專利名稱：一種抗腫瘤的單克隆抗體的序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言本發(fā)明提供一種單克隆抗體，該抗體能特異識別肝癌；肺癌；結(jié)腸癌；胰腺癌；乳腺癌；卵巢癌等惡性腫瘤等惡性腫瘤組織，并能抑制肝癌；肺癌；結(jié)腸癌；胰腺癌；乳腺癌；卵巢癌等惡性腫瘤細(xì)胞和組織的生長；以及所述抗體在制備用于治療結(jié)腸腫瘤的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含所述單克隆抗體作為活性成分。
背景技術(shù)：
抗體作為疾病預(yù)防、診斷和治療的制劑已有上百年的發(fā)展歷史。隨著基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展和完善，抗體藥物已從鼠單克隆抗體發(fā)展到人鼠嵌合抗體、人源化抗體及人源抗體。截至2007年美國FDA已批準(zhǔn)36個抗體藥物。此外還有超過120種抗體藥物處于臨床研究，超過500種抗體藥物處于臨床前研究。這些抗體主要應(yīng)用于自身免疫性疾病、感染性疾病以及腫瘤的治療。 在腫瘤治療中，由于抗體的精確靶向性和高效低毒的特點(diǎn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)放化療途徑特異性差、副反應(yīng)強(qiáng)的缺點(diǎn)，已成為腫瘤生物治療最重要的應(yīng)用領(lǐng)域。1997年Rituximab成為首個經(jīng)FDA認(rèn)證的用于腫瘤治療的抗體藥物，在此之后，腫瘤抗體藥物的研究發(fā)展迅速，截至2007年，已有9種腫瘤抗體藥物上市。預(yù)計2011年，腫瘤抗體藥物的銷售額將達(dá)到140億美元，占所有抗體藥物銷售額的47. 1%。 原發(fā)性肝癌(HCC)是常見的惡性腫瘤之一，死亡率高，嚴(yán)重危害人類的健康和生命。目前，就世界范圍而言，其發(fā)病率呈上升趨勢，作為一種高死亡率的疾病，肝癌的病因、發(fā)生、演化、診斷、治療都越來越引起人們的關(guān)注。其中，肝癌的早期診斷對于患者的轉(zhuǎn)歸以及預(yù)后都具有十分重要的意義。目前，肝癌診斷的標(biāo)志物首推AFP，用于肝癌的血清學(xué)診斷已沿用多年，最近又用于肝癌血液轉(zhuǎn)移的基因診斷。但此方法在特異性和敏感性上仍存在問題。就特異性而言，對于HCC患者，干擾診斷準(zhǔn)確性的因素主要是因?yàn)椴糠职橛懈斡不蚵愿窝椎幕颊哐锌蓹z出AFP蛋白以及mRNA。由于目前尚缺特異性強(qiáng)的檢測和/或治療肝癌的有效方法，因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)特異性抗人肝癌單克隆抗體，以及檢測和治療肝癌的有效方法。 結(jié)直腸癌指大腸內(nèi)膜上皮細(xì)胞的惡性改變，包括異常分化，異常增殖以及細(xì)胞代謝和分泌異常等。其發(fā)生原因、診斷治療和預(yù)防一直是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究重點(diǎn)。結(jié)直腸癌的死亡率居腫瘤死亡的第二位。美國每年診斷為結(jié)直腸癌的病例超過13萬，死亡大于5萬，死亡率約40 % 。結(jié)直腸癌在我國是第三位常見消化道腫瘤，位于食管癌和胃癌之后，但每年死于結(jié)直腸癌的病例估計超過4萬人，約占腫瘤5.8%。我國結(jié)直腸癌發(fā)病一個明顯特點(diǎn)是平均發(fā)病年齡45歲左右，比歐美等國提前12-18年，其中直腸癌較多，約占60%。近二十年，隨著我國經(jīng)濟(jì)增長和人們生活水平的逐步提高，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病人數(shù)逐年增加，發(fā)病更趨于年輕化。 胰腺癌為惡性程度極高的消化道腫瘤，其死亡率占我國惡性腫瘤的第六位，在美國位于第四位。近年來，胰腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，五年生存率仍很低，在診斷后的中位生存期為4 6個月(Coppola, 2000)。胰腺癌因其獨(dú)特的解剖位置，癥狀隱匿，早期診斷非常困難，目前尚無有效的早期診斷方法。目前，用于臨床的腫瘤抗原檢測，均為非特異性的腫瘤相關(guān)抗原，只能通過選擇適當(dāng)?shù)哪[瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測，來提高檢測的靈敏性和有效性。 本發(fā)明的特色之一是運(yùn)用人結(jié)腸癌組織的分離成份直接在非免疫鼠源ScFv噬菌體表面呈現(xiàn)表達(dá)庫中篩選。 本發(fā)明的另一個特色是，雖然是用的結(jié)腸癌組織作為篩選抗原。但所篩到的抗體能特異結(jié)合多種腫瘤組織，包括肝癌腫瘤；肺癌腫瘤；結(jié)腸癌腫瘤；胰腺癌腫瘤；乳腺癌腫瘤；卵巢癌等。動物實(shí)驗(yàn)證明，該抗體能有效抑制腫瘤的生長。 本發(fā)明提供的單克隆抗體命名為CR1G，經(jīng)過檢測單克隆抗體對結(jié)腸癌細(xì)胞的選擇性結(jié)合，而與正常結(jié)腸細(xì)胞不結(jié)合特性，顯示出CR1G單克隆抗體在腫瘤的治療和診斷方面的高效廣譜應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種單克隆抗體，所述單克隆抗體可與癌癥抗原特異性結(jié)
合，從而可以用于制備治療癌癥的藥物或試劑盒。
具體地，本發(fā)明提供以下 1. —種單克隆抗體，其特征在于，它的重鏈可變區(qū)由124個氨基酸殘基組成，序列如下 Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val LysIleSer Cys Lys Thr Ser Phe Trp lie Glu Trp Val Lys lie His Trp Val Lys Gin SerHisGly Lys Ser Leu Glu Trp lie Gly Thr Glu lie Leu Pro Gly Ser Asp Asn ThrAsn TyrAsn Glu Lys Phe Lys Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala ThrLeu Thr Val AspLys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr SerGlu Asp Ser Ala lieTyr Tyr Cys Lys Asn Arg Asn Tyr Tyr Gly Asn Tyr Val ValTrp Gly Gin Gly Thr LeuVal Thr Val SerAla 其輕鏈可變區(qū)由113個氨基酸殘基組成，序列如下 Glu Leu Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly GinArgAla Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Met His Trp Asn GlnGlnLys Pro Gly Gin Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala SerAsn LeuGlu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr AspPhe Thr Leu Asnlie His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys GlnHiS lie Arg Glu LeuThr Arg Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys ArgAla 2. —種單克隆抗體，其特征在于，它的序列與權(quán)利要求書1所述的單克隆抗體的氨基酸序列有80 %或80%以上的序列同源性。 3. —種基因工程抗體，其特征在于，它所含有的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列是與以上l和2所述的可變區(qū)的序列是一致的；該基因工程抗體可以是人一鼠嵌合抗體(chimericantibodies);或者是人源化抗體(humanized antibody, HAb)或改形抗體(Reshapedantibody, RAb);或者是抗體的功能性片段Fab ;或者是單鏈抗體(single chain FVfragment, SCFv);或者是重鏈可變區(qū)和完整輕鏈的融合的抗體功能性片段VH_L :或者是重鏈和輕鏈的一個或多個CDR的排列、串聯(lián)或組合而成的抗體功能性片段；或者是上述抗體或抗體功能片段和其他各種蛋白或多肽進(jìn)行連接、拼接、融合而得到的類抗體的功能性的融合蛋白。 4.以上1-3所述的單克隆抗體或基因工程抗體，其特征在于，它們與多種腫瘤組織具有特異的結(jié)合能力，這些腫瘤組織包括肝癌腫瘤；肺癌；結(jié)腸癌腫瘤；胰腺癌腫瘤；乳腺癌腫瘤；卵巢癌等惡性腫瘤。 5.以上l-3所述的單克隆抗體或基因工程抗體，其特征在于，它們具有特異的廣譜的抗多種腫瘤的作用，它可用于治療多種腫瘤，這些腫瘤包括肝癌腫瘤；肺癌腫瘤；結(jié)腸癌腫瘤；胰腺癌腫瘤；乳腺癌腫瘤；卵巢癌等惡性腫瘤。 6. —種藥物組合物，其特征在于，它含有以上l-4所述的單克隆抗體或基因工程抗體；以及藥學(xué)上可接收的載體或緩沖液或添加劑或賦形劑。 7.以上6所述的藥物組合物，其特征在于，它可用于治療各種腫瘤，這些腫瘤包括肝癌腫瘤；肺癌腫瘤；結(jié)腸癌腫瘤；胰腺癌腫瘤；乳腺癌腫瘤；卵巢癌等惡性腫瘤。
8. —種腫瘤的診斷方法及試劑，其特征在于，它含有如以上1-5所述的單克隆抗體或基因工程抗體；并用于診斷肝癌腫瘤；肺癌腫瘤；結(jié)腸癌腫瘤；胰腺癌腫瘤；乳腺癌腫瘤；卵巢癌等惡性腫瘤。 本發(fā)明是運(yùn)用人結(jié)腸癌組織的分離成份直接在非免疫鼠源ScFv噬菌體表面呈現(xiàn)表達(dá)庫中篩選。經(jīng)過檢測單克隆抗體對結(jié)腸癌細(xì)胞的選擇性結(jié)合，而與正常結(jié)腸細(xì)胞不結(jié)合特性，顯示出該抗體在腫瘤的治療和診斷方面的高效廣譜應(yīng)用價值。雖然是用的結(jié)腸癌組織作為篩選抗原。但所篩到的抗體能特異結(jié)合多種腫瘤組織，包括肝癌腫瘤；肺癌腫瘤；結(jié)腸癌腫瘤；胰腺癌腫瘤；乳腺癌腫瘤；卵巢癌等。動物實(shí)驗(yàn)證明，該抗體能有效抑制腫瘤的生長。因此可以用于治療肝癌；肺癌；結(jié)腸癌；胰腺癌；乳腺癌；卵巢癌等惡性腫瘤。
附圖表說明

圖1. CR1G抗體的可變區(qū)擴(kuò)增鑒定。 圖2.與恒定區(qū)連接后表達(dá)的全長CR1G抗體的SDS-PAGE檢測。 圖3.抗體治療荷人結(jié)腸癌腫瘤裸鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 表1 :免疫組化鑒定抗體CR1G與人體正常組織和腫瘤組織的反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
為了更全面地理解和應(yīng)用本發(fā)明，下文將參考實(shí)施例和附圖詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。 實(shí)施例一、結(jié)腸癌細(xì)朐應(yīng)抗原ffl提物的制備 取新鮮胃癌手術(shù)切除標(biāo)本病理診斷為低分化胃癌，用高濃度裂化鉀的方法，提取
細(xì)胞膜抗原，制備膜抗原粗提物。用4t:滅菌生理鹽水洗凈血跡，冰浴下仔細(xì)剪切并研磨，
邊研磨邊加入3M KCl溶液，研磨至勻漿，過篩網(wǎng)，置4t:過夜攪拌過夜3小時，4t: 10000rpm離心20min，吸取上清液，加等體積飽和硫酸銨沉淀，4。C 10000rpm離心20min。將沉淀用
510mMPBS完全溶解后，對10mMPBS透析，透析畢，分裝后-8(TC保存?zhèn)溆谩?
實(shí)施例二、 Panning篩詵 噬菌體表面呈現(xiàn)文庫是專利申請者之前構(gòu)建的一個非免疫鼠源ScFv表達(dá)庫。本 專利就是從該文庫中篩選能特意識別結(jié)腸癌的抗體。用結(jié)腸癌細(xì)胞膜抗原包被塑料培養(yǎng)皿 后，將重組噬菌體上清傾至其上，37t:培養(yǎng)2h，先后用PBS和PBST各洗板20次。然后將培 養(yǎng)至對數(shù)生長期的TGI傾至免疫吸附后的培養(yǎng)皿上，37t:培養(yǎng)1小時。如此"吸附一洗脫一 繁殖"的過程即為Panning篩選，再以M13K07超感染，就可生成富集克隆的噬菌體表面呈現(xiàn) 文庫。以后按上述方法進(jìn)行7輪篩選。 輔你1H、斜翻B翁鍾德白勺涯齢藩隨^
1.制備單克隆重組噬菌體 Panning篩選后，將TGI茵液按原液；1 : 10 ;1 : 100 ;1 : 10004個稀釋度稀釋， 鋪于SOBAG瓊脂板上，3(TC倒置培養(yǎng)過夜。挑選90個單菌落，分別接種于100ul的2X YTAG 中，30。C培養(yǎng)過夜，取20ul培養(yǎng)物，加入200ul含5X lOpfu/ml M13K07的2XYTAG中，37°C 振蕩培養(yǎng)2h，離心，用2XYTAK 200ul重懸沉淀，3(TC培養(yǎng)過夜.離心后的上清即為單個重 組噬菌體。 2. ELISA檢測抗原結(jié)合活性(Douillard， et al. ， Enzyme-linkedl匪nosorbent Assay for Screening monoclonal antibody production usingenzyme—labeled second antibody,Meth. Enzymol， . 92 :168-74，1983) 設(shè)1個陰性對照孔，1個陽性對照孔，90個待測孔。lOOu 10. 5% BSA包被陰性對 照孑L lOOu 1羊抗M13噬菌體抗體包被陽性對照孔，lOOul/孔(10ug/ml)結(jié)腸癌細(xì)胞膜抗 原包被待測孔。1% BSA 37t:封閉1小時。對照孔加M13噬菌體，待測孔加50ul待測上清 與50ul封閉液的混合物，37t:孵育lh。用PBST洗板3次，各孔加lOOul工作濃度的HRP/ 羊抗M13噬茵體抗體，37。C反應(yīng)1小時。PBST洗板4次，加新鮮配制的H202-ABTS，在410nm 測每孔0D值。 實(shí)施例四、陽性克隆的ScFv基因序列測定，真核表達(dá)和純化 選擇篩選獲得的陽性克隆分別送公司進(jìn)行DNA測序。設(shè)計引物將陽性克隆的輕重 鏈可變區(qū)與鼠源IgG的對應(yīng)的輕重鏈恒定區(qū)連接后插入到真核表達(dá)；然后分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì) 胞篩選穩(wěn)定表達(dá)株。 取lml的ProteinG-s印harose FF介質(zhì)到柱子中，經(jīng)PBS平衡后，將收集的細(xì)胞 培養(yǎng)上清經(jīng)ProteinG-s印harose FF柱子純化，然后用PBS清洗50柱體積后，用100mM Glycine(pH3)將目的蛋白洗脫到1M Tris，pH8. 5平衡液中。在分別透析到PBS緩沖液中。 10% SDS-PAGE鑒定純化得到的抗體純品。
實(shí)施例五、抗體的活性鑒定 設(shè)1個陰性對照孔，1個陽性對照孔，4個待測孔。100ul 10. 5% BSA包被陰性對 照孑L 100ul羊抗鼠抗體包被陽性對照孔，100u1/孔(10ug/ml)結(jié)腸癌細(xì)胞膜抗原包被待測 孔。1% BSA 37t:封閉1小時。對照孔加IgG，待測孔加50ul待測抗體與50ul封閉液的混 合物，37t:孵育lh。用PBST洗板3次，各孔加100ul工作濃度的HRP/羊抗鼠抗體，37t:反 應(yīng)1小時。PBST洗板4次，加新鮮配制的H202-ABTS，在410nm測每孔0D值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只 有一株抗體與抗原有很強(qiáng)的反應(yīng)。命名為CR1G。
實(shí)施例六、單克降杭體CR1G的腫瘤結(jié)合免疫會目化實(shí)驗(yàn) 利用冷凍組織切片和免疫組化方法(Immunology Methods Manual, Edited byIvan Lefkovits， 1997)鑒定抗體CR1G與人體正常組織和腫瘤組織的反應(yīng)，結(jié)果表明抗體CR1G與許多腫瘤組織高特異反應(yīng)，而與正常組織的沒反應(yīng)或極低反應(yīng)。表1反應(yīng)了抗體CR1G對多種腫瘤組織和正常組織的免疫組化染色情況。在免疫組化切片上，清楚可見抗體只與腫瘤組織反應(yīng)，而不與正常組織反應(yīng)(表1)。
實(shí)施例七、單克降杭體CR1G抑制腫瘤牛長實(shí)驗(yàn) 傳代荷人結(jié)腸癌腫瘤鼠皮下腫瘤生長至直徑約2-3cm時，無菌條件下取出瘤塊，將瘤塊切割成1mm3小瘤塊，參照《動物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)指南》(科學(xué)出版社，R. I.弗雷謝尼，2000年，第四版)方法制備原代結(jié)腸癌移植瘤細(xì)胞HCT-8。用套管針接種到裸鼠右側(cè)腋部皮下。待接種的腫瘤體積生長到100-300mm左右時，依瘤體積隨機(jī)分組，開始給藥。l周兩次按10mg/kg給藥，觀察3周；統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CR1G抗體對結(jié)腸癌的
生長具有顯著抑制作用。序列表SEQ.ID. NO :1ValGinLeuLeuGluSerGlyProGluLeuValLysPro Gly Ala
151015SerValLyslieSerCysLysThrSerPheTrplieGlu Trp Val
202530LyslieHisTrpValLysGinSerHisGlyLysSerLeu Glu Trp
354045lieGlyThrGlulieLeuProGlySerAspAsnThrAsnTyr Asn
505560GluLysPheLysSerTyrAsnGinLysPheLysGlyLysAla Thr657075LeuThrValAspLysSerSerSerThrAlaTyrMetGluLeu Arg808590SerLeuThrSerGluAspSerAlalieTyrTyrCysLysAsn Arg95100105AsnTyrTyrGlyAsnTyrValValTrpGlyGinGlyThrLeu Val110115120ThrValSerAlaSEQ.I D.NO ::2GluLeuValMetThrGinSerProAlaSerLeuAlaValSer Leu151015GlyGinArgAlaThrlieSerCysArgAlaSerSerValSer Tyr202530MetTyrMetHisTrpAsnGinGinLysProGlyGinProPro Arg354045
Leu Leu lie Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gin His lie Arg Glu Leu Thr Arg Ser Phe Gly Gly Gly 95 100 105 Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Ala
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權(quán)利要求
一種單克隆抗體，其特征在于，它的重鏈可變區(qū)由124個氨基酸殘基組成，序列如序列表SEQ ID NO1所顯示；其輕鏈可變區(qū)由113個氨基酸殘基組成，序列如序列表SEQ ID NO2所顯示。
2. —種單克隆抗體，其特征在于，它的序列與權(quán)利要求書l所述的單克隆抗體的氨基 酸序列有80%或80%以上的序列同源性。
3. —種基因工程抗體，其特征在于，它所含有的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列是與權(quán)利 要求書1和2所述的可變區(qū)的序列是一致的；該基因工程抗體可以是人 一 鼠嵌合抗 體(chimeric antibodies);或者是人源化抗體(humanizedantibody， HAb)或改形抗體 (Reshaped antibody, RAb);或者是抗體的功能性片段Fab ;或者是單鏈抗體(single chain FV fragment, SCFv);或者是重鏈可變區(qū)和完整輕鏈的融合的抗體功能性片段VH_L ;或者 是重鏈和輕鏈的一個或多個CDR的排列、串聯(lián)或組合而成的抗體功能性片段；或者是上述 抗體或抗體功能片段和其他各種蛋白或多肽進(jìn)行連接、拼接、融合而得到的類抗體的功能 性的融合蛋白。
4. 如權(quán)利要求書1-2所述的單克隆抗體或權(quán)利要求書3-4所述的基因工程抗體，其特 征在于，它們與多種腫瘤組織具有特異的結(jié)合能力，這些腫瘤組織包括肝癌腫瘤；肺癌； 結(jié)腸癌腫瘤；胰腺癌腫瘤；乳腺癌腫瘤；卵巢癌等惡性腫瘤。
5. 如權(quán)利要求書l-2所述的單克隆抗體或權(quán)利要求書3-4所述的基因工程抗體，其 特征在于，它們具有特異的廣譜的抗多種腫瘤的作用，它可用于治療多種腫瘤，這些腫瘤包 括肝癌腫瘤；肺癌腫瘤；結(jié)腸癌腫瘤；胰腺癌腫瘤；乳腺癌腫瘤；卵巢癌等惡性腫瘤
6. —種藥物組合物，其特征在于，它含有如權(quán)利要求書l-4所述的單克隆抗體或基因 工程抗體；以及藥學(xué)上可接收的載體或緩沖液或添加劑或賦形劑。
7. 如權(quán)利要求書7所述的藥物組合物，其特征在于，它可用于治療各種腫瘤，這些腫瘤 包括肝癌腫瘤；肺癌腫瘤；結(jié)腸癌腫瘤；胰腺癌腫瘤；乳腺癌腫瘤；卵巢癌等惡性腫瘤。
8. —種腫瘤的診斷方法及試劑，其特征在于，它含有如權(quán)利要求書l-5所述的單克隆 抗體或基因工程抗體；并用于診斷肝癌腫瘤；肺癌腫瘤；結(jié)腸癌腫瘤；胰腺癌腫瘤；乳腺癌 腫瘤；卵巢癌等惡性腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能特異性結(jié)合多種腫瘤的單克隆抗體及其治療多種腫瘤的功用。該單克隆抗體穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)，特別適用于肝癌；肺癌；結(jié)腸癌；胰腺癌；乳腺癌；卵巢癌等腫瘤的治療。本發(fā)明提供了該抗體的可變區(qū)序列。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物和一種腫瘤的診斷方法。
文檔編號C07K16/30GK101724072SQ20081017190
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月27日
發(fā)明者谷為岳 申請人:谷為岳