能不發(fā)生或不存在，且該描述包括所述事件、情況或材料發(fā)生或存在以及不發(fā)生或不存在的情形。范圍在本文中可被表示為從“大約”一個具體值，和/或到“大約”另一個具體值。當(dāng)表示為這樣一個范圍時，除非上下文另外特別指出，否則也具體地考慮和認(rèn)為公開了從所述的一個具體值和/或到所述的另一個具體值的范圍。類似地，當(dāng)通過在前面使用“大約”將數(shù)值表示為近似值時，除非上下文另外特別指出，否則應(yīng)理解成該具體數(shù)值可形成另一個應(yīng)認(rèn)為被公開的具體考慮的實施方案。還應(yīng)理解，除非上下文另外特別指出，每個范圍的端點在與另一個端點相關(guān)或獨立于另一個端點時都是有意義的。最后，應(yīng)該理解的是，除非文中另外特別說明，否則在明確公開的范圍中所包括的所有單個的數(shù)值和子范圍也被特別考慮和認(rèn)為被公開。不論在具體的情況下這些實施方案的全部或部分是否被明確地公開，上述的原則都適用。除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語都具有與所公開方法和組合物所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管與本文所述方法和材料類似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê筒牧隙伎捎糜诒景l(fā)明方法和組合物的實施或檢測，但是本文仍然描述了特別有用的方法、設(shè)備和材料。本文引用的出版物和引用它們時的目的內(nèi)容在此特別地以援引的方式納入本文。本文不應(yīng)被解釋為承認(rèn)本發(fā)明不能先于在先發(fā)明的這些公開內(nèi)容。且并非承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)都構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。參考文獻(xiàn)的討論說明了它們的作者的論斷，但是本申請人:保留懷疑所引用文獻(xiàn)的正確性和相關(guān)性的權(quán)利?？梢郧宄乩斫?，雖然本文中提及了許多出版物，但是這些參考文獻(xiàn)并不表示承認(rèn)任何這些文件都構(gòu)成本領(lǐng)域的公知常識的一部分。在通篇本申請的說明書和權(quán)利要求中，詞語“包含”和該詞的變化形式如“包括”和“含有”意指“包括但不限于”，而不意欲排除例如其他添加劑、組件、整數(shù)或步驟。本領(lǐng)域的技術(shù)人員僅使用常規(guī)的實驗即可認(rèn)識到或能夠確定本文所述方法和組合物的具體實施方案的許多等價方案。這種等價方案意欲被隨附的權(quán)利要求書所涵蓋。參考文獻(xiàn)Abreu-Goodger，C.，andMerino，Ε.2005.RibEx:awebserverforlocatingriboswitchesandotherconservedbacterialregulatoryelements.NucleicAcidsRes.33:W690_692.Akakura，R.，andWinans,S.C.(2002).MutationsintheoccQoperatorthatdecreaseOccR—inducedDNAbendingdonotcauseconstitutivepromoteractivity.JournalOfBiologicalChemistry277，15773-15780·Akimoto,H.etal.Queuineanalogues.TheirsynthesisandinhibitionofgrowthofmouseL5178Ycellsinvitro.J.Med.Chem.29,1749-1753(1986).Akimoto，H.，Imamiya，E.，Hitaka，T.，Nomura，H.&Nishimura,S.Synthesisofqueuine,thebaseofnaturallyoccurringhypermodifiednucleoside(queuosine),anditsanalogues.J.Chem.Soc.PerkinTrans.1,1637-1644(1988).Altschul，S.F.，Madden，T.L，Schaffer,A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.andLipman,D.J.(1997)GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsResearch，25，3389—3402.Anderson，LA.，McNairn,Ε.，Lubke,Τ.，Pau,R.N.&Boxer,D.H.ModE-dependentmoIybdateregulationofthemolybdenumcofactoroperonmoainEscherichiacoli.J.Bacteriol.182，7035-7043(2000).Arsene-Ploetze，F(xiàn).，Nicoloff,H.，andBringelF.2005.Lactobacillusρlantarumcclgeneisnon-essential,arginine-repressedandcodesforaconservedproteininFirmicutes.Arc.Microbiol.183:307—316.Ausubel，F(xiàn).M.，Brent,R.，Kingston，R.E.，Moore,D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.,andStruhl，K.(1992).ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology(NewYork:JohnWiley&Sons,Inc.).Axmann,I.M.，Kensche，P.，Vogel,J.,Kohl,S.，HerzeliH.andHess,W.R.(2005)Identificationofcyanobacterialnon-codingRNAsbycomparativegenomeanalysis.GenomeBiology,6,R73.Bader,G.，Gomez-Ortiz,M.，Haussmann，C.，Bacher,Α.，Huber,R.&Fischer，M.Structureofthemolybdenum-cofactorbiosynthesisproteinMoaBofEscherichiacoli.ActaCryst.D60，1068-1075(2004)·Baker,K.P.&Boxer,D.H.RegulationofthechlAlocusofEscherichiacoliK12:involvementofmolybdenumcofactor.MolMicrobiol.5，901-907(1991)·Barker,W.C.，Pfeiffer，F(xiàn).，andGeorge,D.G.1996.SuperfamilyclassificationinPIR-InternationalProteinSequenceDatabase.MethodsEnzymol.266:59-71.Barrick,J.E.，Corbino,K.Α.，Winkler,W.C.，Nahvi,Α.，Mandal,Μ.，Collins,J.，Lee,Μ.，Roth,Α.，Sudarsan,N.，etal.2004.NewRNAmotifasuggestanexpandedscopeforriboswitchesinbacterialgenecontrol.Proc.Natl.Acad.Sci.USA1016421-6426.Barrick，J.E.&Breaker，R.R.Thedistributions，mechanisms，andstructuresofmetabolite-bindingriboswitches.GenomeBiol.8,R239(2007).Bassler,B.L.andLosick,R.(2006)BacteriallySpeaking.Cell，125，237—246.Batey，R.T.，Gilbert，S.D.，andMontagne，R.K.2004.Structureofanaturalguanine-responsiveriboswitchcomplexedwiththemetabolitehypoxanthine.Nature432:411-415·Batey,R.T.(2006)StructuresofregulatoryelementsinmRNAs.CurrOpinStructBiol，16，299-306.Baugh，P.E.，Collison，D.，Garner，C.D.&Joule,J.A.Molybdenummetalloenzymes.InComprehensiveBiologicalCatalysis,M.Sinnott，Ed.，AcademicPress，Vol.III，pp.377-400(1998).Bevers,L.E.，Hagedoorn，P.L.，Krijger，G.C.&Hagen，W.R.TungstentransportproteinA(WtpA)inPyrococcusfuriosus:thefirstmemberofanewclassoftungstateandmoIybdatetransporters.J.Bacteriol.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ān)或一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)的衍生物、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)的衍生物或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)或一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)的衍生物；(b)通過使一種細(xì)胞和步驟(a)中改變基因表達(dá)的一種化合物相接觸來改變基因表達(dá)，其中所述細(xì)胞含有編碼含有核糖開關(guān)的RNA的基因，其中所述化合物通過結(jié)合到所述核糖開關(guān)上抑制所述基因的表達(dá)。19.一種鑒定核糖開關(guān)的方法，所述方法包括在存在和不存在一種化合物的條件下評估RNA分子的直讀探測(in-line)的自發(fā)切割，其中所述RNA分子由被所述化合物調(diào)節(jié)的基因編碼，其中所述RNA分子的直讀探測的自發(fā)切割模式的改變表明一種核糖開關(guān)，其中(a)所述RNA包含一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)或一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)的衍生物并且所述化合物為環(huán)二GMP，(b)所述RNA包含一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)或一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)的衍生物并且所述化合物為S-腺苷高半胱氨酸，(c)所述RNA包含一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)或一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)的衍生物并且所述化合物為preQp或者(d)所述RNA包含一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)的衍生物或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)或一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)的衍生物。20.一種改變基因表達(dá)的方法，所述方法包括使一種化合物和一種細(xì)胞相接觸，其中所述細(xì)胞包含一個編碼包括以下核糖開關(guān)的RNA的基因，所述核糖開關(guān)為一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)，其中所述化合物通過結(jié)合于所述一種環(huán)二GMP應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種S-腺苷高半胱氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種preQi應(yīng)答性核糖開關(guān)、一種Moco應(yīng)答性核糖開關(guān)或者一種SAM應(yīng)答性核糖開關(guān)而改變所述基因的表達(dá)。21.權(quán)利要求20的任一項方法，其中所述細(xì)胞已經(jīng)被鑒定為需要改變的基因表達(dá)，22.權(quán)利要求20的方法，其中所述細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述化合物殺滅細(xì)菌細(xì)胞或抑制細(xì)菌細(xì)胞的生長。24.權(quán)利要求20的方法，其中通過將所述化合物給予一個受試者使所述化合物和所述細(xì)胞相接觸。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)胞為所述受試者體內(nèi)的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述化合物殺滅所述細(xì)菌細(xì)胞或抑制所述細(xì)菌細(xì)胞的生長。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述受試者具有細(xì)菌感染。27.權(quán)利要求20的方法，其中所述化合物與另一種抗微生物化合物聯(lián)合給藥。28.權(quán)利要求20的方法，其中所述化合物抑制生物膜中的細(xì)菌生長。全文摘要核糖開關(guān)是抗生素和其他小分子治療的靶。核糖開關(guān)及其部分可用于調(diào)節(jié)RNA分子及其他元件和分子的表達(dá)或功能。核糖開關(guān)及其部分可用于多種其他方法中，例如以鑒定或檢測化合物?；衔锟捎糜诖碳ぁ⒓せ?、抑制和/或滅活所述核糖開關(guān)。核糖開關(guān)及其部分——單獨以及與其他核酸結(jié)合——可用于多種構(gòu)建體和RNA分子中，并且可由核酸編碼。文檔編號C07H21/02GK101849020SQ200880100930公開日2010年9月29日申請日期2008年5月29日優(yōu)先權(quán)日2007年5月29日發(fā)明者A·羅斯,E·E·瑞格爾斯基,M·M·梅耶,N·蘇達(dá)珊,R·R·布雷克,Z·威恩伯格,王欣申請人:耶魯大學(xué)