專利名稱：提取卵黃免疫球蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分離工程與技術(shù)領(lǐng)域，具體是應(yīng)用超濾技術(shù)從雞卵黃中分離提取 卵黃免疫球蛋白的方法，產(chǎn)品純度可達95%以上。
技術(shù)背景免疫球蛋白是機體受抗原(如病原體)刺激后產(chǎn)生的，其主要作用是與抗原起免 疫反應(yīng)，生成抗原-抗體復(fù)合物，從而阻斷病原體對機體的危害，使病原體失去致病 作用。免疫球蛋白主要存在于動物血槳中，具有不同的種類，其中，IgG是血清免疫球 蛋白的主要成分，占總免疫球蛋白的75%，是初級免疫應(yīng)答中最持久、最重要的抗體。 它在抗感染中起到主力軍的作用，能夠促進單核巨噬細胞的吞噬作用(調(diào)理作用)， 中和細菌毒素的毒性(中和毒素)，并能夠與病毒抗原結(jié)合使病毒失去感染宿主細胞 的能力(中和病毒)。卵黃免疫球蛋白(IgY)是指雞卵黃中存在的主要免疫球蛋白，是母雞在接受免 疫后的7 10天，即卵黃成熟期，由母雞血液中的免疫球蛋白IgG選擇性的轉(zhuǎn)移到卵 黃中而形成的。所以，IgY相當于哺乳動物的IgG。同時，與IgG相比，卵黃免疫球 蛋白(IgY)具有諸多優(yōu)點(1) IgY不與血清中的類風濕因子結(jié)合，不激活哺乳動 物補體系統(tǒng)，也不與Fc受體結(jié)合，有利于提高免疫診斷檢測的特異性和敏感性；(2) IgY的性質(zhì)穩(wěn)定，活性保持良好，在75。C以下，IgY活性基本不受影響，在pH3 12 之間，活性保持不變；(3)無需采血，符合國際動物保護條例；(4)價廉易得，一 枚雞蛋中含有的IgY的量相當于從200mL血液中提取的量；(5)由于種系發(fā)生距離 相差很大，禽類IgY與哺乳動物免疫球蛋白之間不會發(fā)生交叉血清學(xué)反應(yīng)。因此，近 年來，許多學(xué)者及生物制品公司都在著手于IgY的分離、純化研究。目前，從卵黃中分離IgY的主要方法有鹽析法、聚乙二醇沉淀法、氯仿抽提法、 中鏈脂肪酸法、表面活性劑法等。然而這些技術(shù)均存在一定的局限性，其中，鹽析法 和聚乙二醇沉淀法容易引起蛋白質(zhì)的失活和變性；氯仿抽提法、中鏈脂肪酸法、表面活性劑法的處理周期較長，存在殘留問題，不利于IgY的藥用。膜分離法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動力， 對雙組份或多組分的混合物進行分離、提純和富集的方法。膜分離技術(shù)是20世紀50 年代發(fā)展起來的一項高效分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相比，具有分離效率高、能耗 低、可連續(xù)操作、易于放大、無污染等優(yōu)點。超濾膜是指膜孔徑在1 100nm之間，具有不對稱結(jié)構(gòu)的復(fù)合膜。由于其孔徑尺 寸與生物大分子的尺寸較為接近，故可用于生物大分子如蛋白質(zhì)等的分離與純化。超 濾分離是分子級的，即可截留溶液中的大分子溶質(zhì)，同時使小分子溶質(zhì)透過；有時也 可以通過調(diào)節(jié)溶液中微環(huán)境，使預(yù)分離的蛋白質(zhì)分子和膜表面帶有不同性質(zhì)的電荷， 再通過蛋白質(zhì)分子之間、蛋白質(zhì)與膜表面之間的靜電作用，達到分離的目的。目前， 在生物加工領(lǐng)域，超濾技術(shù)常用于蛋白質(zhì)的純化與濃縮，在工業(yè)上巳有較多應(yīng)用，但 由于自然體系中蛋白質(zhì)種類復(fù)雜，且存在較多的同工酶，使用超濾法直接分離得到高 純度的功能蛋白質(zhì)的實例極少，且這方面的研究仍處于實驗室規(guī)模。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種環(huán)境友好，操作簡單，易于放大的卵黃免疫球蛋白(IgY) 超濾提取方法，其產(chǎn)品純度可達95%以上。 本發(fā)明采取的技術(shù)路線是1. 將雞蛋的蛋殼、蛋清和蛋黃膜除去，取蛋黃液；2. 使用去離子水或濃度小于500mM、 pH4.0~10.0的磷酸鹽緩沖溶液將卵黃液稀 釋至6 15倍，最佳為7 10倍，充分攪拌20 30分鐘后，于-2(TC冷凍8 12小時， 再解凍，在4'C下離心，棄去沉淀，取上清液；3. 利用截留分子量為30 100kDa的市售超濾膜對上述步驟得到的上清液進行第 一次超濾分離，分離條件為4°C、 pH4.0 10.0，最佳為pH6.0 8.0，取截留液；4. 利用截留分子量為70 150kDa的市售超濾膜對步驟3得到的截留液進行第二 次超濾分離，分離條件為4"C、 pH4.0 10.0，最佳為pH6.0 8.0，截留液即為高純 度的卵黃免疫球蛋白(IgY)溶液；5. 將所得到的卵黃免疫球蛋白(IgY)溶液凍干10 12小時，即獲卵黃免疫球蛋 白(IgY)干粉。本發(fā)明直接應(yīng)用超濾分離技術(shù)從雞卵黃中提取獲得純品卵黃免疫球蛋白(IgY)，由于超濾膜是指膜孔徑在1 100nm，具有不對稱結(jié)構(gòu)的復(fù)合膜。其孔徑尺寸與生物 大分子的尺寸較為接近，故可用于生物大分子如蛋白質(zhì)等的分離與純化。超濾分離是 分子級的，即可截留溶液中的大分子溶質(zhì)，而使小分子溶質(zhì)透過，有時也可以通過調(diào) 節(jié)溶液中微環(huán)境，使預(yù)分離的蛋白質(zhì)分子和膜表面帶有不同性質(zhì)的電荷，再通過蛋白 質(zhì)分子之間、蛋白質(zhì)與膜表面之間的靜電作用，達到分離的目的。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例進一步描述本發(fā)明。實施例l，從黃皮雞蛋中提取卵黃免疫球蛋白(IgY)的方法，步驟1. 取四個新鮮的黃皮雞蛋，用自來水洗凈蛋殼，再用紙擦干，去除蛋殼和蛋清后，用注射器針頭輕輕將蛋黃膜刺破，收集蛋黃液，約50mL;2. 使用去離子水將上述步驟獲得的50mL卵黃液稀釋至350mL，充分攪拌20分 鐘后，置于-20'C冷凍8小時，再解凍，將解凍液在4'C下、用3000rpm離心，棄去沉 淀，取上清液，約300mL;3. 利用截留分子量為30kDa的市售聚砜膜對步驟2得到的上清液進行第一次超濾 分離，分離條件為4'C、 pH6.0，取截留液約160mL;4. 利用截留分子量為70kDa的市售再生纖維素膜對步驟3得到的截留液進行第二 次超濾分離，分離條件為4'C、 pH6.0，截留液即為卵黃免疫球蛋白(IgY)溶液， 純度95.8%;5. 將得到的IgY溶液置于-6(TC冷阱中凍干8小時，獲得IgY干粉約550mg。 實施例2，從白皮雞蛋中提取卵黃免疫球蛋白(IgY)的方法，步驟1. 取三個新鮮的白皮雞蛋，用自來水洗凈蛋殼，再用紙擦干，去除蛋殼和蛋清后， 用注射器針頭輕輕將蛋黃膜刺破，收集蛋黃液，約38mL;2. 使用pH4.0、 lOOmM的磷酸鹽緩沖溶液將上述步驟獲得的卵黃液稀釋至 380mL,充分攪拌30分鐘后，置于-2(TC冷凍12小時，再解凍，將解凍液在4'C下、 用6000rpm離心，棄去沉淀，取上清液，約320mL;3. 利用截留分子量為100kDa的市售聚醚砜膜對步驟2得到的上清液進行第一次 超濾分離，分離條件為4。C、 pH8.0，取截留液約170mL;4. 利用截留分子量為150kDa的市售聚醚砜膜對步驟3得到的截留液進行第二次 超濾分離，分離條件為4。C、 pH8.0，截留液即為卵黃免疫球蛋白(IgY)溶液，純度95.1%;5.將得到的IgY溶液置于-60'C冷阱中凍干12小時，獲得IgY干粉約418mg。 實施例3，從雞蛋中提取卵黃免疫球蛋白(IgY)的方法，步驟1. 取五個新鮮的雞蛋，用自來水洗凈蛋殼，再用紙擦干，去除蛋殼和蛋清后，用 注射器針頭輕輕將蛋黃膜刺破，收集蛋黃液，約60mL;2. 使用pH10.0、 400mM的磷酸鹽緩沖溶液將上述步驟獲得的卵黃液稀釋至 420mL,充分攪拌25分鐘后，置于-2(TC冷凍10小時，再解凍，將解凍液在4'C下用 5000rpm離心，棄去沉淀，取上清液，約360mL;3. 利用截留分子量為70kDa的市售聚醚砜膜對步驟2得到的上清液進行第一次超 濾分離，分離條件為4'C、 pH7.0，取截留液約200mL;4. 利用截留分子量為100kDa的市售聚醚砜膜對步驟3得到的截留液進行第二次 超濾分離，分離條件為4t、 pH7.0。截留液即為卵黃免疫球蛋白(IgY)溶液，純度 96.2%;5. 將得到的IgY溶液置于-60'C冷阱中凍干11小時，獲得IgY干粉約660mg。 本發(fā)明工藝僅涉及稀釋、凍融、離心和超濾四個簡單步驟，相對目前的工業(yè)、實驗室提取工藝，具有操作簡單、分離濃縮同步進行、活性損失小、回收率高的特點， 且未使用有機溶劑，可有效避免傳統(tǒng)提取方法中有機溶劑引起的蛋白變性，杜絕了有 機溶劑殘留造成的產(chǎn)品安全隱患，能耗低、環(huán)境污染小、分離效率高、產(chǎn)品純度可調(diào) 控、控制因素單一，便于工業(yè)放大。
權(quán)利要求
1.一種提取卵黃免疫球蛋白的方法，其特征是按如下步驟進行①將雞蛋的蛋殼、蛋清和蛋黃膜除去，取蛋黃液；②使用去離子水或濃度小于500mM、pH4.0～10.0的磷酸鹽緩沖溶液將卵黃液稀釋至6～15倍，充分攪拌20～30分鐘后，于-20℃冷凍8～12小時，再解凍，在4℃下離心，棄去沉淀，取上清液；③利用截留分子量為30～100kDa的市售超濾膜對上述步驟得到的上清液進行第一次超濾分離，分離條件為4℃、pH4.0～10.0，取截留液；④利用截留分子量為70～150kDa的市售超濾膜對步驟3得到的截留液進行第二次超濾分離，分離條件為4℃、pH4.0～10.0，截留液即為高純度的卵黃免疫球蛋白溶液；⑤將所得到的卵黃免疫球蛋白溶液凍干10～12小時，即獲卵黃免疫球蛋白干粉。
2. 依據(jù)權(quán)利要求1所述的提取卵黃免疫球蛋白的方法，其特征是使用去離 子水或磷酸鹽緩沖溶液將卵黃液稀釋至7~10倍。
3. 依據(jù)權(quán)利要求1所述的提取卵黃免疫球蛋白的方法，其特征是所說的第 一次超濾分離和第二次超濾分離的pH值為6.0 8.0。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提取卵黃免疫球蛋白的方法，屬于生物分離工程技術(shù)領(lǐng)域，主要是應(yīng)用超濾分離技術(shù)，經(jīng)過稀釋、凍融、離心和超濾四個簡單步驟，即可從卵黃中提取高純度的卵黃免疫球蛋白，在提取過程中，未使用有機溶劑，有效避免了有機溶劑引起的蛋白變性，杜絕了溶劑殘留造成的產(chǎn)品安全隱患。
文檔編號C07K16/02GK101402673SQ20081015969
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者劉建國, 娟 楊, 王晶冰 申請人:中國石油大學(xué)(華東)