專利名稱：通過蛻皮素受體復(fù)合物調(diào)節(jié)外源性基因表達(dá)的手性二?；屡潴w的制作方法
通過蛻皮素受體復(fù)合物調(diào)節(jié)外源性基因表達(dá)的手性二?；?br> 肼配體發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物技術(shù)、基因工程和藥物化學(xué)領(lǐng)域。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及 基因表達(dá)的領(lǐng)域。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及天然和突變的核受體的二酰基胼配體 和手性二?；菖潴w以及它們在基于核受體的可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)中的用途，以及使用 這些配體和可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法。背景本文引用了各種出版物，其公開內(nèi)容通過引用被全文并入。然而，本文任何參考文 獻(xiàn)的引用不應(yīng)被解釋為承認(rèn)該參考文獻(xiàn)對于本申請是可以作為“現(xiàn)有技術(shù)”的。在基因工程領(lǐng)域，基因表達(dá)的精確控制是研究、操作和控制發(fā)育和其他生理過程 的有價值的工具。基因表達(dá)是復(fù)雜的生物過程，其包括許多特異性蛋白_蛋白相互作用。為 了觸發(fā)基因表達(dá)以便其產(chǎn)生蛋白合成第一階段中必要的RNA，必須將轉(zhuǎn)錄激活子接近控制 基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。通常地，轉(zhuǎn)錄激活子自身與具有至少一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白締合， 所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合存在于基因啟動子區(qū)域的DNA結(jié)合位點。因此，為了使基因表達(dá) 發(fā)生，包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和位于所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域適當(dāng)距離處的反式激活結(jié)構(gòu)域的蛋 白必須被置于基因的啟動子區(qū)域中正確的位置。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法利用細(xì)胞類型特異性的啟動子來驅(qū)使設(shè)計的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。先 將含有所述轉(zhuǎn)基因的DNA構(gòu)建體整合進(jìn)宿主基因組。當(dāng)被轉(zhuǎn)錄激活子觸發(fā)時，轉(zhuǎn)基因的表 達(dá)在所給細(xì)胞類型中發(fā)生。調(diào)控外源性基因在細(xì)胞中的表達(dá)的另一種方法是通過可誘導(dǎo)的啟動子。使用這種 可誘導(dǎo)的啟動子的例子包括rai-a啟動子、原核的抑制子-操縱子系統(tǒng)、免疫抑制性抑免蛋 白系統(tǒng)和更高級的真核轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)例如類固醇激素受體系統(tǒng)，并描述如下。來自煙草的PRl-a啟動子在病原體攻擊之后全身獲得性抵抗應(yīng)答中被誘導(dǎo)。 PRl-a的用途可被限制，因為它經(jīng)常對內(nèi)源性物質(zhì)和外部的因子例如病原體、UV-B輻射和 污染物產(chǎn)生應(yīng)答。基于由熱激、干擾素和重金屬所誘導(dǎo)的啟動子的基因調(diào)控系統(tǒng)已被描 述(ffurn 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:5414-5418(1986) ；Arnheiter 等，Cell 62: 51-61(1990) ；Filmus 等，Nucleic Acids Research 20:27550-27560(1992))。然而，這些 系統(tǒng)由于它們對非靶基因的表達(dá)的作用而具有局限性。這些系統(tǒng)還是有漏洞的。原核的抑制子_操縱子系統(tǒng)使用細(xì)菌抑制子蛋白和它們所結(jié)合的獨特的操縱子 DNA序列。來自大腸桿菌的四環(huán)素(“Tet”)和乳糖(“Lac”)抑制子-操縱子系統(tǒng)二者都 已被用在植物和動物中以控制基因表達(dá)。在Tet系統(tǒng)中，四環(huán)素結(jié)合至TetR抑制子蛋白， 導(dǎo)致構(gòu)象變化，其將抑制子蛋白從操縱子釋放出來，并因此允許轉(zhuǎn)錄發(fā)生。在Lac系統(tǒng)中， 乳糖操縱子響應(yīng)于乳糖或合成的類似物例如異丙基_b-D-硫代半乳糖苷的存在而被激活。 不幸地，這種系統(tǒng)的使用受到配體即四環(huán)素和乳糖的不穩(wěn)定化學(xué)性質(zhì)、它們的毒性、它們的天然存在或者誘導(dǎo)或抑制所需要的相對高水平的限制。由于相似原因，這種系統(tǒng)在動物中 的使用受到限制。免疫抑制分子例如H(506、雷帕霉素和環(huán)孢菌素A可結(jié)合至抑免蛋白FKBP12、親環(huán) 蛋白等。使用此信息，已經(jīng)設(shè)計了總體戰(zhàn)略以簡單地通過將H(506置于兩種蛋白中的每種 上或者通過將H(506置于一種上并將環(huán)孢菌素A置于另外一種上，而將任何兩種蛋白結(jié)合 在一起。然后可使用H(506(na012)的合成同二聚體或由H(506-環(huán)孢菌素(n(CSA)融合所 得的化合物來誘導(dǎo)這些分子的二聚化(Spencer等，Science 262 1019-24 (1993) ；Belshaw 等，Proc Natl Acad Sci USA 93:4604-7(1996))。融合至 FKBP12 的 Gal4DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域 和融合至親環(huán)蛋白和raCsA化合物的VP16激活子結(jié)構(gòu)域被用來顯示異二聚化和報道基因 在含有Gal4結(jié)合位點的啟動子的控制下的激活。不幸地，該系統(tǒng)包括可具有不需要的副作 用的免疫抑制劑，并因此限制它用于各種哺乳動物基因開關(guān)應(yīng)用。還使用了更高級的真核轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)例如類固醇激素受體系統(tǒng)。類固醇激素受體 是核受體超家族的成員，并在脊椎動物和無脊椎動物細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。不幸地，為了調(diào)控基因 表達(dá)而激活所述受體的類固醇化合物特別地在植物和動物中的使用由于它們參與這些生 物體中許多其他天然生物途徑而受到限制。為了克服這種困難，使用昆蟲蛻皮素受體(EcR) 開發(fā)了一種替代系統(tǒng)。昆蟲的生長、蛻皮和發(fā)育受到蛻皮素類固醇激素(蛻皮激素)和保幼激素調(diào)控 (Dhadialla 等，Annu. Rev. Entomol. 43 :545_569 (1998))。蛻皮素在昆蟲體內(nèi)的分子靶至少 由蛻皮素受體(EcR)和超氣門蛋白(USP)組成。EcR是特征為簽名DNA和配體結(jié)合域和激活 結(jié)構(gòu)域的核類固醇受體超家族的成員(1(06116等，(^11，67 :59-77(1991))。EcR受體對若干 類固醇化合物例如松留酮A和米樂留酮(muristeroneM進(jìn)行應(yīng)答。最近，描述了具有蛻皮 類固醇激動劑活性的非類固醇化合物，其包括由Rohm和Haas公司銷往全世界的商業(yè)上可 得的殺蟲劑蟲酰胼(tebufenozide)和甲氧蟲酰胼(methoxyfenozide)(參見W0 96/27673 和US 5，530，028)。兩種類似物在其他生物體內(nèi)都具有出色的安全性概況。昆蟲蛻皮素受體(EcR)與超氣門蛋白(USP)即哺乳動物的類視黃醇X受體(RXR) 的昆蟲同系物發(fā)生異二聚化作用，并結(jié)合蛻皮類固醇和蛻皮素受體應(yīng)答元件，并激活對蛻 皮素應(yīng)答的基因的轉(zhuǎn)錄。EcR/USP/配體復(fù)合物在昆蟲的發(fā)育和繁殖中起重要作用。EcR有 五個組件式結(jié)構(gòu)域，A/B (反式激活)、C (DNA結(jié)合，異二聚化)、D (鉸鏈，異二聚化)、E (配體 結(jié)合，異二聚化和反式激活)和F(反式激活)結(jié)構(gòu)域。當(dāng)與其他蛋白融合時，這些結(jié)構(gòu)域 中的一些例如A/B、C和E保持它們的功能。緊密地調(diào)控的可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)或“基因開關(guān)”對于各種應(yīng)用是有用的，其中 所述應(yīng)用例如基因療法、細(xì)胞中蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)、基于細(xì)胞的高通量篩選測定、功能性基 因組學(xué)和轉(zhuǎn)基因植物和動物性狀的調(diào)控。第一種型式的基于EcR的基因開關(guān)使用了黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster) EcR(DmEcR)和小家鼠(Mus musculus) RXR(MmRXR)，并且顯示了這些受體在類固醇松甾酮A 存在下反式激活哺乳動物細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因小鼠中的報道基因(Christopherson等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 :6314_6318 (1992) ；No 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93 3346-3351 (1996))。隨后，Suhr 等，Proc. Natl. Acad. Sci. 95 =7999-8004 (1998)顯示非類 固醇蛻皮素激動劑蟲酰胼通過家蠶(Bombyx mori)EcR(BmEcR)在不存在外源性異二聚體配偶體的情況下誘導(dǎo)了哺乳動物細(xì)胞中報道基因的高水平的反式激活。WO 97/38117和WO 99/58155公開了調(diào)節(jié)外源性基因表達(dá)的方法，其中包括外源性基因和蛻皮素應(yīng)答元件的DNA構(gòu)建體被包括蛻皮素受體的第二 DNA構(gòu)建體所激活，其中 所述蛻皮素受體因此在配體的存在下，或者可選地在能夠作為沉默配偶體起作用的受體 的存在下，結(jié)合至蛻皮素應(yīng)答元件以誘導(dǎo)基因表達(dá)。所選的蛻皮素受體是從黑腹果蠅分離 的。通常，為了提供最佳的激活，這種系統(tǒng)需要沉默配偶體的存在，優(yōu)選地為類視黃醇X受 體(RXR)。在哺乳動物細(xì)胞中，昆蟲蛻皮素受體(EcR)與類視黃醇X受體(RXR)異二聚化， 并以配體依賴的方式來調(diào)控靶基因的表達(dá)。WO 99/02683公開，分離自家蠶的蛻皮素受體在 哺乳動物系統(tǒng)中是有功能的，而不需要外源性二聚體配偶體。US 6，265，173B1公開，受體的類固醇/甲狀腺超家族的各成員可與黑腹果蠅超 氣門受體(USP)或至少包括USP 二聚化結(jié)構(gòu)域的其片段相結(jié)合以用于基因表達(dá)系統(tǒng)。US 5，880，333公開了用在植物中的黑腹果蠅EcR和超氣門(USP)異二聚體系統(tǒng)，在其中反式激 活結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域被置于兩種不同的雜交蛋白上。不幸地，這些基于USP的系統(tǒng) 在動物細(xì)胞中是組成性的，并因此對于調(diào)控報道基因表達(dá)是無效的。在這些情況的每種中，反式激活結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或者作為WO 99/02683 中天然的EcR或者作為WO 97/38117中修飾的EcR)被并入單個分子中，而且另一個異二聚 體配偶體USP或RXR以它們的天然狀態(tài)被使用。上述基于EcR的基因調(diào)控系統(tǒng)的缺點包括在配體不存在時相當(dāng)大的背景活性和 這些系統(tǒng)用于植物和動物二者時的不適用性(參見US5，880，333)。因此，本領(lǐng)域存在改進(jìn) 基于EcR的系統(tǒng)以精確調(diào)節(jié)外源性基因在植物和動物中的表達(dá)的需要。這種改進(jìn)的系統(tǒng)將 有用于一些應(yīng)用，例如基因療法、蛋白和抗體的大規(guī)模生產(chǎn)、基于細(xì)胞的高通量篩選測定、 功能性基因組學(xué)和轉(zhuǎn)基因動物性狀的調(diào)控。對于特定的應(yīng)用例如基因療法，可能期望有一 個可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)，其對合成的非類固醇配體很好地應(yīng)答，并同時對天然類固醇不 敏感。因此，簡單的、緊湊的并依賴于相對便宜的、容易獲得的和對宿主毒性低的配體的改 進(jìn)的系統(tǒng)將被證明對于調(diào)控生物系統(tǒng)是有用的。近來，據(jù)顯示，基于蛻皮素受體的可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)致了在不存在配體的情 況下大大減少的背景活性和在有配體存在的情況下顯著增加的背景活性，在其中所述基因 表達(dá)系統(tǒng)中通過將它們置于兩種不同蛋白上而將反式激活和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域互相分離(參 見WO 01/70816A1，以其整體通過引用并入本文)。與在申請WO 97/38117和WO 99/02683 中公開的兩種系統(tǒng)相比，該雙雜交系統(tǒng)是顯著地改進(jìn)的可誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。所述 雙雜交系統(tǒng)利用一對相互作用蛋白的能力來將轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域帶到相對于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu) 域更有利的位置，以致于當(dāng)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合至基因上的DNA結(jié)合位點時，反式激活結(jié)構(gòu) 域更有效地激活啟動子(參加，例如，US 5，283，173)。簡單說，所述雙雜交基因表達(dá)系統(tǒng)包 括兩個基因表達(dá)盒；編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一個融合至核受體多肽，而且編碼反式激活 結(jié)構(gòu)域的第二個融合至不同的核受體多肽。在配體存在下，第一多肽與第二多肽的相互作 用有效地將DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域束縛在反式激活結(jié)構(gòu)域上。由于DNA結(jié)合和反式激活結(jié)構(gòu)域位 于兩個不同分子上，在不存在配體的情況下背景活性大大減少。當(dāng)與類固醇配體例如松甾酮A( “PonA”)或米樂甾酮(“MurA”)相比時，雙雜交 系統(tǒng)還提供對非類固醇配體例如二?；菰鰪姷拿舾行?。那就是，當(dāng)與類固醇比較時，非類固醇配體在較低濃度下提供更高活性。另外，因為基于EcR基因開關(guān)的反式激活通常是細(xì) 胞系依賴性的，所以較容易為每種應(yīng)用定制基因開關(guān)系統(tǒng)以獲得最大的反式激活能力。此 夕卜，雙雜交系統(tǒng)避免一些由于RXR過表達(dá)的副作用，而所述過表達(dá)通常發(fā)生在將未被修飾 的RXR用作異二聚體受體的配偶體之時。在一個雙雜交系統(tǒng)中，EcR或RXR的天然DNA結(jié) 合和反式激活結(jié)構(gòu)域被消除，因此這些雜交分子具有更少的與存在于細(xì)胞中的其他類固醇 受體相互作用的機會，并導(dǎo)致減少的副作用。另外的基因開關(guān)系統(tǒng)包括描述在下面的那些， 其中每一種都通過引用被并入US 7，091, 038、W02004078924、EP1266015、US20010044151、 US20020110861、 US20020119521、 US20040033600、 US20040197861、 US20040235097、 US20060020146、US20040049437、US20040096942、US20050228016、US20050266457、 US20060100416、W02001/70816、W02002/29075、W02002/066612、W02002/066613、 W02002/066614、W02002/066615、W02005/108617、US 6，258，603、US20050209283、 US20050228016、US20060020146、EP0965644、US7, 304，162、US 7，304，161、MX234742、 KR10-0563143, AU765306,AU2002-248500 和 AU2002-306550。隨著基于蛻皮素受體的基因調(diào)控系統(tǒng)的改進(jìn)，它們在各種應(yīng)用中的使用增加了， 這導(dǎo)致了對于比目前存在的那些具有更高活性的配體的需求的增加。US 6，258，603B1、US 2005/0209283A1和US 2006/0020146A1 (以及其中所引用的專利)公開了二苯甲酰胼配體。 然而，還存在對于具有改進(jìn)的藥學(xué)特性的另外配體的需要。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了之前未被描 述過的手性二酰基胼配體，其具有令人吃驚的生物活性和以預(yù)料不到的方式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表 達(dá)的能力。發(fā)明概述本發(fā)明提供與基于蛻皮素受體的可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)一起使用的式I的二?；?胼配體和式II或III的手性二酰基胼配體，其中所述基于蛻皮素受體的可誘導(dǎo)基因表達(dá)系 統(tǒng)對于調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中感興趣的靶基因的表達(dá)是有用的。本發(fā)明的手性二?；菖潴w以 R-或S-立體異構(gòu)體的形式對映體富集。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些新的手性二?；菖潴w令人 吃驚地有效。因此，本發(fā)明有用于應(yīng)用例如基因療法、蛋白和抗體的大規(guī)模生產(chǎn)、基于細(xì)胞 的篩選測定、功能性基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝物組學(xué)和轉(zhuǎn)基因生物體性狀的調(diào)控，其中基 因表達(dá)水平的控制是期望的。本發(fā)明的優(yōu)勢是，它提供一種調(diào)控基因表達(dá)并定制表達(dá)水平 以適應(yīng)使用者的要求的方法。本發(fā)明涉及式I的化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形 形式
其中A是烷氧基、芳烷氧基或芳氧基；B是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；并且R1和R2獨立是可選地取代的烷基、芳烷基、羥烷基、商代烷基、可選地取代的環(huán)烷 基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對映體富集的式II的化合物或者其藥學(xué)上可 接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式

其中A是烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、芳烷基、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳 基；B是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；并且R1和R2獨立是可選地取代的烷基、芳烷基、羥烷基、商代烷基、可選地取代的環(huán)烷 基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選 地取代的雜芳基；條件是R1不等同于R2;其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型主要為S。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對映體富集的式III的化合物或者其藥學(xué)上可 接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式 其中A是烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、芳烷基、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳 基；B是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；并且R1和R2獨立是可選地取代的烷基、芳烷基、羥烷基、商代烷基、可選地取代的環(huán)烷 基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選 地取代的雜芳基；條件是R1不等同于R2;其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型主要為R。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有至少95%的對映體過量的(R)-3，5_ 二甲 基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁基)-N' -(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)_酰胼或其藥學(xué) 上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包括具有至少95%的對映 體過量的(R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N' -(2-乙基-3-甲氧基-苯 甲酰)_酰胼或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式。本發(fā)明還涉及式IV的化合物的制備過程 其中A是芳烷基、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；B是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；R2是可選地取代的烷基、芳烷基、羥烷基、商代烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地 取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代的雜
芳基；條件是R2不等同于-CR8R9CHRiqCR11R12 ；并且R8、R9、R10, R11和R12獨立選自氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)、芳基或雜芳基；其中R2所連接的不對稱碳原子以R或S異構(gòu)體的形式對映體富集；所述過程包括a)將式V的化合物 與式VI的化合物進(jìn)行反應(yīng)R2HC = N-NH-CO2R7式 VI其中X和Y獨立為0或NR，其中R是烷基或芳基；Ca和Cb獨立為S構(gòu)型的不對稱碳原子或R構(gòu)型的不對稱碳原子；R14和R15獨立為烷基或芳基；R13是鹵素、氫、烷基、烷氧基或OSO2CF3 ；R7是烷基、芳烷基或芳基；并且R2、R8、R9、R10, R11和R12具有上述相同的含義；以形成式VII的化合物； b)將式VII的化合物還原以形成式VIII的化合物； c)將式VIII的化合物與式B-CO-LG的化合物進(jìn)行反應(yīng)以形成式IX的化合物，其 中LG是離去基團；
d)將式IX的化合物的R7CO2-基團移除以形成式X的化合物；并且 e)將式X的化合物與式A-CO-LG的化合物進(jìn)行反應(yīng)以形成式IV的化合物，其中 LG是離去基團。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，其使用帶有式I的二?；菖潴w 或者式II或III的手性二?；菖潴w的基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的二酰基胼配體或者式II或III的手性二酰 基胼配體在可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)中的用途，其中所述可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)具有水平降 低的背景基因表達(dá)并對配體的亞微摩爾濃度進(jìn)行應(yīng)答。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法，其中所述 宿主細(xì)胞包括第一基因表達(dá)盒，其包括編碼第一多肽的第一多核苷酸，其包括i)反式激活結(jié)構(gòu)域；ii) DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和iii)組H核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及第二基因表達(dá)盒，其包括i)能夠結(jié)合至所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的應(yīng)答元件；ii)由反式激活結(jié)構(gòu)域所激活的啟動子；和iii)所述靶基因；所述方法包括將所述宿主細(xì)胞與式I的二酰基胼配體或者式II或III的手性二 ?；菖潴w相接觸；其中靶基因的表達(dá)受到調(diào)節(jié)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)控轉(zhuǎn)基因受試者中內(nèi)源性或異源性基因的 表達(dá)的方法，其包括將配體與所述受試者的細(xì)胞中的蛻皮素受體復(fù)合物相接觸，其中所述 細(xì)胞在與配體結(jié)合時還包含蛻皮素受體復(fù)合物的DNA結(jié)合序列，而且其中蛻皮素受體復(fù)合 物_配體-DNA結(jié)合序列復(fù)合物的形成誘導(dǎo)基因表達(dá)，而且其中所述配體是式I的二酰基胼 配體或者式II或III的手性二?；菖潴w，其中轉(zhuǎn)基因受試者的內(nèi)源性或異源性基因表達(dá) 受到調(diào)控。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法，其包括步 驟a)將基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)引入宿主細(xì)胞，所述基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括i)第一基因表達(dá)盒，其能夠被表達(dá)在宿主細(xì)胞中，所述第一基因表達(dá)盒包括編碼 第一雜交多肽的多核苷酸序列，其包括(a)識別與其表達(dá)待調(diào)節(jié)的基因締合的應(yīng)答元件的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和
(b)蛻皮素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；ii)第二基因表達(dá)盒，其能夠被表達(dá)在宿主細(xì)胞中，所述第二基因表達(dá)盒包括編碼 第二雜交多肽的多核苷酸序列，其包括(a)反式激活結(jié)構(gòu)域；和 (b)嵌合的類視黃醇X受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及iii)第三基因表達(dá)盒，其能夠被表達(dá)在宿主細(xì)胞中，所述第三基因表達(dá)盒包括多 核苷酸序列，其包括(a)被第一雜交多肽的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域所識別的應(yīng)答元件；(b)被第二雜交多肽的反式激活結(jié)構(gòu)域所激活的啟動子；和(c)其表達(dá)將受到調(diào)節(jié)的基因；以及b)將式I的二?；菖潴w或者式II或III的手性二酰基胼配體引入宿主細(xì)胞，其 中宿主細(xì)胞的基因表達(dá)受到調(diào)節(jié)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生多肽的方法，其包括步驟a)選擇一種細(xì)胞，其對暴露于式I的二?；菖潴w或者式II或III的手性二酰基 胼配體基本上不敏感；b)將下述引入細(xì)胞i) DNA構(gòu)建體，其包括(a)編碼所述多肽的外源性基因；和(b)應(yīng)答元件；其中所述基因是在所述應(yīng)答元件的控制下；以及ii)蛻皮素受體復(fù)合物，其包括(a)結(jié)合至應(yīng)答元件的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(b)所述配體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(c)反式激活結(jié)構(gòu)域；以及C)將所述細(xì)胞暴露于所述配體；其中多肽被產(chǎn)生。本發(fā)明的該實施方案提供在時間上控制細(xì)胞中多肽產(chǎn)生的優(yōu)勢。此外，在那些情 況下當(dāng)這種多肽的聚集能破壞細(xì)胞時，所述多肽的表達(dá)可通過將所述細(xì)胞暴露于本發(fā)明的 化合物而被限制在短時段內(nèi)。這種控制在當(dāng)外源性基因是治療基因時特別地重要?？梢允?用治療基因來產(chǎn)生控制所需功能的多肽，例如糖尿病患者中胰島素的產(chǎn)生。它們還可被用 來產(chǎn)生破壞性的或甚至致死性的蛋白，例如對癌細(xì)胞致死的那些。當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白水平可 構(gòu)成例如轉(zhuǎn)基因植物中生長或繁殖的代謝消耗時，這種控制還可以是重要的。附圖簡述

圖1 開關(guān)構(gòu)建體CVBE和報道分子構(gòu)建體6XEcRE Lac Z的示意圖。兩種構(gòu)建體的 兩側(cè)都是長末端重復(fù)序列，G418和嘌呤霉素是可選的標(biāo)志物，CMV是細(xì)胞巨化病毒啟動子， VBE是被插入VP16反式激活結(jié)構(gòu)域下游的家蠶EcR的氨基酸26-546的編碼序列，6X EcRE 是六個拷貝的蛻皮素應(yīng)答元件，IacZ編碼報道酶β -半乳糖苷酶。圖2A-2C:㈧外消旋-、(B) (R)-和(C) (S)_3，5_ 二甲基-苯甲酸 N-(1-叔-丁 基-丁基)-N' - (2，6- 二氯-苯甲酰)-酰胼的手性HPLC對比。圖3 顯示體內(nèi)對比外消旋_、(R)-和(S)-2_乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5-二甲基-苯甲酰)-酰胼對于小鼠中尺11€08\^^11 治療系統(tǒng)基因表達(dá)的誘導(dǎo)的圖。實心圓圈是S對映體，實心三角是外消旋物，而空心圓圈是 R對映體。圖4 :2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(I-叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲 基_苯甲酰)_酰胼的外消旋物和R對映體樣品批的表格。通過從甲醇/水或甲苯/庚 烷的快速結(jié)晶/沉淀獲得的R對映體的樣品產(chǎn)生了相同的粉末X-射線衍射圖形(數(shù)據(jù) 未顯示)，并且具有互相比較基本上相同的熔點([甲苯/庚烷]166. 2-167. 1°C，[CH3OH/ H2O] 166. 5-167. 4°C )，以及與得自CH3OH結(jié)晶的標(biāo)準(zhǔn)(165. 1-166. 5°C )相比基本相同的熔 點。通過甲醇蒸發(fā)獲得的外消旋物兩種分開的制劑的樣品顯示在實驗誤差內(nèi)相同的熔點 (170-171 °C，169-170°C )和純度的輕微變動。圖5 顯示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二 甲基-苯甲酰)_酰胼的微粒化的R對映體的粒度分布的表格。圖6 顯示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二 甲基_苯甲酰)_酰胼的微?；耐庀锏牧６确植嫉谋砀?。圖7 顯示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _ (1_叔-丁基-丁基)-N' -(3，5-二 甲基-苯甲酰)-酰胼的微?；耐庀锖蚏對映體的堆密度和拍實密度分析的表格。圖8 :2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲 基-苯甲酰)_酰胼的微粒化的外消旋物和R對映體的熱重分析/差熱分析(TGA/DTA)(熱 繪圖)證明了不同的結(jié)晶形式。批號REH-28-9-l和REH-28-4-2 ；樣品重量7. 71994mg。 信號輸出的單位是uV每mg樣品(uV/mg)；熱重-樣品的百分比重量改變(TG% )。兩種物 質(zhì)都在DTA概況上顯示吸熱作用。R對映體的起始溫度(163. 6°C)比外消旋物的起始溫度 (171. 20C )顯著較低。R對映體的熔化熱(59. 8uv. s/mg)比外消旋物的熔化熱(80. 8uv. s/ mg)顯著較低。圖9 顯示藥物賦形劑中2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁 基)-N' - (3，5- 二甲基-苯甲酰)-酰胼的外消旋物和R對映體的定性對比溶解度測試的 表格。圖10 顯示熱力學(xué)平衡測定(90°C下進(jìn)行5分鐘或所指示的時間；處理2)結(jié)果的 表格，所述測定之后冷卻到室溫并將2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁 基)-N' -(3，5- 二甲基_苯甲酰)_酰胼的外消旋物和R對映體的晶種放入藥物賦形劑。 處理1是在室溫下攪拌彡2. 5小時的結(jié)果。圖11 顯示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_二 甲基-苯甲酰)-酰胼的外消旋物和R對映體在20% PEG 1000的蒸餾水溶液(pH 7.0)中 的溶解度(μΜ)的表格。圖12:顯示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_二 甲基-苯甲酰)_酰胼的外消旋物和R對映體在水性聚山梨醇酯80中的溶解度的表格。圖13:顯示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_二 甲基-苯甲酰)-酰胼的外消旋物和R對映體穿過Caco-2細(xì)胞單層的雙向通透性的表格。 a 通透性分類(Papp A — B) <1. OX 10-6cm/s =低；(Papp A — B) > 1. OX 10_6cm/s = 高;b 顯著外流外流> 3. 0 且(Papp B — A) > 1. 0 X 10_6cm/s。
圖14:顯示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_二 甲基-苯甲酰)-酰胼的外消旋物和R對映體在MDR1-MDCK細(xì)胞中的通透性的表格。分類 A-B Papp > 3. 0且外流比率< 3. 0 高。A-B Papp > 3. 0且10 >外流比率> 3. 0 中等。 A-B Papp > 3. 0 且外流比率> 10 低。A-B Papp < 3. 0 低。圖15:顯示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_二 甲基-苯甲酰)_酰胼的外消旋物和R對映體在人肝臟微粒體中的穩(wěn)定性的表格。圖16:顯示2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_二 甲基-苯甲酰)-酰胼的外消旋物和R對映體/Labrasol制劑在C57BL/6N =Crl小鼠中的給 藥計劃的表格。a給藥施用9天(第一次18只雌性動物/組)或12天(第二次18只雌性 動物/組)；b作為可能的替換而被包括。
圖17 :2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲 基-苯甲酰)_酰胼外消旋物的非微粒化和微?；瘶悠返娘@微照片。注意50微米的參考刻度。圖18 顯示在藥物施用9天后和日劑量之后數(shù)小時后以4種劑量水平(3、10、30 和50mg/kg/天)施用于Labrasol中的2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁 基)-N' -(3，5- 二甲基_苯甲酰)_酰胼的外消旋物和R對映體的血清水平的表格。圖19 顯示在藥物施用12天后和日劑量之后數(shù)小時后以4種劑量水平(3、10、30 和50mg/kg/天)施用于Labrasol中的2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁 基)-N' -(3，5- 二甲基_苯甲酰)_酰胼的外消旋物和R對映體的血清水平的表格。圖20 :pCMV/GEVY(DEF)質(zhì)粒的圖示。質(zhì)粒pCMV/GEVY(DEF)由來自云杉色卷蛾的 EcR的D、E和F結(jié)構(gòu)域所組成，其載有被融合到酵母GAL4-DBD (aa 1-147)下游并受到CMV 啟動子和pBIND載體(PromegaCorporation，Madison, WI，USA)下游的SV40多腺苷酸化信 號控制的突變V390I/Y410E/E274V。使用基于5，和3，末端的20_25nt序列而設(shè)計的引物 將所示的EcR的DEF結(jié)構(gòu)域擴增。將限制性內(nèi)切酶位點BamH I和XbaI分別加到5’和3’ 弓丨物。使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物并克隆進(jìn)pBIND載體。圖 21 :pCMV/VP16-Hs-LmRXR 載體的圖示。pCMV/VP16-Hs_LmRXR 載體含有來自人 類RXR0 (E結(jié)構(gòu)域的螺旋1-8)和飛蝗(Locustamigratoria)RXR(E結(jié)構(gòu)域的螺旋9-12)的 嵌合RXR，其被融合到VP16激活結(jié)構(gòu)域的下游并被置于pBIND載體中CMV啟動子的控制之 下。圖22 :p6xGAL4RE-TTR-SEAP報道載體的圖示?？烧T導(dǎo)的SEAP報道載體 p6xGAL4RE-TTR-SEAP含有人類分泌的堿性磷酸酶報道基因，其被置于可誘導(dǎo)的啟動子的控 制之下，所述啟動子由在運甲狀腺素蛋白(TTR)啟動子上游的6拷貝的Gal4應(yīng)答元件所組 成。圖23 :Ad-RTS-hIL-12的圖示，其中El和E3區(qū)域缺失而且RTS-IL12成分代替El 區(qū)域。圖24 顯示在注射了由Ad. RheoSPl-mIL12質(zhì)粒感染的B16細(xì)胞并以0、3、10、30、 50mg/kg/天的劑量施用了二酰基胼的R對映體或外消旋物之后，mIL12p70在腫瘤和血清中 表達(dá)的圖。對照只接受3天50mg/kg/天的劑量的配體的未被轉(zhuǎn)導(dǎo)的載有B16的小鼠(配 體50)和未被處理的(無配體)載有腫瘤的小鼠(腫瘤對照)?！癓3d后中斷3d”使用配體處理3天然后在接下來另外3天中不提供配體的小鼠。圖25 顯示在注射了由Ad. RheoSPl-mIL12質(zhì)粒感染的B16細(xì)胞并以0、3、10、30、 50mg/kg/天的劑量施用了二?；莸腞對映體或外消旋物之后，mIFN-y在腫瘤和血清中 表達(dá)的圖。對照只接受3天50mg/kg/天的配體的未被轉(zhuǎn)導(dǎo)的載有B16的小鼠(配體50) 和未被處理的(無配體)載有腫瘤的小鼠(腫瘤對照)。“L3d后中斷3d”:使用配體處理3 天然后在接下來另外3天中不提供配體的小鼠。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及式I的化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形 形式 其中A是烷氧基、芳烷氧基或芳氧基；B是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；并且R1和R2獨立是可選地取代的烷基、芳烷基、羥烷基、商代烷基、可選地取代的環(huán)烷 基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選 地取代的雜芳基。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對映體富集的式II的化合物或者其藥學(xué)上可 接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式
R V^L R2
οA式 11
aK Υ
M O其中A是烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、芳烷基、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳 基；B是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；并且R1和R2獨立是可選地取代的烷基、芳烷基、羥烷基、商代烷基、可選地取代的環(huán)烷 基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選 地取代的雜芳基；條件是R1不等同于R2;其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型主要為S。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對映體富集的式III的化合物或者其藥學(xué)上可 接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式
其中A是烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、芳烷基、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳 基；B是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；并且R1和R2獨立是可選地取代的烷基、芳烷基、羥烷基、商代烷基、可選地取代的環(huán)烷 基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選 地取代的雜芳基；條件是R1不等同于R2;其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型主要為R。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對映體富集的式II或III的化合物或者其藥學(xué) 上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式，其中A是-OC (CH3) 3、-OCH2PK可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；B是可選地取代的芳基；R1是可選地取代的(C1-C6)烷基、羥基(C1-C4)烷基或可選地取代的(C2-C6)烯基； 并且R2是可選地取代的(C1-C6)烷基、芳基(C1-C4)烷基、可選地取代的(C3-C7)環(huán)烷基 或可選地取代的芳基；條件是R1不等同于R2;其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型在式II中主要為S ；并且在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型在式III中主要為R。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對映體富集的式II或III的化合物或者其藥學(xué) 上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式，其中A是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；B是可選地取代的芳基；R1是可選地取代的(C1-C6)烷基、羥基(C1-C4)烷基或可選地取代的(C2-C6)烯基； 并且R2是可選地取代的(C1-C6)烷基、芳基(C1-C4)烷基、可選地取代的(C3-C7)環(huán)烷基 或可選地取代的芳基；條件是R1不等同于R2;其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型在式II中主要為S ；并且在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型在式III中主要為R。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對映體畜集的式II或III的化合物或者其藥學(xué) 上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式，其中
A 是 R3\ R3\ R3。、R3d和R3e獨立選自氫、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、可選地取代的烷 基、鹵代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔 基、可選地取代的芳基、可選地取代的雜芳基、可選地取代的雜環(huán)、烷氧基、芳氧基、芳烷氧 基、烷硫基、羧酰氨基、亞磺酰氨基、-C0R\ -SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re) SO2Rg 或-N(IT)C = N(Rh)-氨基；或者R3a和R3b與它們所連接的碳原子一起形成五、六或七元的融合環(huán)烷基或雜環(huán)的環(huán)； 或者R3b和R3e與它們所連接的碳原子一起形成五、六或七元的融合環(huán)烷基或雜環(huán)的 環(huán)；R4\ R4\ R4。、R5\ R5\ R6a、R6b和R6c獨立選自氫、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、可 選地取代的烷基、商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可 選地取代的炔基、可選地取代的芳基、可選地取代的雜芳基、可選地取代的雜環(huán)、烷氧基、 芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亞磺酰氨基、-C0R\ -SO2Rd, -N (Re) CORf、-N(Re) SO2Rg 或-N(Re)C = N(Rh)-氨基;X是 或 S;B 是 并且；R3f、R3g、R3h、R3i和R3j獨立選自氫、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、可選地取代的烷 基、鹵代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔 基、可選地取代的芳基、可選地取代的雜芳基、可選地取代的雜環(huán)、烷氧基、芳氧基、芳烷氧 基、烷硫基、羧酰氨基、亞磺酰氨基、-C0R\ -SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re) SO2Rg 或-N(Re)C = N(Rh)-氨基；或者R3f和R3g與它們所連接的碳原子一起形成五、六或七元的融合環(huán)烷基或雜環(huán)的環(huán)；或者R3g和R3h與它們所連接的碳原子一起形成五、六或七元的融合環(huán)烷基或雜環(huán)環(huán)；其中IT是氫、羥基、商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷 基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基、可選地 取代的雜芳基、烷氧基、芳氧基或芳烷氧基；Rd是商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地 取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代的雜
芳基；Re是氫、商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可 選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代 的雜芳基；Rf是氫、商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可 選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基、可選地取代 的雜芳基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基或氨基；Rg是商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地 取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基、可選地取代的雜
芳基或氨基；Rh是氫、烷基、芳基、氰基或硝基；R1是可選地取代的(C1-C6)烷基、羥基(C1-C4)烷基或可選地取代的(C2-C6)烯基； 并且R2是可選地取代的(C1-C6)烷基、芳基(C1-C4)烷基、可選地取代的(C3-C7)環(huán)烷基 或可選地取代的芳基；條件是R1不等同于R2;其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型在式II中主要為S ；并且在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型在式III中主要為R。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對映體富集的式II的化合物或者其藥學(xué)上可 接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式，其中A、B、R3a、R3b、R3c、R3d、R3e、R3f、R3g、R3h、R3i、R3J、R4a、R4b、R4c、R5a、R5b、R6a、R6b、R6c 和 X 具有與上述相同的含義；R1是(C1-C6)烷基、羥基(C1-C4)烷基或(C2-C4)烯基；并且R2是可選地取代的(C3-C7)環(huán)烷基；其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型主要為S。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對映體富集的式III的化合物或者其藥學(xué)上可 接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式，其中A、B、R3a、R3b、R3c、R3d、R3e、R3f、R3g、R3h、R3i、R3J、R4a、R4b、R4c、R5a、R5b、R6a、R6b、R6c 和 X 具有與上述相同的含義；
R1是(C1-C6)烷基、羥基(C1-C4)烷基或(C2-C4)烯基；并且R2是可選地取代的(C1-C6)烷基；條件是R1不等同于R2;其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型主要為R。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及對映體富集的式II的化合物或者其藥學(xué)上可接 受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式，其中A 是 B 是 R3a、R3b、R3。、R3d、R3e、R3f、R3g、R3h、R3i 和 R3j 獨立選自氫、鹵素、(CrC4)烷基或(C1-C4) 烷氧基；R1是(C1-C6)烷基、羥基(C1-C4)烷基或(C2-C4)烯基；并且R2是可選地取代的(C3-C7)環(huán)烷基；其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型主要為S。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對映體富集的式III的化合物或者其藥學(xué)上可 接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式，其中A 是 B 是 R3a、R3b、R3。、R3d、R3e、R3f、R3g、R3h、R3i 和 R3j 獨立選自氫、鹵素、(C「C4)烷基或(C「C4)
烷氧基；R1是(C1-C6)烷基、羥基(C1-C4)烷基或(C2-C4)烯基；并且R2是可選地取代的(C1-C6)烷基；其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型主要為R。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對映體富集的式II的化合物，其具有S異構(gòu)體 的至少50%、75%、85%、95%或> 99%的對映體過量。在一個實施方案中，式II的化合物 基本上由S異構(gòu)體組成。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對映體富集的式III的化合物，其具有R異構(gòu)體 的至少50%、75%、85%、95%或> 99%的對映體過量。在一個實施方案中，式III的化合 物基本上由R異構(gòu)體組成。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包括式I、II或III的化合 物。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁 基)-N' - (2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰胼，其具有至少95%或至少99%的對映體過 量，或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式。在一個實施方案中，所述化合 物是對映體純的。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包括(R)-3，5_ 二甲基-苯 甲酸N- (1-叔-丁基-丁基)-N' - (2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)_酰胼，其具有至少95% 或至少99%的對映體過量，或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式。在一 個實施方案中，所述化合物是對映體純的。意外地發(fā)現(xiàn)，對映體純的(R)-3，5- 二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁 基)-N' -(2-乙基-3-甲氧基_苯甲酰)_酰胼具有組合在一起的有益特性，其使之獨特 地適合體內(nèi)藥物用途。這種特性包括與外消旋物相比更低的熔點和較低的熔化熱(實施例 68)；在許多液體藥物賦形劑中與外消旋物相比更好的溶解度(實施例68)；在特定細(xì)胞中 與外消旋物相比更好的通透性(實施例69)；與外消旋物相比更可能跨越血腦屏障(實施 例69)；與外消旋物相比具有更穩(wěn)定的肝細(xì)胞代謝(實施例70)；當(dāng)作為Labrasol溶液或懸 浮液口服施用時獲得與外消旋物相比顯著更高的血漿水平(實施例71)；并且通過激活基 于EcR的基因開關(guān)而獲得與外消旋物相比更高的體內(nèi)基因表達(dá)(實施例72)。本發(fā)明還涉及式IV的化合物的制備過程 其中A是芳烷基、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；B是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基； R2是可選地取代的烷基、芳烷基、羥烷基、商代烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地 取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代的雜
芳基；條件是R2不等同于-CR8R9CHRIQCR11R12 ；并且R8、R9、R10, R11和R12獨立選自氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)、芳基或雜芳基；其中R2所連接的不對稱碳原子以R或S異構(gòu)體的形式對映體富集；所述過程包括a)將式V的化合物 與式VI的化合物進(jìn)行反應(yīng)R2HC = N-NH-CO2R7式 VI其中X和Y獨立為0或NR，其中R是烷基或芳基；Ca和Cb獨立為S構(gòu)型的不對稱碳原子或R構(gòu)型的不對稱碳原子；R14和R15獨立為烷基或芳基；R13是鹵素、氫、烷基、烷氧基或OSO2CF3 ；R7是烷基、芳烷基或芳基；并且R2、R8、R9、R10, R11和R12具有上述相同的含義；以形成式VII的化合物； b)將式VII的化合物還原以形成式VIII的化合物； c)將式VIII的化合物與式B-CO-LG的化合物進(jìn)行反應(yīng)以形成式IX的化合物，其 中LG是離去基團； d)將式IX的化合物的R7C02-基團移除以形成式X的化合物；并且
力0。

12式Xe)將式X的化合物與式A-C0-LG的化合物進(jìn)行反應(yīng)以形成式IV的化合物，其中 LG是離去基團。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及制備式IV的化合物的過程，其中R8、R9、R10, R11
和R12是氫。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及制備式IV的化合物的過程，其中！^！^尺“^！？“和！^是氫；X是NR并且R是甲基；Y 是 0 ；R14 是甲基；R15是苯基；并且Ca和Cb中每個都是R構(gòu)型的。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及制備式IV的化合物的過程，其中！^！^尺“^！？“和！^是氫；X是NR并且R是甲基；Y 是 0 ；R14 是甲基；R15是苯基；并且Ca和Cb中每個都是S構(gòu)型的。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及制備式IV的化合物的過程，其中！^！^尺“^?。俊昂?！^是氫；X是NR并且R是甲基；Y 是 0 ；R14 是甲基；R15 是苯基；Ca和Cb中每個都是S構(gòu)型的；并且B 是 3，5-二甲苯基。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及制備式IV的化合物的過程，其中！^！^?。俊癪??？“和！^是氫;X是NR并且R是甲基；Y 是 0 ；R14 是甲基；R15 是苯基；Ca和Cb中每個都是S構(gòu)型的；并且A是2-乙基-3-甲氧苯基。
28
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及制備式IV的化合物的過程，其中
是氫；X是NR并且R是甲基；Y 是 0;R14 是甲基；R15 是苯基；Ca和Cb中每個都是S構(gòu)型的；并且R2 是叔-丁基。本發(fā)明還涉及制備式II或III的化合物的過程，其包括a)將式XI的?；?與式XII的酮進(jìn)行反應(yīng) 以形成式XIII的化合物；其中R1不等同于R2;b)將式XIII的化合物在手性催化劑的存在下還原以形成式S-XIV或R-XIV的化 合物；并且
c)將式S-XIV或R-XIV的化合物與式B_C0_LG的化合物進(jìn)行反應(yīng)以形成式II或 III的化合物，其中LG是離去基團。本發(fā)明的式I的二?；莅ǖ幌抻谕庀?N' - (1-叔-丁基-丁基)-N' - (3，5- 二甲基-苯甲酰)-胼羧酸芐酯； 或外消旋-N' -(1-叔丁基-丁基)_N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)_胼羧酸叔丁酯。本發(fā)明的式II或III的手性二酰基胼包括但不限于(S)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l_環(huán)己基-丁基)_N' _(2_乙基_3_甲氧基-苯 甲酰)_酰胼；(S)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l_環(huán)己基-丁基)_N' _(3_甲氧基-苯甲酰)-酰 胼；(S)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l_環(huán)己基-丁基)_N' _(4_甲基-苯甲酰)-酰胼
oR R2
式 S-XIV M MU 式 R-XIV
A入 NTNH
29
(R)-N'-(1-叔 __ 丁基_-丁基)-N' -(3，5-二甲基-苯甲酰)_胼羧酸芐酯；
(R)-N'-(1-叔-_ 丁基_丁基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-胼羧酸叔-丁酯；
(R)-N'-(1-叔 __ 丁基_-4-羥基-丁基)_N' -(3,5-二甲基-苯甲酰)-胼羧酸芐酯；
(R)-N'-(1-叔 __ 丁基_-4-羥基-丁基)_N' -(3,5-二甲基-苯甲酰)-胼羧酸芐酯；
(R)-3,5-二甲基_苯甲酉髮 N-(l-叔-丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)_-酰胼
(R)-3,5-二甲基-苯甲■浚N'-苯甲酰-N-(l-叔-丁基-丁基)-酰胼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲IltN-(l-叔-丁基-丁基)-N'-(2-甲基-苯甲酰)_酰胼；
(R)-3,5-二甲基_-苯甲S|N-(1-叔-丁基-丁基)-N'_(2_甲氧基-苯甲酰)_酰胼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲IltN-(l-叔-丁基-丁基)-N'-(2-氟代-苯甲酰)_酰胼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲IltN-(l-叔-丁基-丁基)-N'-(2-氯代-苯甲酰)_酰胼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲ItN' -(2-溴代-苯甲酰)-N-(1-叔-丁基-丁基)_酰胼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲IltN-(l-叔-丁基-丁基)-N'-(3-甲基-苯甲酰)_酰胼；
(R)-3,5-二甲基_-苯甲S|N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(3-甲氧基-苯甲酰)-酰胼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲IltN-(l-叔-丁基-丁基)-N'-(3-氯代-苯甲酰)_酰胼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲IltN-(l-叔-丁基-丁基)-N'-(4-甲基-苯甲酰)-酰胼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲IltN-(l-叔-丁基-丁基)-N'-(4-乙基-苯甲酰)_酰胼；
(R)-3,5-二甲基_-苯甲S|N-(1-叔-丁基-丁基)-N'-(4-甲氧基-苯甲酰)-酰胼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲IltN-(l-叔-丁基-丁基)-N'-(4-氯代-苯甲酰)_酰胼；
(R)-3,5-二甲基_-苯甲S|N-(1-叔-丁基-丁基)-N'_(2，6_ 二氟-苯甲酰)-酰胼；
(R)-3,5-二甲基_-苯甲S|N-(1-叔-丁基-丁基)-N'_(2，6_ 二氟-苯甲酰)-酰胼；
(R)-3,5-二甲基-苯甲5脧N-(l-叔-丁基-丁基)-N‘_(3，4_ 二甲氧基-苯甲
酰)-酰胼；
(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l_叔-丁基-丁基)-N' _ (3，5_ 二氟-苯甲酰)-酰 胼；(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸 N-(l-叔-丁基-丁基)-N' - (3，5-二 甲氧基 _4_ 甲 基-苯甲酰)_酰胼；(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸 N-(l-叔-丁基-丁基)-N' -(4-甲基-苯并[1，3] 間二氧雜環(huán)戊烯-5-羰基)-酰胼；(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸 N-(l_ 叔-丁基-丁基)-N' - (5_ 甲基 _2，3_ 二氫-苯 并[1，4] 二氧雜環(huán)己烯-6-羰基)-酰胼；(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸 N-(l_ 叔-丁基-丁基)-N' - (5-乙基-2，3_ 二氫-苯 并[1，4] 二氧雜環(huán)己烯-6-羰基)-酰胼；(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l_叔-丁基-丁基)-N' _ (萘羰基)_酰胼；(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l_叔-丁基-丁基)-N' _ (萘_2_羰基)-酰胼；(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁基)-N' _(噻吩_2_羰基)-酰 胼；(R)-3，5_二甲基-苯甲酸N-(l_叔-丁基-丁基)-N' -(2，5_二甲基-呋喃_3_羰 基)_酰胼；(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁基)-N' _(2_氯代-吡啶_3_羰 基)_酰胼；(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁基)-N' _(6_氯代-吡啶_3_羰 基)_酰胼；(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l_叔-丁基-丁基)-N' - (3_甲氧基_2_甲基-苯 甲酰)_酰胼；(R)-3，5_ 二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁基)-N' _(3_甲氧 基-2-甲基-苯甲酰)_酰胼；和(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N' _ (4_乙基-苯甲酰)_N_ (1_苯乙基-丁 _3_烯 基)_酰胼。式II或III的手性二酰基胼可在分子的其他部分含有手性中心(即，不在含有R1 和R2的非對稱碳原子處)。所有可能的對映體、非對映體和立體異構(gòu)體旨在被包括在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，其使用帶有式I的二?；菖潴w 或者式II或III的手性二?；菖潴w的基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的二?；菖潴w或者式II或III的手性二酰 基胼配體在可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)中的用途，所述可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)在不存在配體的 情況下具有水平降低的背景基因表達(dá)并對亞微摩爾濃度的配體進(jìn)行應(yīng)答。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法，其中所述 宿主細(xì)胞包括第一基因表達(dá)盒，其包括編碼第一多肽的第一多核苷酸，其包括i)反式激活結(jié)構(gòu)域；ii)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和iii)組H核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
以及第二基因表達(dá)盒，其包括i)能夠結(jié)合至所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的應(yīng)答元件；ii)由反式激活結(jié)構(gòu)域所激活的啟動子；和iii)所述靶基因；所述方法包括將所述宿主細(xì)胞與式I的二?；菖潴w或者式II或III的手性二 酰基胼配體相接觸；其中靶基因的表達(dá)受到調(diào)節(jié)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中感興趣的基因的表達(dá)的方法， 其中所述宿主細(xì)胞包括第一重組基因表達(dá)盒，其包括編碼第一多肽的第一多核苷酸，其包 括i)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和ii)組H核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及第二重組基因表達(dá)盒，其包括i)能夠結(jié)合至所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的應(yīng)答元件；ii)啟動子；和iii)所述感興趣的基因；所述方法包括將所述宿主細(xì)胞與式I的二?；菖潴w或者式II或III的手性二 ?；菖潴w相接觸；其中感興趣的基因的表達(dá)受到調(diào)節(jié)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)控轉(zhuǎn)基因受試者中內(nèi)源性或異源性基因的 表達(dá)的方法，其包括將配體與所述受試者的細(xì)胞中的蛻皮素受體復(fù)合物相接觸，其中所述 細(xì)胞在與配體結(jié)合時還包含蛻皮素受體復(fù)合物的DNA結(jié)合序列，而且其中蛻皮素受體復(fù)合 物_配體-DNA結(jié)合序列復(fù)合物的形成誘導(dǎo)基因表達(dá)，而且其中所述配體是式I的二酰基胼 配體或者式II或III的手性二?；菖潴w，其中轉(zhuǎn)基因受試者的內(nèi)源性或異源性基因表達(dá) 受到調(diào)控。在一個實施方案中，所述細(xì)胞是自體細(xì)胞，即所述細(xì)胞是得自所述受試者并被蛻 皮素受體復(fù)合物和DNA結(jié)合序列轉(zhuǎn)染。被轉(zhuǎn)染的自體細(xì)胞然后被植入回所述受試者，而所 述受試者然后被所述配體處理?？梢酝ㄟ^若干方式中的任一種將所述自體細(xì)胞植入，其包 括輸注或注射即直接注射。在一個實施方案中，通過腫瘤內(nèi)注射將所述自體細(xì)胞植入。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)控轉(zhuǎn)基因受試者中內(nèi)源性或異源性基因的表 達(dá)的方法，其包括將配體與所述受試者的細(xì)胞中的嵌合的蛻皮素受體復(fù)合物相接觸，其中 所述細(xì)胞在與配體結(jié)合時還包含蛻皮素受體復(fù)合物的DNA結(jié)合序列，所述DNA結(jié)合序列還 包括啟動子，而且其中蛻皮素受體復(fù)合物_配體-DNA結(jié)合序列復(fù)合物的形成誘導(dǎo)基因表 達(dá)，而且其中所述配體是式I的二酰基胼配體或者式II或III的手性二?；菖潴w，其中 轉(zhuǎn)基因受試者的內(nèi)源性或異源性基因表達(dá)受到調(diào)控。在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因受試者是植物、昆蟲、動物或哺乳動物即人或獸醫(yī)動 物例如奶牛、豬、綿羊、山羊、馬、狗或貓。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)控轉(zhuǎn)基因受試者中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法，其中 所述轉(zhuǎn)基因受試者包括能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的重組蛻皮素受體復(fù)合物；所述方法包括向所 述受試者施用有效量的式I的二?；菖潴w或者式II或III的手性二酰基胼配體。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法，其包括步
32驟a)將基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)引入宿主細(xì)胞，所述基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括i)第一基因表達(dá)盒，其能夠被表達(dá)在宿主細(xì)胞中，所述第一基因表達(dá)盒包括編碼 第一雜交多肽的多核苷酸序列，其包括(a)識別與其表達(dá)將受到調(diào)節(jié)的基因締合的應(yīng)答元件的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)蛻皮素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；ii)第二基因表達(dá)盒，其能夠被表達(dá)在宿主細(xì)胞中，所述第二基因表達(dá)盒包括編碼 第二雜交多肽的多核苷酸序列，其包括(a)反式激活結(jié)構(gòu)域；和(b)嵌合的類視黃醇X受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及iii)第三基因表達(dá)盒，其能夠被表達(dá)在宿主細(xì)胞中，所述第三基因表達(dá)盒包括多 核苷酸序列，其包括(a)被第一雜交多肽的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域所識別的應(yīng)答元件；(b)被第二雜交多肽的反式激活結(jié)構(gòu)域所激活的啟動子；和(c)其表達(dá)將受到調(diào)節(jié)的基因；以及b)將式I的二?；菖潴w或者式II或III的手性二?；菖潴w引入宿主細(xì)胞； 其中宿主細(xì)胞的基因表達(dá)受到調(diào)節(jié)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生多肽的方法，其包括步驟a)選擇一種宿主細(xì)胞，其對暴露于式I的二?；菖潴w或者式II或III的手性二 酰基胼配體基本上不敏感；b)將下述引入宿主細(xì)胞i) DNA構(gòu)建體，其包括(a)編碼所述多肽的外源性基因；和(b)應(yīng)答元件；其中所述基因是在所述應(yīng)答元件的控制下；和ii)蛻皮素受體復(fù)合物，其包括(a)結(jié)合至應(yīng)答元件的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(b)所述化合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(c)反式激活結(jié)構(gòu)域；和c)將所述細(xì)胞暴露于所述化合物，其中多肽被產(chǎn)生。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，其中所述蛻皮素受體復(fù)合物或蛻皮 素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括突變。本文所用縮寫具有它們在化學(xué)和生物領(lǐng)域內(nèi)常用的含義，除非另外指明。例如 “h”是指小時，“min”是指分鐘，"sec"是指秒，“d”是指天，“ u L”是指微升，“mL”是指毫 升，“L”是指升，“ u M”是指微摩爾的，“mM”是指毫摩爾的，“M”是指摩爾的，“mol”是指摩 爾，“mmol”是指毫摩爾，“ U g”是指微克，“mg”是指毫克，“A”是指腺嘌呤或腺嘌呤核苷， “T”是指胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷，“G”是指鳥嘌呤或鳥嘌呤核苷，“C”指胞嘧啶核苷或胞 嘧啶，“x g”是指倍重力，“nt”是指核苷酸，"aa"是指氨基酸，“bp”是指堿基對，“kb”是指 千堿基，“k”是指千，“ u ”是指微，“ °C ”是指攝氏度，“THF”是指四氫呋喃，“DME”是指二甲
33氧基乙烷，“DMF”是指二甲基甲酰胺，“NMR”是指核磁共振，“psi”是指磅每平方英寸，并且 “TLC”是指薄層色譜法。本文所用術(shù)語“烷基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指直鏈或支鏈飽和脂 肪族烴，其具有一至十個碳或所標(biāo)明的碳數(shù)(C1-Cltl是指1至10個碳)。示例性的烷基包括 甲基、乙基、Π-丙基、異丙基、η- 丁基、仲-丁基、異丁基、叔-丁基、η-戊基、η-己基、異己 基、η-庚基、4，4_ 二甲基戊基、η-辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基以及類似物。本文所用術(shù)語“可選地取代的烷基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指上述 所定義的烷基，其被一種至三種取代基可選地取代，其中所述取代基獨立地選自硝基、氰 基、氨基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的雜芳基、可選地取代的雜環(huán)、烷氧基、芳氧基、 芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亞磺酰氨基、-CORc, -SO2Rd, -N(Re) CORf, -N(Re) SO2Rg或-N(Re) C = N(Rh)-氨基。示例性的被取代的烷基包括-CH20CH3、-CH2CH2NH2, -CH2CH2CN, -CH2SO2CH3 以及類似物。本文所用術(shù)語“鹵代烷基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指上述所定義的 烷基，其具有一種至六種鹵素取代基。示例性的鹵代烷基包括三氟甲基、-CH2CH2F以及類似 物。本文所用術(shù)語“羥烷基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指上述所定義的烷 基，其具有一種至三種羥基取代基，通常為一種羥基取代基。示例性的羥烷基包括羥甲基、 羥乙基、羥丙基以及類似物。本文所用術(shù)語“芳烷基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指上述所定義的烷 基，其具有一種至三種芳基取代基(所述芳基取代基可如下述被可選地取代)，通常具有一 種或兩種芳基取代基。示例性的芳烷基包括，例如，苯甲基、苯乙基、4-氟苯乙基、苯丙基、二 苯甲基以及類似物。本文所用術(shù)語“環(huán)烷基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指飽和的和部分地 不飽和的(含有一個或兩個雙鍵)環(huán)狀烴基團，其含有具有3至12個或所指明的碳數(shù)的碳 原子的一至三個環(huán)。示例性的環(huán)烷基包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、 降冰片基、十氫化萘、金剛烷基以及類似物。本文所用術(shù)語“可選地取代的環(huán)烷基”單獨地或作為另一個基團的一部分是 指上述所定義的環(huán)烷基，其被一種至三種取代基可選地取代，其中所述取代基獨立地選 自鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、可選地取代的烷基、商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地 取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的芳基、可選地取代 的雜芳基、可選地取代的雜環(huán)、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亞磺酰氨 基、-cor、-S02Rd、-N(IT) CORf、-N(IT) SO2R8 或-Nor) C = N(Rh)-氨基。示例性的可選地取代
的環(huán)烷基包括 以及類似物?？蛇x地取代的環(huán)烷基可被融合至芳基以提供下述可選地取代的芳基。
本文所用術(shù)語“烯基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指上述所定義的烷基， 其含有一至三個碳碳雙鍵，通常含有一或兩個雙鍵。示例性的烯基包括-CH = CH2, -CH2CH =CH2、-CH2CH2CH = CH2、-CH2CH2CH = CHCH3 以及類似物。本文所用術(shù)語“可選地取代的烯基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指 上述所定義的烯基，其被一種至三種取代基可選地取代，其中所述取代基獨立地選自 鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、可選地取代的烷基、商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取 代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的芳基、可選地取代 的雜芳基、可選地取代的雜環(huán)、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亞磺酰氨 基、-cor、-S02Rd、-N(IT) CORf、-N(IT) SO2Rg 或-Nor) C = N(Rh)-氨基 。示例性的可選地取代 的烯基包括-CH = CHPh, -CH2CH = CHPh以及類似物。本文所用術(shù)語“炔基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指上述所定義的烷基， 其含有一至三個碳碳三鍵，通常含有一個或兩個三鍵。示例性的炔基包括-C ε CH、-C = CCH3> -CH2C = CH、-CH2CH2C = CH 和-CH2CH2C = CCH3。本文所用術(shù)語“可選地取代的炔基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指 上述所定義的炔基，其被一種至三種取代基可選地取代，其中所述取代基獨立地選自 鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、可選地取代的烷基、商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取 代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的芳基、可選地取代 的雜芳基、可選地取代的雜環(huán)、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亞磺酰氨 基、-cor、-S02Rd、-N(IT) CORf、-N(IT) SO2Rg 或-Nor) C = N(Rh)-氨基。示例性的可選地取代 的炔基包括-C ^ CPh、-CH2C ^ CPh以及類似物。本文所用術(shù)語“芳基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指具有6至12個碳原 子的單環(huán)和雙環(huán)芳香環(huán)系統(tǒng)，例如苯基(縮寫為Ph)、1_萘基和2-萘基。本文所用術(shù)語“可選地取代的芳基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指上述 所定義的芳基，其被一種至五種取代基、通常一種至三種取代基可選地取代，其中所述取代 基獨立地選自商素、硝基、氰基、羥基、氨基、可選地取代的烷基、商代烷基、羥烷基、芳烷基、 可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的芳基、可選地 取代的雜芳基、可選地取代的雜環(huán)、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亞磺酰氨 基、-cor、-S02Rd、-N(IT) CORf、-N(IT) SO2Rg 或-Nor) C = N(Rh)-氨基。示例性的可選地取代 的芳基包括2-甲苯基、2-甲氧苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-甲苯基、3-甲氧苯 基、3-氯苯基、4-甲苯基、4-乙苯基、4-甲氧苯基、4-氯苯基、2，6_ 二氟苯基、2，6_ 二氯苯 基、2-甲基、3-甲氧苯基、2-乙基、3-甲氧苯基、3，4_二甲氧苯基、3，5_二氟苯基、3，5_二甲 苯基和3，5_二甲氧基、4-甲苯基以及類似物。術(shù)語可選地取代的芳基旨在包括具有融合的 可選地取代的環(huán)烷基和融合的可選地取代的雜環(huán)的環(huán)的基團。例子包括 以及類似物。本文所用術(shù)語“雜芳基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指具有5至14個碳 原子和1、2、3或4個雜原子的單環(huán)和雙環(huán)芳香環(huán)系統(tǒng)，其中所述雜原子獨立地選自氧、氮和 硫。示例性的雜芳基包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、 2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻 唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶 基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪 唑基、2-苯并噻唑基、4-苯并噻唑基、5-苯并噻唑基、5-吲哚基、5-吲哚基、3-吲唑基、4-吲 唑基、5-吲唑基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、2-喹啉基、3-喹啉 基、6-喹啉基以及類似物。術(shù)語雜芳基旨在包括可能的N-氧化物。示例性的N-氧化物包 括吡啶基N-氧化物以及類似物。本文所用術(shù)語“可選地取代的雜芳基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指 上述所定義的雜芳基，其被一種至四種取代基、通常一種或兩種取代基在任何可能的碳原 子處可選地取代，其中所述取代基獨立地選自商素、硝基、氰基、羥基、氨基、可選地取代的 烷基、商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代的 炔基、可選地取代的芳基、可選地取代的雜芳基、可選地取代的雜環(huán)、烷氧基、芳氧基、芳烷 氧基、烷硫基、羧酰氨基、亞磺酰氨基、-CORc, -SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re) SO2Rg 或-N(Re)C =
N(Rh)-氨基。示例性的可選地取代的雜芳基包括 以及類似物。前面所鑒定的手性二酰基胼配體中末端部分A和B的可選地取代的芳基和可選地 取代的雜芳基的特殊化學(xué)性質(zhì)并不是狹隘地關(guān)鍵性的，并且如所述，考慮了各種取代基。優(yōu) 選地，選擇可選地取代的芳基和可選地取代的雜芳基的取代基以使得碳原子和雜原子的總 數(shù)不多于大約20，更優(yōu)選地不多于大約15。本文所用術(shù)語“雜環(huán)”單獨地或作為另一個基團的一部分是指飽和的和部分地不 飽和的(含有一個或兩個雙鍵)環(huán)狀基團，其含有具有2至12個碳原子和1或2個氧、硫 或氮原子的一至三個環(huán)。所述雜環(huán)可通過碳原子或氮原子可選地連接至分子的其余部分。 示例性的雜環(huán)基團包括 以及類似物。本文所用術(shù)語“可選地取代的雜環(huán)”單獨地或作為另一個基團的一部分是指上述 所定義的雜環(huán)，其被一種至四種取代基、通常一種或兩種取代基可選地取代，其中所述取代 基獨立地選自商素、硝基、氰基、羥基、氨基、可選地取代的烷基、商代烷基、羥烷基、芳烷基、 可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的芳基、可選地 取代的雜芳基、可選地取代的雜環(huán)、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亞磺酰氨 基、-cor、-S02Rd、-N(IT) CORf、-N(IT) SO2Rg 或-Nor) C = N(Rh)-氨基。示例性的可選地取代
的雜環(huán)基團包括 以及類似物。可選地取代的雜環(huán)可被融合至芳基以提供上述可選地取代的芳基。本文所用術(shù)語“烷氧基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指連接到末端氧原 子的羥烷基、商代烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯 基或可選地取代的炔基。示例性的烷氧基包括甲氧基、叔_ 丁氧基、-OCH2CH = CH2以及類 似物。本文所用術(shù)語“芳氧基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指連接到末端氧原 子的可選地取代的芳基。示例性的芳氧基包括苯氧基以及類似物。本文所用術(shù)語“芳烷氧基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指連接到末端氧 原子的芳烷基。示例性的芳烷氧基包括苯甲氧基以及類似物。本文所用術(shù)語“烷硫基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指連接到末端硫原 子的羥烷基、商代烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的烯基或可選地取代的炔 基。示例性的烷基包括-SCH3以及類似物。本文所用術(shù)語“鹵代(halo) ”或“鹵素(halogen) ”單獨地或作為另一個基團的一 部分是指氟、氯、溴或碘。本文所用術(shù)語“氨基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指式-NRaRb的基團，其中Ra和Rb獨立為氫、商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、 可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；或者Ra和Rb與他們所連接 的氮原子一起形成四至七元雜環(huán)。示例性的氨基包括-NH2、-N (H) CH3、-N (CH3) 2、-N (H) CH2Ph 以及類似物。本文所用術(shù)語“羧酰氨基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指式-CO-氨基的 基團。示例性的羧酰氨基包括-C0NH2、-CON(H)CH3、-CON(H)Ph以及類似物。本文所用術(shù)語“亞磺酰氨基”單獨地或作為另一個基團的一部分是指式-SO2-氨基 的基團。示例性的亞磺酰氨基包括_S02NH2、-SO2N(H)CH3^ -SO2N(H)Ph以及類似物。根據(jù)上述可選地取代的基團，Rc是氫、羥基、鹵代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取 代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜 環(huán)、可選地取代的芳基、可選地取代的雜芳基、烷氧基、芳氧基或芳烷氧基；Rd是鹵代烷基、 羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代 的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基;Re是氫、商代烷基、 羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代 的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；Rf是氫、商代烷基、 羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代 的烯基、可選地取代 的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基、可選地取代的雜芳基、烷氧基、芳氧基、芳 烷氧基或氨基；Rg是商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、 可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基、可選地取 代的雜芳基或氨基；并且Rh是氫、烷基、芳基、氰基或硝基。本說明書通篇中，選擇基團及其可選的取代基以提供穩(wěn)定的部分和化合物。本發(fā)明的化合物可包含在組成這種化合物的一個或多個原子上非天然比例的原 子同位素。例如，所述化合物可以是用放射性同位素進(jìn)行放射性標(biāo)記的，所述放射性同位素 例如氚(3H)、碘-125 (125I)或碳-H(14C)。不管是否具有放射性，本發(fā)明化合物的所有同位 素變種旨在被本發(fā)明的范圍所涵蓋。本發(fā)明的化合物可形成也在本發(fā)明范圍內(nèi)的鹽。本文對本發(fā)明的化合物的引用被 理解為包括對其鹽的引用，除非另外指出。本文所用術(shù)語“鹽”表示用無機和/或有機酸和 堿形成的酸性的和/或堿性的鹽。另外，當(dāng)式I、II或III的化合物含有堿性部分和酸性部 分二者時，兩性離子(“內(nèi)鹽”)可被形成，并被包含在本文所用術(shù)語“鹽”中。藥學(xué)上可接 受的(即，無毒的、生理上可接受的)鹽是優(yōu)選的，雖然其他鹽在可在制備中采用的例如分 離或純化步驟中也是有用的。式I、II或III的化合物的鹽可例如通過將化合物與適量的 例如等當(dāng)量的酸或堿在一種使鹽在其中沉淀的介質(zhì)或含水介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)、隨后凍干而形 成。含有堿性部分的本發(fā)明的化合物可與各種有機和無機酸形成鹽。示例性的酸加 成鹽包括醋酸鹽(例如用醋酸或三鹵乙酸例如三氟乙酸所形成的那些)、己二酸鹽、藻酸 鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、 樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸 鹽、葡萄糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽(用鹽酸形成)、氫溴 酸鹽(用溴化氫形成)、氫碘酸鹽、2-羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽(用馬來酸形成)、甲磺酸鹽(用甲磺酸形成)、2_萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、 3_苯丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽(例如 用硫酸形成的那些)、磺酸鹽(例如本文提到的那些)、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽 (toluenesulfonate)例如甲苯磺酸鹽(tosylate)、i^一酸鹽以及類似物。含有酸性部分的本發(fā)明的化合物可與各種有機和無機堿形成鹽。示例性的堿鹽 包括銨鹽，堿金屬鹽例如鈉、鋰和鉀鹽，堿土金屬鹽例如鈣和鎂鹽，含有有機堿(例如，有機 胺)的鹽例如芐星青霉素、二環(huán)己基胺、海巴青霉素(用N，N-雙(去氫揪)乙二胺形成)、 N-甲基-D-葡萄糖胺、N-甲基-D-葡萄糖酰胺、t- 丁胺，和含有氨基酸例如精氨酸、賴氨酸 的鹽，以及類似物。本說明書中所用的立體化學(xué)術(shù)語和慣例與Pure & Appl. Chem 68 =2193(1996)中 描述的那些是一致的，除非另外指出。術(shù)語“對映體過量”或“ee”是指一種對映體與另一種相比存在多少的量度。對于 R和S對映體的混合物，百分比對映體過量被定義為I R-S I *100，其中R和S是混合物中對 映體各自的摩爾或重量分?jǐn)?shù)，以致于R+S = 1。在知道手性物質(zhì)的旋光度的情況下，百分比 對映體過量被定義為([^-/[^!^^(^，其中^！-是對映體混合物的旋光度，而^] _是純對映體的旋光度。使用各種分析技術(shù)來確定對映體過量是可能的，所述分析技術(shù)包 括NMR光譜法、手性柱層析法或光偏振法。 術(shù)語“對映體純的(enantiomerically pure)” 或“對映純的(enantiopure) ” 是 指其所有分子(在檢測限內(nèi))都具有相同手性意義的手性物質(zhì)樣品。術(shù)語“對映體富集的(enantiomerically enriched)”或“對映富集的 (enantioenriched)”是指其對映體比值超過50 50的手性物質(zhì)樣品。對映體富集的化合 物可以是對映體純的。術(shù)語“不對稱碳原子”是指在有機化合物分子中被連接至四個不同原子或原子基 團的碳原子。術(shù)語“主要地”是指超過50 50的比值。術(shù)語“離去基因”或“LG”是指從被認(rèn)為是特定反應(yīng)中底物的殘基或主要 部分中的原子或基團分離的原子或基團。在酰胺偶合反應(yīng)中，示例性的離去基團包 括-F、-Cl、-Br、-OC6F5以及類似物。對于本發(fā)明的目的來說，術(shù)語“分離的”是指一種被移出它的原始環(huán)境(它天然存 在的環(huán)境)的物質(zhì)(例如，化合物或生物物質(zhì)如核酸或蛋白)。例如，植物或動物中以天然 狀態(tài)存在的多核苷酸不是分離的，然而從天然存在的相鄰核酸所分離的相同多核苷酸被認(rèn) 為是“分離的”。應(yīng)用于生物物質(zhì)的術(shù)語“純化的”不要求所述物質(zhì)以展現(xiàn)絕對純度和不含有其他 化合物的形式存在。它更確切說是個相對的定義?！昂怂帷薄ⅰ昂怂岱肿印?、“低聚核苷酸”和“多核苷酸”被互換地使用并且指的是核糖 核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧 胸苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯多聚體形式，或其單鏈形式或雙鏈螺旋的任何磷酸 酯類似物，例如硫代磷酸酯和硫酯。雙鏈的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。 術(shù)語核酸分子，特別地DNA或RNA分子，僅僅是指所述分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，并不將它限制在任何特定的三級形式。因此，該術(shù)語包含尤其在線形或環(huán)形DNA分子(例如，限制性片 段)、質(zhì)粒、超螺旋DNA和染色體中發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA。在討論特定雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時，本 文根據(jù)正常的慣例來描述序列，其中所述正常的慣例只給出沿著未轉(zhuǎn)錄的DNA鏈(即具有 與mRNA同源的序列的鏈)的5’至3’方向的序列?！爸亟MDNA分子”是經(jīng)歷了分子生物學(xué) 操作的DNA分子。DNA包括但不限于cDNA、基因組DNA、質(zhì)粒DNA、合成的DNA和半合成的 DNA。
術(shù)語“片段”是指相對于參考核酸具有縮短長度的核苷酸序列，其在公共的部分 包括與參考核苷酸相同的核苷酸序列。本發(fā)明的這種核酸片段在適當(dāng)?shù)臅r候可作為組成 部分被包括在更大的多核苷酸中。這種片段包括以下或者可選地由以下組成長度范圍為 本發(fā)明核酸的至少 6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、 54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000 或 1500個連續(xù)核苷酸的低聚核苷酸。如本文所用，“分離的核酸片段”是指單或雙鏈的RNA或DNA多聚體，其可選地含有 合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。DNA多聚體形式的分離的核酸片段可包括cDNA、基 因組DNA或合成的DNA的一個或多個區(qū)段?！盎颉敝傅氖前ň幋a功能分子(例如，多肽或RNA)的核苷酸的多核苷酸，并包 括cDNA和基因組DNA核酸。“基因”還指表達(dá)特定的RNA、蛋白或多肽的核酸片段，其包括 在所述編碼序列之前(5’非編碼序列)和之后(3’非編碼序列)的調(diào)控序列。“天然基因” 指的是與它自己的調(diào)控序列一起天然地被發(fā)現(xiàn)的基因。“嵌合的基因”是指非天然的任何基 因，其包括沒有一起被天然地發(fā)現(xiàn)的調(diào)控和/或編碼序列。因此，嵌合的基因可包括衍生自 不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或衍生自相同來源但以不同于天然發(fā)現(xiàn)的方式排列的調(diào) 控序列和編碼序列。嵌合的基因可包括衍生自不同來源的編碼序列和/或衍生自不同來源 的調(diào)控序列?！皟?nèi)源性基因”是指在生物體基因組中天然位置的天然基因?！巴鈦怼被蚧?“異源性”基因是指通常不在宿主生物體中被發(fā)現(xiàn)，但通過基因轉(zhuǎn)移而被引入宿主生物體的 基因。外來基因可包括被插入非天然生物體的天然基因，或者嵌合的基因?！稗D(zhuǎn)基因”是通 過轉(zhuǎn)化步驟被引入基因組的基因?！爱愒葱?DNA是指不天然地位于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞染色體位點的DNA。優(yōu)選地，異源性 DNA包括對于細(xì)胞是外來的基因。術(shù)語“基因組”包括染色體以及線粒體、葉綠體和病毒DNA或RNA。核酸分子是與另外的核酸分子例如cDNA、基因組DNA或RNA “可雜交的”，這是 當(dāng)單鏈形式的核酸分子可與其他核酸分子在適當(dāng)?shù)臏囟群腿芤弘x子強度條件下進(jìn)行退火 時(參見下面的Sambrook等，1989)。雜交和沖洗條件是眾所周知的，并在Sambrook等 Molecular Cloning =ALaboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第二版，冷泉港實驗 室出版社，冷泉港(1989)中，具體在其中第11章和表11.1(通過引用全文并入本文)中得 到示例。溫度和離子強度的條件確定雜交的“嚴(yán)格性”。可以調(diào)整嚴(yán)格性條件以篩選適度相似的片段例如來自遠(yuǎn)親生物體的同源序列，至 高度相似的片段例如復(fù)制來自近親生物體的功能酶的基因。為了初步篩選同源核酸，可以 使用對應(yīng)于Tm為55°的低嚴(yán)格性雜交條件，例如，5XSSC、0. 1% SDS、0. 25%牛奶并不含甲 酰胺；或者30%甲酰胺、5XSSC、0. 5% SDS0中等嚴(yán)格性雜交條件對應(yīng)于更高的Tm，例如，40%甲酰胺和5X或6XSCC。高嚴(yán)格性雜交條件對應(yīng)于最高的Tm，例如，50%甲酰胺、5X 或 6XSCC。雜交要求兩種核酸含有互補序列，雖然取決于雜交的嚴(yán)格性，堿基之間的錯配是 可能的。術(shù)語“互補的”被用來描述能夠互相雜交的核苷酸堿基之間的關(guān)系。例如，就DNA 而論，腺嘌呤核苷與胸腺嘧啶互補，而且胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此，本發(fā)明還包括與本文 所公開或使用的完整序列互補的分離的核酸片段，以及那些基本上相似的核酸序列。在本發(fā)明一個實施方案中，使用包括的雜交步驟的雜交條件并使用上述 條件來檢測多核苷酸。在另一個實施方案中，1為60°C ；在一個實施方案中，1為63°C ；在 另一個實施方案中，Tm*65°C。雜交后的沖洗也確定嚴(yán)格性條件。一組條件使用一系列的沖洗，其從6XSSC、 0.5% SDS 在室溫下開始進(jìn)行15分鐘(min)，然后用2XSSC、0. 5% SDS在45°C下重復(fù)進(jìn)行 30分鐘，并且之后用0. 2XSSC、0. 5% SDS在50°C下30分鐘重復(fù)兩次。一組嚴(yán)格性條件使 用更高的溫度，其中的沖洗與上述那些相同，除了最后兩次在0.2XSSC、0. 5% SDS中沖洗 30min的溫度被增加到60°C之外。另一組高度嚴(yán)格的條件在65°C下使用在0. 1 X SSC、0. 1 % SDS中的兩次最后沖洗。雜交核酸的適當(dāng)?shù)膰?yán)格性取決于核酸長度和互補程度，本領(lǐng)域眾所周知的變量。 兩種核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越大，具有那些序列的核酸的雜交物的Tm值 越大。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(對應(yīng)于較高的Tm)以如下順序減少RNA:RNA、DNA:RNA、 DNA:DNA。關(guān)于超過100個核苷酸長度的雜交物，已經(jīng)得出計算Tm的公式(參見上述 Sambrook等，9. 50-0. 51)。關(guān)于與較短核酸即低聚核苷酸進(jìn)行的雜交，錯配的位置變得更重 要，而且低聚核苷酸的長度確定它的特異性(參見上述Sambrook等，11. 7-11. 8)。在本發(fā)明一個實施方案中，使用包括低于500mM鹽和至少37攝氏度的雜交步驟和 在至少63攝氏度下在2XSSPE中的沖洗步驟的雜交條件來檢測多核苷酸。在一個實施方案 中，所述雜交條件包括低于200mM鹽和至少37攝氏度的雜交步驟。在另一個實施方案中， 所述雜交條件包括2XSSPE和63攝氏度的雜交和沖洗步驟二者。在另一個實施方案中，可雜交的核酸的長度是至少約10個核苷酸。優(yōu)選地，可雜 交的核酸的最小長度是至少約15個核苷酸；更優(yōu)選地至少約20個核苷酸；并且最優(yōu)選地 所述長度是至少30個核苷酸。此外，技術(shù)人員將認(rèn)識到，可以根據(jù)例如探針長度等因素對 溫度和沖洗溶液鹽濃度作必要的調(diào)整。術(shù)語“探針”是指單鏈核酸分子，其可與互補的單鏈靶核酸進(jìn)行堿基配對以形成雙 鏈分子。如本文所用，術(shù)語“低聚核苷酸”是指可與基因組DNA分子、cDNA分子、質(zhì)粒DNA或 mRNA分子雜交的短核酸。低聚核苷酸可被例如32P-核苷酸或與標(biāo)記物例如生物素共價偶 合的核苷酸標(biāo)記。被標(biāo)記的低聚核苷酸可被用作探針來檢測核酸的存在。低聚核苷酸(其 一條或兩條都可被標(biāo)記)可被用作PCR引物來克隆全長或片段的核酸，或檢測核酸的存在。 低聚核苷酸還可被用來與DNA分子形成三螺旋。通常地，合成地制備低聚核苷酸，優(yōu)選地在 核酸合成器上。因此，可以用非天然存在的磷酸酯類似物鍵例如硫酯鍵等制備低聚核苷酸?！耙铩敝傅氖桥c靶核酸序列雜交以產(chǎn)生雙鏈核酸區(qū)域的低聚核苷酸，其中所述雙 鏈核酸區(qū)域在適合的條件下充當(dāng)DNA合成的起始點。這種引物可被用在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中?！熬酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)”被縮寫成PCR并指用來酶擴增特定核酸序列的體外方法。PCR 包含一系列重復(fù)的溫度循環(huán)，而每個循環(huán)包括三個階段將模板核酸變性以分離靶分子鏈， 將單鏈PCR低聚核苷酸引物與模板核酸退火，并用DNA聚合酶延伸被退火的引物。PCR提供 檢測靶分子存在的方法以及在定量或半定量的條件下確定核酸起始庫中靶分子相對量的 方法。“逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”被縮寫成RT-PCR并指這樣的體外方法，其用來從RNA分 子酶促產(chǎn)生靶cDNA分子，隨后酶促擴增上述靶cDNA分子中特定的核酸序列。RT-PCR還提 供檢測靶分子存在的方法以及在定量或半定量的條件下確定核酸起始庫中靶分子相對量 的方法。DNA “編碼序列”是指編碼多肽的雙鏈DNA序列，并且當(dāng)被置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列的 控制之下時可在體外或體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄和翻譯成細(xì)胞中的多肽?！斑m合的調(diào)控序列”是指位于編 碼序列上游(5’非編碼序列)、之中或下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，其影響轉(zhuǎn)錄、 RNA加工或穩(wěn)定性或者相關(guān)編碼序列的翻譯。調(diào)控序列可包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含 子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效 應(yīng)子結(jié)合位點和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。編碼序列的邊界是由 在5’(氨基)端的起始密碼子和在3’(羧基)端的翻譯終止密碼子確定的。編碼序列可 包括但不限于原核序列、來自mRNA的cDNA、基因組DNA序列以及甚至合成的DNA序列。如 果編碼序列是為了在真核細(xì)胞中表達(dá)，多腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列通常將位于編碼序 列的3’側(cè)。“可讀框”被縮寫成0RF，并且指的是一段核酸序列即DNA、cDNA或RNA，其包括翻譯 起始信號或起始密碼子例如ATG或AUG，以及終止密碼子，并可潛在地翻譯成多肽序列。本文使用術(shù)語“頭對頭”來描述兩條多核苷酸序列相對于彼此的方向。當(dāng)一條多核 苷酸編碼鏈的5’端與另一條多核苷酸編碼鏈的5’端臨近時，兩條多核苷酸被置于頭對頭 的方向，從而每條多核苷酸轉(zhuǎn)錄的方向是離開另一條多核苷酸的5’端而進(jìn)行的。術(shù)語“頭 對頭”可被縮寫成(5’ )對(5’)，并且還可用符號(一一)或(3’ 一5’ 5’ 一 3’)來表示。本文使用術(shù)語“尾對尾”來描述兩條多核苷酸序列相對于彼此的方向。當(dāng)一條多 核苷酸編碼鏈的3’端與另一條多核苷酸編碼鏈的3’端臨近時，兩條多核苷酸被置于尾對 尾的方向，從而每條多核苷酸轉(zhuǎn)錄的方向是向著另一條多核苷酸進(jìn)行的。術(shù)語“尾對尾”可 被縮寫成(3’)對(3’)，并且還可用符號(一一)或(5’ 一 3’ 3’ 一 5’)來表示。本文使用術(shù)語“頭對尾”來描述兩條多核苷酸序列相對于彼此的方向。當(dāng)一條多 核苷酸編碼鏈的5’端與另一條多核苷酸編碼鏈的3’端臨近時，兩條多核苷酸被置于頭對 尾的方向，從而每條多核苷酸轉(zhuǎn)錄的方向是與另一條多核苷酸相同的方向。術(shù)語“頭對尾” 可被縮寫成(5’)對(3’)，并且還可用符號(一一)或(5’ 一 3’ 5’ 一 3’)來表示。術(shù)語“下游”是指位于參考核苷酸序列3’側(cè)的核苷酸序列。特別地，下游核苷酸 序列一般涉及在轉(zhuǎn)錄起始點之后的序列。例如，基因的翻譯起始密碼子位于轉(zhuǎn)錄起始位點 的下游。術(shù)語“上游”是指位于參考核苷酸序列5’側(cè)的核苷酸序列。特別地，上游核苷酸 序列一般涉及位于編碼序列5’側(cè)或轉(zhuǎn)錄起始點的序列。例如，多數(shù)啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始位 點的上游。
術(shù)語“限制性內(nèi)切酶”和“限制性酶”被可互換地使用，并且指的是在雙鏈DNA中 特定的核苷酸序列中結(jié)合并切割的酶?！巴粗亟M”指的是將外來DNA序列插入另一個DNA分子，例如將載體插入染色體。 優(yōu)選地，載體靶向特定的染色體位點以進(jìn)行同源重組。對于特定的同源重組，載體含有足夠 長的染色體序列同源區(qū)域以允許載體互補結(jié)合和整合入染色體。更長的同源區(qū)域和更高的 序列相似度可增加同源重組的效率。本領(lǐng)域已知的若干方法可被用來擴增本發(fā)明的多核苷酸。一旦建立適合的宿主系 統(tǒng)和生長條件，就可大量地擴增和制備重組表達(dá)載體。如本文所述，可被使用的表達(dá)載體包 括但不限于下述載體或它們的衍生物人或動物病毒例如牛痘病毒或腺病毒；昆蟲病毒例 如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(例如X)；以及質(zhì)粒和黏端質(zhì)粒DNA載體，僅舉幾個例子。“載體”指的是將核酸克隆和/或轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞的任何載體。載體可以是可連接 另一個DNA區(qū)段以引起所連接的區(qū)段進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制子?！皬?fù)制子”是指在體內(nèi)起DNA復(fù) 制自主單元作用的任何遺傳元件(例如，質(zhì)粒、噬菌體、黏端質(zhì)粒、染色體、病毒)，其中所述 DNA復(fù)制自主單元能夠在它自己的控制下進(jìn)行復(fù)制。術(shù)語“載體”包括在體外、離體或在體 內(nèi)將核酸引入細(xì)胞的病毒和非病毒載體二者。本領(lǐng)域已知的大量載體可被用來對核酸進(jìn)行 操作，將應(yīng)答元件和啟動子引入基因等。可能的載體包括例如質(zhì)?；蛐揎椀牟《荆浒ɡ?如噬菌體如入衍生物，或質(zhì)粒如PBR322或pUC質(zhì)粒衍生物，或Bluescript載體。例如，可 以通過將適當(dāng)?shù)腄NA片段連接至所選的具有互補黏性末端的載體來實現(xiàn)對應(yīng)于應(yīng)答元件 和啟動子的DNA片段向適合的載體中的插入。可選地，DNA分子的末端可被酶修飾或者可 通過將核苷酸序列(連接序列)連接至DNA末端來產(chǎn)生任何位點。這種載體可被改造以含 有可選的標(biāo)志物基因，所述標(biāo)志物基因提供細(xì)胞的選擇，其中所述細(xì)胞已將標(biāo)志物并入細(xì) 胞基因組。這種標(biāo)志物允許宿主細(xì)胞的鑒定和/或選擇，所述宿主細(xì)胞并入且表達(dá)由所述 標(biāo)志物編碼的蛋白。病毒載體及特別地逆轉(zhuǎn)錄載體已被用于細(xì)胞以及活動物受試者中的多種多樣的 基因輸送應(yīng)用。可被使用的病毒載體包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒、天花、桿狀 病毒、牛痘、單純性皰疹、愛潑斯坦-巴爾二氏病毒、腺病毒、雙生病毒和花椰菜花葉病毒載 體。非病毒載體包括質(zhì)粒、脂質(zhì)體、帶電脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)、DNA-蛋白復(fù)合物和生物多聚 體。除了核酸之外，載體還可包括一個或多個調(diào)控區(qū)域和/或在選擇、測量和監(jiān)測核酸轉(zhuǎn)移 結(jié)果(轉(zhuǎn)移至哪種組織，表達(dá)持續(xù)時間等)中有用的可選的標(biāo)志物。術(shù)語“質(zhì)?！笔侵溉旧w外元件，其通常載有不是細(xì)胞中心代謝一部分的基因，且 通常以環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式存在。這種元件可以是衍生自任何來源的單或雙鏈DNA或 RNA的線狀、環(huán)狀或超螺旋的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中若 干核苷酸序列被連接或重組至獨特的構(gòu)造，所述構(gòu)造能夠?qū)⒀刂m當(dāng)?shù)?’未翻譯序列將所 選基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA序列引入細(xì)胞。“克隆載體”是指“復(fù)制子”，它是順序地進(jìn)行復(fù)制的單位長度的核酸，優(yōu)選地為 DNA，并且包括復(fù)制起點，例如質(zhì)粒、噬菌體或黏端質(zhì)粒，另一條核酸片段可與其連接以引起 所連接區(qū)段的復(fù)制?？寺≥d體可能能夠在一種細(xì)胞類型中復(fù)制并在另一種中表達(dá)(“穿梭 載體”)。
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術(shù)語“表達(dá)載體”是指載體、質(zhì)粒或媒介物，其被設(shè)計成能夠在轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主之后表 達(dá)被插入的核酸序列。被克隆的基因即被插入的核酸序列，通常被置于控制元件的控制之 下，所述控制元件例如啟動子、最小啟動子、增強子或類似物。對于驅(qū)使期望的宿主細(xì)胞中 核酸表達(dá)是有用的起始控制區(qū)或啟動子有許多，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。實際上 任何能夠驅(qū)使這些基因的啟動子都適合于本發(fā)明，其包括但不限于病毒啟動子、細(xì)菌啟 動子、動物啟動子、哺乳動物啟動子、合成啟動子、組成性啟動子、組織特異性啟動子、發(fā)育 特異性啟動子、可誘導(dǎo)的啟動子、光調(diào)控的啟動子；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、 PGK、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、堿性磷酸酶啟動子(對于在酵母菌 Saccharomyces中表達(dá)是有用的)；A0X1啟動子(對于在畢赤酵母Pichia中表達(dá)是有用 的)；0 _內(nèi)酰胺酶、lac、ara、tet、trp、1PL, 1PK、T7、tac和trc啟動子(對于在大腸桿菌 中表達(dá)是有用的)；光調(diào)控的、種子特異性的、花粉特異性的、子房特異性的、發(fā)病或疾病相 關(guān)的花椰菜花葉病毒35S、極小的CMV 35S、木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)，葉綠素a/b結(jié)合 蛋白，核酮糖1，5- 二磷酸羧化酶，莖特異性的、根特異性的甲殼酶，應(yīng)激誘導(dǎo)的水稻東格魯 桿狀病毒，植物超啟動子，馬鈴薯亮氨酸氨基肽酶，硝酸鹽還原酶，甘露堿合酶，胭脂氨酸合 酶，泛素，玉米蛋白和花色苷啟動子(對于在植物細(xì)胞中表達(dá)是有用的)；本領(lǐng)域已知的動 物和哺乳動物啟動子包括但不限于SV40早期(SV40e)啟動子區(qū)域、被包含在勞斯肉瘤病 毒(RSV)的3’長末端重復(fù)序列(LTR)中的啟動子、腺病毒(Ad)的E1A或主要晚期啟動子 (MLP)基因的啟動子、細(xì)胞巨化病毒(CMV)早期啟動子、單純性皰疹病毒(HSV)胸腺嘧啶核 苷激酶(TK)啟動子、桿狀病毒IE1啟動子、延伸因子1 a (EF1)啟動子、磷酸甘油酸酯激酶 (PGK)啟動子、泛素(Ubc)啟動子、白蛋白啟動子、小鼠金屬硫蛋白_L啟動子的調(diào)控序列和 轉(zhuǎn)錄控制區(qū)、遍在啟動子(HPRT、波形蛋白、a-肌動蛋白、微管蛋白以及類似物)、中間絲的 啟動子(結(jié)蛋白、神精絲、角蛋白、GFAP以及類似物)、(MDR、CFTR或VIII型因子以及類似 物的)治療基因的啟動子、發(fā)病或疾病相關(guān)的啟動子以及展現(xiàn)了組織特異性并被用在轉(zhuǎn)基 因動物中的啟動子如在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)域；在胰腺3細(xì) 胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)域、在淋巴細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)域、在 睪丸、乳房、淋巴和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)域；在肝臟中有活性的白 蛋白基因、Apo AI和Apo All控制區(qū)域、在肝臟中有活性的a-胎蛋白基因控制區(qū)域、在肝 臟中有活性的a 1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)域、在骨髓細(xì)胞中有活性的珠蛋白基因控制 區(qū)域、在腦中少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓磷脂堿蛋白基因控制區(qū)域、在骨骼肌中有活性的 肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)域以及在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因控制區(qū)域、 丙酮酸激酶啟動子、絨毛蛋白啟動子、脂肪酸結(jié)合腸蛋白的啟動子、平滑肌細(xì)胞a-肌動蛋 白的啟動子以及類似物。此外，可通過加入增強子或調(diào)控序列以及類似物來修飾這些表達(dá) 序列。可通過本領(lǐng)域已知方法將載體引入期望的宿主細(xì)胞，所述方法例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、 微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE、葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、基因槍的 使用或DNA載體運載蛋白(參見，例如Wu等，J.Biol. Chem. 267 :963-967 (1992) ； Wu等， J. Biol. Chem. 263 14621-14624 (1988)；和 Hartmut 等，加拿大專利申請編號 2，012，311，提 交于1990年3月15日)。還可通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染將本發(fā)明的多核苷酸引入體內(nèi)。在過去的十年中，使用脂質(zhì)體來在體外包裹并轉(zhuǎn)染核酸的情況持續(xù)增加。可以使用為了限制在脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染中遇 到的難度和危險而被設(shè)計的合成的陽離子脂質(zhì)來制備用于在體內(nèi)轉(zhuǎn)染編碼標(biāo)志物的基因 的脂質(zhì)體(Feigner 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84 7413 (1987) ；Mackey 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 8027-8031 (1988)；和 Ulmer 等，Science 259 1745-1748 (1993)) 陽離 子脂質(zhì)的使用可促進(jìn)帶負(fù)電的核酸的包裹，并且還促進(jìn)與帶負(fù)電的細(xì)胞膜的融合(Feigner 等，Science 337:387-388(1989))。用來轉(zhuǎn)移核酸的特別有用的脂質(zhì)化合物和組合物在 W095/18863.W096/17823和U. S. 5，459，127中被描述。使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染在體內(nèi)將外源性基因 引入特定器官具有某些實際的優(yōu)勢。脂質(zhì)體向特定細(xì)胞的分子靶向代表一方面的優(yōu)勢。顯 然，將轉(zhuǎn)染指向特定細(xì)胞類型在具有細(xì)胞異質(zhì)性的組織中將是特別優(yōu)選的，其中所述具有 細(xì)胞異質(zhì)性的組織例如胰、肝、腎和腦。為了靶向的目的，可將脂質(zhì)化學(xué)地偶合至其他分子 (上述Mackey等1988)?？蓪⒈话邢虻碾娜缂に鼗蛏窠?jīng)遞質(zhì)以及蛋白如抗體或非肽分子化 學(xué)地偶合至脂質(zhì)體。其他分子對于促進(jìn)體內(nèi)核酸的轉(zhuǎn)染也是有用的，例如陽離子低聚肽(例如， W095/21931)、衍生自DNA結(jié)合蛋白的肽(例如，W096/25508)或陽離子多聚體(例如， W095/21931)。還可能將載體作為裸露的DNA質(zhì)粒體內(nèi)引入(參見美國專利5，693，622、 5，589，466和5，580，859)。還可使用受體介導(dǎo)的DNA輸送方法(Curiel等，Hum. Gene Ther. 3 147-154 (1992)；和 Wu 等，J. Biol. Chem. 262 =4429-4432 (1987))。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指細(xì)胞對外源性或異源性RNA或DNA的吸收。當(dāng)這種RNA或DNA被 引入細(xì)胞內(nèi)時，細(xì)胞就被外源性或異源性RNA或DNA “轉(zhuǎn)染”。當(dāng)被轉(zhuǎn)染的RNA或DNA導(dǎo)致 表型改變時，細(xì)胞就被外源性或異源性RNA或DNA “轉(zhuǎn)化”?？蓪⑥D(zhuǎn)化RNA或DNA整合(共 價連接)到構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA?！稗D(zhuǎn)化”是指將核酸片段轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主生物體的基因組以導(dǎo)致基因穩(wěn)定的遺傳。含有 被轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物體是指“轉(zhuǎn)基因的”或“重組的”或“轉(zhuǎn)化的”生物體。另外，包括本發(fā)明多核苷酸的重組載體可包含細(xì)胞宿主中一種或多種復(fù)制起點以 及標(biāo)志物或可選的標(biāo)志物，在所述細(xì)胞宿主中尋求它們的擴增或表達(dá)。術(shù)語“可選的標(biāo)志物”是指識別因子，其通常為能夠基于標(biāo)志物基因的作用即對抗 生素的抵抗、對除草劑的抵抗、比色標(biāo)志物、酶、熒光標(biāo)志物以及類似物而被選擇的抗生素 或化學(xué)抵抗基因，其中所述作用被用來追蹤感興趣的核酸的遺傳和/或鑒定遺傳了感興趣 的核酸的細(xì)胞或生物體。本領(lǐng)域已知和使用的可選的標(biāo)志物基因的例子包括提供對氨芐 西林、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素、雙丙氨磷除草劑、磺胺以及類似物的抵抗的基 因；以及被用作表型標(biāo)志物的基因即花色苷調(diào)控基因、異戊醇轉(zhuǎn)移酶基因以及類似物。術(shù)語“報道基因”是指編碼識別因子的核酸，其能夠基于報道基因的作用而被鑒 定，其中所述作用被用來追蹤感興趣的核酸的遺傳，鑒定遺傳了感興趣的核酸的細(xì)胞或生 物體和/或測量基因表達(dá)的誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域已知和使用的報道基因的例子包括熒光 素酶(Luc)、綠熒光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、0 -半乳糖苷酶(LacZ)、0 -葡萄 糖醛酸酶(Gus)以及類似物?？蛇x的標(biāo)志物基因還可被視為報道基因?！皢幼印焙汀皢幼有蛄小笨杀换Q地使用并指能夠控制編碼序列或功能性RNA 的表達(dá)的DNA序列。通常，編碼序列位于啟動子序列的3’側(cè)。啟動子可作為整體衍生自天然基因，或由衍生自天然發(fā)現(xiàn)的不同啟動子的不同元件所組成，或甚至包括合成的DNA區(qū) 段。據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，不同啟動子可指導(dǎo)不同組織或細(xì)胞類型中的，或在發(fā)育的不同 階段中的，或?qū)Σ煌h(huán)境或生理條件進(jìn)行應(yīng)答時的基因表達(dá)。導(dǎo)致基因在多數(shù)細(xì)胞類型和 多數(shù)時間中表達(dá)的啟動子通常被稱作“組成性啟動子”。導(dǎo)致基因在特定細(xì)胞類型中表達(dá) 的啟動子通常被稱作“細(xì)胞特異性啟動子”或“組織特異性啟動子”。導(dǎo)致基因在發(fā)育或細(xì) 胞分化特定階段中表達(dá)的啟動子通常被稱作“發(fā)育特異性啟動子”或“細(xì)胞分化特異性啟動 子”。被誘導(dǎo)并導(dǎo)致基因在將細(xì)胞暴露于或用誘導(dǎo)啟動子的試劑、生物分子、化學(xué)品、配體、 光或類似物處理之后表達(dá)的啟動子通常被稱作“可誘導(dǎo)的啟動子”或“可調(diào)控的啟動子”。還 認(rèn)識到，由于多數(shù)情況下調(diào)控序列的確切界限未被完全界定，不同長度的DNA片段可具有 相同的啟動子活性。啟動子序列通常在其3’末端由轉(zhuǎn)錄起始位點界定并向上游延伸(5’方向)以包 括最小數(shù)量的堿基或元件，所述堿基或元件對于在背景之上可檢測的水平的轉(zhuǎn)錄起始是必 要的。在啟動子序列中將發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(例如通過用核酸酶S1進(jìn)行定位來方便地確 定)以及負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA時，編碼序列是“受控”于細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和 翻譯控制序列的，所述mRNA然后被反式RNA剪接(如果所述編碼序列含有內(nèi)含子)并翻譯 成編碼序列所編碼的蛋白?！稗D(zhuǎn)錄和翻譯控制序列”是指DNA調(diào)控序列例如啟動子、增強子、終止子以及類似 物，其提供宿主細(xì)胞中編碼序列的表達(dá)。在真核細(xì)胞中，多腺苷酸化信號是控制序列。術(shù)語“應(yīng)答元件”是指一種或多種順式作用DNA元件，其賦予啟動子通過與轉(zhuǎn)錄 因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用而介導(dǎo)的應(yīng)答，所述轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域例如第一 雜交蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該DNA元件可以是回文的序列(完美的或不完美的)或由 序列模體或被可變數(shù)量的核苷酸分離的半位點所組成。該半位點可以是相似或相同的并 被排列為直接或倒置的重復(fù)或者單個半位點或串聯(lián)的相鄰半位點的多聚體。所述應(yīng)答元 件可包括從不同生物體分離的最小啟動子，其取決于將引入所述應(yīng)答元件的細(xì)胞或生物 體的性質(zhì)。第一雜交蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在存在或不存在配體的情況下結(jié)合至應(yīng)答元 件的DNA序列以在該應(yīng)答元件的調(diào)控下開始或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄。天然蛻皮素受體的 應(yīng)答元件的 DNA 序列的例子包括RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO 16)(參見 Cherbas 等，Genes Dev. 5 120-131 (1991)) ；AGGTCAN(n)AGGTCA，其中 N(n)可以是一種或多種間隔區(qū) 核苷酸(SEQ ID N0:17)(參見 D' Avino 等，Mol. Cell. Endocrinol. 113 1-9 (1995))； 以及 GGGTTGAATGAATTT(SEQ ID NO 18)(參見 Antoniewski 等，Mol. Cell Biol.14 4465-4474(1994))。術(shù)語“可操作地連接”是指核酸序列在單個核酸片段上的締合以使一個的功能受 到另一個的影響。例如，當(dāng)能夠影響編碼序列的表達(dá)時(即所述編碼序列在啟動子的轉(zhuǎn)錄 控制之下)，將啟動子與編碼序列可操作地連接?？蓪⒕幋a序列以有義或反義方向可操作地 連接至調(diào)控序列。本文所用術(shù)語“表達(dá)”是指衍生自核酸或多核苷酸的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn) 錄和穩(wěn)定聚集。表達(dá)還可指mRNA翻譯成蛋白或多肽。術(shù)語“盒”、“表達(dá)盒”和“基因表達(dá)盒”是指可在特定的限制位點或通過同源重組
46插入核酸或多核苷酸的DNA區(qū)段。所述DNA區(qū)段包括編碼感興趣的多肽的多核苷酸，并且 所述盒和限制位點被設(shè)計以確保所述盒被插入轉(zhuǎn)錄和翻譯的適當(dāng)閱讀框架。“轉(zhuǎn)化盒”是指 包括編碼感興趣的多肽的多核苷酸并且具有除了促進(jìn)特定宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的多核苷酸之外 的元件的特定載體。本發(fā)明的盒、表達(dá)盒、基因表達(dá)盒以及轉(zhuǎn)化盒還可包括允許編碼宿主細(xì) 胞中感興趣的多肽的多核苷酸增強表達(dá)的元件。這些元件可包括但不限于啟動子、最小啟 動子、增強子、應(yīng)答元件、終止子序列、多腺苷酸化序列以及類似物。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“基因開關(guān)”是指與啟動子相關(guān)的應(yīng)答元件和基于EcR的 系統(tǒng)的組合，其中所述基于EcR的系統(tǒng)在一種或多種配體的存在下調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，而應(yīng) 答元件和啟動子被整合進(jìn)所述基因。術(shù)語“調(diào)節(jié)(modulate)，，和“調(diào)節(jié)(modulates)，，是指誘導(dǎo)、減少或抑制核酸或基 因表達(dá)，并導(dǎo)致蛋白或多肽生產(chǎn)的相應(yīng)的誘導(dǎo)、減少或抑制。本發(fā)明的質(zhì)粒或載體還可包括至少一個適合驅(qū)使宿主細(xì)胞中基因表達(dá)的啟動子?？杀挥迷诒景l(fā)明實施方案中的增強子包括但不限于SV40增強子、細(xì)胞巨化病毒 (CMV)增強子、延伸因子1(EF1)增強子、酵母增強子、病毒基因增強子以及類似物。終止控制區(qū)域即終止子或多腺苷酸化序列還可衍生自優(yōu)選的宿主中天然的各種 基因。可選地，終止位點可以是不必要的，然而如果被包括進(jìn)來則是最優(yōu)選的。在本發(fā)明一 個實施方案中，終止控制區(qū)域可被包括或衍生自合成的序列、合成的多腺苷酸化信號、SV40 晚期多腺苷酸化信號、SV40多腺苷酸化信號、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化信號、病毒終止 子序列或類似物。術(shù)語“3’非編碼序列”或“3’非翻譯區(qū)(UTR)，，是指位于編碼序列下游(3’ )的 DNA序列，并可包括多腺苷酸化[poly(A)]識別序列以及編碼能夠影響mRNA加工或基因表 達(dá)的調(diào)控信號的其他序列。多腺苷酸化信號通常被表征為影響多聚腺苷酸束向mRNA前體 的3’端的添加?！罢{(diào)控區(qū)域”是指調(diào)控第二個核酸序列的表達(dá)的核酸序列。調(diào)控區(qū)域可包括天然地 負(fù)責(zé)表達(dá)特定核酸的序列(同源區(qū)域)，或可包括負(fù)責(zé)表達(dá)不同蛋白或甚至合成的蛋白的 不同起源的序列(異源區(qū)域)。特別地，所述序列可以是原核、真核或病毒基因的序列或衍 生的序列，其以特定的或非特定的方式并且以可誘導(dǎo)的或不可誘導(dǎo)的方式刺激或抑制基因 轉(zhuǎn)錄。調(diào)控區(qū)域包括復(fù)制起點、RNA剪接位點、啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止序列以及將多肽導(dǎo) 向靶細(xì)胞的分泌途徑的信號序列。來自“異源來源”的調(diào)控區(qū)域是指不與所表達(dá)的核酸天然相連的調(diào)控區(qū)域。包括 在異源調(diào)控區(qū)域之中的是來自不同物種的調(diào)控區(qū)域、來自不同基因的調(diào)控區(qū)域、雜交調(diào)控 序列以及不天然存在卻是由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員設(shè)計的調(diào)控序列。"RNA轉(zhuǎn)錄物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列轉(zhuǎn)錄所得的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物 是DNA序列的完美互補拷貝時，它被稱作初級轉(zhuǎn)錄物或者它可以是衍生自初級轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn) 錄后加工的RNA序列并被稱作成熟RNA?！靶攀筊NA(mRNA)，，是指不含內(nèi)含子并可被細(xì)胞翻 譯成蛋白的RNA?！癱DNA”是指與mRNA互補并衍生自mRNA的雙鏈DNA。“有義” RNA是指包 括mRNA并因此可被細(xì)胞翻譯成蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺戳xRNA”是指與所有或部分的靶初 級轉(zhuǎn)錄物或mRNA互補的并且阻斷靶基因表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物。反義RNA的互補可以是與特 定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分即5’非編碼序列、3’非編碼序列或編碼序列?！肮δ苄訰NA”是指反義RNA、核酶RNA或未被翻譯但對細(xì)胞加工有作用的其他RNA。“多肽”、“肽”和“蛋白”被可互換地使用并指包括共價連接的氨基酸殘基的多聚體 化合物。氨基酸具有如下通用結(jié)構(gòu) “分離的多肽”、“分離的肽”或“分離的蛋白”是指基本上不含通常以天然狀態(tài)與其 相連的那些化合物(例如其他蛋白或多肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì))的多肽或蛋白?！胺蛛x 的”不意味著排除與其他化合物的人工的或合成的混合物，或干擾生物活性的雜質(zhì)的存在， 其中所述雜質(zhì)可由于例如不完全的純化、穩(wěn)定劑的添加或配制成藥學(xué)上可接受的制劑而存在。“取代突變體多肽”或“取代突變體”將被理解為是指這樣的突變體多肽，其包括 用與野生型或天然存在的多肽相關(guān)的不同氨基酸取代至少一個(1)野生型或天然存在的 氨基酸。取代突變體多肽可包括僅一個(1)野生型或天然存在的氨基酸的取代并可被稱作 “點突變體”或“單點突變體”多肽?？蛇x地，取代突變體多肽可包括兩個(2)或更多個野生 型或天然存在的氨基酸被2個或更多個與野生型或天然存在的多肽相關(guān)的氨基酸的取代。 根據(jù)本發(fā)明，包括取代突變的組H核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽包括至少一個(1)野生型或 天然存在的氨基酸被與野生型或天然存在的組H核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽相關(guān)的不同 氨基酸的取代。當(dāng)取代突變體多肽包括兩個(2)或更多個野生型或天然存在的氨基酸的取代時， 該取代可包括相等數(shù)量的為了所述取代而缺失的野生型或天然存在的氨基酸即2個野生 型或天然存在的氨基酸被2個非野生型或非天然存在的氨基酸所替換，或者不相等數(shù)量的 為了所述取代而缺失的野生型氨基酸即2個野生型氨基酸被1個非野生型氨基酸所替換 (取代+缺失突變)或2個野生型氨基酸被3個非野生型氨基酸所替換(取代+插入突 變)?？墒褂每s略的命名系統(tǒng)來描述取代突變體以表示氨基酸殘基和在參考多肽序列 和新的被取代的氨基酸殘基中被替換的個數(shù)。例如，多肽的第二十個(20th)氨基酸殘基 被取代的取代突變體可被縮略為“x20z”，其中“X”是待替換的氨基酸，“20”是多肽中氨 基酸殘基位置或編號，而“z”是新的被取代的氨基酸。因此，被互換地縮略為“E20A”或 "Glu20Ala"的取代突變體表示所述突變體包括丙氨酸殘基(本領(lǐng)域中通?？s略為“A”或 “Ala”)對谷氨酸(本領(lǐng)域中通?？s略為“E”或“Glu”)在所述多肽位置20上的替換?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何誘變技術(shù)進(jìn)行取代突變，其包括但不限于體外 位點定向誘變(Hutchinson 等，J. Biol. Chem. 253 6551(1978) ；Zoller 等，DNA 3 479-488(1984) ；Oliphant 等，Gene 44 177 (1986) ；Hutchinson 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :710(1986))、TAB :連接劑(Pharmacia)的使用、限制性內(nèi)切酶消化/片段缺失和 取代、PCR介導(dǎo)的/低聚核苷酸定向的誘變以及類似物?；赑CR的技術(shù)對于位點定向誘 變是優(yōu)選的(參見 Higuchi，1989，“ Using PCR to Engineer DNA"(使用 PCR 來改造 DNA),在PCR Technology :Principles and Applications for DNA Amplification(PCR技術(shù)=DNA擴增的原理和應(yīng)用)中，H. Erlich，編輯，Stockton出版社，第6章，第61-70頁)。本發(fā)明多肽的“片段”是指這樣一種多肽，其氨基酸序列比參考多肽短，且整段包括與這些參考多肽相同的氨基酸序列。在適當(dāng)時，這種片段可作為一部分而被包括在較大 的多肽中。本發(fā)明這種多肽片段可具有至少2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240 或 300 個氨基酸的長度。多肽或蛋白的“變體”是指任何類似物、片段、衍生物或突變體，其衍生自多肽或蛋 白并保持所述多肽或蛋白的至少一種生物學(xué)性質(zhì)。多肽或蛋白的不同變體可天然存在。這 些變體可以是特征為編碼所述蛋白的結(jié)構(gòu)性基因的核苷酸序列的差異的等位基因變異，或 可包括差別剪接或翻譯后修飾。技術(shù)人員能制造具有單個或多個氨基酸取代、缺失、添加或 替換的變體。這些變體可尤其包括(a)其中一個或多個氨基酸殘基被保守或不保守的氨 基酸所取代的變體，(b)其中一個或多個氨基酸被添加到多肽或蛋白的變體，(c)其中一個 或多個氨基酸包括取代基的變體，和(d)其中多肽或蛋白與另一個多肽例如血清白蛋白融 合的變體。獲得這些變體的技術(shù)包括遺傳(抑制、缺失、突變等)、化學(xué)和酶技術(shù)，是本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員已知的。變體多肽優(yōu)選地包括至少約14個氨基酸。術(shù)語“同源性”是指兩種多核苷酸或兩種多肽部分之間同一性的百分比。可以使 用本領(lǐng)域已知技術(shù)來確定一個部分和另一個部分序列之間的對應(yīng)。例如，可以通過將序列 信息排在一起并使用容易獲得的計算機程序來直接對比兩種多肽分子之間的序列信息以 確定同源性?？蛇x地，可以通過將多核苷酸在形成同源區(qū)域之間穩(wěn)定雙鏈體的條件下雜交 來確定同源性，隨后用單鏈特異性核酸酶進(jìn)行消化并且確定消化片段的大小。如本文所用，所有語法形式和拼寫變化的術(shù)語“同源的”是指具有“共同進(jìn)化起源” 的蛋白之間的關(guān)系，所述蛋白包括來自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白和來自不 同物種的同源蛋白(例如，肌球蛋白輕鏈等)(Reeck等，Cell 50:667(1987))。這種蛋白 (以及它們的編碼基因)具有序列同源性，其通過它們高度的序列相似性得到反映。然而， 在通常使用和本申請中，當(dāng)用副詞例如“高度”修飾時，術(shù)語“同源的”可以指序列相似性而 非共同進(jìn)化起源。因此，所有語法形式的術(shù)語“序列相似性”是指可以或可以不共有共同進(jìn)化起源的 蛋白的核酸或氨基酸序列之間的同一性或?qū)?yīng)程度(Reeck等，Cell 50 :667(1987))。在一 個實施方案中，當(dāng)至少約50% (優(yōu)選地至少約75%，并且最優(yōu)選地至少約90或95% )的 核苷酸在限定長度的DNA序列上匹配時，兩條DNA序列是“基本上同源的”或“基本上相似 的”?？赏ㄟ^使用序列數(shù)據(jù)庫中可得的標(biāo)準(zhǔn)軟件，或者在例如特定系統(tǒng)所限定的嚴(yán)格條件下 的Southern雜交實驗中將序列進(jìn)行比較而鑒定基本上同源的序列。限定適當(dāng)?shù)碾s交條件 是在本領(lǐng)域技術(shù)之內(nèi)的(參見，例如上述Sambrook等，1989)。如本文所用，“基本上相似的”是指這樣的核酸片段，其中在一種或多種核苷酸堿 基上的改變導(dǎo)致一種或多種氨基酸的取代，但不影響由DNA序列編碼的蛋白的功能特性。 “基本上相似的”還指這樣的核酸片段，其中在一種或多種核苷酸堿基上的改變不影響核酸 片段通過反義或共抑制技術(shù)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)改變的能力?！盎旧舷嗨频摹边€指本發(fā)明核酸 片段的修飾，例如一種或多種核苷酸堿基的缺失或插入，其基本上不影響所得轉(zhuǎn)錄物的功 能特性。因此據(jù)理解，本發(fā)明涵蓋多過特定的示范性序列。被提出的修飾中的每個是在本 領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)內(nèi)的，如對編碼的產(chǎn)物生物活性的保持進(jìn)行確定。
此外，技術(shù)人員意識到，本發(fā)明所涵蓋的基本上相似的序列還被它們在嚴(yán)格條件 下(0. IX SSC、0. SDS、65°C并用 2X SSC、0. 1 % SDS 沖洗，接著是 0. IX SSC,0. 1% SDS) 與本文所示例的序列雜交的能力所限定。基本上相似的本發(fā)明的核酸片段是其DNA序列與 本文所報道的核酸片段的DNA序列至少70%相同的那些核酸片段。本發(fā)明的核酸片段包括 其DNA序列與本文所報道的核酸片段的DNA序列至少80%相同的那些核酸片段。其他核酸 片段與本文所報道的核酸片段的DNA序列至少90 %相同。其他核酸片段與本文所報道的核 酸片段的DNA序列至少95%相同。
兩條氨基酸序列當(dāng)超過約40 %的氨基酸是相同的或者超過60 %是相似的(功 能相同)時是“基本上同源的”或“基本上相似的”。優(yōu)選地，通過使用例如GCG(Genetics Computer Group (遺傳學(xué)計算機組)，ProgramManual for the GCG Package (GCG 包的程序 手冊)，第7版，Madison, Wisconsin)堆積程序進(jìn)行對比來鑒定相似或同源的序列。本文使用術(shù)語“對應(yīng)于”來指相似的或同源的序列，不管確切位置是與被測量相似 性或同源性的分子相同還是不同。核酸或氨基酸序列的對比可包含空隙。因此，術(shù)語“對應(yīng) 于”是指序列相似性而非氨基酸殘基或核苷酸堿基的編號。氨基酸或核苷酸序列的“相當(dāng)一部分”包括足夠的多肽氨基酸序列或基因的核 苷酸序列以推定地鑒定該多肽或基因，其通過本領(lǐng)域技術(shù)人員人工地評估所述序列或者 使用算法例如BLAST (Basic Local Alignment SearchTool (基本的局部對比搜索工具)； Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 403 410(1993)；還參見 www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)通 過計算機自動化的序列對比和鑒定來進(jìn)行。通常，為了推定地鑒定多肽或核酸序列與已知 蛋白或基因是同源的，十個或更多連續(xù)氨基酸或者三十個或更多核苷酸的序列是必要的。 此外，關(guān)于核苷酸序列，可以以基因鑒定(例如，Southern雜交)和分離(例如，細(xì)菌菌落 或噬菌斑的原位雜交)的序列依賴性方法使用包括20-30個連續(xù)核苷酸的基因特異性低聚 核苷酸探針。另外，12-15個堿基的短的低聚核苷酸可被用作PCR的擴增引物以獲得包括所 述引物的特定核酸片段。因此，“相當(dāng)一部分”的核苷酸序列包括足夠的序列以特別地鑒定 和/或分離包括所述序列的核酸片段。本領(lǐng)域已知的術(shù)語“百分比同一性”是通過比較其序列而確定的兩種或更多種多 肽序列或兩種或更多種多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同一性”還指多肽或多核 苷酸序列之間的序列相關(guān)程度，視情況而定，其由這種序列串之間的匹配所確定?？梢允?用已知方法容易地計算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于被描述在如下的那 些Computational Molecular Biology (計算分子生物學(xué))(Lesk，Α· Μ·編輯)牛津大學(xué) 出版社，紐約(1988) ；Biocomputing Informatics and GenomePro jects (生物計算信息 學(xué)和基因組計劃)(Smith，D. W.編輯)學(xué)術(shù)出版社，紐約(1993) ；Computer Analysis of Sequence Data(序列數(shù)據(jù)的計算機分析)，第I部分(Griffin，A. Μ.和Griff in，H. G.編輯) Humana 出版社，新澤西(1994) ；Sequence Analysis in Molecular Biology (分子生物學(xué)中 的序列分析)(von Heinje，G.編輯)學(xué)術(shù)出版社(I987)；和 Sequence AnalysisPrimer (序 列分析初級讀本)(Gribskov，M.和Devereux，J.編輯)Stockton出版社，紐約(1991)。將 確定同一性的方法設(shè)計為在被測序列之間展現(xiàn)最好的匹配。將確定同一性和相似性的方法 以公眾可得的計算機程序編碼?？梢允褂肔ASERGENE生物信息學(xué)計算套件(DNASTAR有限 公司，Madison，WI)的Megalign程序來進(jìn)行序列對比和百分比同一性計算?？梢允褂脦в腥笔?shù)(GAP PENALTY = 10，GAP LENGTH PENALTY = 10)的 Clustal 對比方法(Higgins 等，CAB I OS. 5 151 153(1989))進(jìn)行序列的多重對比。使用Clustal方法配對對比的缺省 參數(shù)可被選擇KTUPLE 1，GAPPENALTY = 3，WINDOW = 5 和 DIAGONALS SAVED = 5。術(shù)語“序列分析軟件”是指對于分析核苷酸或氨基酸序列有用的任何計算機算法 或軟件程序。“序列分析軟件”可以是商業(yè)上可得的或獨立地開發(fā)的。通常的序列分析軟件 將包括但不限于GCG程序套件(Wisconsin包第9. 0版，Genetic s Computer Group (遺傳 學(xué)計算機組)(GCG) ,Madison，WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 403-410(1990))和 DNASTAR(DNASTAR 有限公司，1228S. Park St. Madison, WI53715 美國)。 在本申請的范圍內(nèi)，將被理解的是，在序列分析軟件被用于分析時，分析結(jié)果將基于參考程 序的“缺省值”，除非另外說明。如本文所用，“缺省值”將指當(dāng)其被第一次初始化時隨著軟 件最初載入的任何值或參數(shù)組。與DNA序列相關(guān)的“化學(xué)合成的”是指，組成性核苷酸是在體外裝配的?？墒褂煤?好地確立的方法來實現(xiàn)DNA的人工化學(xué)合成，或者可使用若干商業(yè)上可得的機器之一進(jìn)行 自動化的化學(xué)合成。因此，可以為了基于核苷酸序列的最優(yōu)化的最佳基因表達(dá)來定制基因 以反映宿主細(xì)胞的密碼子偏倚性。技術(shù)人員理解成功的基因表達(dá)的可能性，如果密碼子的 使用偏向于被宿主偏愛的那些密碼子。優(yōu)選的密碼子的確定可基于衍生自宿主細(xì)胞的基因 的調(diào)查，所述宿主細(xì)胞中的序列信息是可得的。如本文所用，當(dāng)下述時稱兩種或多種獨立可操作的基因調(diào)控系統(tǒng)是“正交的” :a) 相應(yīng)配體在所選濃度下對每個所給系統(tǒng)的調(diào)節(jié)導(dǎo)致該系統(tǒng)基因表達(dá)強度的可測量的改變， 和b)所述改變在統(tǒng)計學(xué)上顯著不同于在所有其他系統(tǒng)表達(dá)的改變，其中所述所有其他系 統(tǒng)在細(xì)胞、組織或生物體中是同時可操作的，不管實際調(diào)節(jié)的同時性或連續(xù)性。優(yōu)選地，每 種獨立可操作的基因調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)節(jié)導(dǎo)致超過細(xì)胞、組織或生物體中所有其他可操作的系 統(tǒng)至少2倍的基因表達(dá)改變。更優(yōu)選地，所述改變是超過至少5倍。甚至更優(yōu)選地，所述改 變是超過至少10倍。還更優(yōu)選地，所述改變是超過至少100倍。甚至還更優(yōu)選地，所述改 變是超過至少500倍。理想地，每種所給系統(tǒng)被所選濃度的其相應(yīng)配體的調(diào)節(jié)導(dǎo)致該系統(tǒng) 基因表達(dá)強度可測量的改變，并且未導(dǎo)致在細(xì)胞、組織或生物體中可操作的所有其他系統(tǒng) 的表達(dá)的可測量的改變。在這種情況下，多重可誘導(dǎo)基因調(diào)控系統(tǒng)被稱為是“完全正交的”。 本發(fā)明對于搜尋正交的配體和例如描述在US2002/0110861A1中的正交的基于受體的基因 表達(dá)系統(tǒng)是有用的，其整體通過引用被并入本文。術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指所給配體/受體復(fù)合物誘導(dǎo)或抑制外源性基因的反式激活的能 力。術(shù)語“外源性基因”是指對于所述受試者是外來的基因，即通過轉(zhuǎn)化過程被引入所 述受試者的基因，其為外源性突變基因的未突變版本或者外源性未突變基因的突變版本。 轉(zhuǎn)化的方法對于本發(fā)明不是關(guān)鍵性的，并可以是適合于本領(lǐng)域已知受試者的任何適合的方 法。例如，通過從被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生而獲得轉(zhuǎn)基因植物。從文獻(xiàn)中可以知道許多轉(zhuǎn)化程序， 例如使用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或其T1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌感染法、電穿孔、 植物細(xì)胞和原生質(zhì)體的微注射以及微粒轉(zhuǎn)化。用來轉(zhuǎn)化動物細(xì)胞和在轉(zhuǎn)基因動物中再生這 種被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的互補技術(shù)是已知的。外源性基因可以是天然的或合成的基因，以及以DNA 或RNA的形式被引入所述受試者的治療基因，所述DNA或RNA可通過DNA中間產(chǎn)物例如逆轉(zhuǎn)錄酶起作用。這種基因可被引入靶細(xì)胞，直接地引入所述受試者或者間接地通過被轉(zhuǎn)化 的細(xì)胞例如自體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移來引入所述受試者。術(shù)語“治療基因”是指將有利功能傳遞給 宿主細(xì)胞的基因，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)這種基因。術(shù)語“蛻皮素受體復(fù)合物”通常指異二聚體蛋白復(fù)合物，其由類固醇受體家族的 兩個成員蛻皮素受體(“EcR”)和超氣門(“USP”)蛋白所組成(Yao等，Nature 366 476-479(1993)) ；Yao等，Cell 71 :63_72 (1992))。功能性蛻皮類固醇受體復(fù)合物還可包括 另外的蛋白例如抑免蛋白。類固醇受體蛋白質(zhì)家族的另外成員還可以是配體依賴性的或不 依賴性的EcR和/或USP配偶體，被稱作轉(zhuǎn)錄因子(例如DHR38、β FTZ-I或其他昆蟲同系 物)。蛻皮素受體復(fù)合物還可以是蛻皮素受體蛋白和超氣門蛋白的脊椎動物同系物即視黃 酸-X-受體(“RXR”)蛋白的異二聚體。蛻皮素受體蛋白或USP的同二聚體復(fù)合物在一些 情況下還可以是功能性的?？赏ㄟ^結(jié)合至復(fù)合物中一種蛋白的活性蛻皮類固醇或非類固醇配體來激活蛻皮 類固醇受體復(fù)合物，其中所述的復(fù)合物中一種蛋白包括EcR但不排除復(fù)合物的其他蛋白。蛻皮素受體復(fù)合物包括作為類固醇受體超家族成員的蛋白，其中所有成員特征為 存在氨基酸末端反式激活結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(“DBD”)和被鉸鏈區(qū)域分離的配體結(jié)合 結(jié)構(gòu)域(“LBD”)。所述家族的一些成員在LBD羧基端一側(cè)還可具有另一種反式激活結(jié)構(gòu) 域。DBD特征為存在兩個半胱氨酸鋅指，在所述鋅指之間是兩個氨基酸模體即P-盒和D-盒， 其賦予對蛻皮素應(yīng)答元件以特異性。這些結(jié)構(gòu)域可以是天然的、修飾的或異源性受體蛋白 不同結(jié)構(gòu)域的嵌合體。構(gòu)成外源性基因、應(yīng)答元件和蛻皮素受體復(fù)合物的DNA序列可被引入古細(xì)菌，原 核細(xì)胞例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或其他腸道細(xì)菌，或者真核細(xì)胞例如植物或動物細(xì)胞。 然而，因為基因表達(dá)的許多蛋白在細(xì)菌內(nèi)被不正確地加工，真核細(xì)胞是優(yōu)選的。所述細(xì)胞可 以是單個細(xì)胞或多細(xì)胞生物體的形式。外源性基因、應(yīng)答元件和受體復(fù)合物的核苷酸序列 還可作為RNA分子被并入，優(yōu)選地以功能性病毒RNA例如煙草花葉病毒的形式。在真核細(xì) 胞中，脊椎動物細(xì)胞是優(yōu)選的，因為它們天然缺失對本發(fā)明中蛻皮素受體的配體產(chǎn)生應(yīng)答 的分子。結(jié)果，它們對本發(fā)明的配體是“基本上不敏感的”。因此，本發(fā)明的配體將對被轉(zhuǎn)化 的細(xì)胞或整個生物體具有可忽略的生理或其他作用。因此，細(xì)胞可生長并表達(dá)期望的產(chǎn)物， 而基本上不受配體自身存在的影響。術(shù)語“受試者”是指完整的昆蟲、植物或動物或來自昆蟲、植物或動物的細(xì)胞。還預(yù)期，當(dāng)受試者為真菌或酵母時，配體將同樣出色地工作。當(dāng)所述受試者為完整動物時，優(yōu) 選地所述動物為脊椎動物，最優(yōu)選地為哺乳動物。當(dāng)與蛻皮素受體復(fù)合物一起使用時，本發(fā)明中式I的二?；菖潴w和式II或III 的手性二?；菖潴w提供外部短暫調(diào)控外源性基因表達(dá)的方法，其中所述蛻皮素受體復(fù)合 物反過來結(jié)合至被連接到外源性基因的應(yīng)答元件上。各種組件互相結(jié)合即配體結(jié)合至受體 復(fù)合物和受體復(fù)合物結(jié)合至應(yīng)答元件的順序不是關(guān)鍵的。通常，外源性基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是 回應(yīng)蛻皮素受體復(fù)合物與特異性對照或調(diào)控DNA元件的結(jié)合。與類固醇受體家族其他成員 相似，蛻皮素受體蛋白具有至少三個結(jié)構(gòu)域即反式激活結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合 結(jié)構(gòu)域。與類固醇受體家族亞型相似，該受體還具有較少完全確定的區(qū)域，其對異二聚化特 性負(fù)責(zé)。配體對蛻皮素受體蛋白的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合在與USP或RXR蛋白異二聚化之后，致使異二聚體蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與激活形式的應(yīng)答元件結(jié)合，從而導(dǎo)致外源性基 因的表達(dá)或抑制。該機制不排除配體結(jié)合EcR或USP以及導(dǎo)致活性同二聚體復(fù)合物(例如 EcR+EcR或USP+USP)形成的潛力。優(yōu)選地，一個或多個受體結(jié)構(gòu)域可被改變以產(chǎn)生嵌合基 因開關(guān)。通常，三個結(jié)構(gòu)域中的一個或多個可選自不同于其他結(jié)構(gòu)域的來源，以致于嵌合受 體在所選宿主細(xì)胞或生物體中為了反式激活活性、對配體的互補結(jié)合以及對特異性應(yīng)答元 件的識別而被優(yōu)化。另外，應(yīng)答元件自身可被修飾或被其他DNA結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的應(yīng)答元 件所取代以適應(yīng)嵌合的蛻皮素受體復(fù)合物，其中所述其他DNA結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的應(yīng)答元件 例如來自酵母的GAL-4蛋白(參見Sadowski等，Nature 335 :563_564 (1988))或來自大腸 桿菌的LexA蛋白(參見Brent等，Cell 43:729-736(1985))。嵌合系統(tǒng)的另一個優(yōu)勢是， 它們允許選擇被用來根據(jù)期望的最終結(jié)果而驅(qū)使外源性基因的啟動子。這種雙重控制在基 因療法領(lǐng)域中是特別重要的，特別是當(dāng)產(chǎn)生細(xì)胞毒性蛋白時，因為表達(dá)的時間安排和發(fā)生 表達(dá)的細(xì)胞二者皆可被控制。當(dāng)將可操作地連接至適合的啟動子的外源性基因引入受試者 中的細(xì)胞中時，外源性基因的表達(dá)通過本發(fā)明配體的存在被控制。啟動子可被組成性地或 可誘導(dǎo)地調(diào)控或可以是組織特異性的(即只在特定細(xì)胞類型中表達(dá))或?qū)ι矬w特定發(fā)育 階段具有特異性。編碼各種多肽的許多基因組和cDNA核酸序列是本領(lǐng)域已知的。與本發(fā)明的配體 一起有用的外源性遺傳物質(zhì)包括編碼感興趣的生物活性蛋白的基因例如，可從細(xì)胞釋放的 分泌性蛋白；可將底物由毒性物質(zhì)代謝為非毒性物質(zhì)或由非活性物質(zhì)代謝為活性物質(zhì)的 酶；調(diào)控蛋白；細(xì)胞表面受體；以及類似物。有用的基因還包括編碼凝血因子、激素例如胰 島素、甲狀旁腺激素、促黃體激素釋放因子、α和β精子抑制素和人生長激素的基因；編碼 蛋白例如酶的基因，其缺失導(dǎo)致異常狀態(tài)的發(fā)生；編碼細(xì)胞因子或淋巴因子例如干擾素、粒 細(xì)胞性巨噬細(xì)胞集落刺激因子、集 落刺激因子-1、腫瘤壞死因子和促紅細(xì)胞生成素的基因； 編碼抑制劑物質(zhì)例如α工-抗胰蛋白酶的基因、編碼作為藥物例如白喉和霍亂毒素而起作用 的物質(zhì)的基因；以及類似物。有用的基因還包括對癌癥療法以及治療遺傳病癥有用的那些。 本領(lǐng)域技術(shù)人員具有獲得幾乎所有已知基因的核酸序列信息的途徑，并且可從公共倉庫即 發(fā)表該序列的研究所直接獲得核酸分子或者使用常規(guī)方法來制備所述分子。在一個實施方案中，外源性基因是在RheoSwitch 治療系統(tǒng)(RTS)控制之下的 hIL-12基因，其離體地通過腺病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)自體樹突細(xì)胞。為了用于基因療法，本文所述配體可被單獨地或作為藥物組合物的一部分施用， 所述藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的載體。在一個實施方案中，藥物組合物是溶液、懸液、 片劑、膠囊劑、軟膏劑、酏劑或可注射的組合物的形式。藥學(xué)上可接受的載體包括填充劑例如糖如乳糖或蔗糖、甘露醇或山梨醇、纖維素 制劑和/或磷酸鈣如磷酸三鈣或磷酸氫鈣，以及結(jié)合劑例如淀粉糊，其使用例如玉米淀粉、 小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維 素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果希望，可加入崩解劑例如上述的淀粉還有羧甲基淀粉、交 聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或者海藻酸或其鹽例如海藻酸鈉。輔助劑是流量調(diào)控劑和潤滑 劑例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其鹽例如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣和/或聚乙二醇。在一個 實施方案中，提供了含有適合的包衣的糖衣丸核心，所述包衣，如果被期望，對胃液具有抵 抗性。為了該目的，可使用濃縮的糖溶液，其可以選擇地含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和適合的有機溶劑或溶劑混合物。為了產(chǎn)生對胃液有 抵抗性的包衣，使用了適合的纖維素制劑例如鄰苯二酸乙酰纖維素或鄰苯二酸羥丙基甲基 纖維素的溶液。為了識別或為了表征活性化合物劑量的組合，可將染料或色素加入片劑或 糖衣丸的包衣。 其他可被口服使用的藥物制劑包括由明膠制成的推入配合(push-fit)膠囊劑， 以及由明膠和增塑劑例如甘油或山梨醇制成的軟的、密封的膠囊劑。推入配合的膠囊劑可 含有顆?；蚣{米顆粒形式的活性化合物，其可被可選地與填充劑例如乳糖、結(jié)合劑例如淀 粉和/或潤滑劑例如滑石或硬脂酸鎂，以及可選地穩(wěn)定劑進(jìn)行混合。在一個實施方案中，其 被溶解或懸浮在適合的液體例如脂肪油或液體石蠟中，可選地與穩(wěn)定劑一起。脂肪油可包括甘油單、二或三酯。甘油單、二或三酯包括衍生自C6、C8、C1(1、C12、C14、 C16、C18、C2(I和C22酸的那些。示例性的甘油二酯特別地包括二油精、二棕櫚一油精和混合的辛 酸甘油酯-癸酸甘油酯甘油二酯。優(yōu)選的甘油三酯包括植物油、魚油、動物脂肪、氫化植物 油、部分氫化的植物油、合成的甘油三酯、修飾的甘油三酯、分餾的甘油三酯、中鏈和長鏈甘 油三酯、結(jié)構(gòu)化的甘油三酯及其混合物。示例性的甘油三酯包括杏仁油；巴西棕櫚樹油； 琉璃苣油；黑醋栗種子油；加拿大低芥酸菜籽油；蓖麻油；椰子油；玉米油；棉籽油；月見草 油；葡萄籽油；落花生油；芥籽油；橄欖油；棕櫚油；棕櫚仁油；花生油；菜籽油；紅花油；芝 麻油；鯊魚肝油；大豆油；葵花籽油；氫化蓖麻油；氫化椰子油；氫化棕櫚油；氫化大豆油； 氫化植物油；氫化棉籽油和蓖麻油；部分氫化大豆油；部分大豆和棉籽油；三己酸甘油酯； 三辛酸甘油酯；三癸酸甘油酯；三-十一酸甘油酯；三-月桂酸甘油酯；三油酸甘油酯；三亞 油酸甘油酯；三亞麻酸甘油酯；三辛酸/癸酸甘油酯；三辛酸/癸酸/月桂酸甘油酯；三辛 酸/癸酸/亞油酸甘油酯以及三辛酸/癸酸/硬脂酸甘油酯。在一個實施方案中，甘油三酯是中鏈甘油三酯，其以商標(biāo)名LABRAFAC CC可獲得。 其他的甘油三酯包括中性油例如中性植物油，特別是分餾的椰子油例如已知的和以商標(biāo) 名MIGLY0L商業(yè)上可得的，其包括如下產(chǎn)品MIGLY0L 810 ；MIGLY0L 812 ；MIGLY0L 818和 CAPTEX355。其他的甘油三酯是辛-癸酸甘油三酯例如已知的和以商標(biāo)名MYRIT0L商業(yè)上可 得的，其包括產(chǎn)品MYRIT0L 813。該類甘油三酯還有CAPMUL MCT,CAPTEX 200,CAPTEX 300、 CAPTEX 800、NEOBEE M5 禾口 MAZOL 1400。包括甘油三酯的藥物組合物還可包括親脂的和/或親水的表面活性劑，其在溶于 水溶劑時可形成澄清的溶液。一種這樣的表面活性劑是生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(維 生素E TPGS)。這種組合物的例子在美國專利6，267，985中被描述。在另一個實施方案中，藥學(xué)上可接受的載體包括LABRASOUGattefosse SA)，其為 PEG-8辛-癸酸甘油三酯。在另一個實施方案中，藥學(xué)上可接受的載體包括PL90G、維生素 E TPGS和Miglitol 812N。這種制劑的組分被顯示在表1中。表 1 可經(jīng)直腸使用的可能的藥物制劑包括例如栓劑，其由含有栓劑基質(zhì)的一種或多種 配體的組合所組成。適合的栓劑基質(zhì)是例如天然的或合成的甘油三酯或石蠟烴。另外，還 可能使用明膠直腸膠囊，其由配體和基質(zhì)的組合所組成?？赡艿幕|(zhì)物質(zhì)包括例如液體甘 油三酯、聚乙二醇或石蠟烴。胃腸外施用的適合制劑包括水溶形式的配體的水溶液，例如水溶性鹽和堿性溶 液。另外，配體懸液可作為適當(dāng)?shù)挠蜖钭⑸鋺乙菏┯谩＿m合的親脂溶劑或媒介物包括脂肪 油例如芝麻油或者合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯或聚乙二醇-400。水注射懸液可 含有增加懸液粘性的物質(zhì)，其包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖?？蛇x地，懸 液還可包含穩(wěn)定劑。還可將局部組合物通過選擇適當(dāng)?shù)妮d體而配制為油、乳膏、洗液、軟膏以及類似 物。適合的載體包括植物或礦物油、白色礦脂(白色軟石蠟)、支鏈的脂肪或油、動物脂肪和 高分子量乙醇(高于C12)。如果期望的話，還可包括乳化劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑和抗氧化劑以 及帶來顏色或香味的劑。另外，還可將經(jīng)皮滲透增強劑用于這些局部制劑中。這種增強劑 的例子可在第3，989，816和4，444，762號美國專利中找到?？捎傻V物油、自乳化蜂蠟和水的混合物配制乳膏，其中摻入了溶解于少量油例如 杏仁油的配體。這種乳膏的典型例子包括約40份水、約20份蜂蠟、約40份礦物油和約1 份杏仁油?？赏ㄟ^將植物油例如杏仁油中的配體懸液與溫暖的軟石蠟混合并使混合物冷卻 而配制軟膏。這種軟膏的典型例子是包括按重量計約30%杏仁油和約70%白色軟石蠟的軟膏?？赏ㄟ^制備配體在適合的高分子量醇例如丙二醇或聚乙二醇中的懸液來方便地 制備洗液?？杀惶砑舆M(jìn)藥物組合物的抗氧化劑的例子包括BHA和BHT。在一個實施方案中，固體明膠膠囊中的藥物組合物包括每mLLABRASOL中30mg配 體。在另一個實施方案中，所述膠囊含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 IOOmg 配體。藥物組合物可含有按重量計0.01%至99%的配體。組合物可以是單劑或多劑形 式。任何特定藥物組合物中配體的量將取決于有效劑量，即引發(fā)期望的基因表達(dá)或抑制所 需的劑量。在一個實施方案中，將0.1至7.5mg/kg施用于受試者。在另一個實施方案中，將0. 1至3mg/kg施用于受試者。在另一個實施方案中，施用0. 1至3mg/kg。施用藥物組合物的適合途徑包括口服、直腸、局部(包括皮膚、口腔和舌下)、陰 道、胃腸外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、腫瘤內(nèi)和硬膜外)和經(jīng)過鼻胃管。本領(lǐng) 域技術(shù)人員將理解，優(yōu)選的施用途徑將取決于被治療的狀況，并可隨例如接受者的狀況等 因素改變。每天可施用一次或多次所述藥物組合物。在一個實施方案中，每天從施用含有 蛻皮素受體復(fù)合物和DNA結(jié)合序列的細(xì)胞之前24小時開始施用所述藥物組合物。本文所述的本發(fā)明式I的二?；菖潴w或者式II或III的手性二?；菖潴w還 可與其他藥學(xué)上有活性的化合物共同施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，將選擇與本文所述配 體共同使用的藥學(xué)上有活性的化合物以避免對接受者的不良作用或化合物之間不期望的 相互作用。可與所述配體共同使用的其他藥學(xué)上有活性的化合物的例子包括例如AIDS化 療劑、氨基酸衍生物、止痛劑、麻醉劑、肛門直腸產(chǎn)品、抗酸劑和抗胃腸氣脹藥、抗生素、抗凝 血劑、解毒劑、抗纖溶劑、抗組胺劑、抗炎劑、抗腫瘤劑、抗寄生蟲劑、抗原生動物劑、退燒藥、 防腐劑、鎮(zhèn)痙劑和抗膽堿能劑、抗病毒劑、食欲抑制劑、關(guān)節(jié)炎藥物、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、骨代 謝調(diào)控劑、腸道排泄劑、心血管藥物、中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激劑、腦代謝增強劑、耳垢溶解劑、膽 堿酯酶抑制劑、感冒和咳嗽制劑、集落刺激因子、避孕劑、細(xì)胞保護劑、牙科制劑、除臭劑、皮 膚科用藥、解毒劑、糖尿病藥物、診斷劑、腹瀉藥、多巴胺受體激動劑、電解質(zhì)、酶和助消化 齊IJ、麥角制劑、致育劑、纖維補充劑、抗真菌劑、溢乳抑制劑、胃酸分泌抑制劑、胃腸促動劑、 促性腺激素抑制劑、頭發(fā)生長刺激劑、補血藥、血液流變學(xué)制劑、止血劑、組胺H2受體拮抗 齊U、激素、促血糖增高劑、降血脂藥、免疫抑制劑、緩瀉藥、抗麻風(fēng)劑、白細(xì)胞清除輔助劑、肺 表面活性物質(zhì)、偏頭痛制劑、粘液溶解劑、肌肉松弛劑拮抗劑、肌肉松弛劑、麻醉拮抗劑、鼻 腔噴霧劑、惡心藥物核苷類似物、營養(yǎng)補充品、骨質(zhì)疏 松癥制劑、催產(chǎn)藥、副交感神經(jīng)阻斷 藥、擬副交感神經(jīng)劑、帕金森病的藥物、青霉素佐劑、磷脂、血小板抑制劑、嚇啉劑、前列腺素 類似物、前列腺素、質(zhì)子泵抑制劑、瘙癢癥藥物擬精神藥物、喹諾酮類藥物、呼吸刺激劑、唾 液刺激劑、鹽替代品、硬化劑、皮膚傷口制劑、戒煙助劑、磺胺藥、抗交感神經(jīng)藥、血栓溶解 齊lKTourette氏綜合征劑、顫抖癥制劑、肺結(jié)核制劑、促尿酸排泄劑、尿道劑、子宮收縮劑、子 宮松弛劑、陰道制劑、眩暈劑、維生素D類似物、維生素以及醫(yī)學(xué)成像對比劑。在一些情況 下，所述配體作為藥物療法的佐劑可以是有用的，例如“關(guān)閉”一種基因，所述基因產(chǎn)生使特 定藥物新陳代謝的酶。為了農(nóng)業(yè)應(yīng)用，除了上述的應(yīng)用之外，本發(fā)明的配體還可被用來控制殺蟲蛋白例 如蘇云金芽孢桿菌(Bt)毒素的表達(dá)。這種表達(dá)可以是組織或植物特異性的。此外，特別地 當(dāng)也需要控制植物害蟲時，可將一種或多種殺蟲劑與本文所述配體合并，從而提供另外的 優(yōu)勢和效力，包括比單獨應(yīng)用殺蟲劑更少的總施用。當(dāng)使用與殺蟲劑的混合物時，組合物中 每種組分的相應(yīng)比例將取決于每種殺蟲劑關(guān)于莊稼、害蟲和/或待處理的雜草的相對有效 性和期望的施用量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，殺蟲劑混合物可提供優(yōu)點例如比單獨使用 的一種殺蟲劑更廣譜的活性。能與本文所述配體合并成組合物的殺蟲劑的例子包括殺真菌 齊U、除草劑、殺蟲劑、殺螨劑和殺微生物劑。本文所述的本發(fā)明式I的二?；菖潴w和式II或III的手性二?；菖潴w可 通過通常使用的方法作為水噴霧被應(yīng)用到植物葉子，所述方法例如通常的大容積水力噴 霧、小容積噴霧、空氣鼓風(fēng)和空氣噴霧。稀釋和施用量將取決于所用儀器的類型、期望的施用的方法和頻率和配體施用量?？梢云诖趪婌F罐中包含另外的佐劑。這種佐劑包括 表面活性劑、分散劑、撒播劑、粘著劑、消泡劑、乳化劑以及其他相似物質(zhì)，其被描述于每 年由MC出版公司的McCutcheon部門(新澤西)所出版的McCutcheon ‘ sEmulsifiers and Detergents (McCutcheon 氏乳化齊[J 禾口 去污齊[J )、McCutcheon ‘ sEmulsifiers and Detergents/Functional Materials (McCutcheon氏乳化劑和去污劑/功能性物質(zhì))以及 McCutcheon' s Functional Materials (McCutcheon 氏功能性物質(zhì))。這些配體還可在施 用前與肥料或施肥材料混合。這些配體和固體施肥材料還可在混合或摻和設(shè)備中混合，或 者它們可與顆粒制劑中的肥料結(jié)合。可以使用肥料的任何相對比率，其適合待處理的莊稼 和雜草。本文所述配體通常將包括5%至50%的施肥組合物。這些組合物提供促進(jìn)所期望 的植物的快速生長的施肥材料，并且同時控制基因表達(dá)。宿主細(xì)胞和非人生物體 如上所述，式I的二?；菖潴w和式II或III的手性二?；菖潴w可被用來調(diào)節(jié) 宿主細(xì)胞中的基因表達(dá)。轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中的表達(dá)對于感興趣的各種基因的表達(dá)可能是有 用的。本發(fā)明提供調(diào)節(jié)原核和真核宿主細(xì)胞中基因表達(dá)的配體。轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中的表達(dá)對于感興趣的各種多肽的表達(dá)是有用的，其中所述多肽 包括但不限于在植物中作為疫苗而被產(chǎn)生的抗原；酶，如α-淀粉酶、肌醇六磷酸酶、葡萄 聚糖和木聚糖酶；抵抗植物中昆蟲、線蟲、真菌、細(xì)菌、病毒和非生物應(yīng)激的基因；抗原；營 養(yǎng)品；藥品；維生素；修飾氨基酸含量、殺蟲劑抵抗、耐冷、耐干旱和耐熱性的基因；工業(yè)產(chǎn) 品；油、蛋白、碳水化合物；抗氧化劑；雄性不育植物；花；燃料；其他輸出特征；可被用來治 療狀況、疾病、病癥、功能異?；蜻z傳缺陷的治療多肽或產(chǎn)品，例如單克隆抗體、酶、蛋白酶、 細(xì)胞因子、干擾素、胰島素、促紅細(xì)胞生成素、凝血因子、其他血液因子或成分；用于基因療 法的病毒載體；作為疫苗的病毒；藥物開發(fā)的靶、功能基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析和應(yīng)用用 于調(diào)節(jié)已經(jīng)存在于宿主中的途徑的途徑中間產(chǎn)物；用于合成之前使用宿主不可能合成的新 產(chǎn)物的途徑中間產(chǎn)物；基于細(xì)胞的測定；功能基因組測定；蛋白質(zhì)組學(xué)測定以及類似物。另 夕卜，對于帶來宿主的更高生長產(chǎn)量或?qū)τ趯崿F(xiàn)待使用的可選的生長模式，基因產(chǎn)物可能是 有用的。因此，本發(fā)明提供式1的二酰基胼配體和式II或III的手性二?；菖潴w來調(diào)節(jié) 分離的宿主細(xì)胞中的基因表達(dá)。在一個實施方案中，分離的宿主細(xì)胞是原核宿主細(xì)胞或真 核宿主細(xì)胞。在另一個實施方案中，分離的宿主細(xì)胞是無脊椎動物宿主細(xì)胞或脊椎動物宿 主細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞選自由細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、線蟲細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、魚細(xì) 胞、植物細(xì)胞、禽細(xì)胞、動物細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞所組成的組。更優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是酵母細(xì) 胞、線蟲細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、斑馬魚細(xì)胞、雞細(xì)胞、倉鼠細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、兔 細(xì)胞、貓細(xì)胞、狗細(xì)胞、牛細(xì)胞、山羊細(xì)胞、奶牛細(xì)胞、豬細(xì)胞、馬細(xì)胞、綿羊細(xì)胞、猿細(xì)胞、猴 細(xì)胞、黑猩猩細(xì)胞或人細(xì)胞。宿主細(xì)胞的例子包括但不限于真菌或酵母種例如曲霉菌屬、木 霉菌屬、酵母屬、畢赤酵母屬、念珠菌屬、漢森酵母屬，或細(xì)菌種例如在集胞藻屬、聚球藻屬、 沙門氏菌屬、芽胞桿菌屬、不動桿菌屬、紅球菌屬、鏈霉菌屬、大腸桿菌屬、假單胞菌屬、甲基 單胞菌屬、甲基桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、魚腥藻屬、硫桿菌屬、甲烷桿菌屬和克雷伯氏桿菌屬中 的那些；植物種，選自由蘋果、擬南芥、珍珠粟、香蕉、大麥、大豆、糖蘿卜、黑豆、鷹嘴豆、辣 椒、黃瓜、茄子、蠶豆、玉米、甜瓜、小米、綠豆、燕麥、秋葵、黍、木瓜、花生、豌豆、胡椒、木豆、菠蘿、菜豆、土豆、南瓜、大米、高粱、大豆、南瓜、甘蔗、甜菜、向日葵、紅薯、茶葉、番茄、煙草、 西瓜和小麥所組成的組；動物；以及哺乳動物宿主細(xì)胞。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，其選自由酵母、畢赤酵母和假絲酵母 宿主細(xì)胞所組成的組。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞是秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)細(xì) 胞。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞，其選自由蘋果、擬南芥、珍珠粟、香 蕉、大麥、大豆、糖蘿卜、黑豆、鷹嘴豆、辣椒、黃瓜、茄子、蠶豆、玉米、甜瓜、小米、綠豆、燕麥、 秋葵、黍、木瓜、花生、豌豆、胡椒、木豆、菠蘿、菜豆、土豆、南瓜、大米、高粱、大豆、南瓜、甘 蔗、甜菜、向日葵、紅薯、茶葉、番茄、煙草、西瓜和小麥細(xì)胞所組成的組。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞是斑馬魚細(xì)胞。 在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞是雞細(xì)胞。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，其選自由倉鼠細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、 大鼠細(xì)胞、兔細(xì)胞、貓細(xì)胞、狗細(xì)胞、牛細(xì)胞、山羊細(xì)胞、奶牛細(xì)胞、豬細(xì)胞、馬細(xì)胞、綿羊細(xì) 胞、猴細(xì)胞、黑猩猩細(xì)胞和人細(xì)胞所組成的組。宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域眾所周知的，并可以通過許多方法實現(xiàn)，所述方法包括但 不限于電穿孔、病毒感染、質(zhì)粒/載體轉(zhuǎn)染、非病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、粒 子轟擊以及類似方法。期望的基因產(chǎn)物的表達(dá)包括在適合的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞 并誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)。原核和真核細(xì)胞的培養(yǎng)條件和基因表達(dá)方案是本領(lǐng)域眾所周知 的。可以收集細(xì)胞并根據(jù)針對基因產(chǎn)物的方案分離基因產(chǎn)物。另外，可以選擇這樣的宿主細(xì)胞，其調(diào)節(jié)被插入的多核苷酸的表達(dá)，或以期望的特 定方式修飾并加工多肽產(chǎn)物。不同的宿主細(xì)胞對于蛋白的翻譯和翻譯后的加工和修飾(例 如，糖基化、裂解(例如信號序列的))具有特征性的和特異性的機制?？蛇x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞 系或宿主系統(tǒng)以保證被表達(dá)的外來蛋白的期望的修飾和加工。例如，可以使用細(xì)菌系統(tǒng)中 的表達(dá)來產(chǎn)生非糖基化的核心蛋白產(chǎn)物。然而，表達(dá)在細(xì)菌中的多肽可能未被適當(dāng)?shù)卣郫B。 在酵母中的表達(dá)可產(chǎn)生糖基化的產(chǎn)物。在真核細(xì)胞中的表達(dá)能增加異源性蛋白“天然”糖 基化和折疊的可能性。此外，在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)能提供再生或構(gòu)成多肽活性的工具。 此外，不同的載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)可在不同程度上影響加工反應(yīng)，例如溶蛋白性裂解。本發(fā) 明式I的二?；菖潴w和式II或III的手性二?；菖潴w可被用于非人生物體，其包括分 離的宿主細(xì)胞。在一個實施方案中，非人生物體是原核生物體或真核生物體。在另一個實 施方案中，非人生物體是無脊椎動物生物體或脊椎動物生物體。優(yōu)選地，非人生物體選自由細(xì)菌、真菌、酵母、線蟲、昆蟲、魚、植物、鳥、動物和哺乳 動物所組成的組。更優(yōu)選地，非人生物體是酵母、線蟲、昆蟲、植物、斑馬魚、雞、倉鼠、小鼠、 大鼠、兔、貓、狗、牛、山羊、奶牛、豬、馬、綿羊、猿、猴或黑猩猩。在另一個實施方案中，非人生物體是酵母，其選自由酵母、畢赤酵母和假絲酵母所 組成的組。在另一個實施方案中，非人生物體是秀麗隱桿線蟲。在另一個實施方案中，非人生物體是植物，其選自由蘋果、擬南芥、珍珠粟、香蕉、大麥、大豆、糖蘿卜、黑豆、鷹嘴豆、辣椒、黃瓜、茄子、蠶豆、玉米、甜瓜、小米、綠豆、燕麥、秋葵、黍、木瓜、花生、豌豆、胡椒、木豆、菠蘿、菜豆、土豆、南瓜、大米、高粱、大豆、南瓜、甘蔗、 甜菜、向日葵、紅薯、茶葉、番茄、煙草、西瓜和小麥所組成的組。在另一個實施方案中，非人生物體是小家鼠(Mus musculus) 0基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)本發(fā)明涉及式I的二酰基胼配體和式II或III的手性二?；菖潴w，其在基于蛻 皮素受體的可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)中是有用的。這些二酰基胼配體在原核和真核宿主細(xì)胞二 者中提供改進(jìn)的可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)。因此，本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的式I的二酰 基胼配體和式II或III的手性二酰基胼配體。特別地，本發(fā)明涉及具有反式激活基因表達(dá) 調(diào)節(jié)系統(tǒng)的能力的式I的二?；菖潴w和式II或III的手性二?；菖潴w，其中所述基因 表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括至少一種基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒能夠被表達(dá)在宿主細(xì)胞中，所述 宿主細(xì)胞包括編碼含有組H核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的多核苷酸。在一個實施方案 中，組H核受體配體結(jié)合是來自蛻皮素受體、遍在受體、孤獨受體1、NER-1、類固醇激素核受 體1、類視黃醇X受體相互作用蛋白-15、肝X受體β、類固醇激素受體樣蛋白、肝X受體、肝 X受體α、類法尼醇X受體、受體相互作用蛋白14或法呢醇受體。在另一個實施方案中，組 H核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來自蛻皮素受體。在另一個實施方案中，基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括基因表達(dá)盒，其包括編碼多肽的多 核苷酸，其包括反式激活結(jié)構(gòu)域、識別和其表達(dá)待調(diào)節(jié)的基因相關(guān)的應(yīng)答元件的DNA結(jié)合 結(jié)構(gòu)域以及包括取代突變的組H核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域?；虮磉_(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)還可包括第二 個基因表達(dá)盒，其包括i)被第一個基因表達(dá)盒的編碼的多肽的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域所識別的 應(yīng)答元件；ii)被第一個基因表達(dá)盒的編碼的多肽的反式激活結(jié)構(gòu)域所激活的啟動子；以 及iii)其表達(dá)待調(diào)節(jié)的基因。在另一個實施方案中，基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括一個基因表達(dá)盒，其包括a)編碼多 肽的多核苷酸，其包括反式激活結(jié)構(gòu)域、識別和其表達(dá)待調(diào)節(jié)的基因相關(guān)的應(yīng)答元件的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及包括取代突變的組H核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及b)第二個核受體配體結(jié) 合結(jié)構(gòu)域，其選自由脊椎動物類視黃醇X受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、無脊椎動物類視黃醇X受體 配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、超氣門蛋白配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含兩個多肽片段的嵌合配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 所組成的組，其中第一個多肽片段來自脊椎動物類視黃醇X受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、無脊椎 動物類視黃醇X受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或超氣門蛋白配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而第二個多肽片段來 自不同的脊椎動物類視黃醇X受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、無脊椎動物類視黃醇X受體配體結(jié)合 結(jié)構(gòu)域或超氣門蛋白配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域?；虮磉_(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)還可包括第二個基因表達(dá)盒，其 包括i)被第一個基因表達(dá)盒的編碼的多肽的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域所識別的應(yīng)答元件；ii)被 第一個基因表達(dá)盒的編碼的多肽的反式激活結(jié)構(gòu)域所激活的啟動子；以及iii)其表達(dá)待 調(diào)節(jié)的基因。在另一個實施方案中，基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括第一基因表達(dá)盒和第二個基因表達(dá) 盒，第一基因表達(dá)盒包括編碼第一多肽的多核苷酸，其包括識別和其表達(dá)待調(diào)節(jié)的基因相 關(guān)的應(yīng)答元件的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而第二個基因表達(dá)盒包括編 碼第二多肽的多核苷酸，其包括反式激活結(jié)構(gòu)域和核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中核受體配 體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一是包括取代突變的組H核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，第一多肽基本上不含反式激活結(jié)構(gòu)域，而第二多肽基本上不含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對本發(fā)明目的，“基本上不含”是指所討論的蛋白不含足以提供激活或結(jié)合活性的所討論結(jié)構(gòu)域的序 列?；虮磉_(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)還可包括第三個基因表達(dá)盒，其包括i)被第一個基因表達(dá)盒的第 一多肽的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域所識別的應(yīng)答元件；ii)被第二個基因表達(dá)盒的第二個多肽的反 式激活結(jié)構(gòu)域所激活的啟動子；以及iii)其表達(dá)待調(diào)節(jié)的基因。其中當(dāng)只有一個核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是包括取代突變的組H核受體配體結(jié)合 結(jié)構(gòu)域時，另一個核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可來自與包括取代突變的組H核受體配體結(jié)合 結(jié)構(gòu)域形成二聚體的任何其他核受體。例如，當(dāng)包括取代突變的組H核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu) 域是包括取代突變的蛻皮素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域時，另一個核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(“配 偶體”)可來自蛻皮素受體、脊椎動物類視黃醇X受體(RXR)、無脊椎動物RXR、超氣門蛋白 (USP)或包括至少兩種不同核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽片段的嵌合核受體，其中所述多肽 片段選自由脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR和USP所組成的組(參見WO 01/70816A2、國際 專利申請第PCT/US02/05235號和US 2004/0096942A1，其通過引用全文并入本文)?！芭渑?體”核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域還可包括截斷突變、缺失突變、取代突變或另外的修飾。在一個實施方案中，脊椎動物RXR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來自人類Homosapiens、小鼠 Mus musculus、大鼠 Rattus norvegicus、雞 Gallus gallus、豬 Sus scrofa domestical 娃 Xenopus laevis、斑馬魚 Danio rerio、被囊動物 Polyandrocarpa misakiensis 或水母 Tripedalia cysophora RXR0在一個實施方案中，無脊椎動物RXR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來自飛蝗Locusta migratoria 超氣門多肽(“LmUSP”)、硬蜱螨 Amblyomma americanumRXR 同系物 1 ( "AmaRXRl")、硬蜱螨 Amblyomma americanum RXR 同系物 2 ( “AmaRXR2”)、招潮蟹 Celuca pugilator RXR 同系物(“CpRXR”)、甲蟲 Tenebrio moIitor RXR 同系物(“TmRXR”)、蜜蜂 Apis mellifera RXR 同系物(“AmRXR，，)、蚜蟲 Myzus persicae RXR 同系物("MpRXR") 或非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲RXR同系物。在一個實施方案中，嵌合RXR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括至少兩個多肽片段，其選自由 脊椎動物種RXR多肽片段、無脊椎動物種RXR多肽片段和非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲無 脊椎動物種RXR同系物多肽片段所組成的組。用于本發(fā)明的嵌合RXR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包 括至少兩種不同種RXR多肽片段，或者當(dāng)所述物種相同時，所述兩種或更多種多肽片段可 來自所述種RXR多肽片段的兩種或更多種不同的同工型。在一個實施方案中，嵌合RXR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括至少一種脊椎動物種RXR多肽 片段和一種無脊椎動物種RXR多肽片段。在另一個實施方案中，嵌合RXR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括至少一種脊椎動物種RXR多 肽片段和一種非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲無脊椎動物種RXR同系物多肽片段。在另一個實施方案中，其表達(dá)待調(diào)節(jié)的基因是關(guān)于宿主細(xì)胞的同源基因。在另一 個實施方案中，其表達(dá)待調(diào)節(jié)的基因是關(guān)于宿主細(xì)胞的異源基因。如下述用于本發(fā)明的式I的二?；菖潴w和式II或III的手性二酰基胼配體，當(dāng) 與核受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域合并時，提供基因表達(dá)的外部短暫調(diào)控方法，其中所述核受體 的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域反過來結(jié)合至連接到基因的應(yīng)答元件。結(jié)合機制或本發(fā)明各種成分互相 結(jié)合的順序不是關(guān)鍵的，其中所述結(jié)合亦即例如配體對配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)答元件、反式激活結(jié)構(gòu)域?qū)幼拥取?蛻皮素受體是核受體超家族的成員，并被歸類為超家族1組H(本文稱作“組H核 受體”)。每組的成員在E(配體結(jié)合)結(jié)構(gòu)域中共有40-60%的氨基酸同一性(Laudet等， Cell 97:161-163(1999))。除了蛻皮素受體，該核受體超家族1組H的其他成員包括遍 在受體(UR)、孤獨受體1 (0R-1)、類固醇激素核受體1 (NER-I)、類視黃醇X受體相互作用蛋 白-15(RIP-15)、肝X受體β (LXRi3)、類固醇激素受體樣蛋白(RLD-I)、肝X受體(LXR)、 肝X受體α (LXRα)、類法尼醇X受體(FXR)、受體相互作用蛋白14(RIP_14)和法尼醇受體 (HRR-I)。在特定的例子中，配體與組H核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及它的核受體配體結(jié)合結(jié) 構(gòu)域配偶體的結(jié)合導(dǎo)致基因的表達(dá)或抑制。該機制不排除配體與組H核受體(GHNR)或它 的配偶體的結(jié)合潛力，以及所致的活性同二聚體復(fù)合物的形成(例如GHNR+GHNR或配偶體+ 配偶體)。優(yōu)選地，改變一種或多種受體結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生雜交基因開關(guān)。通常，三種結(jié)構(gòu)域即 DBD, LBD和反式激活結(jié)構(gòu)域中一個或多個可選自不同于其他結(jié)構(gòu)域來源的來源，以便在所 選宿主細(xì)胞或生物體中為了反式激活活性、配體的互補結(jié)合和特異性應(yīng)答元件的識別而將 雜交基因和所得的雜交蛋白最優(yōu)化。另外，應(yīng)答元件本身可被修飾或被其他DNA結(jié)合蛋白 結(jié)構(gòu)域例如來自酵母的GAL-4蛋白(參見SadoWski等，Nature 335:563-564(1988))或來 自大腸桿菌的LexA蛋白(參見Brent等，Cell 43:729-736(1985))的應(yīng)答元件所取代，或 者被對于與蛋白的靶向相互作用有特異性的合成應(yīng)答元件所取代，其中所述蛋白為了適應(yīng) 雜交受體而被設(shè)計、修飾和選擇以用于此特定的相互作用(參見，例如，Kim等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 =3616-3620 (1997))。雙雜交系統(tǒng)的另一個優(yōu)點是，它們允許根據(jù)期望的 最終結(jié)果來選擇啟動子以用來驅(qū)使基因表達(dá)。這種雙重控制在基因療法領(lǐng)域可以是特別重 要的，特別是當(dāng)產(chǎn)生細(xì)胞毒性蛋白時，因為表達(dá)的時間安排和表達(dá)所發(fā)生在的細(xì)胞二者都 可被控制。當(dāng)被可操作地連接至適合的啟動子的基因被引入受試者的細(xì)胞中時，外源性基 因的表達(dá)受到本發(fā)明系統(tǒng)的存在的控制。啟動子可被組成性地或可誘導(dǎo)地調(diào)控，或者可以 是組織特異性的(即只在特定類型的細(xì)胞中表達(dá))或?qū)ι矬w特定發(fā)育階段具有特異性。特別地，本文所述的是在基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)中有用的式I的二?；菖潴w和式II 或III的手性二?；菖潴w，所述基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括含有取代突變的組H核受體配體 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該基因表達(dá)系統(tǒng)可以是基于“單開關(guān)”的基因表達(dá)系統(tǒng)，在其中反式激活結(jié)構(gòu) 域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域在一個被編碼的多肽上。可選地，基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng) 可以是基于“雙開關(guān)”或“雙雜交”的基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在其中反式激活結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié) 合結(jié)構(gòu)域位于兩個不同的被編碼的多肽上。本發(fā)明所用的基于蛻皮素受體的基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)可以是異二聚化的或同二聚 化的。功能性EcR復(fù)合物通常指異二聚化蛋白復(fù)合物，其由類固醇受體家族的兩種成員、 從各種昆蟲獲得的蛻皮素受體蛋白以及超氣門(USP)蛋白或USP的脊椎動物同系物即類 視黃醇X受體蛋白所組成(參見Yao等，Nature 366 :476_479 (1993)和Yao等，Cell 71 63-72(1992))。然而，所述復(fù)合物還可以是如下所述的同二聚體。功能性蛻皮類固醇受體復(fù) 合物還可包括另外的蛋白例如抑免蛋白。被稱作轉(zhuǎn)錄因子(例如DHR38或i3FTZ-l)的類 固醇受體蛋白質(zhì)家族的另外成員還可以是EcR、USP和/或RXR的配體依賴性的或非依賴性 的配偶體。另外，還可能需要其他輔助因子例如通常被稱作共同激活子(還被稱作適配子或調(diào)節(jié)子)的蛋白。這些蛋白不序列特異性地結(jié)合至DNA，并且不被包括在基態(tài)轉(zhuǎn)錄中。它 們可能通過各種機制對轉(zhuǎn)錄激活產(chǎn)生作用，所述機制包括通過影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或調(diào)節(jié)激活 子-起始復(fù)合物的相互作用來刺激激活子的DNA結(jié)合。這種共同激活子的例子包括RIP140、 TIFl、RAP46/Bag-l、ARA70、SRC-l/NCoA-l、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIBl/RAC3/pCIP 以及 混雜的共同激活子C應(yīng)答元件B結(jié)合蛋白、CBP/p300 (關(guān)于綜述，參見Glass等，Curr. Opin. CellBiol. 9 =222-232(1997)) 0并且，為了有效地抑制在不含配體時的轉(zhuǎn)錄激活，可能需要 通常被稱作共同抑制子(還被稱作抑制子、沉默子或沉默調(diào)節(jié)子)的蛋白輔助因子。這些共 同抑制子可與未配體的蛻皮素受體相互作用以沉默應(yīng)答元件的活性。目前的證據(jù)表明，配 體的結(jié)合改變受體的構(gòu)象，其導(dǎo)致共同抑制子的釋放和上述共同激活子的募集，從而破壞 它們的沉默活性。共同抑制子的例子包括N-CoR和SMRT (關(guān)于綜述，參見Horwitz等，Mol Endocrinol. 10 1167-1177 (1996))。這些輔助因子可以是在細(xì)胞或生物體中內(nèi)源性的，或 可以被作為轉(zhuǎn)基因外源性地加入而以調(diào)控的或未被調(diào)控的方式被表達(dá)。蛻皮素受體蛋白、 USP或RXR的同二聚體復(fù)合物在一些情況下還可以是功能性的。蛻皮素受體復(fù)合物通常包含作為核受體超家族成員的蛋白，所述核受體超家族中 的所有成員通常被表征為存在氨基末端反式激活結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(“DBD”)和被鉸 鏈區(qū)域從DBD分離的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(“LBD”)。如本文所用，術(shù)語“DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域”包括 DNA結(jié)合蛋白的最小多肽序列直至全長的DNA結(jié)合蛋白，只要DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域起作用以與特 別的應(yīng)答元件締合。核受體超家族的成員還被表征 為存在四或五個結(jié)構(gòu)域:A/B、C、D、E以 及在一些成員中的 F(參見 US 4，981，784 和 Evans，Science 240:889-895(1988))?！唉?Β” 結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于反式激活結(jié)構(gòu)域，“C”對應(yīng)于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，“D”對應(yīng)于鉸鏈區(qū)域，而“Ε”對 應(yīng)于配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該家族一些成員還可在LBD的羧基末端一側(cè)具有另外的反式激活結(jié) 構(gòu)域，其對應(yīng)于“F”。DBD被表征為存在兩個半胱氨酸鋅指，在其之間是兩個氨基酸模體即P-盒和 D-盒，其賦予對蛻皮素應(yīng)答元件以特異性。這些結(jié)構(gòu)域可以是天然的、修飾的或異源性受體 蛋白不同結(jié)構(gòu)域的嵌合體。EcR受體，像類固醇受體家族的亞型，還具有負(fù)責(zé)異二聚化特性 的未完全界定的區(qū)域。因為核受體的結(jié)構(gòu)域在性質(zhì)上是組件式的，所以LBD、DBD和反式激 活結(jié)構(gòu)域可互換?；蜷_關(guān)系統(tǒng)是已知的，其包含來自蛻皮素受體復(fù)合物的成分。然而，在這些已知 的系統(tǒng)中，無論何時使用EcR，它都與天然或修飾的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和反式激活結(jié)構(gòu)域在同 一個分子上締合。USP或RXR通常被用作沉默配偶體。之前曾顯示，當(dāng)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和反 式激活結(jié)構(gòu)域在相同分子上時在不存在配體下的背景活性是高的，而且當(dāng)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 和反式激活結(jié)構(gòu)域在不同分子上也就是各自在異二聚體或同二聚體復(fù)合物的兩個配偶體 上時這種活性被顯著降低(參見PCT/US01/09050)。調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法本發(fā)明還涉及在宿主細(xì)胞中使用基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)和本發(fā)明的配體來調(diào)節(jié)基因 表達(dá)的方法。特別地，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，其包括步驟a)將基因 表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)引入宿主細(xì)胞；和b)將式I的二酰基胼配體或者式II或III的手性二?；?胼配體引入宿主細(xì)胞；其中待調(diào)節(jié)的基因是基因表達(dá)盒的成分，所述基因表達(dá)盒包括i) 包括被基因表達(dá)系統(tǒng)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域所識別的結(jié)構(gòu)域的應(yīng)答元件；ii)被基因表達(dá)系統(tǒng)的反式激活結(jié)構(gòu)域所激活的啟動子；和iii)其表達(dá)待調(diào)節(jié)的基因，借此，當(dāng)將式I的二?；?胼配體或者式II或III的手性二?；菖潴w引入宿主細(xì)胞之后，基因表達(dá)受到調(diào)節(jié)。本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，其包括步驟a)將基因表達(dá)調(diào)節(jié) 系統(tǒng)引入宿主細(xì)胞；b)將基因表達(dá)盒引入宿主細(xì)胞，其中所述基因表達(dá)盒包括i)包括被 基因表達(dá)系統(tǒng)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域所識別的結(jié)構(gòu)域的應(yīng)答元件；ii)被基因表達(dá)系統(tǒng)的反式 激活結(jié)構(gòu)域所激活的啟動子；和iii)其表達(dá)待調(diào)節(jié)的基因；以及c)將式I的二?；菖潴w 或者式II或III的手性二酰基胼配體引入宿主細(xì)胞；借此，當(dāng)將式I的二?；菖潴w或者 式II或III的手性二酰基胼配體引入宿主細(xì)胞之后，基因表達(dá)受到調(diào)節(jié)。本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，其中所述宿主細(xì)胞包括基因表達(dá) 盒，其含有應(yīng)答元件，所述應(yīng)答元件包括被基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的第一雜交多肽的DNA結(jié)合 結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的結(jié)構(gòu)域；被基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的第二雜交多肽的反式激活結(jié)構(gòu)域所激活的 啟動子；以及其表達(dá)待調(diào)節(jié)的基因；其中所述方法包括步驟a)將基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)引入 宿主細(xì)胞；和b)將式I的二酰基胼配體或者式II或III的手性二?；菖潴w引入宿主細(xì) 胞；借此，當(dāng)將配體弓I入宿主之后，基因表達(dá)受到調(diào)節(jié)。使用本文所公開的方法在宿主細(xì)胞中表達(dá)的感興趣的基因可以是內(nèi)源性基因 或異源性基因。期望的基因或蛋白的核酸或氨基酸序列信息可在許多公共數(shù)據(jù)庫例如 GENBANK、EMBL、Swiss-Prot和PIR中或許多生物學(xué)相關(guān)的期刊發(fā)表中找到。因此，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以使用幾乎所有已知基因的核酸序列信息。然后可將這種信息用于構(gòu)建期望的 構(gòu)建體以將感興趣的基因插入本發(fā)明所述方法中使用的基因表達(dá)盒中。測量基因表達(dá)/轉(zhuǎn)錄本發(fā)明所述方法的一個有用的測量是細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的測量，其包括RNA優(yōu)選地 為mRNA種的同一性和豐度。通過使用幾種現(xiàn)存的基因表達(dá)技術(shù)中的任一種測量cDNA的豐 度來方便地進(jìn)行這種測量。核酸陣列技術(shù)是用來確定mRNA差異表達(dá)的有用技術(shù)。這種技術(shù)包括例如低聚核 苷酸芯片和DNA微陣列。這些技術(shù)依賴對應(yīng)于不同基因或cDNA的DNA片段或低聚核苷酸， 其中所述基因或cDNA被固定在固體支持體上并與探針進(jìn)行雜交，所述探針是從在細(xì)胞、組 織或整個生物體中提取的總mRNA庫制備的并被轉(zhuǎn)換成cDNA。低聚核苷酸芯片是在底物上 使用光刻技術(shù)合成的低聚核苷酸陣列。已經(jīng)生產(chǎn)了這樣的芯片，其可被用來分析多達(dá)1700 種基因。DNA微陣列是通常為PCR產(chǎn)物的DNA樣品的陣列，其通過機器被印在顯微鏡載玻片 上。通過全長或部分長的靶DNA序列來分析每個基因。目前在商業(yè)上常規(guī)地制備含有多達(dá) 10，000個基因的微陣列。這兩種技術(shù)之間的主要區(qū)別是，低聚核苷酸芯片通常使用允許分 段成短DNA分子的25mer低聚核苷酸，而含有大約1000個堿基對的微陣列的較大DNA靶可 在將復(fù)合的DNA混合物分割中提供更高的敏感性。本發(fā)明所述方法的另一個有用的測量是確定細(xì)胞的翻譯狀態(tài)的測量，其通過使用 本領(lǐng)域眾所周知的方法來測量存在于細(xì)胞中的成分蛋白種的豐度。當(dāng)期望鑒定與各種生理功能相關(guān)的基因時，可以使用測量功能變化的測定，其中 所述功能例如細(xì)胞生長、凋亡、老化、分化、粘連、對特定分子的結(jié)合、對另一個細(xì)胞的結(jié)合、 細(xì)胞的組成、器官發(fā)生、細(xì)胞內(nèi)運輸、運輸促進(jìn)、能量轉(zhuǎn)變、新陳代謝、肌形成、神經(jīng)形成和/ 或血細(xì)胞生成。
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另外，可選的標(biāo)志物或報道基因表達(dá)可被用來測量使用本發(fā)明的基因表達(dá)調(diào)節(jié)。檢測基因表達(dá)產(chǎn)物的其他方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包含Southern印記 (DNA 檢測)、斑點或狹縫印記(DNA、RNA)、Northern 印記(RNA)、RT-PCR(RNA)、Western 印 記(多肽檢測)和ELISA(多肽)分析。雖然較不優(yōu)選，但可以使用被標(biāo)記的蛋白來檢測與 之雜交的特定的核酸序列。在一些情況下，有必要擴增核酸序列的量。這可使用若干適合方法中的一種或多 種來進(jìn)行，其包括例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“PCR”)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“LCR”)、鏈置換擴增 (“SDA”)、基于轉(zhuǎn)錄的擴增以及類似方法。根據(jù)已知技術(shù)來進(jìn)行PCR，例如在熱穩(wěn)定的DNA 聚合酶的存在下、在雜交條件下、用一對低聚核苷酸引物、用一個同待測的特定序列的一條 鏈(模板)雜交的引物處理核酸樣品。所述引物與特定序列的每條模板鏈充分互補以與其 雜交。每個引物的延伸產(chǎn)物被合成，并且與和它雜交的核酸模板鏈互補。從每個引物合成 的延伸產(chǎn)物還可充當(dāng)使用相 同引物來進(jìn)一步合成延伸產(chǎn)物的模板。在合成了延伸產(chǎn)物足夠 輪數(shù)之后，可按上述來分析所述樣品以評估待檢測的序列是否存在。通用方法本文所用的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且被描 述在 Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E. F.禾口 Maniatis，T.，Molecular Cloning :ALaboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)；冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(1989) (Maniatis) 以及 T. J. Silhavy，M. L Bennan 禾口 L W. Enquist，Experiments with Gene Fusions(基因融 合實驗)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(1984)以及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology (最新分子生物學(xué)實驗方法匯編)，Greene Publishing Assoc.和 Wiley-Interscience(1987)。適合于細(xì)菌培養(yǎng)物維持和生長的材料和方法是本領(lǐng)域眾所周知的。適合 于用在如下實施例中的技術(shù)可在如下所述中找到Manual of Methods forGeneral Bacteriology ( ^iliffl^^^^^ ) (Phi llipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene ff. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg 禾口 G. Briggs Phillips編 輯)，American Society for Microbiology (美國微生物學(xué)會)，華盛頓特區(qū)(1994)或者 Thomas D. Brock, Biotechnology :A Textbookof Industrial Microbiology (生物技術(shù) 工業(yè)微生物學(xué)教科書)，第二版，Sinauer Associates, Inc.，Sunderland, MA(1989)。用于 宿主細(xì)胞的生長和維持的所有試劑、限制酶和物質(zhì)是從Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI)、DIFC0 Laboratories(Detroit, MI)>GIBC0/BRL(Gaithersburg,MD) ^ SigmaChemical Company (St. Louis, M0)獲得的，除非另外說明。nTjifflU g Genetics Computer Group Inc.白勺禾呈;(Wisconsin Package % 9.0版，Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI)來完成對遺傳序列的操作。當(dāng)使用 GCG程序“Pileup”時，可以使用gap產(chǎn)生的缺省值12，以及gap延伸的缺省值4。當(dāng)使用 CGC “Gap”或“Bestfit”時，可以使用缺省的gap產(chǎn)生罰分50，以及缺省的gap延伸罰分 3。在任何情況下，在這些或任何其他GCG程序中當(dāng)GCG程序參數(shù)未被提示時，可以使用缺 省值。在玻璃毛細(xì)管中用Electrothermal 儀器測量了熔點并未被校正。在室溫下于 10cm長的石英池中使用Perkin Elmer341型旋光計測量旋光度([a ]255 8 9)。以g/100mL給出濃度。使用Bruker匪R在300MHz或400. 13MHz下記錄咕匪R光譜。除非另外說明，內(nèi) 部參比為溶劑。使用BrukerNMR在100.611泡下記錄13〔 NMR光譜。除非另外說明，內(nèi)部參比 為溶劑。使用與Agilent單級四級質(zhì)譜儀偶合的Agilent 1100LC層疊組件來進(jìn)行LC-MS分 析。溶劑是(A)H20/0. 甲酸禾口 (B)ACN/0. 甲酸，梯度為 T = 015%B 至 T= 10 98% B, 結(jié)束時間為20min，C18柱子尺寸為75mmX 2. 1mm,流速為0. 2mL/min。通過直接注入Agi lent ESI/T0F質(zhì)譜儀來進(jìn)行確切的質(zhì)量分析。使用Bruker SMART6000來進(jìn)行X-射線晶體結(jié)構(gòu)的 確定。在Perkin Elmer2400CHN分析儀上進(jìn)行元素分析。使用Macherey-Nagel Polygram Sil G/UV2540 . 2mm板來進(jìn)行分析性薄層色譜或TLC。大多數(shù)板被UV光成像。一些使用碘或磷 鉬酸顯像。使用玻璃柱中的Aldrich硅膠(230-400孔，60人)在大約30psi的隊或氬氣柱 前壓力下來進(jìn)行硅膠色譜。使用裝備有811C動態(tài)混合器、306UV/VIS 155檢測器和215液態(tài) 操縱器的Gilson的HPLC系統(tǒng)來進(jìn)行分析性HPLC。在220nm和254nm下測量UV吸光度，并 且在254nm下進(jìn)行整合。流速通常被保持在lmL/min。使用4. 6mm X 25cm的DuPont Zorbax 0DS柱進(jìn)行正相色譜。使用Alltech Adsorbosphere的5微米的4. 6mmX25cm的C18柱進(jìn) 行反相色譜。使用CHIRALCEL 的5微米的4. 6mmX 25cm的0D-H柱、CHIRAKPAK 的 5 微米的 4. 6mmX 25cm 的 AD-H 柱或 5 微米的 100 A的 4. 6mmX 25cm 的 Regis Rexchrom(S, S)ULM0柱進(jìn)行手性HPLC。溶劑是試劑級的，除非另外說明。使用與購買時一樣的無水溶劑。通用的合成方法可通過如通用方案1所述的不對稱合成來制備式II或III的對映體富集的化合 物，其中A、B和R2如上定義而且R1是烯基。通用方案1 被保護的胼1 (例如胼基甲酸芐酯或胼基甲酸t(yī)-丁酯)和醛R2CH0的反應(yīng)產(chǎn)生2。2 的不對稱烯丙基化提供對映體富集形式的3或4，這尤其取決于手性試劑和R2的選擇。進(jìn)行 不對稱烯丙基化反應(yīng)的方法是本領(lǐng)域已知的，并可被用來制備本發(fā)明的化合物。在不對稱 烯丙基化反應(yīng)中特別有用的手性試劑的合成被描述在Leighton等，J. Am. Chem. Soc. 125 9596(2003)和W0 03/074534中。3與羧酸氯化物B-C0C1的反應(yīng)得到5。羧酸B_C02H還可 ?；?與酮RtOR2的反應(yīng)提供腙2。2的不對稱還原提供對映體富集形式的3 或4，這尤其取決于還原劑、R1和R2的選擇。US 5，250，731描述?；甑牟粚ΨQ催化氫化， 其在手性磷烷催化劑復(fù)合物的存在下提供旋光的?；?。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到可以使用 其他手性配體。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，可以使用另外的不對稱還原方法。在這個 例子中，3與BC0C1的反應(yīng)得到5，即式II的化合物。相似地，4的反應(yīng)導(dǎo)致式III的化合 物。另外，可通過手性拆分，或者不對稱合成和手性拆分的組合，或者不對稱氫化和手 性拆分的組合來制備式II或III的對映體富集的化合物。如通用方案3中所述，將外消旋 二酰基胼進(jìn)行手性HPLC色譜分析以提供式II或III的對映體富集的化合物。用于手性拆 分的適合的手性柱子包括例如 Daicel CHIRALCEL OD-H,DaicelCHIRAKPAK AD-H 和RegisTechnologies ULM0手性柱子。其他的手性拆分方法也是可能的。用于手性拆分 過程的外消旋二?；菘赏ㄟ^US 2005/0209283A1和US2006/0020146A1中所述的方法學(xué) 來制備。通用方案3
與3偶合以得到5。將5的保護基團移除而得到6。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到，有許多方法對 胼進(jìn)行脫保護，其取決于保護基團的性質(zhì)。適合的保護/脫保護策略在“Protective Groups in Organic Synthesis (有機合成中的保護基團)，，，T. W. Green 和 P. G. M. Wuts (1999)中有 討論。7與羧酸氯化物A-C0C1或羧酸A-C02H的反應(yīng)得到8，即式II的化合物。相似地，4 的反應(yīng)導(dǎo)致式III的化合物。還可通過如通用方案2所述的不對稱還原來制備式II或III的對映體富集的化 合物，其中A、B、R1和R2如上定義。通用方案2
還可使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)轉(zhuǎn)化來進(jìn)一步加工對映體富集的式II或III的化合物，其中 R1是烯基。如通用方案4中所述，對于對映體富集的式III的化合物，烯基可被轉(zhuǎn)化為烷 基、羥烷基、用環(huán)烷基可選地取代的烷基、用雜環(huán)可選地取代的烷基、用烷氧基取代的烷基、 鹵代烷基和其他可選地取代的烷基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將識別可用來將鏈烯轉(zhuǎn)化為本發(fā)明其 他基團的單或多步化學(xué)轉(zhuǎn)化的分類。通用方案4
實施例通過參考上面提供的下面的通用合成方法和下面提供的非限制性的實施例，可更 好地理解本發(fā)明，其作為本發(fā)明的例證而被提供。實施例1 (R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N' _ (2_乙基_3_甲氧基-苯 甲酰)_酰胼合成 化合物1 胼基甲酸芐酯是商業(yè)上可得的?；衔? 將胼基甲酸芐酯(300g，1. 81摩爾)在裝備有回流冷凝器、溫度計、磁力 攪拌和500mL添加漏斗的3L的4-頸燒瓶中溶解于1. 2L甲醇中。將冰醋酸(5mL)加入混 合物然后提升至45°C。在30分鐘內(nèi)將吡呋醛(248. 8g溶液，2. 17摩爾，在t_ 丁醇中大約 75%)分批加入。將反應(yīng)回流加熱30分鐘，同時用TLC進(jìn)行監(jiān)測。將混合物冷卻至將近室 溫并在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器上濃縮至大約700mL的總體積。在大約30°C下加入大約7g活性碳。 將混合物攪拌過夜并通過一片硅藻土(Celite)在孔徑為“C”的玻璃燒結(jié)的布氏漏斗中過 濾。在真空中將溶劑除去以留下淺黃色油，其被倒入結(jié)晶皿并通過用鏟操作而被誘導(dǎo)結(jié)晶。 將該物質(zhì)顆粒化，并將殘留的溶劑在空氣中于室溫下蒸發(fā)數(shù)日，留下420. 4g的粗產(chǎn)物。在 室溫下從最初的300mL乙酸乙酯和IL己烷的沸騰混合物中重結(jié)晶，產(chǎn)生363. 2g的近白色 固體(E)-N’ _(2，2-二甲基-亞丙基)-胼羧酸芐酯。從大約150mL己烷和45mL乙酸乙酯 的混合物獲得43. Ig的第二次收獲和相同的熔點?？偖a(chǎn)率96.1%。Rf = 0.32(2 1己 烷乙酸乙酯)；mp = 74-74. 5°C ；1H NMR(400MHz, CDC13) δ 8. 0(1H, br s)，7· 4_7· 3 (5H， m)，7. 1 (1Η, s)，5. 20 (2H, s)，1· 1 (9H, s)。化合物3 使用從 Leighton 等，J. Am. Chem. Soc. 125 9596 (2003)和 WO 03/074534 修改得來的過程來制備(S，S)-2-烯丙基-2-氯代-3，4-二甲基-5-苯基-[1，3，2] oxazasilolidine.整個過程是在無水的封閉系統(tǒng)下最小程度地且短暫地暴露于大氣中進(jìn) 行的。首先將烯丙基三氯硅烷(419. 5g，2. 39摩爾)充入含有氣體入口、頂端攪拌和添加漏 斗的烘干的5L的4頸燒瓶，然后是2L的無水CH2Cl215在冰/鹽浴上氬氣中將溶液冷卻到 O0C。通過添加漏斗將三乙胺(485g，4. 79摩爾)加入，并將溫度維持在0°C。在這一點上，反 應(yīng)是透明的琥珀色。使用固體添加漏斗在2h的時段內(nèi)將S，S-假麻黃堿(359g，2. 17摩爾)分批加入，并維持內(nèi)部溫度< 15°C。使用200mL的CH2Cl2沖洗添加漏斗并加入反應(yīng)。隨著時間的流逝，糊狀半顆粒狀固體形成了(Et3NCl)。在冰上將淺褐色粘稠漿攪拌大約2h，然后 除去冰浴，從而允許反應(yīng)在幾小時的一段時間內(nèi)達(dá)到室溫。大約12h后，通過蒸餾除去大多 數(shù)CH2Cl2，并將系統(tǒng)維持在氬氣下。加入IL的無水己烷，并再次將溶劑蒸餾。然后加入IL 的無水戊烷，并在室溫下氬氣中將混合物攪拌大約lh。之前最初在CH2Cl2中形成的糊狀漿 變得更顆粒狀，首先是在加入己烷時，然后特別是在加入戊烷之后。溶液的顏色是淺琥珀褐 色的。一部分一部分地，并且通過使用溫和的氬氣壓，將戊烷和可溶產(chǎn)物通過玻璃棉濾器和 PFA管轉(zhuǎn)移出反應(yīng)燒瓶并進(jìn)入裝備有蒸餾頭和磁力攪拌的第二只干燥的1L、3頸圓底燒瓶。 在改變?nèi)芤恨D(zhuǎn)移方面，將戊烷蒸餾出該第二只燒瓶并留下濃縮的油狀產(chǎn)物。重復(fù)該過程，各 用500mL戊烷沖洗Et3NCl殘留物兩次并將沖洗物在氬氣環(huán)境下轉(zhuǎn)移至第二只燒瓶。在大約 IOtorr的真空下通過蒸餾收集成餾分的產(chǎn)物。在初餾物中收集到大約56. 3g(9. 7% )，其可 能含有多達(dá)大約3%的烯丙基三氯硅烷。獲得的主餾分即純化的(S，S)-2-烯丙基-2-氯 代-3，4-二甲基-5-苯基-[l，3，2]oxazasilolidine 的量為 413. 3g(71% ) ,bp = 140-1440 大約lOtorr，其作為輕微粘性的液體在收集時是淺黃色的，但在冷藏和用隔板/封口膜密 封下幾天內(nèi)變成橙色。所述物質(zhì)被冷藏儲藏，未被鑒定并且未經(jīng)純化而用于隨后的烯丙基 化反應(yīng)中。 化合物4 將裝備有溫度計和磁力攪拌的5L、4頸燒瓶在烘箱中干燥并被維持在 氬氣中，同時加入2L無水CH2Cl2,之后是N’ -(2，2- 二甲基-亞丙基)_胼羧酸芐酯(220g， 939毫摩爾)。將混合物冷卻并在大的大約10加侖的冰/鹽浴中于2-3°C下進(jìn)行攪拌。在 大約30min內(nèi)使用插管和溫和的氬氣壓的協(xié)助來將(S，S)-2-烯丙基-2-氯代-3，4-二甲 基-5-苯基-[1，3，2] oxazasilolidine (363g，1. 355摩爾)加入燒瓶。最初的淺黃色溶液變 成透明的淺橙色，而溫度維持在2-3°C。允許反應(yīng)自行溫暖至室溫，并通過在CH3OH中將一小 部分猝滅并通過TLC(2 1己烷EtOAc)進(jìn)行分析來進(jìn)行監(jiān)測。開始后36小時，TLC分析指示 了大約90%完成。將混合物冷卻到5°C，加入另外的48g(0. 179毫摩爾)oxazasilolidine， 并允許所述混合物溫暖至室溫。大約8小時后，再次將反應(yīng)冷卻至5°C，并用預(yù)先冷卻的溶 液(100g K2CO3在IOOmL去離子水中)猝滅大約Ih的時間。在猝滅過程中，放出的熱量將 溫度升至高達(dá)17°C。加入大約IOOmL另外的去離子水。溶液看上去變成了透明的藍(lán)-綠 色。在反應(yīng)或猝滅中從未出現(xiàn)任何明顯的氣體釋放。在室溫下攪拌4天后，溶液是淺黃色， 并且在5天后，有機相形成凝膠狀但保持淺黃色。將混合物冷卻至大約15°C (稍后明白這 不必要)，加入大約1.25L己烷，并且使用頂端攪拌將所述凝膠部分地斷裂和分散。將上清 液離心(siphone off)并通過玻璃棉過濾，同時交替地將大約IL部分加到殘留在燒瓶中的 白色凝膠。還將另外的己烷加入上清液以使假麻黃堿作為白色固體沉淀并使任何殘留凝膠 斷裂。將己烷提取物合并，并且在真空中除去溶劑?？偟膩碚f，通過凝膠的提取、己烷誘導(dǎo) 的假麻黃堿沉淀以及通過玻璃棉和玻璃燒結(jié)布氏漏斗的過濾，使用大約5-6L己烷來獲得 黃色油狀的粗制烯丙基酰胼。分批地用大約三體積的己烷處理該粗制物質(zhì)，允許其保持在 室溫下，從沉淀的假麻黃堿傾析出來，并被轉(zhuǎn)移至分離漏斗。通過用大約各25mL 1.4N的 HCl沖洗三次(大部分顏色也被除去)將產(chǎn)物溶液從殘留的假麻黃堿中分離，接著用10% 的K2CO3和鹽水沖洗。將粗產(chǎn)物的己烷溶液在固體無水Na2SO4上干燥，在真空中除去溶劑 以得到淺黃色的粘稠油。TLC(2 1己烷EtOAc)顯示期望的產(chǎn)物Rf = 0.4;兩種雜質(zhì)的是0. 25和0. 31 (各自5-10%，其中一個可能是起始物質(zhì))，以及較不顯著的雜質(zhì)約為Rf = 0. 4。之前在基線檢測到的假麻黃堿現(xiàn)在是不存在的。在用真空泵除去痕量溶劑之后分離出 琥珀色油狀的全部196.8g(75.8%)的(R)-N' _(1_叔-丁基-丁 _3_烯基)-胼羧酸芐 酯。使用大約2L煮沸的己烷提取最初的凝膠，其現(xiàn)在是稍微濃縮和顆粒化的。過濾固體， 脫去己烷，并從沉淀的假麻黃堿傾析出油，其產(chǎn)生大約18g。將該物質(zhì)與來自上述原始產(chǎn)物 批次(大約3-4g)的殘留物合并，并用前述1.4N HC1、K2CO3水溶液和鹽水沖洗。脫去己烷 以產(chǎn)生琥珀油狀的20. 6克另外的產(chǎn)物，通過TLC其看上去與第一批相同。在硅膠上定量地 對lO.lg部分的(R)-N' -(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-胼羧酸芐酯進(jìn)行色譜分析以產(chǎn)生 8. 8 8g(色譜的88%產(chǎn)率)澄清、近于白色的油狀純產(chǎn)物。Rf = O. 43(2 1己烷乙酸乙 酉旨)；1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7. 4(5H, br s) ,6. 2(1H, br s) ,6. 0(1H, br s), 5. 15 (2H, s)， 5. 1 (2H, s)，4. 1 (1H, br)，2. 7 (1H, m)，2· 4(1Η, brd)，2. 0 (1Η, m)，0. 95 (9H, s) ；ee = 98. 1%, AD-H 柱子；[α ]25589-42. 5° (c 2· 18，CH3OH)。化合物5:將(R)-N' -(1-叔-丁基-丁-3-烯基)_胼羧酸芐酯(110g，398毫 摩爾)和500mL 二氯甲烷加入帶有溫度計和磁力攪拌器的2L圓底燒瓶中。隨后加入K2CO3 溶液(82.51g，200mL去離子水中597毫摩爾濃度)，并將燒瓶冷卻至大約10°C。然后在 20min的一段時間里緩慢加入無水的3，5-二甲基苯甲酰氯(73. 82g，437. 8毫摩爾)。使 用IL的二氯甲烷將殘留的酰基氯沖洗進(jìn)燒瓶并稀釋反應(yīng)混合物。在添加時溫度不允許超 過15°C。將反應(yīng)攪拌過夜，首先是在冰浴中然后是在室溫下。在大約16小時的TLC分析 表明反應(yīng)完成并含有殘留的?；龋粚⒒旌衔镆还矓嚢璐蠹s40小時。將反應(yīng)混合物傾入 2L的分液漏斗。收集有機層并與水層的少量CH2Cl2回流合并。再用10%的1(20)3將有機 相沖洗一次，用鹽水沖洗，然后在固體MgS04/Na2S04i干燥。將混合物從鹽中濾出，并在真 空中除去溶劑以獲得顆粒狀淺米色固體。將粗產(chǎn)物懸浮并在300mL的2 1己烷醚中攪 拌，并用布氏漏斗過濾以基本上除去殘留的3，5_ 二甲基苯甲酰氯。使用合并的總共大約 1200mL的2 1己烷醚將收集的固體沖洗四次，從而提供白色顆粒狀固體。將產(chǎn)物收集 并允許在空氣中干燥以產(chǎn)生144. 55g的(R)-N' -(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-N' -(3， 5-二甲基-苯甲酰)-胼羧酸芐酯，產(chǎn)率=88. 9 %。將30g的樣品溶解在205mL沸騰的 甲醇中并允許在室溫下結(jié)晶。在布氏漏斗中用50mL CH3OH沖洗所生成的絮凝劑物質(zhì)以得 到22. 2g，mp (熔點)=146°C, (ee > 99.9% )。通過將該物質(zhì)從沸騰的CH3OH重結(jié)晶兩 次而獲得(R)-N' -(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-胼羧酸 芐酯的分析樣品，接下來進(jìn)行Kugelrohr短程蒸餾并收集固體以得到純的白色物質(zhì)mp = 145. 5-147°C。Rf = 0. 12(10 1 己烷:乙酸乙酯)；1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7. 5-7. 2 (m, 9H, Φ +NH), 7. 2-6. 8 (m), 6. 4 (S), 6. 3 (S), 5. 95 (br, 5Η,節(jié)基 +C = C)，5· 4_4· 6 (m，9Η， 烯丙基 N-CH，Φ -CH3)，3. 65 (br)，2. 5 (m)，2. 35 (S)，2. 3 (S)，1. 2-0. 8 (m, 9H, -C (CH3) 3)； [α ]25589-12· 8° (c 2· 01，CHCl3)?；衔?將(R)-N' -(I-叔-丁基-丁-3-烯基)-Ν' _(3，5_ 二甲基-苯甲 酰)_胼羧酸芐酯(13.58，33毫摩爾)于室溫下懸浮在IOOmL冰醋酸中。將10%碳載鈀 (0. 24g)作為4. 4g醋酸中的漿加入。將灰色懸液在10-30psi下于帕爾氫化器上搖動90 分鐘，并通過TLC監(jiān)測反應(yīng)。將催化劑沉降，使用移液管除去反應(yīng)溶液并通過帶凹槽的濾 紙(Schleicher & Schuell 597 1/2，125mm直徑)。將催化劑殘留物用醋酸沖洗并將沖洗物通過濾紙以得到合并的總質(zhì)量為156g的醋酸和產(chǎn)物。將混合物在冰上冷卻，并加入 大約600mL去離子水。在30分鐘的一段時間里，油狀產(chǎn)物流出，然后將其結(jié)晶。將其用濾 紙過濾，在空氣中干燥，并在紙上收集以產(chǎn)生7. 9g的淺黃色固體。經(jīng)過幾小時，0. 52g另 外的產(chǎn)物從濾液中沉淀下來，得到總產(chǎn)量為8. 42g(92. 2%)的(R)-3，5-二甲基-苯甲酸 N-(l-叔-丁基-丁基)酰胼；Rf = 0.5(1 1 己烷乙酸乙酯)；[a]25589+7.63 (c 1.98, CH30H), NMR(400MHz，CDC13) 8 7. 05 (1H, s)，7. 02 (2H，s)，4. 6+3. 5 (1H，2d)，4. 1 (2H，s, NH2)，2. 38+2. 37 (6H, 2s)，1. 1-2. 1 (4H, m)，1. 0+0. 9 (9H, 2s)，1. 0+0. 98 (3H, 2t)，2 個不同的 構(gòu)象異構(gòu)體?；衔? (標(biāo)題化合物)將(R) _3，5- 二甲基-苯甲酸N- (1-叔-丁基-丁基)酰胼 (35g，126.6毫摩爾)在500mL的圓底燒瓶中使用磁力攪拌溶解在100mL 二氯甲烷中。加入 K2C03水溶液(26. 25g，189. 9毫摩爾，溶解于75mL去離子水)并在冰上攪拌該混合物。加入 固體2-乙基-3-甲氧基苯甲酰氯(27. 67g，139. 3毫摩爾)并用25mL的CH2C12將其沖洗進(jìn) 燒瓶。在冰上攪拌該混合物大約40h，允許浴溫暖至室溫。按需加入另外的二氯甲烷和水以 協(xié)助操作。將有機層分離并在MgS04i干燥。加入大約5g活性炭，并通過濾紙過濾除去鹽和 碳。在真空中將溶劑蒸發(fā)，首先在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器上然后在高真空下，得到57. 8g粗產(chǎn)物，其 含有痕量的CH2C12。首先用3X100mL部分的醚(2%乙醇)，然后用lXlOOmL部分的1 1 己烷醚在燒結(jié)玻璃布氏漏斗(孔尺寸ASTM 40-60C, Pyrex)中研磨該粗制物質(zhì)。然后用 2 X 200mL去離子水沖洗產(chǎn)物并徹底混合，且允許在空氣中干燥。(R) -3，5- 二甲基-苯甲酸 N-(l-叔-丁基-丁基)-N' _(2_乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰胼(還被稱作(R)-2-乙 基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-酰胼) 作為亮白色粉末狀固體(36. 51g，65. 7 %產(chǎn)率，經(jīng)HPLC和手性HPLC相當(dāng)純且具非常高的 ee，經(jīng)TLC得到一個斑點，1 1己烷醚)被收集。對合并的有機沖洗物進(jìn)行蒸發(fā)產(chǎn)出大 約20g的物質(zhì)，首先將其用200mL 2 1己烷醚研磨，然后再用2X100mL 2 1己烷 醚在燒結(jié)玻璃布氏漏斗(孔尺寸ASTM 40-60C)中研磨。將該物質(zhì)用3X 100mL去離子水通 過徹底混合而沖洗，并允許在空氣中干燥。收集第二次收獲的白色粉末(12.98g，23.4%的 產(chǎn)率，經(jīng)HPLC和手性HPLC相當(dāng)純且具有高ee)。以相同的方式獲得第三次收獲的近白色固 體(1.52g，2. 7%，98%純度，> 99% ee)。通過溶解在溫暖的甲醇中并用0. 45微米的注射 器式濾器過濾至大的結(jié)晶皿中而制備最終樣品。收集該物質(zhì)，用鏟子將其粉碎，并在真空爐 中于50-58°C加熱，實際上直至恒定重量。HPLC分析指示99. 3%的化學(xué)純度和> 99. 9% ee Rf = 0.28(1 1 己烷:乙酸乙酯)；mp = 162. 2-162. 8°C;[a ]25589+12. 9 (c 2. 04,CH30H)；
NMR(400MHz, CD30D) 8 7. 0-7. 1 (4H, m) ,6. 9(1H, d) ,6. 1-6. 4(lH，2d)，4. 5-4. 7(1H, 2d)，3. 78 (3H, s)，2. 3 (6H, s)，2. 3 (1H, m)，1. 9 (2H, m)，1. 55 (3H, m)，1. 1-1. 15 (9H, 2s)， 0. 9-1. 0(6H, m)。使用實施例1中描述的方法學(xué)來制備實施例2至29。通過手性HPLC來確定百分 比對映體過量(ee)。表2提供實施例2至29的分析數(shù)據(jù)。
(RJ-3,5- 二甲基-苯甲酸 N-(l-焱-丁 基-丁 基)-N’-(3-
氯代-笨甲耽)-酰肼
(RJ-3,5- 二甲基-苯曱酸 >99 N’-(2-溴代-苯甲醜)-N-(l-炎 -丁基-丁基 > 酰肼 化合物1 如實施例1中所述制備(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁 基)_酰胼?；衔? 從對應(yīng)的羧酸制備化合物2。將亞硫酰二氯(1. 24g，10. 42毫摩爾)在裝 備有磁力攪拌的圓底燒瓶中加入在8. 2mL氯仿中的(S) - (+) -2- (6-甲氧基-萘-2-基)-丙 酸(甲氧萘丙酸，2g，8. 69毫摩爾)溶液。將一滴DMF加入并將混合物回流3小時。從反應(yīng) 混合物中將氯仿和過剩的亞硫酰二氯蒸餾出來，同時加入二氯甲烷。將殘留的溶劑蒸發(fā)而 產(chǎn)出(S)-2-(6-甲氧基-萘-2-基)-丙酰氯(1.918g，88.8% 產(chǎn)率)。Rf = 0.2(1 1 己 燒乙醚)。屯 NMR(400MHz, CDC13) 6 9. 98 (br, 1H)，7. 78(t，2H)，7. 36 (d, 1H)，7. 18 (d, 1H)， 7. 14 (m, 2H)，4. 25 (q, 1H)，3. 93 (s, 3H)，1. 68 (d, 3H)。化合物3(標(biāo)題化合物)將(R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁 基)-酰胼(6』估計>99%基于前體，1.18，3.98毫摩爾)溶解在10mL 二氯甲烷中。將 K2C03水溶液(2. 5mL中0. 907g，6. 57毫摩爾)加入反應(yīng)混合物。加入(S)-2_(6_甲氧 基-萘-2-基)_丙酰氯(1.098，4.38毫摩爾)并將反應(yīng)攪拌24小時且用TLC監(jiān)測。按 需加入另外的二氯甲烷和水以協(xié)助操作。將有機層分離，在Na2S04上干燥，過濾，并在真 空中除去溶劑以提供粗產(chǎn)物mp = 98°C (玻璃)_123°C。將該粗制物質(zhì)用2 1己烷 醚研磨三次以提供1.554g，80. 產(chǎn)率的(R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁 S)-N'-(S)-[2-(6-甲氧基-萘-2-基)-丙酰]-酰胼，mp = 98°C (玻璃)_122°C。將研 磨的物質(zhì)在35°C下從異丙醇結(jié)晶以得到結(jié)晶產(chǎn)物。所有三批的1HNMR光譜是相同的。Rf = 0.15(1 1 己烷乙醚)；mp = 158-160°C (在 150°C開始加熱)；mp = 156_164°C (在 25°C 開始加熱)；[a ]25589+95 . 8° (c 2.02, CH30H) ；1H NMR(400MHz, DMS0_d6) 8 9. 96+9. 82 (NH, 2s)，7. 71+7. 58 (2H, 2d)，7. 63 (1H, s)，7. 49+7. 31 (1H, 2d)，7. 26 (1H, s)，7. 13+6. 77 (1H, (R)-3，5- 二甲基-苯甲酸 N-(l-叔-丁基-丁基)_N，-(S)-[2_(6-甲氧 基-萘-2-基)_丙酰]-酰胼合成2d)，7. 06 (2H, s)，6. 68+6. 30 (1H, 2s)，4. 31 (m, 1H)，3. 88+3. 85 (3H, 2s)，3. 58 (1H, m)， 2. 30+1. 83 (6H, 2s)，1. 64-1. 03 (4H, mm)，1. 00 (3H, m)，0. 87+0. 84 (9H, 2s)，0. 63 (3H, t)； 13C NMR(100MHz, CDC13) 6 173. 9，172. 2，157. 8，137. 3，133. 7，130. 8，129. 1，128. 8，127. 4， 125. 9，125. 8，123. 7，123. 3，119. 2，119. 1，105. 5,62. 7,55. 3,45. 1,35. 0,28. 5,27. 6,26. 9， 21. 2，17. 5，14. 2 ；HRMS(ESI)m/z 計算得到 C31H39N203[M-Hr487. 2966，實測 487. 2949，計算得 到 C31H40C1N203 [M+Cl]"523. 2733，實測 523. 2718，分析計算得到 C31H40N203 :C，76. 19 ；H，8. 25 ； N, 5. 73 ；0，9. 8 ；實測:C, 76. 01 ；H, 8. 35 ；N, 5. 70。為了確定實施例1中不對稱烯丙基化反應(yīng)的立體化學(xué)過程，確定了(R)-3，5_ 二甲 基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁基)-N’-(S)-[2-(6-甲氧基-萘-2-基)-丙酰]-酰胼的 X-射線晶體結(jié)構(gòu)。該實驗確定，含有叔丁基和n-丙基的碳的絕對構(gòu)型是R。實施例31 (5)-3，5-二甲基-苯甲酸^(1-叔-丁基-丁基)州，_(2-乙基-3-甲氧基-苯 甲酰)_酰胼合成 化合物1 如實施例1中所述制備(E)-N’_(2，2-二甲基-亞丙基)_胼羧酸芐酯?；衔? 使用實施例1中所述的方法學(xué)用R，R-假麻黃堿制備(R，R)-2-烯丙 基-2-氯代-3，4- 二甲基-5-苯基-[1,3, 2]oxazasilolidine?；衔? 使用實施例1中所述的方法學(xué)制備⑶-N’ -(1-叔-丁基-丁 -3-烯 基)_胼羧酸芐酯。分析數(shù)據(jù)Rf = 0.46(2 1己烷乙酸乙酯)；mp = 69-71°C ；屯 NMR(400MHz, CDC13) 6 7. 4(br s,5H) ,6. 2(br s, 1H) ,6. 0(br s，1H)，5. 15 (s，2H)，5. 1 (s， 2H)，4. l(br,lH),2. 7(m, 1H),2. 4(br d，1H)，2. 0 (m，1H)，0. 95 (s，9H) ；ee = 98. 2%, ADH 柱 子；[a ]25589+39. 3° (c = 2. 03，CHC13)?；衔? 使用實施例1中所述的方法學(xué)制備(S)_N’ -(1-叔-丁基-丁 -3-烯 基)-N’ _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)胼羧酸芐酯。分析數(shù)據(jù)Rf = 0.43(2 1己烷乙酸 乙酉旨)；mp = 150-151. 5 °C ；1H NMR(400MHz, CDC13) 6 7. 45-6. 88 (m, 7H), 6. 44+6. 28 (2s, 1H)，5. 96 (br, 1H)，5. 38-4. 68 (m, 5H)，3. 69 (br, 1H)，2. 68-2. 43 (m, 2H)，2. 36+2. 29 (2s, 6H)，
1.13+1. 02+0. 94(3s,9H) ； [ a ]25589+12. 5° (c = 2. 01，CHC13)?；衔?:使用實施例1中所述的方法學(xué)制備(S)-3，5_ 二甲基-苯甲酸 N-(l-叔-丁基-丁基)-酰胼。分析數(shù)據(jù)Rf = 0.5(1 1己烷乙酸乙酯)；mp = 112-112. 8 °C ；1H NMR(400MHz, CDC13) 8 7. 05 (s, 1H), 7. 02 (s, 2H) , 4. 6+3. 5 (2d, 1H),
2.38+2. 37 (2s, 6H)，1. 2-2. 1 (m, 4H)，1. 1+1. 0 (2s, 9H)，1. 05+0. 98 (2t, 3H) 2 個不同的構(gòu)象異 構(gòu)體；[a ]25589-7. 97 (c 2. 14，CH30H)?；衔?(標(biāo)題化合物)使用實施例1中所述的方法學(xué)制備(S)-3，5_ 二甲 基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁基)-N’ -(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)酰胼。分析 數(shù)據(jù)Rf = 0.28(1 1 己烷乙酸乙酯)；mp = 156. 5-157. 5°C ;[a ]25589-13. 39 ° (c 2. 05, CH30H) ；1H NMR(400MHz, DMS0_d6) 8 10. 4+10. 26 (s, 1H), 7. 18-7. 14 (m，3H)，7. 08 (d，J =7. 2Hz，lH)，7. 03 (t, J = 8. 4Hz，lH)，6. 34+6. 21 (d, J = 6. 8Hz，lH)，4. 57+4. 38 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，3. 78(s，3H)，2. 29(s，6H)，2. 27-2. 23 (m, 1H)，1. 89-1. 79 (m，2H)，1. 59-1. 38 (m, 3H)，1. 09+1. 06(s，9H)，0. 95+0. 87(t，J = 6. 8Hz，6H) ；13C 匪R(100MHz，DMS0_d6) 8 173. 40, 168.24, 157.64,137. 18, 136. 98, 136. 50, 130. 89, 130. 73, 130. 20,126. 96,125. 28, 124. 83，119. 37,118. 95，112. 41,62. 29,56. 11,35. 45,28. 71,27. 56,21. 24，20. 15，15. 15， 14. 68 ；HRMS (ESI)m/z,計算得到 C27H39N203[M+H]+439. 2955，實測 439. 295，計算得到 C27H38NaN203[M+Na]+461. 2774，實測 461. 2765 ；分析計算得到 C27H38N203 :C,73. 94 ；H，8. 73 ；N, 6. 39 ;0，10. 94。實測C，73. 87 ;H，8. 94 ;N，6. 38 ;ee :> 99. 9% ;Regis(S，S)ULM0，98 2 己烷甲醇的混合物，流速lmL/min。使用實施例31中所述的方法學(xué)制備實施例32至47。通過手性HPLC來確定百分 比對映體過量(ee)。
實施例48 (S)-N' _ (1-叔-丁基-丁基)-N' - (3，5- 二甲基-苯甲酰)-胼羧酸叔丁酯合 成 化合物1 胼基甲酸t(yī)_ 丁酯是商業(yè)上可得的。
化合物2 將吡呋醛(52. lg，454毫摩爾，在t-丁醇中大約75%的溶液)在帶有回 流冷凝器、溫度計和添加漏斗的1L、3頸圓底燒瓶中溶解在120mL甲醇中。將冰醋酸(ImL) 加入，然后在控制下加入胼基甲酸t(yī)-丁酯(50g，378毫摩爾)，且不除去反應(yīng)的熱量。將混 合物攪拌4小時，同時通過TLC檢測。反應(yīng)完成時，在真空中除去溶劑，在戊烷中吸收殘留 物，并將戊烷蒸發(fā)掉。所得的油在靜置后結(jié)晶以得到N' _(2，2_ 二甲基-亞丙基)-胼羧 酸叔丁酯(75. 7g，93% )。Rf = 0.42(2 1 己燒乙酸乙酯，醋酸)；1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7. 6 (br s，lH)，7. 1 (s，1H)，1· 5 (s，9H)，1. l(s，9H)ppm。化合物3 使用實施例1中所述的方法學(xué)用R，R-假麻黃堿制備(R，R)-2-烯丙 基-2-氯代-3，4- 二甲基-5-苯基-[1,3, 2]oxazasilolidine?；衔?:將N’ _(2，2_ 二甲基-亞丙基)_胼羧酸叔丁酯(12g，59.9毫摩爾)裝 入干燥的帶有溫度計、磁力攪拌器和氮氣氛的3頸、IL圓底燒瓶。使用導(dǎo)管將無水二氯甲 烷(200mL)充入燒瓶。使用冰浴將混合物冷卻到0°C。隨后在惰性條件下將(R，R)-2-烯丙 基-2-氯代-3，4-二甲基-5-苯基-[l，3，2]oxazasilolidine(24. 07g，89. 87 毫摩爾)加入 燒瓶。在幾分鐘內(nèi)，原來淺黃色的溶液轉(zhuǎn)變?yōu)橥该鞯陌迭S色。在0°C下將反應(yīng)攪拌6小時，然 后允許其溫暖至室溫并攪拌過夜，同時使用TLC監(jiān)測。通過加入大約25mL甲醇來將反應(yīng)猝 滅，導(dǎo)致顏色減輕。將溶液濃縮并用IOOmL乙酸乙酯和IOOmL水稀釋殘留物。將各相分離， 并用乙酸乙酯萃取水層兩次。將有機相合并，用鹽水沖洗，在Na2SO4I干燥并濃縮。通過柱 色譜使用己烷中的10%乙酸乙酯將所得油純化。獲得油狀的純化的(S)-N' -(1-叔-丁 基-丁-3-烯基)_胼羧酸叔丁酯(2.878，24.4%產(chǎn)率)。還收集到不純的餾分(3. 17g)。 Rf = 0. 44(5 1 己烷乙酸乙酯，I2 成像)；1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 6. 07 (br, 1H, NH)， 5. 85 (m, 1H)，5. 0 (dd, 2H)，2. 6 (m, 1H)，2. 33 (m, 1H)，2. 3 (m, 1H)，1. 4 (s,9H)，0. 9 (s,9H)?；衔? 將⑶-N' -(1-叔-丁基-丁-3-烯基)_胼羧酸叔丁酯(2. 34g，9. 65毫 摩爾)在帕爾瓶中溶解于甲醇(50mL)。將10%的Pd/C(70mg)加入水(1. 6mL)中形成漿狀， 并在起始壓力為55psi的帕爾氫化器上將混合物搖動4. 5h。作為反應(yīng)進(jìn)度的量度監(jiān)測壓 力的降低，指示在30分鐘后反應(yīng)可能完成。允許催化劑基本沉降，并用移液管除去上清液， 通過0. 45微米的注射器式濾器，并用TLC分析。在真空中除去溶劑以產(chǎn)生2. 19g(92. 7% ) 的淡蒼黃色油狀(S)-N' -(1-叔-丁基-丁基)_胼羧酸叔丁酯。Rf = 0.48(5 1己烷 乙酸乙酯，I2 成像),1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 6. 0(br, 1H) ,4. 0(br, 1H)，2· 5(d，1H)，1. 5(s, 9H)，1. 1 (m, 2H)，1. 6 (br, 2H)，0. 94 (s,9H)，0. 94 (t, 3H)。化合物6(標(biāo)題化合物)將⑶-N' -(1-叔-丁基-丁基)_胼羧酸叔丁酯 (lg，4. 09毫摩爾)在帶有磁力攪拌棒的管形瓶中溶于大約3mL 二氯甲烷。加入溶解在 大約2mL水中的0.8g&K2C03(5. 79毫摩爾)的溶液，接著是0. 81g(4. 80毫摩爾)的3， 5-二甲基苯甲酰氯。將反應(yīng)攪拌過夜，第一次在冰上，然后使之溫暖至室溫。然后將水 和二氯甲烷各幾mL加入以溶解所有固體。將水層除去并在固體MgSO4上將有機層干燥。 TLC指示反應(yīng)大約95%完成。將混合物濾過一些玻璃棉進(jìn)入管形瓶。使用N2蒸汽將溶 劑蒸發(fā)，用3 1己烷醚和戊烷進(jìn)行追蹤。將殘留物用鏟操作以使結(jié)晶開始，并在完全 固體化之后用2-3mL戊烷在小燒結(jié)玻璃漏斗中將其研磨三次。在空氣中干燥之后，得到 300mg(19. 5% )的⑶-N' _(1_叔-丁基-丁基)-N' -(3，5-二甲基-苯甲酰)-胼羧酸叔丁酯，其經(jīng)TLC指示為相當(dāng)純，手性HPLC表明e.e = 93.3%。在真空爐中于50°C下將 產(chǎn)物干燥以確定熔點。Rf = 0. 42(4 1己烷乙酸乙酯，UV(強)，I2(弱)成像)；mp = 115. 5-117. 5°C ；[α ]25589-30. 18 (c 2. 02, CH3OH)，1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7. 15-7. 03 (m, 3H)，6. 07+6. 00 (s+d, 1H)，4. 52+4. 40 (2dd, 1H)，2. 32+2. 28+2. 23 (3s, 6H)，1. 85-0. 89 (m, 25H)。實施例49 (R)-N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' _ (3，5-二甲基-苯甲酰)_胼羧酸叔丁酯 化合物1 如實施例1中所述制備(R)-N' 3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁 基-丁-3-烯基)_酰胼?；衔? (標(biāo)題化合物)向(R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁基)-酰 胼(400mg，1. 44毫摩爾)的THF(IOmL)溶液中加入t_boc酸酐(629mg，2. 88毫摩爾)。將 反應(yīng)回流40h，冷卻，用醚(20mL)稀釋，用H2O沖洗并在無水Na2SO4I干燥。將溶劑在真空 中蒸發(fā)并將殘留物經(jīng)快速色譜和薄層色譜進(jìn)行純化以得到白色固體(R)-N' -(1-叔-丁 基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-胼羧酸叔丁酯(45.7mg，產(chǎn)率4. )。Rf =0.39(1 3Et0Ac η-己烷)；[α ]25589+26· 25 (c 2.09, CH3OH), 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7. 15-7. 03 (m, 3H)，6. 07+6. 00 (2d, 1H)，4. 59+4. 50 (2dd, 1H)，2. 37+2. 34 (2s, 6H)， 1. 85-0. 89(m，25H)ppm ；HRMS(ESI)m/z 計算得到 C22H37N2O3[M+H]+377. 2804，實測 377. 2795， 計算得到 C22H36N2NaO3 [M+Na]+399. 2624，實測 399. 2618。實施例50 (R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁 _3_烯基)-N' -((S)-3, 3，3-三氟-2-甲氧基-2-苯基-丙酰)_酰胼合成 化合物1 使用US 2005/0209283A1中所述的方法學(xué)來制備3_甲氧基_2_甲
基-苯甲酸酰胼?；衔? 將吡呋醛(13. 45g，156毫摩爾)在圓底燒瓶中溶解于300mL甲醇。加入
3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸酰胼(26.6g，147. 6毫摩爾)和150滴冰醋酸，并將混合物回 流加熱大約8小時，同時通過TLC監(jiān)測。反應(yīng)完成時，在真空中除去溶劑，并將產(chǎn)物在冷己 烷中弄成漿，且在布氏漏斗上過濾以產(chǎn)生24. 4g(66% )的3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸(2， 2-二甲基-亞丙基)-酰胼。Rf = O. 19，(2 1己烷乙酸乙酯)；1H匪R(400MHz，DMS0-d6) δ 7. 42+7. 41 (3s, 1H)，7. 1 (t，1H)，6. 9 (d, 1H)，6. 82 (d, 1H)，3. 78 (s,3H)，2. 2+2. 1 (2s, 3H)， 1. 07+1. O (3s，9H)，多種構(gòu)象，可能為E/Z混合物。化合物3 如實施例1中所述制備(S，S)-2-烯丙基-2-氯代-3，4-二甲基-5-苯 基-[1，3, 2] oxazasiIolidineο化合物4 將3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸(2，2-二甲基-亞丙基)_酰胼(10. 84g， 43. 31毫摩爾)充入被保持在氮氣氛中的干燥的IL圓底燒瓶。通過導(dǎo)管加入350mL無水 二氯甲烷。在冰浴上將燒瓶冷卻至約5°C。通過注射器加入(S，S)-2-烯丙基-2-氯代-3，
4-二甲基-5-苯基-[1，3，2]oxazasilolidine0在幾分鐘內(nèi)，原來淺色的混合物轉(zhuǎn)變?yōu)橥?明的暗黃色，并且在大約5°C下于氮氣中任其攪拌。4小時后，TLC指示反應(yīng)完成。通過加入 大約25mL甲醇并緩慢混合將反應(yīng)猝滅。暗色消散。將溶液濃縮并用乙酸乙酯(IOOmL)和水(IOOmL)稀釋殘留物。將各相分離并用乙酸乙酯(2X IOOmL)萃取水層。用鹽水將合并 的有機相沖洗一次，在MgSO4上干燥，傾析，并濃縮以產(chǎn)生深黃色油，其靜置后結(jié)晶(13. 66g， 72. 4%產(chǎn)率)。將粗制物質(zhì)從4 1己燒乙酸乙酯中結(jié)晶，同時從不溶的粉末殘留物中分 離，所述殘留物可能是假麻黃堿。在結(jié)晶一次之后，純化的物質(zhì)顯示大約80%的e. e，偏好 R-同分異構(gòu)體，如Mosher分析所確定。在三次結(jié)晶后，回收6. 65g的結(jié)晶固體(R)_3_甲氧 基-2-甲基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁-3-烯基)酰胼(35. 2%)，但是ee沒有進(jìn)一步 提高。Rf = 0.38 (2 1 己烷:乙酸乙酯)；1H 匪R(400MHz,CDCl3) δ 7. 22 (t，lH)，7. 11 (br s, 1H)，6. 95 (d, 1H)，6. 15 (m, 1H)，5. 2 (d, 1H)，5. 15 (d, 1H)，3. 89 (s, 3H)，2. 80 (d, 1H)，2. 50 (dm, 1H)，2. 33 (s，3H)，2. 2 (dt, 1H)，1. 08 (s,9H)。 化合物5(標(biāo)題化合物)將(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N' _(1_叔-丁 基-丁-3-烯基)酰胼(100mg，0. 344毫摩爾)和(R) - (+) - α -甲基-α -(三氟甲基)-苯 乙酰氯(104mg，0.413毫摩爾)在管形瓶中溶解于1.5mL 二氯甲烷。加入在大約0. 5mL水中 的K2CO3 (95mg，0. 69毫摩爾)溶液，并將反應(yīng)混合物在室溫下過夜攪拌，并用TLC監(jiān)測。將各 相分離，按需加入另外的二氯甲烷和/或水以協(xié)助操作。在MgSO4或Na2SO4上將二氯甲烷層 干燥，并在真空中除去溶劑以得到油狀固體粗產(chǎn)物。用己烷/醚將該殘留物研磨，于是開始 結(jié)晶。在沒有進(jìn)一步擾動的情況下允許結(jié)晶發(fā)生。從母液的分離提供了 83mg(16.4%)的 (R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-N' -((S)-3，3，3-三 氟-2-甲氧基-2-苯基-丙酰)-酰胼結(jié)晶，并從中獲得X-射線晶體結(jié)構(gòu)。Mp = 128-129°C ； [α ]25589+66. 4° (c 2. 00, CH3OH) ；1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7. 5 (d，2H)，7. 2-7. 3 (m，4H)， 7. 07 (m, 1H)，6. 9 (d, 1H)，6. 6+6. 2 (br, 1H)，5. 2 (d, 1H)，5. 1 (d, 1H)，4. 8 (1H, br)，3. 85 (s, 3H), 3. 8 (s, 3H), 2. 55 (br, 1H), 2. 35 (br, 2H), 1. 5 (3H), 1. 05 (br s，9H) ； 13C NMR(1 OOMHz, CDCl3) δ 168. 1,158. 3，138. 7，134. 0，129. 4，128. 0，126. 5，126. 4，126. 3，124. 9，122. 1， 118. 0，117. 0，112. 2，57. 3，55. 7，35. 8，32. 0，28. 1，12. 3 ;HRMS(ESI)m/z 計算得至Ij C27H34F3N2O4 [M+H]+507. 24了1，實測 5O7. 2463,m/z 計算得到 C27H33F3N2NaO4 [M+Na]+529· 2290,實 測 529. 2284。分析計算得到 C27H33F3N2O4 -.C, 64. 02 ；H, 6. 57 ；F, 11. 25 ；N, 5. 53 ；0，12. 63。實 測:C,63. 87 ；H, 6. 71 ；N, 5. 52。為了確定實施例50中不對稱烯丙基化反應(yīng)的立體化學(xué)過程，確定了(R)_3-甲氧 基-2-甲基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁-3-烯基)-N' -((S)-3，3，3-三氟-2-甲氧 基-2-苯基-丙酰)-酰胼的X-射線晶體結(jié)構(gòu)。該實驗確定，含有叔丁基和η-丙基的碳的 絕對構(gòu)型是R。實施例51 (R)-3，5_ 二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁基)-N' _(3_甲氧 基-2-甲基-苯甲酰)_酰胼合成 化合物1 如實施例50中所述制備(R)-3-甲氧基_2_甲基-苯甲酸 N' -(1-叔-丁基-丁-3-烯基)酰胼。化合物2 將(R) -3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N' - (1_叔-丁基-丁 _3_烯基) 酰胼(3. 05g, 10. 5毫摩爾)溶于IOOmL甲醇。將碳載鈀(1 %，240mg)小心地加入，并將混合 物在起始壓力為55psi的帕爾氫化器上搖動2. 5小時。作為反應(yīng)進(jìn)度的量度監(jiān)測壓力的降 低；1.5小時后，氫吸收停止。將混合物濾過一片硅藻土(Celite)，并在真空中除去溶劑。使 用幾種溶劑的TLC分析在區(qū)分兩個酰胼斑點方面非常不成功，雖然3 1己烷乙酸乙酯 (Rf = O. 28)或多或少地成功了。從2 1戊烷己烷中將粗產(chǎn)物結(jié)晶兩次以得到>0.6g的 (R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)酰胼。1HNMRGOOMHhCDCl3) δ 7. 05 (t, 1H)，6. 79 (d, 1H)，6. 76 (d, 1H)，3. 7 (s，3H)，2. 37 (m, 1H)，2. 12 (s, 3H)，1. 7-1. 1 (m, 4H), 0. 90(s，9H)，0· 82(t，3H)。化合物3(標(biāo)題化合物)將(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N' _(1_叔-丁 基-丁基)酰胼(100mg，0. 34毫摩爾)和3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰氯(90mg，0.41 毫摩爾)溶解于ImL的二氯甲烷。加入1.5當(dāng)量的大約25%的K2CO3，并將反應(yīng)混合物在 室溫下攪拌且通過TLC監(jiān)測。完成后，將各相分離，按需加入另外的CH2Cl2和/或水以協(xié) 助操作。將CH2Cl2相在1%504或妝2504上干燥，在真空中除去溶劑以得到油狀固體。將此 用1 1己烷醚研磨，并允許在空氣中干燥以產(chǎn)出(R)_3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲 酸N-(l-叔-丁基-丁基)-N' -(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰)-酰胼。Rf = 0.29(2 1 己烷乙酸乙酯)；1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7. 1 (t，1Η)，7· 0 (s，NH 1H) ,6. 9(d, 1H) ,6. 7(s, 2H), 6. 3(d, 1H), 4. 78 (m, 1H) ,3. 95(s，3H)，3. 85 (2s，6H)，2. 2 (s，3H)，2. 05 (m, 1H)，1. 95 (s, 3H)，1. 8(m，1H)，1. 6(m，2H)，1. 2+1. 1+1. 05(3s，9H)，1. 05(m，3H) ；HRMS (ESI)m/z 計算得 到 C27H39N2O5[M+H]+471· 2859，實測 471. 2850，計算得到 C27H38NaN2O5[M+Na] +493. 2670，實測 493.2678。實施例52 (R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-環(huán)己基-丁基)-N' _ (2_乙基_3_甲氧基-苯 甲酰)_酰胼合成 化合物1 胼基甲酸芐酯是商業(yè)上可得的?；衔? 將胼基甲酸芐酯(25g，150. 44毫摩爾)在裝備有磁力攪拌的圓底燒瓶 中于氮氣氛中溶解于200mL乙醇。將環(huán)己烷甲醛(17. 7g，158毫摩爾)和乙酸(ImL)加 入溶液并將混合物在室溫下攪拌8h。將所得的固體沉淀過濾，用己烷沖洗，從乙酸乙酯 中結(jié)晶，并在開放的實驗臺上過夜干燥以得到28. 87g(73. 7%產(chǎn)率)的白色晶體N'-環(huán) 己亞甲基-胼羧酸芐酯。Rf = 0.67(1 3己烷乙酸乙酯)/H NMR(400MHz，CDCl3) δ 7. 8 (1Η, br s)，7. 4 (5H, m)，7. 1 (1H, br s)，5. 3 (2H, s)，2. 4 (1H，m)，1. 7-1. 9 (4H, m)， 1. 3(6H, m) ；HRMS(ESI)m/z 計算得到 C15H21N2O2[M+H]+261. 1603，實測 261. 1592，計算得到 C15H20NaN2O2 [M+Na]+283. 1426，實測 283. 1417?；衔? 如實施例1中所述制備(S，S)-2-烯丙基-2-氯代-3，4-二甲基-5-苯 基-[1，3，2] oxazasiIolidineο化合物4:將在75mL無水CHCl3中的5g(19. 21毫摩爾)的N'-環(huán)己亞甲基-胼羧酸芐酯充入帶有磁力攪拌器和N2氣氛的圓底燒瓶中。將混合物冷卻到0°C，并用注射器 將(S，S)-oxazasilolidine(5. 66g，21. 1毫摩爾)加入溶液。在大約30分鐘后移除冰浴， 并將反應(yīng)在室溫下過夜攪拌。用Na2CO3水溶液將反應(yīng)猝滅。除去有機層，并用CHCl3萃取 水相。將合并的有機相用水反向沖洗幾次，在無水Na2SO4上干燥，并使用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器除 去溶劑。通過柱色譜將所得的粗產(chǎn)物純化以提供2. 31g、產(chǎn)率為39. 8%的淺黃色粘稠油狀 (R)-N' -(1-環(huán)己基-丁-3-烯基)-胼羧酸芐酯。Rf = O. 41(3 1己烷乙酸乙酯)； 1H 匪R (400MHz，CDCl3) δ 7. 4 (5Η, m)，6. 3 (1H, br)，5. 9 (1H, br s)，5. 25 (2H, s)，5. 2 (2H, br s)，2. 95 (1H, br s)，2. 35 (1H, br d)，2. 17 (1H, br m)，1. 8 (2H, br m)，1. 75 (2H, br d)， 1. 55 (1H, br t)，1. 0-1. 4 (6H，m)ppm ；HRMS (ESI) m/z 計算得到 C18H27N2O2 [M+H]+303. 2072，實 測 303. 2079，計算得到 C18H26NaN2O2 [M+Na]+325. 1892，實測 325. 1899。 化合物5 將R-N' -(1-環(huán)己基-丁 _3_烯基)_胼羧酸芐酯(2. 20g, 7. 27毫摩 爾)在帶有磁力攪拌器的管形瓶中溶于2mL 二氯甲烷。將K2CO3水溶液(4mL中1.51g， 10. 91毫摩爾)加入，并將混合物在冰上冷卻。將無水?；染徛丶尤?，并使用大約ImL 二氯甲烷追蹤并沖洗。將混合物過夜攪拌，首先在冰上然后在室溫下，同時用TLC監(jiān)測。將 水和/或CH2Cl2加入反應(yīng)混合物以協(xié)助操作，并收集有機層。用CH2Cl2將水層萃取一次， 并將有機層合并而且在固體Na2SO4I干燥。在真空中除去溶劑，并用2 1己烷醚研磨 殘留物以產(chǎn)出2.93g(92.7% )的白色固體(R)-N' -(1_環(huán)己基-丁 _3_烯基)-N' -(3， 5-二甲基-苯甲酰)胼羧酸芐酯。Rf = O. 33(3 1己烷乙酸乙酯)；力MR(400MHz, DMS0-d6) δ 9. 8+9. 65 (0· 5Η, NH, 2s)，7. 1-7. 5 (3. 5H, m)，6. 9-7. 1 (5H, m)，6. 05 (0. 5H, m)， 5. 9 (0. 5H, m)，5. 2 (1H, m)，5. 0 (2H, m)，4. 8 (1H, m)，4. 35 (1H, m)，2. 35 (2H, brm)，2. 25 (6H, s)， 0. 8-2. 0(11H，m) ；HMS (ESI) m/z 計算得到 C27H35N2O3 [M+H]+435. 2647，實測 435. 2659，計算得 到 C27H34NaN2O3 [M+Na]+457· 2467,實測 457· 24了0?；衔?:將(R)-N' -(1-環(huán)己基-丁-3-烯基)-N' - (3，5_ 二甲基-苯甲酰) 胼羧酸芐酯(2.9化，6.7毫摩爾)懸浮在大約50mL冰醋酸中。將102mg的10 %的碳載鈀 加入幾mL冰醋酸中成為漿。用醋酸將混合物稀釋至75mL，并在20_30psi下于帕爾氫化 器上搖動90分鐘。將懸液靜置兩天以允許碳沉淀出來。將上清液濾過0.45微米的注射 器式濾器進(jìn)入結(jié)晶皿，并將溶劑蒸發(fā)以留下2. 06g(102%的質(zhì)量平衡)的赤褐色粘稠油 狀(R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(l-環(huán)己基-丁基)-酰胼。Rf = 0.24(2 1己烷乙 酸乙酯)；1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7. 05 (1Η, s)，7· 0 (2H，s) ,4. 55+3. 35 (1H, 2t), 2. 4 (6H, s)，0· 8-1. 9(15Η，m)，0.9(3H，t) ；HRMS(ESI)m/z 計算得到 C19H31N2O[M+H]+303. 2436，實測 303. 2441，計算得到 C19H3tlN2NaO [M+Na]+325. 2256，實測 325. 2262?；衔?(標(biāo)題化合物)將(R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l-環(huán)己基-丁基)_酰 胼(0. 14g，0.46毫摩爾)在帶有磁力攪拌器的管形瓶中溶于ImL的二氯甲烷。將K2CO3水 溶液(0. lg，0.69毫摩爾，2.77mL)加入。將燒瓶在冰上冷卻，并將無水?；燃尤?。使用 大約0. SmL另外的二氯甲烷追蹤并沖洗。將混合物過夜攪拌，首先在冰上然后在室溫下，同 時用TLC監(jiān)測反應(yīng)。將水和CH2Cl2加入反應(yīng)混合物以協(xié)助操作，并用CH2Cl2將水層萃取一 次。將有機層合并而且在固體Na2SO4上干燥。在真空中除去溶劑，并用層析法純化粗產(chǎn)物以 產(chǎn)出143mg(67.9%產(chǎn)率)的赤褐色粘稠油狀(R) _3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-環(huán)己基-丁 基)-N' -(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰胼。1H NMR(400MHz，DMS0-d6) δ 10. 4(1H，2s)，7. 0-7. 25 (5H, m)，6. 2 (1H, m)，4. 45 (1H, m)，3. 8 (3H, s)，2. 35 (6H, s)，2. 0-2. 2 (2H, m)， 0. 9-2. 0(15H, m)，0· 9(6H，m)。使用實施例52中所述的方法學(xué)制備實施例53至55。通過手性HPLC確定百分比 對映體過量(ee)。 實施例56 (S)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l-環(huán)己基-丁基)-N' _(2_乙基_3_甲氧基-苯 甲酰)_酰胼合成 化合物1 如實施例52中所述制備N' _環(huán)己亞甲基-胼羧酸芐酯?；衔? 使用實施例1中所述的方法學(xué)用R，R-假麻黃堿制備(R，R)-2-烯丙 基-2-氯代-3，4- 二甲基-5-苯基-[1,3, 2]oxazasilolidine?；衔? 使用實施例52中所述的方法學(xué)以69%的產(chǎn)率制備淡黃色粘稠油狀 ⑶-N' -(1-環(huán)己基-丁-3-烯基)-胼羧酸芐酯。分析數(shù)據(jù)Rf = 0.41(3 1己烷乙 酸乙酯)；1H NMR(400MHz, DMS0_d6) 8 8. 65 (1H, br s)，7.4(5H，m), 5. 85 (1H, br), 5. 1 (4H, m)，4. 2 (1H, s)，2. 7 (1H, br s)，2. 1 (1H, br m)，2. 0 (1H, br m)，1. 8 (2H, br m)，1. 65 (2H, br m)，1. 45 (1H, br m) 1. 0—1. 2 (6H，br m) ；1H NMR(400MHz, CDC13) 8 7. 4(5H, m) ,6. 3(1H, br)， 5. 9 (1H, br s)，5. 25 (2H, s)，5. 2 (2H, br s)，2. 95 (1H, br s)，2. 35 (1H, br d)，2. 17 (1H, br m), 1. 8(2H, br m), 1. 75 (2H, br d), 1. 55 (1H, br t)，1. 0—1. 4 (6H，m) ；HRMS (ESI)m/z 計算 得到 C18H27N202[M+H]+303. 2072，實測 303. 2057，計算得到 C18H26NaN202 [M+Na]+325. 1892，實測 325.1873?；衔? 使用實施例52中所述的方法學(xué)以84. 8 %的產(chǎn)率制備白色固體 ⑶-N' -(1-環(huán)己基-丁-3-烯基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-胼羧酸芐酯。分 析數(shù)據(jù)ee 彡 80 %。Rf = 0. 34(3 1 己烷乙酸乙酯)；力 NMR(400MHz, DMS0_d6) 8 9. 8+9. 65 (0. 5H, NH, 2s)，7. 1-7. 5 (3. 5H, m)，6. 9-7. 1 (5H, m)，6. 05 (0. 5H, m)，5. 9 (0. 5H,
m) ,5. 2 (1H, m) ,5. 0 (2H, m)，4. 8 (1H, m)，4. 35 (1H, m)，2. 35 (2H, br m)，2. 25 (6H, s)， 0. 8-2. 0(llH,m) ；111 ^伍51)111/2計算得到(271135隊03[]\1+11]+435. 2647，實測 435. 2655，計算得 到 C27H34NaN203 [M+Na]+457. 2467，實測 457. 2469?；衔? 使用實施例52中所述的方法學(xué)制備(S)-3，5_二甲基-苯甲酸N-(l_環(huán)己基-丁基)-酰胼。分析數(shù)據(jù)Rf = 0.24(2 1己烷乙酸乙酯)；力NMR(400MHz, DMS0-d6) 8 7. 05+6. 95 (1H, s)，7. 0+6. 85 (2H, 2s)，4. 55+4. 05 (2H, 2s)，4. 3+3. 15 (1H，2t)， 2. 3(6H，2s)，0. 6-1. 9(15H, m) ,0. 9+0. 8 (3H, 2t) ； (400MHz, CDC13) 8 7. 05 (1H, s)，7. 0 (2H， s)，4. 55+3. 35 (1H, 2t)，2. 4 (6H, s)，0. 8-1. 9 (15H，m)，0. 9 (3H, t) ；HRMS (ESI) m/z 計算得 到 C19H31N20[M+H]+303. 2436，實測 303. 2440，計算得到 C19H30N2NaO[M+Na]+325. 2256，實測 325.2260?；衔?(標(biāo)題化合物)使用實施例52中所述的方法學(xué)以37%的ee制備(S)_3， 5-二甲基-苯甲酸N-(l-環(huán)己基-丁基)-N' -(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)_酰胼。使用實施例56中所述的方法學(xué)制備實施例57至59。通過手性HPLC確定百分比 對映體過量(ee)。表3提供實施例57至59的分析數(shù)據(jù)。表3:分析數(shù)據(jù) 實施例60 (R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l_環(huán)己基-丁-3-烯基)_N' _(3_甲氧基_2_甲
基-苯甲酰)_酰胼 化合物1 如實施例50中所述制備3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸酰胼?；衔? 將10. Og(55. 5毫摩爾)的3_甲氧基_2_甲基-苯甲酸酰胼溶解在200mL 的無水乙醇中。加入環(huán)己烷甲醛(6. 85g，61.0毫摩爾)和冰醋酸(3mL)，并將反應(yīng)混合物攪 拌18h，同時用TLC監(jiān)測。經(jīng)過濾收集沉淀物，并用己烷沖洗。獲得白色固體產(chǎn)物3-甲氧 基-2-甲基-苯甲酸環(huán)己亞甲基-酰胼(9. 36g，產(chǎn)率61% ) =Rf = 0. 20(3 IEtOAc η-己 烷)；1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 11. 17 (s，1H)，7· 91 (s, 1H)，7· 50 (d, J = 4. 8Hz, 1H)，7· 25 (t, J = 6. 4Hz, 1Η) ,6. 99 (t, J = 5. 6Hz，1Η)，3. 89 (s，3Η)，2. 28 (s，3Η)，1. 92-1. 62 (m，5Η)， 1. 38-1. 14(m，6H) ；HRMS (ESI)m/z 計算得到 C16H23N2O2 [M+H]+275. 1760，實測 275. 1752，計算 得到 C16H22N2NaO2 [M+Na]+297. 1579，實測 297. 1568?；衔? 使用實施例1中所述制備(S，S)-2-烯丙基-2-氯代-3，4-二甲基-5-苯 基-[1，3，2] oxazasiIolidineο化合物4 向帶有攪拌器和氮氣入口的圓底燒瓶中加入3-甲氧基-2-甲基-苯 甲酸環(huán)己亞甲基-酰胼(2.8g，10. 2毫摩爾)和干燥的CHCl3(50mL)。逐滴加入(S， S) -oxazasilolidine(3. 28g，12. 20毫摩爾)。將反應(yīng)在50°C下攪拌6h，然后在室溫下18h。 加入飽和的NaHCO3溶液(30mL)以將反應(yīng)猝滅。將CHCl3層分離并用CHCl3(2X 30mL)萃取水 層。將CHCl3溶液合并，且在無水Na2SO4I干燥。將溶劑在真空中蒸發(fā)，并用快速色譜將粗 制混合物純化以獲得白色固體(R)_3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N' -(1-環(huán)己基-丁-3-烯 基)酰胼(1. 74g，54%產(chǎn)率)O1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 9. 69 (s, 1H)，7. 24(t, J = 8. OHz, 1H)， 7. 05 (d, J = 8. OHz, 1Η)，6· 88 (d, J = 7. 6Hz, 1Η)，5. 92 (m, 1Η)，5. 15 (dd, J = 1. 6，17. 2Ηζ, 1Η) ,5. 08 (dd, J = 1.6,10. 4Hz, 1Η), 4. 91 (dd, J = 3. 6，6. 8Hz，1Η)，3. 83 (s，3Η)，2. 75 (m， 1Η)，2· 26-2. 22 (m, 1Η)，2· 16(s，3H)，2· 14-2. 08 (m, 1Η)，1. 81-1. 08(m，11Η) ；HRMS(ESI)m/z 計算得到 C19H29N2O2 [M+H]+317. 2229，實測 317. 2221，m/z 計算得到 C19H29N2O2 [M+Na]+C19H28N2N a02339. 2048，實測 339. 2037?；衔?(標(biāo)題化合物)向(R)-3-甲氧基-2-甲基-苯甲酸N' _(1_環(huán)己 基-丁-3-烯基)酰胼(1.3g，4. 11 毫摩爾)的 CH2Cl2 (5mL)溶液中加入 K2CO3 (2. 27g，16. 44 毫摩爾)、H20(5mL)以及最后3，5_ 二甲基苯甲酰氯(727mg，4. 31毫摩爾)。將反應(yīng)在室溫下攪拌24h。加入另外的CH2Cl2和H2O以協(xié)助操作，將CH2Cl2層分離，并用CH2Cl2萃取水層。將CH2Cl2溶液合并，而且在無水Na2SO4上干燥。將溶劑在真空中蒸發(fā)并用快速色譜純化殘 留物以得到白色固體(R)_3，5-二甲基-苯甲酸N-(l-環(huán)己基-丁-3-烯基)-N' -(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰)_酰胼(1.458，78%產(chǎn)率)。Rf = 0.21(3 IEtOAc η-己 烷)；1H NMR(400MHz, DMS0-d6) δ 10. 47+10. 39 (2s, 1H), 7. 20-7. 01 (m,5H) ,6. 37 (d, J = 7. 2Hz, 1H)，6. 22-5. 89 (m, 1H)，5. 18 (dd, 1H)，5. 02 (dd, 1H)，4. 46 (m, 1H)，3. 79 (s,3H)， 2. 44-2. 34(m，2H)，2. 29(s，3H)，2. 02-1. 53(m，8H)，1. 26-1. 02(m，3H) ；HRMS (ESI) m/z 計算 得到 C28H37N2O3[M+H]+449· 2804,實測 449· 2793,計算得到 C28H36N2NaO3 [M+Na]+471. 2624,實測 471. 2615。實施例61 (R)-4-甲氧基-3，5_ 二甲基-苯甲酸N-(l_環(huán)己基-丁-3-烯基)-N' _(3_甲 氧基-2-甲基-苯甲酰)_酰胼合成使用實施例60中所述的方法學(xué)以71%的產(chǎn)率制備(R)-4-甲氧基-3，5-二甲 基-苯甲酸N-(l-環(huán)己基-丁-3-烯基)-N' "(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰)-酰胼。分析 數(shù)據(jù)Rf = 0.14(1 3Et0Ac η-己燒)；1HNMR(400MHz，DMS0_d6) δ 10. 46+10. 38 (2s, 1H), 7. 21-6. 42 (m, 5Η)，6. 16-5. 93 (m, 1Η)，5. 23 (dd, 1H)，5. 01 (dd, 1H)，4. 45 (m, 1H)，3. 79 (s, 3H)，3. 77(s，6H)，2· 42-2. 28(m，2H)，2. 04(s，3H)，1. 88-1. 05(m，14H) ；HRMS (ESI) m/z 計算 得到 C29H38N2O5[M+H]+495· 2859,實測 4卯· 2848,計算得到 C29H38N2NaO5 [M+Na]+5I7. 2678,實測 517.2667。實施例62 (R)-3，5_ 二甲基-苯甲酸N' _ (4_乙基-苯甲酰)_N_ (1_苯乙基-丁 _3_烯
基)_酰胼合成 化合物1 :4-乙基-苯甲酸酰胼是商業(yè)上可得的?；衔? 將4-乙基-苯甲酸酰胼(10g，60.9毫摩爾)溶于32mL甲醇。加入醋酸 (ImL)，將混合物至回流，并且然后緩慢加入氫化肉桂醛(5. 77g，67毫摩爾)。將反應(yīng)混合物 回流IOh并用TLC監(jiān)測。通過過濾收集沉淀物并用己烷沖洗。獲得白色固體4-乙基-苯 甲酸(3-苯基-亞丙基)-酰胼(9. 34g，54. 7% 產(chǎn)率)。Rf = 0. 36(1 IEtOAc η-己 烷)；1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 8. 87 (s, 1H)，7· 72-7. 24 (m, 10H)，2· 87 (t, J = 15. 2Hz，2H)， 2. 79-2. 57(m，4H)，1. 24 (t, J = 8Hz，3H)?；衔? 將(R)_(+)_甲基P -甲苯基亞砜(0. 5g，3. 21毫摩爾)和四丁基三苯 基二氟代硅酸銨(TBAT) (0. 12g，0. 214毫摩爾)在氮氣中和磁力攪拌下溶解在0. 038mL的 2-甲基-2-丁烯和2. 4mL無水二氯甲烷中。將烯丙基三氯硅烷(0. 23mL，1. 61毫摩爾) 在-78°C加入，并將反應(yīng)攪拌15分鐘。將4-乙基-苯甲酸(1-甲基-3-苯基-亞丙基)酰 胼(0. 3g，1. 07毫摩爾)溶解在11. 6mL的無水二氯甲烷中并在30分鐘的時間段里加入反 應(yīng)。將反應(yīng)混合物在氮氣中攪拌5小時并維持在-78°C至_70°C，且用TLC監(jiān)測。用1. 5mL 三乙胺和3mL無水甲醇在-78°C將反應(yīng)猝滅。然后加入鹽水并允許混合物溫暖至室溫。除 去有機層，與三種二氯甲烷萃取物合并，而且在硫酸鈉上干燥。將溶劑蒸發(fā)，并通過快速色 譜用不連續(xù)梯度的2 1和1 1戊烷乙酸乙酯將粗制混合物純化。獲得澄清油狀的純 化的(R)_4-乙基-苯甲酸N’ -(1-苯乙基-丁-3-烯基)-酰胼(0. 145g，41.4%產(chǎn)率，在 Chiralcel ADH 上通過手性 HPLC 得到 57. 6% ee)。Rf = 0.50(1 IEtOAc η-己燒)； 1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7. 64-7. 13 (m，9Η)，5· 91 (m，1Η)，5· 15 (t，J = 28. 0Ηζ,2Η) ,3. 12 (m, 1Η)，2· 76-2. 63(m，4H)，2· 38-2. 24(m，2H)，1. 88-1. 74(m，2H)，1. 23 (t, J = 8. 0Hz，3H)?；衔?(標(biāo)題化合物)將(R)-4-乙基-苯甲酸N’ - (1-苯乙基-丁 -3-烯 基)-酰胼(0. lg，0.31毫摩爾)經(jīng)磁力攪拌溶解于0.47mL 二氯甲烷。將0.7mL去離子水中的碳酸氫鉀(0.064g，0.37毫摩爾)以及3，5-二甲基苯甲酰氯(0. 063g，0. 37毫摩 爾)加入混合物。首先將反應(yīng)混合物在冰上攪拌，然后允許其經(jīng)過周末溫暖至室溫，同時 用TLC監(jiān)測。將有機層除去并將水層用二氯甲烷萃取三次且在硫酸鈉上干燥。將溶劑蒸 發(fā)，并用快速色譜將粗制混合物純化，其使用2 1己燒乙酸乙酯作為洗脫液。獲得黃色 油狀的純化的(R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(4-乙基-苯甲酰)-Ν-(1-苯乙基-丁-3-烯 基)-酰胼(0. 102g，產(chǎn)率 72. 9%，在 Chiralcel ADH 上通過手性 HPLC 得到 51. 2% ee)。Rf =0.34(2 1 己烷EtOAc) ；1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7. 8-7. 02 (m, 12H), 5. 99 (br, 1H), 5. 22 (d, J = 24. 0Ηζ，2Η)，2· 73 (d, J = 8Hz，2Η)，2· 31 (s，6Η)，212-203 (m，2Η)，187 (s，1Η)， 1. 61 (s，2H)，1. 29 (t, J = 8. 0Hz，3H) ；HRMS (E SI)m/z 計算得到 C30H35N2O2 [M+H]+455. 2699，實 測 455. 2685，計算得到 C3tlH34N2NaO2 [M+Na]+477. 2518，實測 477. 2505。實施例63 化合物1 如實施例31中所述制備化合物1?；衔?(標(biāo)題化合物)在0°C下向⑶-N' -(1-叔-丁基-丁-3-烯 基)-N' _(3，5-二甲基-苯甲酰)-胼羧酸芐酯(200mg，0.49毫摩爾)的THF(3mL)溶液中 加入硼烷二甲基硫化物(THF中2M，125 μ L，0. 25毫摩爾)。將混合物在室溫下攪拌16h。在 真空中除去過量的硼烷和THF，并加入另外的THF (3mL)，之后是H2O2 (61微升，0. 54毫摩爾) 和3N NaOH (90微升，0. 27毫摩爾)。在50-55°C下攪拌Ih之后，加入更多水，用醚萃取混合 物，在無水Na2SO4上將醚層干燥。在真空中除去溶劑并通過快速色譜將殘留物純化以得到 白色固體⑶-N' -(1-叔-丁基-4-羥基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-胼羧酸 芐酯(128mg，產(chǎn)率 61% )。Rf = 0.30(1 IEtOAc η-己烷)。1H NMR(400MHz，DMS0-d6) δ 9. 71+9. 63 (2s, 1H), 7. 44-6. 88 (m, 8Η), 5. 06 (dd, J = 3. 6，12. 8Hz，1Η)，4. 79 (dd，J = 12. 4，25. 2Hz, 1Η)，4· 43 (d, J = 10. 8Hz, 1Η)，4· 28 (t, J = 5. 2Hz, 1Η)，3. 47 (m，2Η)，2. 27 (s,6H)，1. 86-1. 21(m，4H)，1. 01(s，9H) ；HRMS(ESI)m/z 計算得到 C25H35N2O4[M+H]+427. 2597，實 測 427. 2587，計算得到 C25H34N2NaO4 [M+Na]+449. 2416，實測 449. 2407。實施例64
(R)-N' -(1-叔-丁基-4-羥基-丁基)-N' - (3，5_ 二甲基-苯甲酰)-胼羧酸 芐酯合成使用實施例63中所述的方法學(xué)以>99%的ee制備(R)-N' _(1_叔-丁基_4_羥 基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-胼羧酸芐酯。實施例65該實施例舉例說明用于確定本發(fā)明的化合物對映體過量(ee)的分析方法。如圖2A-C所示，外消旋-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N' -(2， 6_ 二氯代_苯甲酰)_酰胼(實施例16)、(R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁 基)-N' -(2，6_ 二氯代-苯甲酰)-酰胼和(S)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁 基)-N' _(2，6_ 二氯代-苯甲酰)-酰胼(實施例41)的手性HPLC層析譜舉例說明用來 確定對映體過量的方法。外消旋_3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N' -(2， 6- 二氯代-苯甲酰)_酰胼含有50 %的R-同分異構(gòu)體(在大約16分鐘處有峰1)和50 %的 S-同分異構(gòu)體(在大約19分鐘處有峰2)。(R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁 基)-N' _(2，6_二氯代-苯甲酰)-酰胼的對映體富集的樣品基本上不含S-同分異構(gòu)體，其 ee 為 >99%。(S) _3，5_ 二甲基-苯甲酸 N-(1_ 叔-丁基-丁基)-N' _(2，6_ 二氯代-苯 甲酰)_酰胼的對映體富集的樣品基本上不含R-同分異構(gòu)體，其ee為>99%。在該實驗 中，使用 4. 6mmX 25cm Regis Rexchrom(S, S)ULMO 柱子來產(chǎn)生數(shù)據(jù)，其流速為 2. OmL/min, 使用在己烷中的2%甲醇作為溶劑，20 μ L的注射體積。以相似的方式確定式II或III的 其他化合物的對映體過量，除非另外說明。實施例66該實施例舉例說明本發(fā)明化合物的體外測試。基因表達(dá)盒GAL4 DBD (1-147) -CfEcR (DEF) /VP16AD- β RXREF-LmUSPEF 將來自云杉食心蟲 Choristoneura fumiferana EcR 的野生型 D、E 和 F 結(jié)構(gòu)域(“CfEcR-DEF” ；SEQ ID NO: 1)融合至GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(“Gal4DBDl-147”；SEQ ID NO 2)并置于磷酸甘油酸激 酶啟動子(“PGK”；SEQ ID NO 3)的控制之下。來自人類RXR3的EF結(jié)構(gòu)域的螺旋1至 8( "HsRXRβ-EF" ；SEQ ID NO 4的核苷酸1-465)和飛蝗超氣門蛋白的EF結(jié)構(gòu)域的螺旋9 至12 ( “LmUSP-EF”；SEQ ID NO 5的核苷酸403-630)被融合至來自VP16的反式激活結(jié)構(gòu)域(“VP16AD” ；SEQ IDNO 6)并被置于延伸因子 _1 α 啟動子(“EF-1 α，，；SEQ ID NO 7) 的控制之下。五個共有GAL4應(yīng)答元件結(jié)合位點(“5XGAL4RE”;其包括5個拷貝的GAL4RE， 其包括SEQ ID NO 8)被融合至合成的TATA最小啟動子(SEQ ID NO 9)并被置于熒光素酶 報道基因(SEQ ID NO 10)的上游。穩(wěn)定細(xì)胞系 CHO細(xì)胞被由單個質(zhì)粒上的遍在的活性細(xì)胞啟動子(分別為PGK和EF-I α )所控 制的 GAL4 DBD (1-147) CfEcR(DEF)和 VP 16AD β RXREF-LmUSPEF 的轉(zhuǎn)錄盒瞬時轉(zhuǎn)染。通過 Zeocin抗性來篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。用GAL4RE-熒光素酶報道分子(pFR Luc)瞬時轉(zhuǎn)染單 獨分離的CHO細(xì)胞克隆。使用潮霉素選擇27-63個克隆。用手性二酰基胼配體處理將細(xì)胞胰蛋白酶化并稀釋至2. 5 X IO4細(xì)胞mL的濃度。將100 μ L細(xì)胞懸液置于 96孔板的每個孔中并在37°C下于5% CO2中孵化24h。在DMSO中配制配體儲液并稀釋300 倍用于所有處理。劑量響應(yīng)測試由從33 μ M至0. 01-范圍內(nèi)的8個濃度所組成。報道基因測定在用來自Promega的Bright-Glo 熒光素酶測定系統(tǒng)(E2650)處理細(xì)胞之后48h， 測量熒光素酶報道基因的表達(dá)。在室溫下使用Dynex MLX微量滴定板光度計檢測發(fā)光。穩(wěn)定細(xì)胞系獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體，其含有如Suhr等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7999-804 (1998)中所述的CVBE和6XEcRE。人293腎細(xì)胞，也被稱作HEK-293細(xì)胞，被編碼 第一開關(guān)構(gòu)建體CVBE的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及接下來的報道分子構(gòu)建體6XEcRE Lac Z順序 感染。所述開關(guān)構(gòu)建體含有來自家蠶EcR(BE) (Iatrou)的氨基酸26-546的編碼序列，其被 插入框內(nèi)并位于VP16反式激活結(jié)構(gòu)域(VBE)的下游。將合成的ATG起始密碼子置于細(xì)胞 巨化病毒(CVBE)立即早期啟動子的控制之下，并且被夾在長末端重復(fù)序列(LTR)之間。報 道分子構(gòu)建體含有六個拷貝的蛻皮素應(yīng)答元件(EcRE)結(jié)合位點，其被置于LacZ的上游并 在兩側(cè)有LTR序列(6XEcRE)。使用稀釋克隆法來分離單個的克隆。使用450ug/mL的G418和lOOng/mL的嘌呤 霉素對克隆進(jìn)行選擇?；趯Υ嬖诤筒淮嬖跍y試配體的應(yīng)答來評估單個克隆。為了篩選和 SAR的目的來選擇克隆Z3。用CVBE和6XEcRE LacZ穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的人293腎細(xì)胞在37 °C下含有5 % CO2的氣 氛中被維持在含有 10 % FBS (Life Technologies, 26140-087)，450 膠 G418 (Mediates, 30-234-CR)和 IOOgnome promising (Sigma, P-7255)的極限必需培養(yǎng)基(Mediates, 10-010-CV)中，并在它們達(dá)到75%匯合的時候被繼代培養(yǎng)。用手性二?；菖潴w處理將Z3細(xì)胞以每孔2. 5 X IO3個細(xì)胞的濃度種在96孔組織培養(yǎng)板上，并在37°C下于 5% CO2中孵化24小時。配體的儲液是在DMSO中配制的。將配體儲液在培養(yǎng)基中稀釋100 倍，并將50 μ L該稀釋的配體溶液(33 μ Μ)添加到細(xì)胞。對照組和處理組二者中DMSO的終 濃度被維持在0. 03%。報道基因測定在處理細(xì)胞48小時之后評估報道基因的表達(dá)。使用來自Tropix的GalScreen 生物發(fā)光報道基因測定系統(tǒng)(GSY1000)來測量β-半乳糖苷酶活性。通過將用配體處理的細(xì)胞中的相對光單位(“RLU”)除以用DMSO處理的細(xì)胞中的RLU來計算誘導(dǎo)活性的倍數(shù)。 在室溫下使用Dynex MLx微量滴定板光度計檢測發(fā)光。開關(guān)構(gòu)建體CVBE和報道分子構(gòu)建體6XEcRE Lac Z的簡圖被顯示在圖1中。所述 兩個構(gòu)建體兩側(cè)是長末端重復(fù)序列，G418和嘌呤霉素是可選的標(biāo)志物，CMV是細(xì)胞巨化病 毒啟動子，VBE是被插入VP16反式激活結(jié)構(gòu)域下游的來自家蠶EcR的氨基酸26-546的編 碼序列，6X EcRE是六個拷貝的蛻皮素應(yīng)答元件，IacZ編碼報道酶β -半乳糖苷酶。基因表達(dá)盒GAL4 DBD-CfEcR(DEF)/VP16AD-MmRXRE 將來自云杉食心蟲 Choristoneura fumiferana EcR 的野生型 D、E 和 F 結(jié)構(gòu)域("CfEcR-DEF”；SEQ ID NO 1)融合至 GAL4 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域("Gal4DBDl-147" ；SEQ IDNO 2)并置于 pM 載體(PT3119-5，Clontech, Palo Alto, CA)的SV40e啟動子的控制之下。來自小家鼠RXR( “MmRXR-DE" ；SEQ ID NO 11)的 D和E結(jié)構(gòu)域被融合至來自VP16的反式激活結(jié)構(gòu)域(“VP16AD” ；SEQID NO 6)并被置于 PVP16 載體(PT3127-5, Clontech, Palo Alto, CA)的 SV40e 啟動子的控制之下。穩(wěn)定細(xì)胞系CHO 細(xì)胞被由 SV40e 啟動子所控制的 GAL4 DBD CfEcR(DEF)和 VP16AD_MmRXRE 的 轉(zhuǎn)錄盒瞬時轉(zhuǎn)染。使用潮霉素來選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。用GAL4 RE-熒光素酶報道分子 (pFR-Luc, Stratagene, La Jolla, CA)瞬時轉(zhuǎn)染單獨分離的CHO細(xì)胞克隆。使用Zeocin選 擇13B3克隆。用手性二?；菖潴w處理將細(xì)胞胰蛋白酶化并稀釋至2. 5 X IO4細(xì)胞mL的濃度。將100 μ L細(xì)胞懸液置于 96孔板的每個孔中并在37°C下于5% CO2中孵化24h。在DMSO中配制配體儲液并稀釋300 倍用于所有處理。劑量響應(yīng)測試由從33 μ M至0. 01 μ M范圍內(nèi)的8個濃度所組成?；蜷_關(guān)測定-人工改造的EcR :USP/PXR系統(tǒng)通過將下面的構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)來進(jìn)行細(xì)胞基因 開關(guān)測定。將來自云杉色卷蛾EcR的野生型D、E和F結(jié)構(gòu)域或其V390I/Y410E/E274V突變 體融合至 GAL4-DBD 并置于 pBIND 載體(Promega Corporation，Madison，WI，USA)中 CMV 啟 動子的控制之下。使用基于5’和3’末端的20-25nt序列所設(shè)計的引物將所顯示的EcR的 DEF結(jié)構(gòu)域擴增。分別將限制酶位點EcoR I/BamH I和Xba I添加到5，和3，引物。用適 當(dāng)?shù)南拗泼笇CR產(chǎn)物消化并克隆進(jìn)pBIND載體。通過測序來確認(rèn)被克隆進(jìn)pBIND載體的 EcR LBD0 按以前所述(Kumar P & KatakamA，于 Gene Transfer (基因轉(zhuǎn)移)，F(xiàn)riedmann T 禾口 Rossi J,編輯，pp. 643-651 (2007), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)構(gòu)建了來自人類RXR β和飛蝗RXR的嵌合RXR，其被融合至VP16-AD并 置于SV40e啟動子的控制之下?？烧T導(dǎo)的熒光素酶報道質(zhì)粒pFRLuc (StratageneCloning Systems, La Jolla, CA, USA)含有五個拷貝的GAL4應(yīng)答元件和合成的最小啟動子。NIH3T3細(xì)胞被維持在37°C和5% CO2條件下的補充有10%小牛血清的達(dá)爾伯克 氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)中，其二者都獲得自Mediatechlnc. ,Manassas，VA。將細(xì)胞 以2，500個細(xì)胞/孔的密度種在96孔板中的50 μ 1生長培養(yǎng)基中。在接下來的一天里首 先將細(xì)胞用35 μ L含有二甲基亞砜(DMS0 ；對照)的不含血清的DMEM或者含配體的DMSO溶液處理。然后根據(jù)制造商的說明使用SuperFect 轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen Inc.，Valencia, CA, USA)，將細(xì)胞用每孔含有0. 04 μ g的EcR構(gòu)建體、0. 04ug的RXR構(gòu)建體和0. 16 μ g的熒光素 酶報道分子構(gòu)建體的15 μ 1不含血清的DMEM轉(zhuǎn)染。以0. 01-33 μ M的8個劑量測試配體，并 且在對照和處理孔中DMSO的終濃度為0. 33%。在48個小時后處理和轉(zhuǎn)染孵化之后，按照 制造商的說明使用Bright-Glo 熒光素酶測定系統(tǒng)(Promega Corporation, Madison, WI, USA)來測定細(xì)胞的熒光素酶活性。最少一式二份地測量EC5tl值。報道基因測定 在用來自Promega的Bright-Glo 熒光素酶測定系統(tǒng)(E2650)處理細(xì)胞之后48h， 測量熒光素酶報道基因的表達(dá)。在室溫下使用Dynex MLX微量滴定板光度計檢測發(fā)光。在兩個分開的孔中進(jìn)行單個測定，并將兩個值平均。通過將用配體處理的細(xì)胞中 的相對光單位(“RLU”)除以用DMSO處理的細(xì)胞中的RLU來計算誘導(dǎo)倍數(shù)。使用三參數(shù) 邏輯模型從劑量響應(yīng)數(shù)據(jù)計算EC5tlt5相對最大FI被確定為在任何濃度下觀測的被測配體 (本發(fā)明一個實施方案)的最大誘導(dǎo)倍數(shù)相對于在任何濃度下觀測的GStm-E配體(3，5-二 甲基-苯甲酸N-叔-丁基-N’ -(2-乙基-3-甲氧基_苯甲酰)_酰胼)的最大誘導(dǎo)倍數(shù)。
實施例67
該實施舉例說明本發(fā)明化合物的體內(nèi)測試.在含有基因開關(guān)的C57BL/6小鼠模型系統(tǒng)中評估本發(fā)明的手性二酰基胼配體對報道酶的體內(nèi)誘導(dǎo)?；虮磉_(dá)盒將來自云杉食心蟲Choristoneura fumiferana EcR的野生型D、E和F結(jié)構(gòu)域 (“ CfEcR-DEF”； SEQ ID NO 1)突變[V107(gtt) — I107(att)和 Y127(tac) — E127(gag)] 并融合至GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(“Gal4DBDl_147” ；SEQ ID NO :2)。來自人類RXR3的EF 結(jié)構(gòu)域的螺旋1至8( "HsRXRβ-EF" ；SEQ ID NO 4的核苷酸1-465)和飛蝗超氣門蛋白的 EF結(jié)構(gòu)域的螺旋9至12 ("LmUSP-EF"；SEQ ID NO 5的核苷酸403-630)被融合至來自VP16 的反式激活結(jié)構(gòu)域(“VP16AD”；SEQ ID NO :6)，其調(diào)控人類分泌的堿性磷酸酶的報道基因 ("SEAP",SEQ ID NO 12)，所述報道基因被置于6xGAL4應(yīng)答元件(SEQ ID NO 13)和運甲 狀腺素蛋白啟動子(SEQ ID NO 14)的控制之下?；蜷_關(guān)的每個元件是在分開的質(zhì)粒上。 受體表達(dá)是在CMV啟動子(SEQ ID NO 15)的控制之下。通過在配體存在下表達(dá)的報道蛋 白的量來對誘導(dǎo)進(jìn)行評估?；蜷_關(guān)的電穿孔在將基因開關(guān)電穿孔導(dǎo)入小鼠四頭肌之后，對小鼠血清中的SEAP表達(dá)進(jìn)行評估。 用2yL/g的氯胺酮(lOOmg/mL)和甲苯噻嗪(20mg/mL)混合物將小鼠麻醉。然后為動物剃 毛，將DNA載體在體積為2 X 50 μ L的聚谷氨酸(12mg/mL水)中注射進(jìn)肌肉，應(yīng)用電極導(dǎo)電 性凝膠，并將電極口徑(IcmX Icm ；384型)置于后腿。用200V/cm, 20msec/脈沖，以1秒的 時間間隔對肌肉進(jìn)行8次電穿孔。在動物接受了 一半的脈沖之后，將橫向電場的方向逆轉(zhuǎn)。 使用來自BTX Molecular Delivery Systems的ECM830電穿孔儀進(jìn)行電穿孔。用手性二?；菖潴w處理在一些實驗中，在基因開關(guān)的電穿孔后3天，小鼠接受在50 μ L DMSO中的 2. 6 μ mol的配體的腹膜內(nèi)注射(IP)。在其他實驗中，配體濃度被降至26nmol/50 μ L DMSO/ 小鼠。在配體施用之后2-11天對SEAP表達(dá)進(jìn)行評估。在其他實驗中通過嚙齒類飼料 (rodent chow)將配體施用。通過將2g配體溶解于20mL丙酮并將其加入來自Purina Mills 的Ikg的LabDiet 5010可高溫高壓消毒的飼料來制備所述飼料。在Hobart混合器中將其 徹底混合，然后在Cross Blend混合器中再混合15min。動物隨意地接受飼料1、2或3天。 所有數(shù)值是來自四只動物的平均數(shù)。不加入配體而單獨用載體處理的動物的血清中的背景 SEAP 是 Ο-llng/mL 血清。報道分子測定對用小玻璃毛細(xì)管進(jìn)行眶后放血獲得的血液進(jìn)行離心而獲得小鼠血清。使用 Clontech Great Escape化學(xué)發(fā)光試劑盒并與Clontech SEAP標(biāo)準(zhǔn)比較來確定SEAP定量。為了評估(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(I-叔-丁基-丁基)-N' -(3， 5-二甲基-苯甲酰)-酰胼(實施例1)對于誘導(dǎo)RheoSwiteh 治療系統(tǒng)(RTS)基因表 達(dá)的相對體內(nèi)有效性，用下述質(zhì)粒將十二只C57BL6小鼠電穿孔pCMV/GEVY(DEF)、pCMV/ VP16-Hs-LmRXR 和 p6XGAL4RE_TTR_SEAP。質(zhì)粒 pCMV/GEVT (DEF)由來自云杉色卷蛾的 EcR 的 D、E和F結(jié)構(gòu)域所組成，其載有被融合到酵母GAL4-DBD(aa 1-147)下游并受到pBIND載體 (Promega Corporation, Madison, WI, USA) CMV啟動子和下游的SV40多腺苷酸化信號控制 的突變V390I/Y410E/E274V。使用基于5，和3，末端的20_25nt序列而設(shè)計的引物將所示的 EcR的DEF結(jié)構(gòu)域擴增。將限制性內(nèi)切酶位點BamH I和Xba I分別加到5’和3’引物。使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物并克隆進(jìn)pBIND載體(圖20)。載體pCMV/VP16-Hs-LmRXR 含有來自人類RXR β (Ε結(jié)構(gòu)域的螺旋1-8)和飛蝗RXR(Ε結(jié)構(gòu)域的螺旋9-12)的嵌合RXR， 其被融合到VP16激活結(jié)構(gòu)域的下游并被置于pBIND載體中CMV啟動子的控制之下(圖 21)?？烧T導(dǎo)的SEAP報道載體p6xGAL4RE-TTR-SEAP含有人類分泌的堿性磷酸酶報道基因， 其被置于可誘導(dǎo)的啟動子的控制之下，所述啟動子由在運甲狀腺素蛋白(TTR)啟動子上游 的6拷貝的Gal4應(yīng)答元件所組成(圖22)。將質(zhì)粒DNA電穿孔導(dǎo)入小鼠四頭肌之后3天， 以26nmol/小鼠(11. 4 μ g/小鼠，大約570 μ g/kg)的比率通過腹膜內(nèi)注射向小鼠施用三 種配體制劑。接下來在配體施用后對人類分泌的堿性磷酸酶(SEAP)在小鼠血清中的表達(dá) 監(jiān)測17天。為了比較，評估了(S)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁 基)-N' _(3，5-二甲基-苯甲酰)-酰胼(實施例31)和外消旋-2-乙基-3-甲氧基-苯 甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-酰胼的相對體內(nèi)有效性。 如圖3所示，(S)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5_ 二 甲基-苯甲酰)-酰胼(·-·)不誘導(dǎo)RTS基因報道分子表達(dá)。外消旋-2-乙基-3-甲 氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-酰胼誘導(dǎo)適度 的RTS基因報道分子表達(dá)(▲-▲)。(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁 基-丁基)-N' _(3，5-二甲基-苯甲酰)-酰胼(〇-〇)誘導(dǎo)大量的RTS基因報道分子 表達(dá)。實施例682-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(I-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5_ 二甲基-苯 甲酰)-酰胼的R對映體和外消旋物的物理性質(zhì)形態(tài)形式在圖4中報道了固體樣品批。關(guān)于R對映體，從甲醇/水或甲苯/庚 烷快速結(jié)晶/沉淀獲得的樣品產(chǎn)生相同的粉末X-射線衍射圖型(數(shù)據(jù)未顯示)，并具有互 相相比和與得自CH3OH結(jié)晶的標(biāo)準(zhǔn)(165. 1-166. 5°C )相比基本上相同的熔點([甲苯/庚 烷]166. 2-167. I0C, [CH30H/H20] 166. 5-167. 4°C )。關(guān)于外消旋物，通過甲醇蒸發(fā)獲得的兩 個單獨的制劑顯示了在實驗誤差內(nèi)相同的熔點(170-17rC，169-17(TC)和純度的微小變 化。2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5_ 二甲基-苯甲 酰)“酰胼的外消旋物和R對映體的形態(tài)形式看來是最常見的。微?；土６葹榱藢⒘６日；?，2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁 基-丁基)-N' - (3，5- 二甲基-苯甲酰)-酰胼的R對映體和外消旋物的每個通過20篩目 被預(yù)先篩選并被微?；Ｍㄟ^稱出約20mg測試物質(zhì)并放入15mL的Falcon管中來確定粒 度。將IOmL去離子水加進(jìn)粉末。將懸液混合，用聲波處理20分鐘，然后立即使用Malvern Mastersizer裝置通過激光衍射來分析粒度。尺寸分布顯示在圖5和6中。雖然外消旋物 看上去具有比R外消旋物稍大的整體粒度，但該二樣品非常相似。堆密度和拍實密度分析使用在IOmL量筒中測量的重量和體積來計算微粒化的 2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-酰 胼的R對映體和外消旋物的堆密度。使用物質(zhì)的重量和拍實體積來計算微?；奈镔|(zhì)的拍 實密度。使用拍實密度分析器(型號=Stampfy0Iumeter, JEL的STAV2003)來測量拍實體 積，當(dāng)其變得恒定時記錄拍實體積(圖7)。R對映體具有稍低的堆密度和拍實密度。兩種 物質(zhì)都是絮狀的(低的堆密度)。
熱重分析/差熱分析(TGA/DTA)通過熱重分析/差熱分析來分析微粒化的2_乙 基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)_酰胼的 R對映體和外消旋物。熱重曲線圖顯示在圖8中。兩種物質(zhì)都在DTA概況上顯示了吸熱事 件。R對映體的起始溫度(163. 6°C)顯著低于外消旋物的起始溫度(171. 2°C)。R對映體 的熔化熱(59. 8uv. s/mg)也顯著低于外消旋物的熔化熱(80. 8uv. s/mg)。這說明兩種物質(zhì) 是不同的晶體形式。R對映體較低的熔點和較低的熔化熱反映在不同的溶解特性。在加熱到150°C以上后，R對映體失去0. 4%的總重量而外消旋物失去0. 8%的總 重量(圖8)。兩種物質(zhì)的含水量(可被熱除去的水分)稍微不同。動態(tài)蒸汽吸收分析當(dāng)被暴露于干燥條件(20% RH)時，外消旋物未顯示任何顯著 的總量減輕，而R對映體失去0. 9%的總重量(數(shù)據(jù)未顯示)，其可能對應(yīng)于在樣品轉(zhuǎn)移或 儲存中獲得的松散地伴隨的水分。當(dāng)在干燥條件下脫水后，在暴露于低(30-40% RH)、中 (50-60% RH)和高(70-80% RH)濕度時，該二物質(zhì)顯示了可比的重量增加。在70% RH，重 量增加對于R對映體為6. 3%而對外消旋物為6. 2% (數(shù)據(jù)未顯示)，這表明二種物質(zhì)適中 的吸濕性。在藥物賦形劑中的溶解度測定1 在商業(yè)上可得的賦形劑中定量地評估了微粒 化的2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5_ 二甲基-苯甲 酰)-酰胼的R對映體和外消旋物的溶解度(圖9)。通過在室溫下超聲處理15分鐘(以5 分鐘的間隔回蕩30秒)并且接下來在鋁砧上以50°C加熱12分鐘(以3分鐘的間隔回蕩 30秒)來制備玻璃管形瓶中10mg/g (檢品/賦形劑)的初始溶液/懸液。基于該初始的 10mg/g賦形劑樣品的表現(xiàn)，通過在如下幾點的間隔處向上或向下取樣來掃描2-4點濃度連 續(xù)譜5、10、15、20、30、50mg/g(檢品/賦形劑)。在所有被測的藥物賦形劑中R對映體比外 消旋物更可溶，除了在無水聚山梨醇酯80中R對映體和外消旋物看上去具有可比較的溶解 度(參見圖9)。對任何樣品都未觀察到顏色改變。為透明玻璃管形瓶中的幾種制劑照了相 (未顯示)ο測定2 對于每種賦形劑，鑒定了圖9的測定中2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸 N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5-二甲基-苯甲酰)-酰胼的R對映體和外消旋物不 能溶解的最低濃度。在管形瓶中制備該相同濃度的兩種物質(zhì)的懸液。在室溫下將每個樣 品攪拌< 2. 5hr (處理1)。作為單獨的實驗，將檢品/賦形劑組合在90°C下于鋁砧上加熱 5分鐘或按需要更長的時間；如圖10中所示，并允許其冷卻至室溫，并用少量相同的微粒化 的物質(zhì)撒種(處理2)。在72hr或標(biāo)明的時間記錄物理性質(zhì)(圖10)。在所有情況下未觀 察到顏色變化。該溶解度測定是在完全溶解的條件下操作的，在其中最初的粒度和形態(tài)形 式是不相關(guān)的。在用任何形態(tài)形式的結(jié)晶外消旋物向過飽和的2-乙基-3-甲氧基-苯甲 酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5-二甲基-苯甲酰)-酰胼的外消旋物溶液撒種后 觀察到沉淀/結(jié)晶，而R對映體保持完全溶解(特別在不加熱時)，表明了在被測濃度下外 消旋物和R對映體之間的溶解度差異。為透明玻璃管形瓶中的制劑照相(在測定1條件下 不加熱到90°C的R對映體，以及在90°C處理、冷卻并撒種后的外消旋物，未顯示)。測定3 將2-乙基-3-甲氧 基-苯甲酸N' _ (1_叔-丁基-丁基)-N' -(3，5-二 甲基-苯甲酰)-酰胼的R對映體和外消旋物與20% PEG 1000在蒸餾水中混合，pH 7.0， 每mL含l-2mg的粉末。將混合物在37°C孵化，在室溫下漩渦混合大約2小時，并允許在室溫下靜置另外12小時。將溶液過濾或離心，并且使用具有最小4點校準(zhǔn)曲線的普通LC/ MS/MS方法通過重復(fù)的LC/MS/MS注射對濃度進(jìn)行定量(圖11)。參見LGbenberg R，等， Solubilityas a limiting factor to drug absorption(作為藥物吸收限制因素的溶解 度)，在 Oral Drug Absorption (口月艮藥物吸收)中，J. B. Dressman (編輯)，MarcelDekker, NY，2000 和 Mader WJ,Grady LT, Determination of solubility (溶解度的確定)，第 5 章， Techniques of Chemistry ( it^^^f), Physical Methodsin Chemis try ( it^^^J^M 方法)，第 1 卷，第 V 部分，Weissberger，VA.，Rossiter，B. W.，編輯，Wiley，紐約，1971。測定4 在制劑賦形劑和生物液體中的平衡溶解度影響藥物的生物利用率，雖然 溶解的動力學(xué)也可能是確定生物利用率時的一個限制因素。在藥物表面活性劑聚山梨醇酯 80的水制劑中定量地確定2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' -(3， 5-二甲基-苯甲酰)-酰胼的R對映體和外消旋物的溶解度，然后觀測了壓縮的被測物質(zhì) 內(nèi)在的溶解速率。通過將20+/-lmg被測物質(zhì)接著是500mg聚山梨醇酯溶液加入2mL的 Eppendorf管形瓶來制備在0. 5%、1%和1. 5%聚山梨醇酯80溶液中的外消旋物和R對映 體混合物。將混合物用小珠打擊120秒，在25°C下?lián)u動16至24小時，并用Spin-X(0. 2 μ Μ) 過濾。記錄濾液的ρΗ。通過定量HPLC分析來測量濾液中被測物質(zhì)的濃度(圖12)。在1.0 和1.5%聚山梨醇酯80溶液中R對映體具有2-3Χ更高的溶解度。在去離子水和0.5%聚 山梨醇酯80中，外消旋物和R對映體的溶解度是可比較的。接下來，在37°C下使用去離子水中的聚山梨醇酯80中壓縮的小丸(7mm直徑， IOOmg)來確定2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲 基-苯甲酰)_酰胼的R對映體和外消旋物的內(nèi)在的溶解概況，其根據(jù)如下的測試條件容器IOOOmL介質(zhì)去離子水中聚山梨醇酯80(通過0.8μΜ濾器真空過濾)介質(zhì)容積IOOOmL速度100RPM溫度37°C采樣點15、30、45、60、90和 120min
采樣容積ImL (濾過30微米)分析HPLC (從每批制備標(biāo)準(zhǔn)溶液)樣品尺寸n = 2個小丸/被測物質(zhì)在至多120分鐘內(nèi)，外消旋物和R對映體的釋放是在HPLC的檢測限內(nèi)的。120分 鐘以后，據(jù)觀察，兩種物質(zhì)的小丸在介質(zhì)中都保持完整。實施例692-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(I-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5_ 二甲基-苯 甲酰)-酰胼的R對映體和外消旋物的細(xì)胞膜通透性穿過Caco-2細(xì)胞單層的雙向通透性(參見Sambuy Y，等，The Caco_2cell line as a model of the intestinal barrier !influence of cell and culture-relatedfactors on Caco-2 cell functional characteristics (作為小腸屏障模型的 Caco-2 細(xì)胞系 細(xì)胞和培養(yǎng)相關(guān)的因素對Caco-細(xì)胞功能特性的影響).Ce 11 Biο 1 Toxi C01. 2005Jan ； 21(1) 1-26 禾口 Artursson P 等，Caco_2monolayers inexperimental and theoreticalpredictions of drug transport (在藥物運輸?shù)膶嶒灪屠碚擃A(yù)測中的Caco_2單層).Adv Drug Deliv Rev.2001Mar 1 ；46 (1-3) :27_43)數(shù)據(jù)在圖13中顯示。在HBSSg中制備5iiM的被測化合物，其中最大DMS0濃度 彡1 %。制備了 21至28天的匯合的Caco-2細(xì)胞單層。用改良的Hanks緩沖液HBSSg中1 %的 BSA制備接受孔，并將頂端和基底側(cè)的Caco-2細(xì)胞維持在pH 7. 4士0. 2。對兩個單層向各方 向給藥(N = 2)為了評估(A —B)對頂端側(cè)給藥，而為了評估(B —A)對基底側(cè)給藥。使用 帶有最小4點校準(zhǔn)曲線的普通LC/MS/MS方法在120分鐘的時間點為頂端和基底側(cè)二者測 量被測化合物的濃度。圖13中的值為被測化合物從含有Caco-2細(xì)胞單層的Transwell 孔的百分比回收；兩個方向的表觀通透性(Papp)；外流比率(Papp B-A)/(Papp A — B)； 被分類為低或高的被測化合物的吸收潛力；當(dāng)外流彡3.0且Papp(B —A)彡1.0X10_6cm/ s時外流分類是顯著的。R對映體在兩個方向上的通透性都比外消旋物更強。而且，R對映 體的外流速率較低。使用MDR1-MDCK細(xì)胞對血腦屏障穿透潛力的確定(參見Taub ME,等，F(xiàn)unctional assessment of multiple P-glycoprotein(P~gp)probe substrates :Influence of cellline and modulator concentration on P-gp activity(多個 P_ II 蛋白 (P-gp)探針底物的功能評價細(xì)胞系和調(diào)節(jié)劑濃度對P-gp活性的影響).Drug Metab Dispos. 2005Nov ；33 (11) 1679-87 和 Wang Q,等，Evaluation ofthe MDR-MDCK cell line as a permeability screen for the blood-brain barrier(血||屏障ffl胃f生ff 時 MDR-MDCK 細(xì)胞系的評價) Int J Pharm. 2005Jan 20 ；288 (2) :349_59.(從 Absorption Systems Inc.簡報修飾而得))數(shù)據(jù)在圖14中顯示。在HBSSg中制備5 y M的被測化合物溶液，其中最大DMS0濃度 彡1%。制備了 7至11天的匯合的MDR1-MDCK細(xì)胞單層。用改良的Hanks緩沖液(HBSSg)中
的BSA制備接受孔，并將頂端和基底側(cè)維持在pH 7.4 士 0.2。對兩個單層向各方向給藥 (N=2)為了評估(A —B)對頂端側(cè)給藥，而為了評估(B —A)對基底側(cè)給藥。使用帶有最 小4點校準(zhǔn)曲線的普通LC/MS/MS方法在120分鐘的時間點為頂端和基底側(cè)二者測量被測 化合物的濃度。圖14中報道的值被測化合物從含有MDR1-MDCK細(xì)胞單層的Transwell 孔 的百分比回收；兩個方向的表觀通透性(Papp)；外流比率(Papp B-A)/(Papp A — B)；和 血腦屏障穿透潛力分類。2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' -(3， 5- 二甲基-苯甲酰)-酰胼的R對映體在MDR1-MDCK細(xì)胞中在A — B和B — A兩個方向都 比外消旋物具有更強的通透性。而且，R對映體經(jīng)歷更少的外流。R對映體被歸類為適度地 穿透血腦屏障，而外消旋體被歸類為低地穿透血腦屏障。較高的血腦屏障穿透對醫(yī)療指征 具有顯著優(yōu)勢，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CBS)的穿透是必需的。實施例702-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5_ 二甲基-苯甲 酰)_酰胼的R對映體和外消旋物的微粒體代謝(參見Jeffrey P，等，Utility ofmetabolic stability screening-comparison of in vitro and in vivo clearance (^iltli/^f^fefft 選效用體外和體內(nèi)清除的比較).Xenobiotica. 2001Aug_S?。?1 (8-9) :591_8和Lin JH， 等，Role of pharmacokinetics and metabolism in drugdiscovery and development (藥 代學(xué)和代謝作用在藥物發(fā)現(xiàn)和研究中的作用).Pharmacol Rev. 1997Dec ；49 (4) :403_49)
在DMSO(濃度小于0. 25% )、甲醇或乙腈中制備5 μ M的被測化合物溶液。從彡10 個供給者集合了混合性別人的肝臟微粒體，并將其用ImMNADPH孵化。在37°C下于含有 1. Omg/mL微粒體蛋白的緩沖液中與ImM的NADPH —起孵化被測化合物。在O和60分鐘，對 混合物取樣并通過LC/MS/MS監(jiān)測對應(yīng)于被測化合物的峰面積，其范圍是10-100%。一式二 份地進(jìn)行該測定(N = 2次分開孵化)。圖15中報道的數(shù)據(jù)是睪酮標(biāo)準(zhǔn)物的百分比殘留和 被測化合物的百分比殘留。R對映體對于人肝臟微粒體的代謝比外消旋物稍微更穩(wěn)定。實施例712-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(I-叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯 甲酰)-酰胼的R對映體和外消旋物的生物利用率通過口服管飼法將Labrasol中的化合物施用于C57BL/6N =Crl (野生型)小鼠 (Charles River Laboratories)，所述口服管飼法是在人身上期望的施用途徑。劑量被設(shè) 置在3,10,30或50mg/kg/天和2. 5mL/kg/劑(圖16)。施用該劑9天(第一次18只雌性 /組)或12天(第二次18只雌性/組)(圖16)。在9天和12天的時間點抽血。通過反 相HPLC對濃度進(jìn)行定量。對于每個濃度，通過將Labrasol加到燒杯中的固體R對映體或外消旋物，用聲波 處理以打碎可見的聚集物并用磁力攪拌直到獲得均勻的形態(tài)來制備樣品。將混合物轉(zhuǎn)移到 量筒并使用Labrasol對燒杯的沖洗液加到需要的體積。通過倒置將量筒的內(nèi)含物混合并 將其磁力攪拌直到給藥。這些Labrasol給藥制劑利用了微?；腞對映體，但是非微粒化的外消旋物。為 了解決非微?；耐庀飿?biāo)本可能使其在Labrasol中的溶解速率發(fā)生偏差的可能性， 進(jìn)行了獨立的實驗。在該實驗中，檢驗了微?；头俏⒘；耐庀锏?0mg/mL制劑的 溶解度和表現(xiàn)。將微粒化的外消旋物(批REH-28-9-1/PYAP-2-8-2-2M)、非微粒化的外消旋 物(批#PYAP-2-8-2-2)和微?；腞對映體(批#REH_28-4_2)各自懸浮在Labrasol中， 用手振蕩，然后在Branson 2100桌面超聲波儀上于25_28°C以3X 5min的間隔和1 X IOmin 的間隔經(jīng)超聲波處理，經(jīng)手振蕩使其散布。R對映體容易地溶解而微粒化的和未微?；耐?消旋物混合物保持含有懸浮微小粒子的渾濁(照片未顯示)。通過目檢，微粒化的和未微粒 化的外消旋物樣品中未溶解的物質(zhì)的量基本上相同。顯微術(shù)(圖17)揭示，微?；暮臀?微粒化的外消旋物懸浮液中多數(shù)粒子小于25微米(圖17)。一些較大的晶體片段保持為 未微?；臉悠?。既然微?；暮臀次⒘；耐庀飿悠范叨紝?dǎo)致相似量的未溶解物 質(zhì)，看來R對映體和外消旋物L(fēng)abrasol制劑之間的主要區(qū)別是內(nèi)在的溶劑性而非溶質(zhì)的起 始粒度。通過定量HPLC來測量作為時間的函數(shù)的小鼠血清水平。Labrasol中的R對映體 在30和50mg/kg/天(施用了 12和20mg/mL的Labrasol)的較高劑量獲得顯著較高的血 清水平。外消旋物血清水平基本上保持較低(< 4-5倍AUC)(圖18和19)。外消旋物和R 對映體之間初始粒度的不同可能是血清水平不同的一部分原因。而且，R對映體比外消旋 物在Labrasol中具有較大的內(nèi)在溶解度可能是血清水平不同的一部分原因。此外，血清水 平不同可能是由于膜通透性(每Caco-2細(xì)胞和MDCK細(xì)胞實驗；圖13和14)、吸收、分布或 分泌的不同。實施例72
2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(I-叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯 甲酰)_酰胼的R對映體和外消旋物關(guān)于在體內(nèi)誘導(dǎo)基因修飾的腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因IL-12 產(chǎn)生方面的對比
在該樣品中被測的轉(zhuǎn)基因是在RTS控制之下的鼠IL-12。用載有RTS控制的鼠 IL-12轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體Ad-RTS-mIL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠黑素瘤細(xì)胞(B16)。通過皮下(s. c.) 將這些細(xì)胞注射進(jìn)C57BL/6小鼠(與B16細(xì)胞是組織相容的)，并用2-乙基-3-甲氧基-苯 甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5-二甲基-苯甲酰)-酰胼的R對映體和外消旋 物的不同劑量對小鼠處理三天。對照組包括了接受未轉(zhuǎn)導(dǎo)的B16細(xì)胞和較高劑量配體的小 鼠，以及接受轉(zhuǎn)導(dǎo)的B16細(xì)胞而不含配體的另_組。為了評估由配體直接誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表 達(dá)，在皮下注射之后72小時從每組中一半的小鼠中采集腫瘤和血清。制備腫瘤提取物和血 清并使用ELISA分析其中IL-12。將余下的小鼠用來測試當(dāng)配體施用中斷另外72小時的時候的轉(zhuǎn)基因的關(guān)閉。結(jié) 果表明用配體的外消旋物和R對映體處理的小鼠中腫瘤轉(zhuǎn)基因IL-12的表達(dá)以及血清水平 的不同。配體施用的中斷以相似的方式導(dǎo)致了所有組中轉(zhuǎn)基因的關(guān)閉。材料和方法用Ad. -RTS-mIL-12(M0I = 100)在體外將B16細(xì)胞感染。48h后， 通過皮下將5X105個(B16，右側(cè))細(xì)胞注射進(jìn)C57 BL/6小鼠(10只小鼠/組)。通過在 50°C將lOmg/mL混合物加熱5分鐘來使R對映體和外消旋物配體溶解于Labrasol。根據(jù) 目檢，兩種配體都溶解于Labrasol。在3天中每天通過口服管飼法提供如下劑量(Omg/kg ； 3mg/kg ； 10mg/kg ；30mg/kg和50mg/kg)的激活配體。另外的對照包括只接受配體的含有 B16的小鼠(在3天中50mg/kg/天且未處理的含腫瘤小鼠)。收集了五只小鼠/組用來 分離腫瘤損傷和外周血。在總共ImL的磷酸鹽緩沖鹽水中將組織攪勻。將溶解物/血清 冷凍保存在_80°C。在沒有進(jìn)一步施用配體的情況下允許替代的5只小鼠/組進(jìn)行另外的 72h。收集了這些后來的5只小鼠/組用來分離腫瘤損傷和外周血。如上述將組織攪勻， 并冷凍保存，且將溶解物/血清冷凍保存在-80°C。在37°C水浴中將標(biāo)本解凍并用特殊的 ELISA(BD-Pharmingen)分析其中的mIL_12p70以及mIFN- γ，即對于將CTL運輸進(jìn)腫瘤是 重要的推論的依賴于IL-12的細(xì)胞因子。結(jié)果腫瘤中轉(zhuǎn)基因IL-12的表達(dá)以及血清水平對于所述配體二者都遵循了劑 量依賴型(圖24和25)。然而，在用2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁基-丁 基)-N' -(3，5- 二甲基-苯甲酰)_酰胼的R對映體處理的小鼠中的表達(dá)水平高出2. 5至 3倍。在腫瘤提取物和血清中觀察到該類型。對照組未顯示任何IL-12的表達(dá)，在所述對照 組中，小鼠接受未轉(zhuǎn)導(dǎo)的Β16細(xì)胞加上最大劑量的配體，或轉(zhuǎn)導(dǎo)的Β16細(xì)胞而沒有配體的施 用。在配體處理被中斷3天的組中，表達(dá)水平下降到所有處理組中相似的比例，這表明，所 述配體被清除且當(dāng)所述配體被撤出時RTS激活是可逆的。當(dāng)在腫瘤和血清中測定IFN-Y 水平時，R對映體組清晰地顯示增強的表達(dá)。實施例73包括2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(I-叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲 基-苯甲酰)_酰胼的藥物組合物表1顯示包括2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _ (1_叔-丁基-丁基)-N' -(3， 5-二甲基-苯甲酰)-酰胼、PL90G、維生素E TPGS、BHT和Miglyol 812Ν的藥物組合物。PL90G是來自大豆的高度純化的磷脂酰膽堿。PL90G的制造商是PHOSPHOLIPID GmbH,即 Lipoid的子公司。維生素E TPGS是一種GRAS(公認(rèn)為安全的)化合物且符合當(dāng)前的國家 配方集(NF)專著的所有要求。Miglyol 812N含有分餾的植物C8和Cltl脂肪酸的甘油三酯。 用來產(chǎn)生Miglyol 812N的脂肪酸被歸類為GRAS且符合當(dāng)前NF和EP專著關(guān)于中鏈甘油三 酯的要求。BHT [MeC6H2 (CMe3)2OH]是有機化合物，其為廣泛用作抗氧化劑食品添加劑的親脂 的(脂溶性的)酚。該制劑被配制成硬明膠膠囊。實施例74疾病的動物模型中的效力在(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(I-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5-二甲 基-苯甲酰)_酰胼存在的情況下，被分別編碼RTS和mIL-12或hIL_12的腺病毒載體所轉(zhuǎn) 導(dǎo)的鼠或人樹突細(xì)胞(DC)在體外以劑量依賴的方式表達(dá)細(xì)胞因子。在不存在(R)-2-乙 基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-酰胼的 情況下，IL-12表達(dá)是在基礎(chǔ)水平。在B16黑素瘤小鼠模型上進(jìn)行了(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _(1_叔-丁 基-丁基) -N' -(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-酰胼的各種施用途徑和劑量對瘤內(nèi)運送的DC 的抗腫瘤效力的對比分析，其中所述DC被編碼鼠白細(xì)胞介素-12p70 (DC-SP1 (IL-12p70)) 的腺病毒載體所轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)果表明，(DC-SPl(IL-12p70))療法與通過腹膜內(nèi)(i. p.)注射、 口服管飼或飲食混合施用的(R)-2_乙基-3-甲氧基-苯甲酸N ‘ -(1-叔-丁基-丁 基)-N' _(3，5-二甲基-苯甲酰)-酰胼相結(jié)合證明了抗腫瘤效力。最佳的抗腫瘤作用發(fā) 生在與(DC-SPl(IL-12p70))療法一起施用的彡30mg/kg的(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲 酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-酰胼劑量。在鼠B16黑素瘤模型中，載有被注射進(jìn)腫瘤的鼠IL-12基因的被轉(zhuǎn)導(dǎo)的AdDC介 導(dǎo)了完全的腫瘤退行和延長的動物存活，其依賴于在AdDC注射后48個小時內(nèi)于全身施用 的(R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5_ 二甲基-苯甲 酰)“酰胼，在所述鼠B16黑素瘤模型中小鼠在治療開始之前被腫瘤接種(對C57/BL6小鼠 皮下注射B16細(xì)胞以形成腫瘤)。該藥物依賴作用與如下相關(guān)在腫瘤和DLN中的轉(zhuǎn)基因 表達(dá)；在腫瘤微環(huán)境中延長的Ad-DC存活；AdDC在DLN中的遷移和存留；以及抗B16⑶8+T 細(xì)胞的誘導(dǎo)。在上面的鼠B16黑素瘤模型中，由IO7AdDC的注射所組成的瘤內(nèi)療法與用 (R)-2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' -(3，5_ 二甲基-苯甲 酰)_酰胼進(jìn)行的13天處理一起顯示了腫瘤特異性的保護性免疫。當(dāng)不含腫瘤的動物被再 次攻擊，在第50天(最初的腫瘤接種之后)，這些動物對B16黑素瘤而非MC38結(jié)腸癌的進(jìn) 展是抗拒的。實施例75包含RTS和hIL-12的不能夠復(fù)制的重組腺病毒圖23是Ad-RTS-hIL-12的圖示，在所述Ad-RTS-hIL-12中El和E3區(qū)域缺失且 RTS-IL12組分替換El區(qū)域(圖23不是按比例描繪的)。用于圖23的術(shù)語具有如下的含 義RTS-IL-12 在RheoSwitch 治療系統(tǒng)控制之下的人仏-12
Preg 受到活性藥物調(diào)控的、驅(qū)使IL12表達(dá)的啟動子hIL-12 被IRES序列分開的人IL-12的p40和p35亞基的編碼序列polyA 多腺苷酸化信號Pubc 泛素C啟動子VP16-RXR :VP16轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和嵌合RXR之間的融合IRES 內(nèi)核糖體進(jìn)入位點Gal4-EcR :Gal4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和蛻皮素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的融合蛋白Ad 含有El和E3基因缺失的腺病毒_5主鏈如Anderson 等，Gene Therapy, 4 =1034-1038(2000)所述制備重組的腺病毒載體 Ad-RTS-hIL-12。按如下方式生產(chǎn)Ad-RTS-hIL-12載體。由EMCV-IRES(內(nèi)核糖體進(jìn)入位 點)分開的受體融合蛋白VP16-RXR和Gal4-EcR的編碼序列被插入人泛素C啟動子(組成 性啟動子)控制下的腺病毒穿梭載體。接下來，被置于合成的可誘導(dǎo)啟動子的控制之下的、 由IRES分開的hIL-12的p40和p35亞基的編碼序列被插入泛素C啟動子和受體序列的上 游。穿梭載體含有從左末端至mul6的腺病毒血清型5序列，從所述ml6開始El序列缺失 并被RTS和IL-12序列(RTS-hIL-12)所替換。通過在HT-1080細(xì)胞中的瞬時轉(zhuǎn)染來測試 載有RTS-hIL-12的穿梭載體的配體依賴性IL-12表達(dá)。然后通過向HEK 293細(xì)胞中共轉(zhuǎn) 染將穿梭載體與E3缺失的腺病毒主鏈重組以獲得重組的腺病毒Ad-RTS-hIL-12。在cGMP 裝置中生產(chǎn)臨床級的腺病毒載體。實施例76含有hIL-12轉(zhuǎn)基因和Rheoswitch 治療系統(tǒng)的腺病毒對自體未成熟樹突細(xì)胞的 轉(zhuǎn)導(dǎo)通過白細(xì)胞分離法收集PBMC 受試者在Hillman門診病人CTRC進(jìn)行了 90-120分 鐘的白細(xì)胞分離。白細(xì)胞分離過程包括從一條臂的靜脈抽血；使血液通過離心機(細(xì)胞分 離器)，其中它的成分被分離且一種或多種成分被除去；以及使殘留成分返回到受試者相 同或另一條臂的靜脈。當(dāng)血通過細(xì)胞分離器裝置被加工時，任何一次抽取出受試者不超過 15%的全血容積。在細(xì)胞分離器中，血被分離成血漿、血小板、白細(xì)胞和紅血細(xì)胞。白血細(xì) 胞(WBC)被除去且所有其他成分被返回到受試者的循環(huán)中。每次都試圖使用該過程的兩條 外周IV線。如果那不可能，中線可能是必要的。醫(yī)師必須清理受試者以進(jìn)行白細(xì)胞分離， 并且在所述過程之前常規(guī)地篩選生命體征(包括血壓)。加工采集之后，用手將Ieukapack輸送到CPL，并且馬上在ELUTRA 上用離心淘洗來加工。這是一個被批準(zhǔn)為臨床使用的封閉系統(tǒng)。單核細(xì)胞級分被回收，且在細(xì)胞的回 收和生活力被建立之后，它們被轉(zhuǎn)移到Aastrom藥筒中在IL-4和GM-CSF的存在下培養(yǎng)6 天。所有加工和沖洗過程是在無菌條件下進(jìn)行的。最初的鋪板在臺盼藍(lán)染料的存在下對從單個Ieukapack回收的單核細(xì)胞進(jìn)行計 數(shù)以確定活細(xì)胞的數(shù)量。使用流式細(xì)胞術(shù)來評估單核細(xì)胞的純度。在不含血漿和抗生素但 每 SOP-CPL-0166 含有 1，000IU/mL 的 IL-4 和 1，000IU/mL 的 GM-CSF 的 CellGenix 培養(yǎng)基 中將單核細(xì)胞再懸浮，并置于Aastrom藥筒中。盒接種必需最小為50ml的加樣體積和最少 的細(xì)胞數(shù)量。藍(lán)泰=Aastrom藥筒被置于R印Iicell系統(tǒng)的孵化器中，所述系統(tǒng)為用于不成熟DC生成的完全封閉的、cGMP相容的自動化培養(yǎng)設(shè)備。不成熟DC的采集在第6天，從孵化器中取出Aastrom藥筒并采集不成熟的DC。通過用l，500rpm離心將細(xì)胞回收，用CellGenix培養(yǎng)基沖洗，在臺盼藍(lán)染料的存在下計數(shù) 并檢查形態(tài)和表型特征。牛活力這是通過在臺盼藍(lán)的存在下講行血細(xì)胞計數(shù)器的細(xì)胞計數(shù)來確定的。通 常，> 95%的被采集細(xì)胞是有生活力的，也就是將臺盼藍(lán)染料排除在外。如果生活力小于 70%，不成熟的DC將被丟棄。確定表型通過在血細(xì)胞計數(shù)器上用顯微鏡觀察來對培養(yǎng)中所生成的細(xì)胞進(jìn)行計 數(shù)，并使用臺盼藍(lán)染料獲得初步的分類計數(shù)(DC對比淋巴細(xì)胞)。通過流式細(xì)胞術(shù)，門控DC 和淋巴細(xì)胞，并使用不成熟DC的高的前向和側(cè)向散射特性作為鑒定它們的標(biāo)準(zhǔn)來對分類 計數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。不成熟的DC通常含有> 80%的帶有樹突細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞且具有DC表型。IL-12D70效價測定已經(jīng)確認(rèn)，成熟的DC(mDC)具有自發(fā)或者用CD40L進(jìn)行激 活時產(chǎn)生IL-12p70的能力，其中加入或不加入先天的免疫信號(例如，LPS)。標(biāo)準(zhǔn)化的 IL-12p70生產(chǎn)測定最近被建立且適用于在各種條件下產(chǎn)生的小樣品或大批DC疫苗。當(dāng) 前的效價測定由兩個不同步驟組成，第一個步驟包括應(yīng)答DC與用人CD40配體基因作為刺 激劑穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的J588淋巴瘤細(xì)胞的共同孵化。第二個步驟包括測試來自這些共同培養(yǎng) 物的上清液中由DC分泌的IL-12p70的水平，其中所述DC是由Luminex系統(tǒng)中的J558/ ⑶40L+/-LPS刺激的。該效價測定具有18. 5% (η = 30)的測定間CV和大的動態(tài)范圍，其 促進(jìn)對各種DC產(chǎn)物的評估，所述DC產(chǎn)物的特點是具有非常不同的IL-12p70生成水平。使 用產(chǎn)自13個正常供給者的單核細(xì)胞的DC產(chǎn)物所建立的測定的正常范圍是8-999pg/mL，其 平均值為270pg/mL。實施例77不成熟的DC的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)采集不成熟的DC，計數(shù)并測試其生活力。在最佳的感染復(fù)數(shù)(最佳的Μ0Ι，在500 和1000之間，待定)用腺病毒載體將大約6-7X107個DC轉(zhuǎn)導(dǎo)了最佳的病毒吸附時間(在 2h和5h之間，待定)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，將細(xì)胞反復(fù)沖洗以除去任何未吸附的病毒顆粒。將等份試 樣進(jìn)行除菌、內(nèi)毒素、支原體、DC表型和IL-12轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)測定。5X IO7個細(xì)胞的靶劑量保 持在4°C的鹽水中直至放行測試完成。將已經(jīng)通過了所有放行測試的被轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC(AdDC)送至臨床以進(jìn)行下述的患者施用。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的AdDC對IL-12轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)的體外測試花了最少兩天才得到可用的結(jié) 果，并且因此，IL-12的產(chǎn)生作為對(R) -2-乙基-3-甲氧基-苯甲酸N' _ (1_叔-丁基-丁 基)-N' -(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-酰胼的響應(yīng)，將不是AdDC瘤內(nèi)注射的放行標(biāo)準(zhǔn)。然 而，基于對來自三個健康志愿者的AdDC的初步研究，所誘導(dǎo)的IL-12表達(dá)作為對(R)-2-乙 基-3-甲氧基-苯甲酸N' -(1-叔-丁基-丁基)-N' _(3，5_ 二甲基-苯甲酰)-酰胼 的響應(yīng)，已經(jīng)在24小時內(nèi)每百萬個細(xì)胞80至300ng的IL-12的靶范圍內(nèi)實現(xiàn)了(在3個 AdDC制劑中的2個中觀測到80ng/百萬個細(xì)胞/24h的表達(dá)水平)。因此，將體外IL-12誘 導(dǎo)結(jié)果用于治療結(jié)果的分析。像這樣，在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和沖洗之后將被轉(zhuǎn)導(dǎo)的AdDC用于注射。 任何剩余的未被轉(zhuǎn)導(dǎo)的和被轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC被冷凍保存以應(yīng)將來的分析所需。
AdDC對患者的施用0. 9%鹽溶液中的AdDC的單獨瘤內(nèi)注射在每次注射中150微 升的體積內(nèi)含有大約5X IO7個細(xì)胞(或大約90%的DC是從實驗受試者產(chǎn)生的)。應(yīng)該以 最大可行的AdDC劑量對受試者給藥，但每次注射不超過5 X IO7個細(xì)胞。實施例78對人施用被腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體樹突細(xì)胞，其被人工改造以在攜帶III和IV期黑素 瘤的受試者中RheoSwitch 治療系統(tǒng)的控制下表達(dá)hIL-12組群1將由12個受試者組成而組群2將由28個受試者組成，其所有將在(R)_3， 5-二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁基)-N' -(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰胼的第 一次給藥之后大約24小時接受單獨瘤內(nèi)注射的轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體AdDC。組群1受試者將被分成4 個組(A、B、C、D)每組3個受試者以接受增加劑量的(R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁 基-丁基)-N' -(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰胼。組群2，受試者將接受最大耐受口 服劑量的(R) _3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔-丁基-丁基)-N' -(2-乙基-3-甲氧基-苯 甲酰)_酰胼(如組群1中所確定的)。在注射AdDC之后馬上將受試者用(R)-3，5-二甲 基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁基)-N' -(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰胼的每日給藥 處理另外的13天。在招募受試者接受更高劑量的(R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁 基-丁基)-N' - (2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰胼之前，在注射了 AdDC之后至多一 個 月，將其對組群1中每組的所有受試者的安全性、耐受性和轉(zhuǎn)基因功能進(jìn)行評估。在組群1 完成了住院病人治療階段之后30天且在被轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體樹突細(xì)胞的瘤內(nèi)注射之后至少6至 8周，如果受試者期望再治療且受試者符合再治療的標(biāo)準(zhǔn)，可以施用另外的DC注射，使用14 個連續(xù)日劑量的(R) _3，5- 二甲基-苯甲酸N- (1-叔-丁基-丁基)-N' - (2-乙基-3-甲 氧基-苯甲酰)-酰胼。(R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁基)-N' -(2-乙 基-3-甲氧基-苯甲酰)_ 酰胼的劑量(0. 01mg/kg、0. lmg/kgU. Omg/kg 或 10. Omg/kg)將 為組群1的最大耐受劑量。將通過體檢(包括ECOG性能狀況)、生命體征、血清化學(xué)、尿分析、血液學(xué)、有害事 件、抗體以及對腺病毒載體和RheoSwitch 治療系統(tǒng)成分的細(xì)胞免疫應(yīng)答來對患者進(jìn)行評 估。還將評價口服的(R)_3，5-二甲基-苯甲酸N-(l-叔-丁基-丁基)-N' -(2-乙基-3-甲 氧基-苯甲酰)-酰胼及其主要代謝物的單獨劑量和穩(wěn)態(tài)的藥物代謝動力學(xué)/ADME，通過測 量靶腫瘤和/或引流淋巴結(jié)的活組織檢查中的hIL-12水平來對轉(zhuǎn)基因功能進(jìn)行的分析，通 過測量靶腫瘤、引流淋巴結(jié)和外周循環(huán)的活組織檢查中的細(xì)胞免疫應(yīng)答(T細(xì)胞)來對免疫 作用進(jìn)行的評估，以及血清細(xì)胞因子概況。需要理解的是，上述的實施方案和例證不是想在任何方面對本發(fā)明的范圍加以限 制，而且本文所呈現(xiàn)的權(quán)利要求旨在涵蓋所有實施方案和例證，不管其是否被明確地呈現(xiàn) 在本文中。
權(quán)利要求
一種式I的化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式式I其中A是烷氧基、芳烷氧基或芳氧基；B是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；并且R1和R2獨立是可選地取代的烷基、芳烷基、羥烷基、鹵代烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基。FPA00001010316700011.tif
2.一種對映體富集的式II的化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無 定形形式 其中A是烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、芳烷基、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基； B是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；并且R1和R2獨立是可選地取代的烷基、芳烷基、羥烷基、商代烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可 選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代 的雜芳基；條件是R1不等同于R2;其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型主要為S。
3.—種對映體富集的式III的化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或 無定形形式 其中A是烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、芳烷基、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基； B是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；并且R1和R2獨立是可選地取代的烷基、芳烷基、羥烷基、商代烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可 選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代 的雜芳基；條件是R1不等同于R2;其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型主要為R。
4.如權(quán)利要求2或3所述的化合物，其具有至少50%的對映體過量。
5.如權(quán)利要求4所述的化合物，其具有至少75%的對映體過量。
6.如權(quán)利要求5所述的化合物，其具有至少85%的對映體過量。
7.如權(quán)利要求6所述的化合物，其具有至少95%的對映體過量。
8.如權(quán)利要求2或3所述的化合物，其中A是-OC (CH3) 3、-OCH2PK可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；B是可選地取代的芳基；R1是可選地取代的(C1-C6)烷基、羥基(C1-C4)烷基或可選地取代的(C2-C6)烯基；并且R2是可選地取代的(C1-C6)烷基、芳基(C1-C4)烷基、可選地取代的(C3-C7)環(huán)烷基或可 選地取代的芳基。
9.如權(quán)利要求8所述的化合物，其中A是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基。
10.如權(quán)利要求9所述的化合物，其中A是 R3a、R3b、R3。、R3d和R3e獨立選自氫、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、可選地取代的烷基、鹵 代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可 選地取代的芳基、可選地取代的雜芳基、可選地取代的雜環(huán)、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷 硫基、羧酰氨基、亞磺酰氨基、-COR。、-S02Rd、-N (Re) CORf、-N (Re) SO2Rg 或-N (Re) C = N (Rh)-氨 基；或者R3InR3b與它們所連接的碳原子一起形成五、六或七元的融合環(huán)烷基或雜環(huán)的環(huán)；或者R3b和R3c;與它們所連接的碳原子一起形成五、六或七元的融合環(huán)烷基或雜環(huán)的環(huán)；R4a、R4b、R4。、R5\ R5\ R6a、R6b和R6。獨立選自氫、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、可選地取 代的烷基、商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取 代的炔基、可選地取代的芳基、可選地取代的雜芳基、可選地取代的雜環(huán)、烷氧基、芳氧基、 芳烷氧基、烷硫基、羧酰氨基、亞磺酰氨基、-CORc, -SO2Rd, -N(Re) CORf, -N(Re) SO2Rg或-N(Re) C = N(Rh)-氨基;X是0或S ；B是 R3f> R3g> R3\ R3i和R3j獨立選自氫、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、可選地取代的烷基、鹵 代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可 選地取代的芳基、可選地取代的雜芳基、可選地取代的雜環(huán)、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷 硫基、羧酰氨基、亞磺酰氨基、-COR。、-S02Rd、-N (Re) CORf、-N (Re) SO2Rg 或-N (Re) C = N (Rh)-氨 基；或者R3f*R3g與它們所連接的碳原子一起形成五、六或七元的融合環(huán)烷基或雜環(huán)的環(huán)；或者 R3g和R3h與它們所連接的碳原子一起形成五、六或七元的融合環(huán)烷基或雜環(huán)的環(huán)； 其中Rc是氫、羥基、商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可 選地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基、可選地取代 的雜芳基、烷氧基、芳氧基或芳烷氧基；Rd是商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取 代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳 基；R6是氫、商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地 取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；Rf是氫、商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地 取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基、可選地取代的雜 芳基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基或氨基；Rg是商代烷基、羥烷基、芳烷基、可選地取代的烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選地取代 的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基、可選地取代的雜芳基 或氨基；并且Rh是氫、烷基、芳基、氰基或硝基。
11.如權(quán)利要求10所述的化合物，其中R1是(C1-C6)烷基、羥基(C1-C4)烷基或(C2-C4)烯基；并且 R2是可選地取代的(C1-C6)烷基；其中在含有R1和R2的不對稱碳原子處的絕對構(gòu)型主要為R。
12.如權(quán)利要求11所述的化合物，其中 A是R3a、R3b、R3。、R3d和R3e獨立選自氫、鹵素、(C「C4)烷基或(C「C4)烷氧基；并且 R3f、R3g、R3h、R3i和R3j獨立選自氫、鹵素、(C「C4)烷基或(C「C4)烷氧基。
13.如權(quán)利要求8所述的化合物，其具有至少50%的對映體過量。
14.如權(quán)利要求13所述的化合物，其具有至少75%的對映體過量。
15.如權(quán)利要求14所述的化合物，其具有至少85%的對映體過量。
16.如權(quán)利要求15所述的化合物，其具有至少95%的對映體過量。
17.如權(quán)利要求3所述的化合物，其選自 肼；(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(卜叔一丁基一丁基)一N’ 一(3，5一二氟一苯甲酰)一酰肼；(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(卜叔一丁基一丁基)一N’ 一(3，5一二甲氧基一4一甲基一苯甲酰)一酰肼；(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(卜叔一丁基一丁基)一N’ 一(4一甲基一苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯一5一羰基)一酰肼；(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(卜叔[1，4]二氧雜環(huán)己烯一6一羰基)一酰肼；(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(1一叔[1，4]二氧雜環(huán)己烯一6一羰基)一酰肼；(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(卜叔(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(卜叔(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(卜叔(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(卜叔基)一酰肼；(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(1一叔一丁基一丁基)一N’ 一(5一甲基一2，3一二氫一苯并丁基一丁基)一N’ 一(5一乙基一2，3一二氫一苯并丁基一丁基丁基一丁基丁基一丁基丁基一丁基N’一(萘一卜羰基)一酰肼；N’一(萘一2一羰基)一酰肼；N’一(噻吩一2一羰基)一酰肼；一N’一(2，5一二甲基一呋喃一3一羰丁基一丁基)一N’一(2一氯代一吡啶一3一羰基)一酰肼；(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(卜叔一丁基一丁基)一N’一(6一氯代一吡啶一3一羰基)一酰肼；(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(卜叔一丁基一丁基)一N’ 一(3一甲氧基一2一甲基一苯甲酰)一酰肼；(R)一3，5一二甲氧基一4一甲基一苯甲酸N一(1一叔一丁基一丁基)一N’ 一(3一甲氧基一2一甲基一苯甲酰)一酰肼；或(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N’ 一(4一乙基一苯甲酰)一N一(卜苯乙基一丁一3一烯基)一酰肼。
18.具有至少95％對映體過量的(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(1一叔一丁基一丁基)一N’ 一(2一乙基一3一甲氧基一苯甲酰)一酰肼或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式。
19.具有至少99％對映體過量的(R)一3，5一二甲基一苯甲酸N一(卜叔一丁基一丁基)一N’ 一(2一乙基一3一甲氧基一苯甲酰)一酰肼或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、結(jié)晶形式或無定形形式。
20.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求卜17中任一項所述的化合物。
21.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求工8或工9所述的化合物。
22.一種制備式IV的化合物的過程 其中A是芳烷基、可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基； B是可選地取代的芳基或可選地取代的雜芳基；R2是獨立地可選地取代的烷基、芳烷基、羥烷基、商代烷基、可選地取代的環(huán)烷基、可選 地取代的烯基、可選地取代的炔基、可選地取代的雜環(huán)、可選地取代的芳基或可選地取代的 雜芳基；條件是R2不等同于-CRfCHI^CRnR12 ；并且R8、R9、R10, R11和R12獨立選自氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)、芳基或雜芳基； 其中R2所連接的不對稱碳原子以R或S異構(gòu)體的形式對映體富集； 所述過程包括a)將式V的化合物 d8 與式VI的化合物進(jìn)行反應(yīng) r2hc = n-nh-co2r7 式 VI 其中X和Y獨立為0或NR，其中R是烷基或芳基； ca和Cb獨立為S構(gòu)型的不對稱碳原子或R構(gòu)型的不對稱碳原子； R14和R15獨立為烷基或芳基； R13是鹵素、氫、烷基、烷氧基或0S02CF3 ； R7是烷基、芳烷基或芳基；并且 R2、R8、R9、R10、R11和R12具有上述相同的含義； 以形成式VII的化合物； b)將式VII的化合物還原以形成式VIII的化合物； c)將式VIII的化合物與式B-CO-LG的化合物進(jìn)行反應(yīng)以形成式IX的化合物，其中LG是離去基團； d)將式IX的化合物的r7co2-基團移除以形成式X的化合物；并且 e)將式X的化合物與式A-CO-LG的化合物進(jìn)行反應(yīng)以形成式IV的化合物，其中LG是離去基團。
23.如權(quán)利要求22所述的過程，其中R8、R9、R10、R11和R12是氫。
24.如權(quán)利要求23所述的過程，其中 X是NR并且R是甲基；Y是0 ；R14是甲基;R15是苯基；并且Ca和Cb中每個都是R構(gòu)型的。
25.如權(quán)利要求24所述的過程，其中 X是NR并且R是甲基；Y是0 ；R14是甲基;R15是苯基；并且ca和cb中每個都是S構(gòu)型的。
26.一種制備權(quán)利要求2或3的化合物的過程，其包括a)將式XI的?；?與式XII的酮進(jìn)行反應(yīng) 以形成式XIII的化合物； 其中R1不等同于R2;b)將式XIII的化合物在手性催化劑的存在下還原以形成式S-XIV或R-XIV的化合物；并且 c)將式S-XIV或R-XIV的化合物與式B-C0-LG的化合物進(jìn)行反應(yīng)以形成權(quán)利要求2或 3的化合物，其中LG是離去基團。
27.如權(quán)利要求25或26所述的過程，其中B是3，5-二甲苯基。
28.如權(quán)利要求25或26所述的過程，其中A是2-乙基-3-甲氧苯基。
29.如權(quán)利要求25或26所述的過程，其中R2是叔-丁基。
30.一種調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中感興趣的基因的表達(dá)的方法，其中所述宿主細(xì)胞包括第一重 組基因表達(dá)盒，其包括編碼第一多肽的第一多核苷酸，其包括i)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和ii)組H核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及第二重組基因表達(dá)盒，其包括；i)能夠結(jié)合至所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的應(yīng)答元件；ii)啟動子；和iii)所述感興趣的基因；所述方法包括將所述宿主細(xì)胞與權(quán)利要求1-3中任一項的化合物相接觸；其中感興趣 的基因的表達(dá)受到調(diào)節(jié)。
31.一種調(diào)控轉(zhuǎn)基因受試者中內(nèi)源性或異源性基因表達(dá)的方法，其包括將配體與所述 受試者的細(xì)胞中的蛻皮素受體復(fù)合物相接觸，其中所述細(xì)胞在與所述配體結(jié)合時還包含所 述蛻皮素受體復(fù)合物的DNA結(jié)合序列，而且其中蛻皮素受體復(fù)合物-配體-DNA結(jié)合序列復(fù) 合物的形成誘導(dǎo)基因表達(dá)，而且其中所述配體是權(quán)利要求1-3中任一項的化合物；其中轉(zhuǎn) 基因受試者的內(nèi)源性或異源性基因表達(dá)受到調(diào)控。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述蛻皮素受體復(fù)合物是嵌合的蛻皮素受體復(fù)合 物而且所述DNA結(jié)合序列還包括啟動子。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述受試者是植物。
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述受試者是動物。
35.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述受試者是人。
37.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述細(xì)胞是自體細(xì)胞。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述自體細(xì)胞含有所述蛻皮素受體復(fù)合物和所述 蛻皮素復(fù)合物的DNA結(jié)合序列，并且所述細(xì)胞被植入所述受試者以使其成為轉(zhuǎn)基因的。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述植入是通過注射。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述注射是進(jìn)入腫瘤。
41.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述配體作為藥物組合物的一部分被施用于所述 轉(zhuǎn)基因受試者，所述藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的載體。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述藥物組合物被口服施用。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括親脂的溶劑。
44.一種調(diào)控轉(zhuǎn)基因受試者中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因受試者包括能夠調(diào) 節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的重組蛻皮素受體復(fù)合物；所述方法包括向所述受試者施用有效量的權(quán)利要 求1-3中任一項的化合物。
45.一種調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，其包括步驟(a)將基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)引入宿主細(xì)胞，所述基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括(i)第一重組基因表達(dá)盒，其能夠被表達(dá)在宿主細(xì)胞中，所述第一重組基因表達(dá)盒包括 編碼第一雜交多肽的多核苷酸序列，其包括(a)識別與其表達(dá)將被調(diào)節(jié)的基因締合的應(yīng)答元件的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)蛻皮素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(ii)第二重組基因表達(dá)盒，其能夠被表達(dá)在宿主細(xì)胞中，所述第二重組基因表達(dá)盒包 括編碼第二雜交多肽的多核苷酸序列，其包括(a)反式激活結(jié)構(gòu)域；和(b)嵌合的類視黃醇X受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及(iii)第三重組基因表達(dá)盒，其能夠被表達(dá)在宿主細(xì)胞中，所述第三重組基因表達(dá)盒包 括多核苷酸序列，其包括(a)被所述第一雜交多肽的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域所識別的應(yīng)答元件；(b)被所述第二雜交多肽的反式激活結(jié)構(gòu)域所激活的啟動子；和(c)其表達(dá)將受到調(diào)節(jié)的基因；以及(b)將權(quán)利要求1-3中任一項的化合物引入宿主細(xì)胞；其中宿主細(xì)胞的基因表達(dá)受到調(diào)節(jié)。
46.一種產(chǎn)生多肽的方法，其包括步驟(a)選擇一種宿主細(xì)胞，其對暴露于權(quán)利要求1-3中任一項的化合物基本上不敏感；(b)將下述引入宿主細(xì)胞(i)DNA構(gòu)建體，其包括(a)編碼所述多肽的外源性基因；和(b)應(yīng)答元件；其中所述外源性基因是在所述應(yīng)答元件的控制下；以及(ii)蛻皮素受體復(fù)合物，其包括(a)結(jié)合至所述應(yīng)答元件的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(b)所述化合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(c)反式激活結(jié)構(gòu)域；以及(c)將所述細(xì)胞暴露于所述化合物；其中多肽被產(chǎn)生。
47.如權(quán)利要求31-44中任一項所述的方法，其中所述蛻皮素受體復(fù)合物或蛻皮素受 體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括突變。
全文摘要
本發(fā)明提供與基于蛻皮素受體的可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)一起使用的二酰基肼配體和手性二?；屡潴w。因此，本發(fā)明用于例如下述應(yīng)用基因療法、蛋白和抗體的大規(guī)模生產(chǎn)、基于細(xì)胞的篩選測定、功能性基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝物組學(xué)和轉(zhuǎn)基因生物體中性狀的調(diào)控，其中對基因表達(dá)水平的控制是被期望的。本發(fā)明的一個優(yōu)勢是它提供調(diào)控基因表達(dá)并修改表達(dá)水平以適應(yīng)使用者的要求的方法。
文檔編號C07C241/00GK101848887SQ200880100879
公開日2010年9月29日 申請日期2008年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月29日
發(fā)明者李兵, 羅伯特·E·霍曼 申請人:英特拉克森公司