專利名稱：從茶葉中制備甲基化兒茶素的工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從天然產(chǎn)物中制備活性成分的方法，具體地說，涉及從茶葉中 提取甲基化兒茶素的工藝方法。
背景技術(shù)：
二十世紀(jì)卯年代末期，日本科學(xué)家最早成功從臺灣凍頂烏龍茶中分離鑒定 出兩種具有抗過敏功能的新型兒茶素衍生物，經(jīng)分離、純化后鑒定證明其分子
結(jié)構(gòu)分別為(一)-表沒食子兒茶素3-0(3-0-甲基欣食子酸酯(C-l)和(一)-表沒食亍 兒茶素3-0(4-0-甲基)沒食子酸酯(C-2)。為白色粉末狀物質(zhì)，易溶于水和有機(jī)溶 劑，其結(jié)構(gòu)式如式(1)所示
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EGCG3〃 Me禾3EGCG4〃 Me對抗過敏，尤其是抗花粉癥過敏具有非常顯著 的功效?；ǚ郯Y是變態(tài)反應(yīng)中最具代表性的，其發(fā)病率逐年升高，尤其是二十 世紀(jì)八十年代以后其發(fā)病率迅速升高，己經(jīng)成為世界性衛(wèi)生問題。WHO于1997 年將之列為"二十一世紀(jì)重點研究和預(yù)防的疾病"。但是，甲基化兒茶素僅在極
少數(shù)的中葉種茶樹品種中存有，所以該項研究受到日本業(yè)界高度重視，小川制 藥、太陽制藥、三井農(nóng)林等幾大公司均投以重金，加緊秘密研發(fā)。因甲基化兒 茶素對治療花粉過敏等過敏反應(yīng)癥有極其顯著的效果，抑制小鼠皮膚被動過敏
反應(yīng)的效果是EGCG的兩倍，已被視為人們期待已久的抗過敏癥材料。隨著甲
基化兒茶素的功能研究逐歩得到權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)可，其相關(guān)方面的研究也逐步得 到國際學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)的高度重視。目前，甲基化兒茶素的提取與分離純化技術(shù)的前
沿研究主要集中在日本，受商業(yè)秘密的保護(hù)，甲基化EGCG的提取與分離純化 技術(shù)方法尚未見到報導(dǎo)。
目前，工業(yè)化提取兒茶素的方法主要是溶劑萃取法和離子沉淀法，溶劑萃 取法是目前最廣泛采用的方法，該方法工藝成熟穩(wěn)定，提取率較高，但生產(chǎn)時 使用多種有機(jī)溶劑，且用量大，有些甚至是有毒溶劑(如氯仿)，因而很難為食品 和醫(yī)藥等行業(yè)所接受。離子沉淀法減少了有機(jī)溶劑的使用量，生產(chǎn)的兒茶素純 度高，但工藝操作要求較高，需嚴(yán)格控制pH值，否則兒茶素可能會氧化，同 時，工藝中大量使用酸堿液，廢渣處理量大，容易造成環(huán)境污染。其次，還有
幾種提取技術(shù)正處于試驗階段(1)超臨界流體萃取技術(shù)，該技術(shù)是一種新型
的提取天然物質(zhì)的分離技術(shù)，具有低能耗、無污染、高分離能力、質(zhì)量好、速度 快等優(yōu)點，這些特點迎合崇尚純天然的發(fā)展潮流，但設(shè)備要求高，一次性投資大,
對于提取兒茶素來說，超臨界<:02提取效果不是很好，而超臨界萃取劑、助溶劑 在超臨界狀態(tài)下的溶解度等研究尚未成熟，因此很難進(jìn)入規(guī)?；笊a(chǎn)；(2)吸 附樹脂法提取兒茶素工藝簡單，能耗少，樹脂再生容易，可反復(fù)利用，提取效 率高，提取過程無污染，符合環(huán)保要求，條件溫和，不會破壞兒茶素活性，具有 良好的發(fā)展前景。但關(guān)鍵問題在于怎樣找到一種對兒茶素吸附能力強、解吸容
易的樹脂。兒茶素單體制備方法主要有凝膠層析法、HPLC制備以及高速逆流色 譜法等技術(shù),前兩種技術(shù)操作繁瑣、耗時長、設(shè)備材料昂貴，高速逆流色譜則具有 適應(yīng)性好、操作簡單、回收率高、重現(xiàn)性好、分離效率高、分離量大等特點，因 而具有良好的應(yīng)用和開發(fā)價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從茶葉中提取、分離、純化甲基化兒茶素的工 藝方法，以得到高純度的甲基化兒茶素。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
制備步驟1、先將茶鮮葉蔞凋5 12小時，進(jìn)行滾筒殺青處理，然后在80 12(TC條件下干燥，經(jīng)粉碎機(jī)制成顆粒大小為60 80目的茶粉。
制備歩驟2、用茶粉和60 80%乙醇溶液同時置于提取罐中進(jìn)行固液萃取， 萃取溫度為70 90°C，時間為30 120分鐘，料液比為1:3 1:10，過濾，濾渣 反復(fù)萃取2 5次；參照茶葉中茶多酚的提取方法進(jìn)行初歩提取，茶多酚的提取 方法一般采用水提法、乙醇提取法、丙酮提取法、酸液提取法。其中水提法提 取率不高，而且沸點較高，不能采用連續(xù)回流的方法進(jìn)行提取，同時會給隨后 的濃縮過程帶來困難，因此不可取；丙酮提取法提取的多酚提取率較高，但是 相對成本較高、毒性較大，不可?。凰嵋禾崛》梢蕴岣叨喾拥奶崛÷?，但其 易使多酚分子降解，不能真實地反應(yīng)材料中的多酚成分。乙醇價廉易得，無毒， 選擇性好，提取液易于濃縮、干燥，可以回收再利用，通過綜合考慮各個因素， 本發(fā)明采用乙醇作為提取劑進(jìn)行提取。
制備步驟3、合并所有萃取液后進(jìn)行濃縮，濃縮液和石油醚溶液按體積比 1:1 1:2混合后，進(jìn)行液液萃取，時間為5 30分鐘，反復(fù)操作2 5次；用石 油醚萃取去除萃取液中葉綠素和脂溶性成分雜質(zhì)。
制備步驟4、將所得萃余液再與乙酸乙酯按體積比為1:1 1:2混合，進(jìn)行液 液萃取，時間為5 30分鐘，反復(fù)操作2 5次，所得萃取液過濾、濃縮，得濃 縮液，濃縮液在60 10(TC條件下干燥，得甲基化幾茶素粗提物干粉A;乙酸乙 酯對多酚類物質(zhì)溶解性較強，經(jīng)過乙酸乙酯萃取后，多酚類物質(zhì)的含量進(jìn)一步 富集，純化后多酚物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以達(dá)到80%左右，對下一步提取分離的效 果顯著提高。
制備步驟5、用經(jīng)預(yù)處理過的20 50目粗聚酰胺樹脂裝進(jìn)層析柱，將甲基 化兒茶素粗提物干粉A與粗聚酰胺樹脂按重量比1:1 3.5:1充分混勻，裝入層 析柱，然后用20~95%的乙醇洗脫，流速為0.5 lBV/h，收集洗脫液，濃縮，在 60 10(TC條件下干燥得甲基化兒茶素粗提物干粉B;利用粗聚酰胺樹脂初步去 除茶多酚中與甲基化兒茶素化學(xué)性質(zhì)差異較大的雜質(zhì)。
制備步驟6、用經(jīng)預(yù)處理過的60 200目細(xì)聚酰胺樹脂裝進(jìn)層析柱，將甲基 化兒茶素粗提物干粉B與細(xì)聚酰胺樹脂按重量比1:1 3.5:1充分混勻，裝入層 析柱，用甲醇和三氯甲垸按體積比為1:1 4:1的洗脫液進(jìn)行洗脫，流速為0.1 0.5BV/h，收集洗脫液，濃縮，在60 10(TC條件下干燥，得甲基化兒茶素粗品； 利用細(xì)聚酰胺樹脂進(jìn)一步去除茶多酚中與甲基化兒茶素化學(xué)性質(zhì)差異較大的雜 質(zhì)。
制備步驟7、用水和甲醇按體積比7:2 5:2混合，配置混合液A，用乙酸乙 酯和正己烷按體積比6:1 10:1，配制混合液B，將混合液A和混合液B均勻混 合，充分飽和后，靜置6 12h，取上相作為固定相，下相作為流動相；將甲基 化兒茶素粗品，用流動相配制成0.5 2mg/mL的溶液M，將固定相推進(jìn)逆流色
譜的螺旋管柱中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為正轉(zhuǎn)600 800 r / min，以1 2 mL / min的流速 將流動相泵入，待機(jī)器穩(wěn)定后將溶液M注入逆流色譜，用分布收集器進(jìn)行收集， 將所有含有甲基化兒茶素的收集液合并、濃縮后，濃縮液在60 10(TC條件下干 燥，得甲基化兒茶素純品。
所述制備步驟3、制備步驟4、制備步驟5、制備步驟6和制備歩驟7的濃 縮條件是溫度為20 65°C，負(fù)壓為0.06 0.1MPa。
所述粗聚酰胺樹脂樹脂和細(xì)聚酰胺樹脂樹脂的預(yù)處理方法如下歩驟1、 Z 醇浸泡將樹脂浸泡在90 95%的乙醇中，不時用玻璃棒攪拌，使樹脂和乙醇 充分的接觸、溶脹， 一般為24h。以便從中趕出空氣并對樹脂進(jìn)行浮選；步驟2、 乙醇沖洗將浸泡了 24h后的樹脂濕法上柱，再用90 95%的乙醇沖洗，直至 流出液清亮無混濁，蒸干無殘留物為止；步驟3、 3%的氫氧化鈉沖洗以2BV、 3%的氫氧化鈉沖洗樹脂，并浸泡4h，然后用蒸餾水沖洗至中性；歩驟4、 5% 的檸檬酸沖洗以2BV、 5%的檸檬酸沖洗樹脂，并浸泡4小時，然后用蒸餾水 沖洗至中性。粗聚酰胺樹脂樹脂和細(xì)聚酰胺樹脂樹脂也可以采用其他預(yù)處理方 法。
所述制備步驟4中通過以下方法使兒茶素粗提物干粉A與粗聚酰胺樹脂充 分混勻先將兒茶素粗提物干粉A全部溶于甲醇制成溶液，在80 10(TC加熱 條件下，邊加入溶液，邊攪拌粗聚酰胺樹脂直到兒茶素粗提物干粉A與粗聚酰 胺樹脂充分混勻。
所述制備步驟5中通過以下方法使兒茶素粗提物干粉B與細(xì)聚酰胺樹脂充 分混勻先將兒茶素粗提物干粉B全部溶于甲醇制成溶液，在80 10(TC加熱條 件下，邊加入溶液，邊攪拌粗聚酰胺樹脂直到兒茶素粗提物千粉B與細(xì)聚酰胺樹脂充分混勻。
所述制備步驟2、制備步驟3、制備步驟4、制備步驟5和制備步驟6的濃 縮條件是溫度為20 65°C，負(fù)壓為0.06 0.1MPa。
所述制備步驟1的過濾采用80 200目的濾網(wǎng)進(jìn)行負(fù)壓抽濾或離心過濾。
所述制備步驟4和制備步驟5中的層析柱為中壓層析柱，該層析柱的柱長 30 100cm，柱直徑5 100cm，柱壓0.1 5MPa。
所述制備步驟6中，固定相以9.99 ml/min的流速泵入管路中，甲基化兒 茶素粗品溶于流動相后，然后超聲溶解均勻、過濾即得溶液M。由首端向尾端 洗脫，然后泵入流動相進(jìn)行洗脫，當(dāng)流動相流出色譜分離柱時，調(diào)整紫外檢測 器零點，并在254nm下連續(xù)檢測，記錄儀同步記錄，用自動部分收集器收集下 相洗脫液，根據(jù)譜峰收集樣品。
本發(fā)明的優(yōu)點
(1) 首先在國內(nèi)建立了甲基化兒茶素的提純工藝，得到純度90%以上的甲 基化兒茶素；
(2) 本發(fā)明采用高速逆流色譜(HSCCC)制備工藝，相比于高效液相色譜 (HPLC)制備工藝，高速逆流色譜不需要固體支撐體，克服了固相載體帶來的
樣品吸附、損失、污染和峰形拖尾等缺點。且高速逆流色譜具有制備量大，綜 合成本低，易于工業(yè)推廣等優(yōu)點。
(3) 浸提過程中選用乙醇做溶劑，成本低，安全性能好，污染低，易于
回收；


圖1為甲基化兒茶素標(biāo)樣的HPLC圖譜；
圖2為本發(fā)明實施例1所制得產(chǎn)品的HPLC圖譜；
圖3為本發(fā)明實施例2所制得產(chǎn)品的HPLC圖譜； 圖4為本發(fā)明實施例3所制得產(chǎn)品的HPLC圖譜；
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例進(jìn)一步對本發(fā)明加以說明 本發(fā)明的制備步驟如下
(1) 樣品制備采摘一芽二、三葉茶鮮葉，在通風(fēng)條件下，在萎凋室中， 用萎凋篩萎凋5 12小時后，進(jìn)行滾筒殺青處理，然后在80 12(TC條件下，用 烘干機(jī)干燥，將茶葉用粉碎機(jī)粉碎成60 80目粉末；
(2) 乙醇提取用茶粉與60 80%乙醇溶液同時置于提取罐中進(jìn)行固液萃 取，萃取溫度為70 90。C，時間為30 120分鐘，料液比為1:3 1:10，用真空 抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾，濾渣反復(fù)萃取2 5次；
(3) 粗提液的純化合并所有萃取液后進(jìn)行在濃縮罐中進(jìn)行真空濃縮，濃
縮液和石油醚溶液按體積比1:1 1:2混合，在萃取罐中進(jìn)行液液萃取，時間為 5 30分鐘，反復(fù)操作2 5次，以去除葉綠素和脂溶性成分；
(4) 乙酸乙酯進(jìn)行萃取將所得萃余液再與乙酸乙酯按體積比為1:1 1:2 混合，在萃取罐中進(jìn)行液液萃取，時間為5 30分鐘，反復(fù)操作2 5次，所得 萃取液用真空抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾，在溫度為20 65。C，負(fù)壓為0.06 0.1MPa真空 濃縮，得濃縮液，濃縮液在60 10(TC條件下經(jīng)真空干燥箱干燥，得甲基化兒茶 素粗提物干粉A;
(5) 粗聚酰胺初步分離、純化 a粗聚酰胺樹脂的預(yù)處理
步驟1、乙醇浸泡..將樹脂浸泡在90 95%的乙醇中，不時攪拌，使樹脂
和乙醇充分的接觸、溶脹， 一般為24h。以便從中趕出空氣并對樹脂進(jìn)行浮選。 步驟2、乙醇沖洗將浸泡了 24h后的樹脂上柱，再用90 95%的乙醇沖
洗，直至流出液清亮無混濁，蒸干無殘留物為止。
步驟3、 3%的氫氧化鈉沖洗以2BV、 3%的氫氧化鈉沖洗樹脂，并浸泡
4h，然后用蒸餾水沖洗至中性。
步驟4、 5%的檸檬酸沖洗以2BV、 5%的檸檬酸沖洗樹脂，并浸泡4小時，
然后用蒸餾水沖洗至中性。
b按干法裝柱法，用經(jīng)預(yù)處理過的20 50目粗聚酰胺樹脂裝進(jìn)層析柱，先 將兒茶素粗提物干粉A全部溶于甲醇制成溶液，在80 10(TC加熱條件下，邊 加入溶液，邊攪拌粗聚酰胺樹脂直到兒茶素粗提物干粉A與粗聚酰胺樹脂充分 混勻，甲基化兒茶素粗提物干粉A與粗聚酰胺樹脂的重量比為1:1 3.5:1。裝入 層析柱，然后用20 95%的乙醇洗脫，流速為0.5 lBV/h，收集洗脫液，在溫度 為20 65。C，負(fù)壓為0.06 0.1MPa的條件下用濃縮罐真空濃縮，在60 100。C 條件下經(jīng)真空干燥箱經(jīng)干燥得甲基化兒茶素粗提物干粉B; (6)細(xì)聚酰胺分離、純化 a細(xì)聚酰胺的預(yù)處理預(yù)處理工藝同粗聚酰胺樹脂的預(yù)處理-， b按干法裝柱法，用經(jīng)預(yù)處理過的20 50目粗聚酰胺樹脂裝進(jìn)層析柱，先 將兒茶素粗提物干粉B全部溶于甲醇制成溶液，在80 100。C加熱條件下，邊加 入溶液，邊攪拌粗聚酰胺樹脂直到兒茶素粗提物千粉B與細(xì)聚酰胺樹脂充分混 勻，甲基化兒茶素粗提物干粉A與粗聚酰胺樹脂的重量比為1:1 3.5:1，裝入層 析柱，然后用20 95%的乙醇洗脫，流速為0.5 1BV/h，收集洗脫液，在纟顯度為 20 65°C，負(fù)壓為0.06 0.1MPa的條件下用濃縮罐濃縮，在60 10(TC條件下 經(jīng)液噴霧干燥得得甲基化兒茶素粗品；
(7) 高速逆流色譜純化用水和甲醇按體積比7:2 5:2混合，配置混合液 A，用乙酸乙酯和正己烷按體積比6: 1 10: 1，配制混合液B，將混合液A和 混合液B混合，充分飽和后，靜置分層，取上相作為固定相，下相作為流動相； 將甲基化兒茶素粗品，用流動相配制成0.5 2mg/mL的溶液M，將固定相推進(jìn) 逆流色譜的螺旋管柱中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為正轉(zhuǎn)600 800 r/min，以l 2mL/min 的流速將流動相泵入，待機(jī)子穩(wěn)定后進(jìn)樣，分布收集器進(jìn)行收集，將所有含有 甲基化兒茶素的收集液合并，在溫度為20 65。C，負(fù)壓為0.06 0.1MPa的條件 下用濃縮罐濃縮后，濃縮液噴霧干燥，得甲基化兒茶素純品。
(8) 甲基化兒茶素的高效液相色譜(HPLC)檢測 HPLC檢測條件KromasilC18柱(200mmX4.6mm id,5um)色譜柱；流動
相A:乙睛，流動相B: O.lmol/L的磷酸二氫鈉;流速1.0ml/min;檢測波長 280nm;靈敏度l.OOOAUFS;柱溫40°C;進(jìn)樣量lOul。 甲基化兒茶素標(biāo)樣的HPLC圖譜見圖1。
下面，用具體實施例對本發(fā)明進(jìn)一步加以說明，但是本發(fā)明并不限于這些 實施例的任一個或類似實例。 實施例1
采摘一芽二、三葉茶鮮葉，在通風(fēng)條件下，在萎凋室中，用萎凋篩萎凋5 小時后，進(jìn)行滾筒殺青處理，然后在8(TC條件下，用烘干機(jī)干燥，將茶葉用粉 碎機(jī)粉碎成60目粉末；按料液比1:3添加60%乙醇到茶粉中，在70。C，萃取30 分鐘，萃取完成后，過濾，濾渣反復(fù)萃取2次，合并所有萃取液后進(jìn)行濃縮，濃縮液和石油醚溶液按體積比l:l混合，進(jìn)行液液萃取，時間為5分鐘，反復(fù)操
作2次；將所得萃余液再與乙酸乙酯按體積比為1:1混合，進(jìn)行液液萃取，時間 為5分鐘，反復(fù)操作2次，所得萃取液過濾、濃縮，得濃縮液，濃縮液經(jīng)干燥， 得甲基化兒茶素粗提物干粉A;用經(jīng)預(yù)處理過的20目粗聚酰胺樹脂裝進(jìn)層析柱， 將甲基化兒茶素粗提物干粉A與粗聚酰胺樹脂按重量比1:1充分混勻，裝入層 析柱，然后用20%的乙醇洗脫，流速為0.5BV/h，收集洗脫液，濃縮，經(jīng)千燥得 甲基化兒茶素粗提物干粉B;用經(jīng)預(yù)處理過的60目細(xì)聚酰胺樹脂裝進(jìn)層析柱， 將甲基化兒茶素粗提物干粉B與細(xì)聚酰胺樹脂按重量比1:1充分混勻，裝入層 析柱，用甲醇和三氯甲烷按體積比為1:1的洗脫液進(jìn)行洗脫，流速為0.1BV/h， 收集洗脫液，濃縮，干燥，得甲基化兒茶素粗品；用水和甲醇按體積比7:2混合， 配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按體積比6:1，配制混合液B，將混合液A 和混合液B混合，充分飽和后，靜置分層，取上相作為固定相，下相作為流動 相；將甲基化兒茶素粗品，用流動相配制成0.5mg/mL的溶液M，將固定相推進(jìn) 逆流色譜的螺旋管柱中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為正轉(zhuǎn)600r / min，以1 mL / min的流速將流 動相泵入，待機(jī)子穩(wěn)定后進(jìn)樣，分布收集器進(jìn)行收集，將所有含有甲基化兒茶 素的收集液合并、濃縮后，濃縮液干燥，得甲基化兒茶素純品。
將得到的兒茶素純品進(jìn)行HPLC檢測，如圖2，純度為92.1%。
實施例2
采摘一芽二、三葉茶鮮葉，在通風(fēng)條件下，在萎凋室中，用萎凋篩萎凋8 小時后，進(jìn)行滾筒殺青處理，然后在10(TC條件下，用烘干機(jī)干燥，將茶葉用粉 碎機(jī)粉碎成70目粉末；按料液比1:6添加70°/。乙醇到茶粉中，在8(TC，萃取60 分鐘，萃取完成后，過濾，濾渣反復(fù)萃取3次，合并所有萃取液后進(jìn)行濃縮，
濃縮液和石油醚溶液按體積比1:1混合，進(jìn)行液液萃取，時間為15分鐘，反復(fù)
操作3次；將所得萃余液再與乙酸乙酯按體積比為1:1混合，進(jìn)行液液萃取，時 間為15分鐘，反復(fù)操作3次，所得萃取液過濾、濃縮，得濃縮液，濃縮液經(jīng)干 燥，得甲基化兒茶素粗提物干粉A;用經(jīng)預(yù)處理過的30目粗聚酰胺樹脂裝進(jìn)層 析柱，將甲基化兒茶素粗提物干粉A與粗聚酰胺樹脂按重量比l: l充分混勻， 裝入層析柱，然后用60%的乙醇洗脫，流速為0.8BV/h，收集洗脫液，濃縮，經(jīng) 干燥得甲基化兒茶素粗提物干粉B;用經(jīng)預(yù)處理過的80目細(xì)聚酰胺樹脂裝進(jìn)層 析柱，將甲基化兒茶素粗提物干粉B與細(xì)聚酰胺樹脂按重量比2:1充分混勻， 裝入層析柱，用甲醇和三氯甲烷按體積比為2.5:1的洗脫液進(jìn)行洗脫，流速為 0.3BV/h，收集洗脫液，濃縮，干燥，得甲基化兒茶素粗品；用水和甲醇按體積 比6:2混合，配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按體積比8:1，配置混合液B， 將混合液A和混合液B混合，充分飽和后，靜置分層，取上相作為固定相，下 相作為流動相；將甲基化兒茶素粗品，用流動相配制成1.5mg/mL的溶液M，將 固定相推進(jìn)逆流色譜的螺旋管柱中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為正轉(zhuǎn)700r/min，以1.5 mL / min的流速將流動相泵入，待機(jī)子穩(wěn)定后進(jìn)樣，分布收集器進(jìn)行收集，將所有含 有甲基化兒茶素的收集液合并、濃縮后，濃縮液干燥，得甲基化兒茶素純品。
將得到的兒茶素純品進(jìn)行HPLC檢測，如圖3，純度為96.5%。
實施例3
采摘一芽二、三葉茶鮮葉，在通風(fēng)條件下，在蔞凋室中，用萎調(diào)篩萎調(diào)5 小時后，進(jìn)行滾筒殺青處理，然后在120。C條件下，用烘干機(jī)千燥，將茶葉用粉 碎機(jī)粉碎成80目粉末；按料液比1:10添加80%乙醇到茶粉中，在90。C，萃取 120分鐘，萃取完成后，過濾，濾渣反復(fù)萃取5次，合并所有萃取液后進(jìn)行濃縮，
濃縮液和石油醚溶液按體積比l:2混合，進(jìn)行液液萃取，時間為30分鐘，反復(fù) 操作5次；將所得萃余液再與乙酸乙酯按體積比為l:2混合，進(jìn)行液液萃取，時 間為30分鐘，反復(fù)操作5次，所得萃取液過濾、濃縮，得濃縮液，濃縮液經(jīng)干 燥，得甲基化兒茶素粗提物干粉A;用經(jīng)預(yù)處理過的50目粗聚酰胺樹脂裝進(jìn)層 析柱，將甲基化兒茶素粗提物干粉A與粗聚酰胺樹脂按重量比3.5:1充分混勻， 裝入層析柱，然后用95%的乙醇洗脫，流速為lBV/h，收集洗脫液，濃縮，經(jīng) 干燥得甲基化兒茶素粗提物干粉B;用經(jīng)預(yù)處理過的200目細(xì)聚酰胺樹脂裝進(jìn)層 析柱，將甲基化兒茶素粗提物干粉B與細(xì)聚酰胺樹脂按重量比3.5:1充分混勻， 裝入層析柱，用甲醇和三氯甲垸按體積比為4:1的洗脫液進(jìn)行洗脫，流速為 0.5BV/h，收集洗脫液，濃縮，干燥，得甲基化兒茶素粗品；用水和甲醇按體積 比5:2混合，配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按體積比10:1，配制混合液B， 將混合液A和混合液B混合，充分飽和后，靜置分層，取上相作為固定相，下 相作為流動相；將甲基化兒茶素粗品，用流動相配制成2mg/mL的溶液M，將 固定相推進(jìn)逆流色譜的螺旋管柱中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為正轉(zhuǎn)800r/min，以2 mL / min 的流速將流動相泵入，待機(jī)子穩(wěn)定后進(jìn)樣，分布收集器進(jìn)行收集，將所有含有 甲基化兒茶素的收集液合并、濃縮后，濃縮液干燥，得甲基化兒茶素純品。 將得到的兒茶素純品進(jìn)行HPLC檢測，如圖4，純度為93.8%。
權(quán)利要求
1.一種從茶葉中制備甲基化兒茶素的工藝方法，其特征在于制備步驟1、先將茶鮮葉萎凋5～12小時，進(jìn)行滾筒殺青處理，然后在80～120℃條件下干燥，經(jīng)粉碎機(jī)制成顆粒大小為60～80目的茶粉；制備步驟2、用茶粉和60～80％乙醇溶液同時置于提取罐中進(jìn)行固液萃取，萃取溫度為70～90℃，時間為30～120分鐘，料液比為1∶3～1∶10，過濾，濾渣反復(fù)萃取2～5次；制備步驟3、合并所有萃取液后進(jìn)行濃縮，濃縮液和石油醚溶液按體積比1∶1～1∶2混合后，進(jìn)行液液萃取，時間為5～30分鐘，反復(fù)操作2～5次；制備步驟4、將所得萃余液再與乙酸乙酯按體積比為1∶1～1∶2混合，進(jìn)行液液萃取，時間為5～30分鐘，反復(fù)操作2～5次，所得萃取液過濾、濃縮，得濃縮液，濃縮液在60～100℃條件下干燥，得甲基化兒茶素粗提物干粉A；制備步驟5、用經(jīng)預(yù)處理過的20～50目粗聚酰胺樹脂裝進(jìn)層析柱，將甲基化兒茶素粗提物干粉A與粗聚酰胺樹脂按重量比1∶1～3.5∶1充分混勻，裝入層析柱，然后用20～95％的乙醇洗脫，流速為0.5～1BV/h，收集洗脫液，濃縮，在60～100℃條件下干燥得甲基化兒茶素粗提物干粉B；制備步驟6、用經(jīng)預(yù)處理過的60～200目細(xì)聚酰胺樹脂裝進(jìn)層析柱，將甲基化兒茶素粗提物干粉B與細(xì)聚酰胺樹脂按重量比1∶1～3.5∶1充分混勻，裝入層析柱，用甲醇和三氯甲烷按體積比為1∶1～4∶1的洗脫液進(jìn)行洗脫，流速為0.1～0.5BV/h，收集洗脫液，濃縮，在60～100℃條件下干燥，得甲基化兒茶素粗品；制備步驟7、用水和甲醇按體積比7∶2～5∶2混合，配置混合液A，用乙酸乙酯和正己烷按體積比6∶1～10∶1，配制混合液B，將混合液A和混合液B均勻混合，充分飽和后，靜置6～12h，取上相作為固定相，下相作為流動相；將甲基化兒茶素粗品，用流動相配制成0.5～2mg/mL的溶液M，將固定相推進(jìn)逆流色譜的螺旋管柱中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為正轉(zhuǎn)600～800r/min，以1～2mL/min的流速將流動相泵入，待機(jī)器穩(wěn)定后將溶液M注入逆流色譜，用分布收集器進(jìn)行收集，將所有含有甲基化兒茶素的收集液合并、濃縮后，濃縮液在60～100℃條件下干燥，得甲基化兒茶素純品；所述制備步驟3、制備步驟4、制備步驟5、制備步驟6和制備步驟7的濃縮條件是溫度為20～65℃，負(fù)壓為0.06～0.1MPa。
2. 按照權(quán)利要求1所述的從茶葉中制備甲基化兒茶素的工藝方法，其特征 在于所述粗聚酰胺樹脂樹脂和細(xì)聚酰胺樹脂樹脂的預(yù)處理方法如下歩驟1、乙醇浸泡將樹脂浸泡在90 95%的乙醇中，不時攪拌，使樹脂 和乙醇充分的接觸、溶脹， 一般為24h。以便從中趕出空氣并對樹脂進(jìn)行浮選；步驟2、乙醇沖洗將浸泡了 24h后的樹脂濕法上柱，再用90 95%的乙 醇沖洗，直至流出液清亮無混濁，蒸干無殘留物為止；步驟3、 3%的氫氧化鈉沖洗以2BV、 3%的氫氧化鈉沖洗樹脂，并浸泡 4h，然后用蒸餾水沖洗至中性；步驟4、 5%的檸檬酸沖洗以2BV、 5%的檸檬酸沖洗樹脂，并浸泡4小 時，然后用蒸餾水沖洗至中性。
3. 按照權(quán)利要求1所述的從茶葉中制備甲基化兒茶素的工藝方法，其特征 在于所述制備步驟5中通過以下方法使兒茶素粗提物干粉A與粗聚酰胺樹脂 充分混勻先將兒茶素粗提物干粉A全部溶于甲醇制成溶液，在80 100。C加熱條件下，邊加入溶液，邊攪拌粗聚酰胺樹脂直到兒茶素粗提物干粉A與粗聚 酰胺樹脂充分混勻。
4. 按照權(quán)利要求1所述的從茶葉中制備甲基化兒茶素的工藝方法，其特征 在于所述制備步驟6中通過以下方法使兒茶素粗提物干粉B與細(xì)聚酰胺樹脂充分混勻先將兒茶素粗提物干粉B全部溶于甲醇制成溶液，在80 10(TC加熱 條件下，邊加入溶液，邊攪拌粗聚酰胺樹脂直到兒茶素粗提物干粉B與細(xì)聚酰胺樹脂充分混勻。
5. 按照權(quán)利要求1所述的從茶葉中制備甲基化兒茶素的工藝方法，其特征 在于所述制備歩驟2的過濾采用80 200目的濾網(wǎng)進(jìn)行負(fù)壓抽濾或離心過濾。
6. 按照權(quán)利要求1所述的從茶葉中制備甲基化兒茶素的工藝方法，其特征 在于所述制備步驟5和制備歩驟6中的層析柱為中壓層析柱，該層析柱的豐主 長30 100cm，柱直徑5 100cm，柱壓0.1 5MPa。
7. 按照權(quán)利要求1所述的從茶葉中制備甲基化兒茶素的工藝方法，其特征 在于所述制備步驟7中〖固定相以9.99 ml/min的流速泵入管路中，甲基化 兒茶素粗品溶于流動相后，然后超聲溶解均勻、過濾即得溶液M;由首端向尾 端洗脫，然后泵入流動相進(jìn)行洗脫，當(dāng)流動相流出色譜分離柱時，調(diào)整紫外檢 測器零點，并在254nm下連續(xù)檢測，記錄儀同步記錄，用自動部分收集器收集 下相洗脫液，根據(jù)譜峰收集樣品。
全文摘要
一種從茶葉中制備甲基化兒茶素的工藝方法，茶粉末先經(jīng)乙醇提取，再經(jīng)石油醚萃取以去除葉綠素和脂溶性成分，然后經(jīng)乙酸乙酯萃取得甲基化兒茶素粗提物干粉A，再經(jīng)粗聚酰胺樹脂和細(xì)聚酰胺樹脂分離純化，得甲基化兒茶素粗品，最后經(jīng)高效逆流色譜進(jìn)一步提純，得甲基化兒茶素純品。本發(fā)明首先在國內(nèi)建立了甲基化兒茶素的提純工藝，得到較高純度的甲基化兒茶素；而且本發(fā)明采用高速逆流色譜(HSCCC)制備工藝，相比于高效液相色譜(HPLC)制備工藝，高速逆流色譜不需要固體支撐體，克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染和峰形拖尾等缺點。且高速逆流色譜具有制備量大，綜合成本低，易于工業(yè)推廣等優(yōu)點。
文檔編號C07D311/00GK101177422SQ20071009311
公開日2008年5月14日 申請日期2007年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日
發(fā)明者堅 楊, 童華榮, 羅正飛, 謝進(jìn)平, 龔正禮 申請人:西南大學(xué)