專利名稱：：動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織總rna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種富含蛋白多糖的RNA提取方法，特別涉及一種動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA提取方法。
背景技術(shù)：
：各種關(guān)節(jié)疾病和脊柱關(guān)節(jié)的疾病的治療一直是醫(yī)學(xué)界面臨的難題，國內(nèi)外正在開始嘗試的基因治療有望獲得該領(lǐng)域治療的突破。從基因水平對軟骨組織進(jìn)行研究意義重大，而從軟骨組織中提取高質(zhì)量的RM是各種基因表達(dá)研究的關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)多，細(xì)胞少，細(xì)胞成分只占20%,軟骨基質(zhì)的主要成分是II型膠原，由于II型膠原中富含羥賴氨酸，并且羥賴氨酸的羥基幾乎全部和糖結(jié)合，因而糖化率高，*量約為10%,因此軟骨基質(zhì)主要成分是蛋白多糖。關(guān)節(jié)軟骨屬于細(xì)胞含量少的組織，組織RNA含量低，并且多糖的理化性質(zhì)與核糖核酸RNA非常相似，在沉淀RNA時(shí)，蛋白多糖和RNA—塊無區(qū)分的沉淀下來，產(chǎn)生富含多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液，這樣的RNA由于蛋白多糖的干擾無法進(jìn)行后續(xù)的各種分子生物學(xué)試驗(yàn)。在去除多糖的同時(shí)RNA也被帶走，造成RNA的大量丟失，因jtb^軟骨中提取高質(zhì)、足量的RNA非常困難。由于軟骨組織的特殊結(jié)構(gòu)，目前尚無有效的方法來解決這一難題，基于酸酚/胍鹽原理的總RM抽提方法是動(dòng)物組織、細(xì)胞核酸分離的主要方法，如一步法、trizol法等，但基于酸酚/胍鹽原理的方法不適于富含多糖的動(dòng)物組織，因?yàn)樵摲N方法不能區(qū)分理化性質(zhì)相似的多聚核糖和蛋白多糖，在進(jìn)行RNA沉淀的時(shí)候，蛋白多糖和RNA—起沉淀下來，而去除蛋白多糖的步驟也是RNA損失的步驟。plantRNAout法是基于CTAB裂解法的總RNA提取方法，其優(yōu)點(diǎn)是操作筒便、易行，含CTAB的裂解液是用于富含多糖和多酚的植物總RNA抽提的首選細(xì)胞裂解方法，可以有效的分離植物組織中的多糖和RNA，但通過多次實(shí)驗(yàn)證明，該方法用于抽提新西蘭白兔關(guān)節(jié)軟骨組織的總RNA時(shí)引入DAN污染。因此，我們試驗(yàn)證明用一步法、trizol法、animaRNAout法、植物RNA提取法等成熟的RNA提取方法都不能獲得高質(zhì)量總RNA，采用經(jīng)典的去除多糖的方法如高鹽、低醇沉淀法都不能去除大量的多糖。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA提取方法，它適用于含蛋白多糖的RNA難提組織的小量總RNA提取，采用本發(fā)明方法提取的動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA的收率高，并且質(zhì)量好、純度高、完整性好，可以滿足分子生物學(xué)研究應(yīng)用。本發(fā)明方法有以下步驟(1)取動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織，立即投入液氮中研磨至粉末狀，每50重量份的關(guān)節(jié)軟骨組織加入l體積變性液，0.007體積的(3-巰基乙醇，勻漿至無明顯組織塊；(2)將勾漿液置于冰水浴上，加酸性水飽和酚，搖勻，加醋酸鈉，氯仿、異戊醇混合液，置于冰水浴上15min;(3)4。C下，離心，取上清液，加入氯仿、異戊醇混合液，離心取上清加入異丙醇，-20。C下沉淀30min,離心30分鐘，得到凝膠狀RNA和蛋白多糖混合沉淀，加入無RNA酶水，溶解沉淀得到膠狀溶液；(4)取膠狀溶液用plantRNAout試劑盒的R駄纟是取步驟得到總RNA沉淀，取沉淀，乙醇洗滌二次后用無RNA酶水溶解沉淀即得關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA溶液。本發(fā)明所述的重量與體積的計(jì)量單位，采用克與毫升或千克與升或微克與微升等。通常細(xì)胞中約75%的RNA酶存在于胞液中，當(dāng)細(xì)胞裂解后，RNA酶會(huì)釋i文出來，在沒有有效的抑制措施下，RNA酶會(huì)迅速降解RNA。一步法所用的裂解液主要成分為異^5危氰酸胍，它是一種強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變性劑，能有效的抑制RNase活性，使RNase變性，裂解液中加入的P-巰基乙醇也是RNase的強(qiáng)烈抑制劑，聯(lián)合應(yīng)用可有效防止RNA降解。由于動(dòng)物RNA提取方法基于酸性環(huán)境，而植物RNA提取方法是基于堿性環(huán)境。本發(fā)明將動(dòng)物RNA提取方法和植物RM提取方法兩種方法結(jié)合，并根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨組織總MA的理化性質(zhì)做進(jìn)一步的改進(jìn)，使得提取的動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA的收率高，完整性好。原因是一步法提取的總RNA沉淀非常徹底，RNA損失少，得率是最高的，而且一步法所用的試濟(jì)對RNA酶的抑制也是可靠的。用一步法分離DNA和RNA，在移取上清的步驟盡量多取，雖然在已取上清夜中引入了少量的中間層蛋白質(zhì)，但在后續(xù)的氯仿抽提過程可以去除。加入異丙醇后要在-20°沉淀30分鐘，沉淀離心時(shí)間也延長到3O分鐘，都能有效的增加RNA的得率，雖然這兩個(gè)步驟增加了蛋白多糖的污染，但在后續(xù)的plantRNAout提取過程中可以有效的去除多糖。本發(fā)明適用于小量關(guān)節(jié)軟骨組織或其他部位軟骨組織的RNA提取，并且有方法簡單、經(jīng)濟(jì)、適用的優(yōu)點(diǎn)適合于分子生物學(xué)研究應(yīng)用。采用本發(fā)明方法提取的動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA的收得率、質(zhì)量和純度均高于動(dòng)物RNA提取方法和植物RNA提:取方法。圖1為一步法提取RNA電泳圖2為Trizol法^是取RNA電泳圖3為animalRNAout法提取RNA電泳圖4為plantRNAout法提取總RNA電泳圖5為酶消化實(shí)驗(yàn)電泳圖6為本發(fā)明方法提取總RNA電泳圖7為用所提取總RNA經(jīng)過不同循環(huán)數(shù)LD-PCR合成的雙鏈cDAN電泳圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例采用的試劑和設(shè)備本發(fā)明所述試劑均采用市售的分析純試劑。1.無RNase的DEPC水雙蒸水中加0.1%的DEPC搖勻后置室溫內(nèi)過夜，再進(jìn)行高壓滅菌處理即可使用。2.變性液秤異硫氰酸胍23.6320g,檸檬酸三鈉G.3676g,十二烷基肌氨酸鈉G.25g,加入25ml高壓滅菌三蒸水，定容到50ml。3.pH為4.0的2mol/L醋酸鈉50ml:無水醋酸鈉8.28g，三蒸水30ml溶解，水醋酸調(diào)pH值到4.0加水定容至50ml。4.氯仿、異戊醇混合液氯仿異戊醇為49:1;吸耳又氯仿49ml,加入異戊醇lml混勻；5.75%乙醇100ml:耳又新開弁瓦乙醇75m1,加入進(jìn)行了無RNase處理的弁瓦子，加入無RNase水25ml;6.plantRNAout試劑盒由綿羊天擇基因公司生產(chǎn)的同名產(chǎn)品；7.PH為4.5的酸性水飽和酚由上海生工公司生產(chǎn)的產(chǎn)品；8.AJ-30I型低溫超速離心機(jī)(Beckman，USA);9.Chemilmager5500型凝月交成i"象儀(AlphaInnotech,USA);10.DU-800型核酸/蛋白檢測儀(Beckman,USA);實(shí)施例1關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA的提取組織勻漿取新西蘭白兔關(guān)節(jié)軟骨組織后立即投入液氮中，按每50mg新西蘭白兔關(guān)節(jié)軟骨組織加入變性液lml中裂解，7^1p-巰基乙醇，勻漿。將勻漿液分裝入無酶無菌(無RNase)1.5ml離心管，每管0.5ml，置于冰水浴上，每管加500^1酸性水飽和酚，用力搖勻，每管加50|_U2mol/LpH為4.O的醋酸鈉溶液，lOOpl氯仿異戊醇(49:1)混合液，用力搖勻，置于冰水浴上15min。于4。C，12,000g，離心10min，取上清加入無RNasel.5ml離心管，每管加500(xl氯仿異戊醇(49:1)混合液，用力搖勻。于4。C,12，000g,離心5min,取上清加入無RNase1.5ml離心管。每管加等體積異丙醇，用力搖勻，置于-20。C沉淀30min。于4。C，14，000g，離心30min，小心將上清吸出并拋棄。加入20fxl用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的無RM酶水無RNA酶水，振蕩溶解沉淀，得到沉淀溶解后的膠狀溶液，將膠狀溶液合并于一個(gè)無RNasel.5ml離心管。加入lml溶液A,充分混勻后加入0.3ml溶液B和0.2ml氯仿，充分混勻。于4。C,15,000g，離心5min，小心將上清吸出轉(zhuǎn)移到另一個(gè)1.5ml離心管。加入0.3ml溶液C和0.2ml氯仿，充分混勻。于4°C，15,000g,離心3min，小心將上清吸出轉(zhuǎn)移到另一個(gè)1.5ml離心管。加入1/2體積溶液D，充分混勻。于4°C，15,OOOg,離心30min。小心吸棄上清液，加入lml75%乙醇，輕搖離心管洗沉淀30秒。于4'C，15,OOOg,離心3min。小心吸棄上清液，加入lml75%乙醇，輕搖離心管洗沉淀30秒。于4°C，15，OOOg,離心3min。簡單離心，將殘存乙醇聚于管低，小心用移液器吸棄。室溫干燥5分鐘，加入適量無RNA酶水溶解沉淀。實(shí)施例2各種試驗(yàn)方法的比較見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)論一步法、Trizol法和animalRNAout法的共同特點(diǎn)是提取物中含有大量白色不溶解沉淀，為蛋白多糖，所得RNA純度差，得率低，增加抽提次數(shù)仍不能去除蛋白多糖；植物RNA提取法為植物RNA提取方法的嘗試，多次試驗(yàn)結(jié)果顯示有基因組DNA污染。本發(fā)明方法獲得高質(zhì)量、高純度、完整性好、收率較高的RNA,完全滿足后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)要求。實(shí)施例3總RNA的逆轉(zhuǎn)錄及LD-PCR擴(kuò)增采用美國CL0NTECH/厶司的SMARTPCRcDNASynthesisKit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用LD-PCR方法，用本發(fā)明方法提取的新西蘭白兔關(guān)節(jié)軟骨總RNA為模板，利用引物SMARTIIAOligonucleotide和3'SMARTCDSPrimerIIA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下首先合成兩端帶有接頭的cDNA,通過引物5PCRPrimerIIA繼續(xù)合成并擴(kuò)增雙鏈cDNA。實(shí)驗(yàn)在PTC-200型PCR儀上進(jìn)行15、18、21個(gè)循環(huán)，并確定17個(gè)循環(huán)為最優(yōu)循環(huán)數(shù)字。提取的總RNA的LD-PCR結(jié)果見圖7，由左至右依次為Marker、15、18、21循環(huán)，因此，用本發(fā)明方法提耳又的總RNA獲得LD-PCR的成功。結(jié)論LD-PCR對RNA質(zhì)量的要求高于普通的逆轉(zhuǎn)錄PCR，將分本發(fā)明方法所獲得的總RNA進(jìn)行LD-PCR獲得成功說明總RNA質(zhì)量好，完全滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。權(quán)利要求1.一種動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA提取方法，其特征在于該方法有以下步驟(1)取動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織，立即投入液氮中研磨至粉末狀，每50重量份的關(guān)節(jié)軟骨組織加入1體積變性液，0.007體積的β-巰基乙醇，勻漿至無明顯組織塊；(2)將勻漿液置于冰水浴上，加酸性水飽和酚，搖勻，加醋酸鈉，氯仿、異戊醇混合液，置于冰水浴上15min；(3)4℃下，離心，取上清液，加入氯仿、異戊醇混合液，離心取上清加入異丙醇，-20℃下沉淀30min，離心30分鐘，得到凝膠狀RNA和蛋白多糖混合沉淀，加入無RNA酶水，溶解沉淀得到膠狀溶液；(4)取膠狀溶液用plantRNAout試劑盒的RNA提取步驟得到總RNA沉淀，取沉淀，乙醇洗滌二次后用無RNA酶水溶解沉淀即得關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA溶液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA提取方法，其特征在于步驟(1)中所述的變性液的組成為秤異碌u氰酸胍23.6320重量份檸檬酸三鈉Q.3676重量份十二烷基肌氨酸鈉G.25重量份加入25重量份三蒸水，定容至50體積。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA提取方法，其特征在于步驟(2)、(3)中所述的氯仿、異戊醇混合液中的氯仿異戊醇為49:1。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA提取方法，其特征在于步驟(2)中所述的醋酸鈉溶液的濃度為2mol/L。全文摘要本發(fā)明涉及一種動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA提取方法，該方法有以下步驟(1)取動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織，研磨，加入變性液，β-巰基乙醇，勻漿；(2)冰水浴下，加酸性水飽和酚，搖勻，加醋酸鈉，氯仿、異戊醇混合液，冰水浴上15min；(3)4℃下，離心，取上清液，加氯仿、異戊醇混合液，離心取上清，加異丙醇，-20℃下沉淀，離心，得到凝膠狀RNA和蛋白多糖混合沉淀，加無RNA酶水，溶解得膠狀溶液；(4)取膠狀溶液用plantRNAout試劑盒的RNA提取步驟得到總RNA沉淀，取沉淀，乙醇洗滌后用無RNA酶水溶解沉淀，即得關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA溶液。采用本發(fā)明方法提取的動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA的收率高，并且純度高、質(zhì)量、完整性好，可以滿足分子生物學(xué)研究應(yīng)用。文檔編號C07H21/02GK101182343SQ20071009316公開日2008年5月21日申請日期2007年12月18日優(yōu)先權(quán)日2007年12月18日發(fā)明者劉玉剛,初同偉,躍周,歐娟娟申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院