專利名稱：：聚乙二醇修飾的抗菌/中和內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子、其合成方法及醫(yī)學(xué)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類用以治療或預(yù)防內(nèi)毒素膿毒癥、膿毒性休克等疾病或癥狀的高分子修飾的多肽分子、其制備方法和醫(yī)學(xué)用途。
背景技術(shù)：
：膿毒癥(sepsis)是感染所致的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS),進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致嚴(yán)重感染、膿毒性休克(septicshock)及多器官功能障礙綜合征(multipleorgandysfUnctionsyndrome,MODS)。美國疾病控制中心的統(tǒng)計(jì)調(diào)查結(jié)果[AngusDC,Wa/.O/.OweMed，2001，29(7):1303~1310]顯示:美國每年大約有75萬人感染膿毒癥，超過21萬人因此而喪生全身性感染已成為美國老年人十大死因之一，每年投入全身性感染的醫(yī)療費(fèi)用高達(dá)l億美元。在中國，多發(fā)傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷、外科大手術(shù)后全身性感染、嚴(yán)重感染、MODS的患病率及死亡率較國外報(bào)道略高。雖然國內(nèi)外臨床上廣泛采用了綜合療法，但其死亡率仍居高不下，膿毒癥仍是導(dǎo)致危重病人死亡的第一因素。革蘭陰性菌細(xì)胞外膜內(nèi)含有脂多糖(LPS),也稱內(nèi)毒素，當(dāng)它釋放入血后可引起宿主的炎癥瀑布效應(yīng)并導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥甚至死亡。目前普遍認(rèn)為，內(nèi)毒素是介導(dǎo)G-菌膿毒癥的重要啟動(dòng)子，通過其調(diào)節(jié)蛋白或結(jié)合受體的作用，誘導(dǎo)宿主多種細(xì)胞因子的釋放，激發(fā)機(jī)體一系列病理生理改變。國內(nèi)外針對G-細(xì)菌感染所伴隨的內(nèi)毒素血癥的防治研究已進(jìn)行了數(shù)十年，但目前尚無一種安全有效的特異性中和LPS的制劑。殺菌性/通透性增力口蛋白(bactericidal/permeability-increasingprotein,BPI)是一個(gè)分子量介于50-60kD之間的陽性蛋白。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BPI具有強(qiáng)大的殺滅G-細(xì)菌及中和LPS活性，被國外學(xué)者譽(yù)為"超級抗生素"。1992年獲得BPI重組功能性的iV-末端1199個(gè)氨基酸片段(rBPl23)。臨床研究表明，rBPl23及其突變體rBPI^兼有殺菌、中和內(nèi)毒素作用，與內(nèi)毒素具有很高的親和力；rBPl2!與抗菌素合用，效應(yīng)增強(qiáng)；rBPl2i發(fā)生生物效應(yīng)時(shí)，對機(jī)體不產(chǎn)生任何損害。因此rBPIu存在著廣闊的應(yīng)用前景，最有希望成為特異性中和LPS的藥物[LevyO.￡x/eW.C!pz'"./"veW/g.i>wg>y，2002，11(2):159~167;LinY,etal.爿""附/cra6.C/je/woA^:,1996，40(1):65~69]。但是rBPIn易于被肝臟降解或從腎臟排泄，生物半衰期不足l小時(shí)，存在生產(chǎn)成本高、絕對用量大、難以廣泛應(yīng)用于臨床等問題[LevinM,etal.2000,356:961~967〗。中國專利申請94191894和94194835涉及殺菌性通透性增強(qiáng)蛋白的功能區(qū)的生物活性肽及其應(yīng)用，其中公開了人殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白質(zhì)(BPI)功能區(qū)的M酸序列或其亞序列的肽，以及該序列的變異體或其亞序列，它們具有至少一種BPI的生物學(xué)活性，如肝素中和、LBS結(jié)合/中和或殺菌活性。中國授權(quán)專利CN01104591公開了們具有LPS中和或殺菌活性。與rBPIu類似，BNEP仍然存在半衰期較短、、需要連續(xù)給藥的問題。我們在中國公開專利200410028159.0中，選取中國授權(quán)專利01104591.4中的BPI模擬肽BNEP9卯1315:KTKGGWLIQLFHKK作為母體分子(BNEP),對其碳端(C-terminal)、氮端(iV-端)進(jìn)行化學(xué)修飾，并采用多肽固相合成法、液相合成方法以及這兩種方法的組合，合成了具有R、BNEP-X(R3)n通式的一系列多肽衍生物；同時(shí)，選取具有穿膜效應(yīng)(cellpenetratingeffect)的穿膜肽(CMT)RKKRRQRRRorYGRKKRRQRRR作為另一活性部位(CMT),與BNEP共同組成母體，必要時(shí)對其C-端、iV-端進(jìn)行化學(xué)修飾，得到具有下列通式的系列衍生物Ri-BNEP-CMT國X(R3)nR!-CMT-BNEP-X(R3)nW-BNEP-Z-CMT-X(R3)nI^-CMT-Z-BNEP-X(R3)n體外試驗(yàn)表明，許多這些變構(gòu)肽的抗菌沖和LPS活性增強(qiáng)。這是BPI類型多肽的全新改造方式，但是半衰期仍然不長。大量文獻(xiàn)報(bào)道，解決半衰期較短、需要連續(xù)給藥問題的方法，最常見的是劑型改造和分子結(jié)構(gòu)修飾或改造。一般而言，藥學(xué)上的方法是先進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)修飾或文造，如有必要再利用劑型改造進(jìn)一步延長半衰期并增強(qiáng)生物活性。分子結(jié)構(gòu)修飾或改造，常見的有化學(xué)、生物和基因修飾等方法，其中化學(xué)修飾應(yīng)用最為廣泛。在使用的眾多修飾劑中，聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)、葡聚糖、聚蔗糖、聚氨基酸、聚酸酐等應(yīng)用最為普遍，最為成功的是PEG修飾技術(shù)，迄今已有6個(gè)采用該項(xiàng)技術(shù)的蛋白藥物獲得美國FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場，另有20多個(gè)藥物正在進(jìn)行臨床研究[孫漢棟，等.兒科藥學(xué)雜志，2004，10(4):710]。PEG具有優(yōu)異的生物相容性，在體內(nèi)能溶于組織液中，能被機(jī)體迅速排除體外而不產(chǎn)生任何毒副作用，是一種安全無毒的聚合物，得到了美國食品與藥物管理局(FDA)的認(rèn)可。此外，PEG具有良好的水溶性，也能溶于二氯甲烷(DCM)、乙腈(ACN)、二曱基曱酰胺(DMF)等有機(jī)溶劑，有利于修飾反應(yīng)的進(jìn)行和產(chǎn)物的分離純化。更難得的是，PEG通過共價(jià)聯(lián)結(jié)至多肽分子上進(jìn)行化學(xué)修飾，即聚乙二醇化(PEGylation)，不僅它的許多優(yōu)良性質(zhì)隨之轉(zhuǎn)移到結(jié)合物中，而且可改變多肽分子某些生物化學(xué)特性，包括分子大小、疏水性及電荷等，增加多肽分子水溶性和穩(wěn)定性。已有大量事實(shí)證明，PEG化蛋白既能保留天然蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，也能有效地克服蛋白質(zhì)類藥物在臨床應(yīng)用中的一些缺點(diǎn)，如可以延長血漿半衰期、增強(qiáng)生物利用度、提高藥物療效及安全性等[王良友,劉克良.有機(jī)化學(xué),2003,23(11):1320~1323;RobertsMJ，etal.柚Z)ragDe歸ev"2002，54:459~476;VeroneseFM.歷ow加m'a/，2001,22:405~417]。利用PEG化技術(shù)來進(jìn)行蛋白藥物的二次開發(fā)正成為新藥開發(fā)的熱點(diǎn)。本發(fā)明仍然選取中國授權(quán)專利01104591.4中的BNEP9901315作為母體分子(BNEP)，對其碳端進(jìn)行PEG修飾，合成了一類BNEP的amPEG偶聯(lián)物；通過多濃度鱟試驗(yàn)、生物傳感器親和力試驗(yàn)、細(xì)胞因子刺激試驗(yàn)、體外抗菌試驗(yàn)，獲得了具有較理想中和內(nèi)毒素活性的BNEP多肽的amPEG偶聯(lián)物，顯示了進(jìn)一步開發(fā)成為新型中和內(nèi)毒素藥物的潛力。技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供一類治療或預(yù)防內(nèi)毒素膿毒癥、膿毒性休克等疾病或癥狀的高分子修^飾的多肽分子(見下)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供合成上述多肽BNEP的amPEG偶聯(lián)物分子及其氮端衍生物的方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供上述多肽BNEP的amPEG偶聯(lián)物分子及其氮端衍生物的醫(yī)學(xué)用途。本發(fā)明選取中國授權(quán)專利01104591.4設(shè)計(jì)的BNEP9901315:iOXGG『丄/g丄FZ/ii:A:作為母體分子(BNEP)，對其碳端進(jìn)行amPEG修飾，并采用多肽固相合成法、多肽液相合成法以及這兩種方法的組合，合成具有下列通式的amPEG修飾的母體分子及其^f汁生物Y-BNEP誦Z彌PEG其中，Y是氫或其它修飾基團(tuán)，包括但不限于酰基、Cl-C18烷基、芳基千基、烯丙基；Z是各種連接基，包括但不限于-NH(CH2)nCO-(『l-8)、-NH(CH2)nX(n=l-10,X=0，S，NH,etc),也可以沒有連接基；amPEG的分子量包括但不限于2000，4000，6000,12000和20000。采用多肽可溶性聚合物液相合成法，逐步偶聯(lián)合成得到全保護(hù)的[B證I--Z-amPEG后(逐步合成法)，又采用固相合成法得到全保護(hù)的BNEP肽樹脂，去除碳端樹脂、與預(yù)先合成的Z-amPEG液相偶聯(lián)(片段合成法)，又得到了純度更高的BNE外Z-amPEG，裂解后得到目標(biāo)分子之一BNEP-Z-amPEG。通過類似方法，合成了中國專利申請94191894中的BPI.13(SEQIDNo:15/CSi^G『丄/g丄F/^iQ與amPEG的偶聯(lián)物BPI-Z-amPEG,作為活性研究的對照物之一。必要時(shí)，合成上述分子的氮端衍生物。一般采用高效液相色譜法(HPLC)確定純度，基質(zhì)輔助激光解吸釋間飛行質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)測定分子量，氨基酸組成測定進(jìn)一步確定結(jié)構(gòu)。上述BNEP-Z-amPEG偶聯(lián)物分子可以表現(xiàn)為多肽的藥學(xué)上可接受的各種無機(jī)酸、有機(jī)酸的鹽類，諸如三氟醋酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、磺酸鹽和氨基酸鹽等。再一方面，本發(fā)明涉及聯(lián)合制劑，該聯(lián)合制劑包括一種中和內(nèi)毒素功能多肽的amPEG偶聯(lián)物，或其藥物學(xué)上可接受的鹽，和一種在藥物學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的BNEP-amPEG偶聯(lián)物的制備方法1、母體肽樹脂F(xiàn)moc扭NE外CTC合成通法稱取適量Fmoc-Lys(Boc)-CTC樹脂或其它多肽合成M酸樹脂倒入合成柱中，加入溶劑(DCM,DMF,orDCM/DMF)溶脹，以10%-50%六氫吡啶的DMF溶液脫除氨基酸樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，4企測后抽濾至干，用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡啶。稱取本發(fā)明的抗菌/中和內(nèi)毒素變構(gòu)肽BNEP的^J^^列C端第二個(gè)氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH于適宜的容器中，加入適量DMF溶解，然后加入偶聯(lián)劑(如TBTU/HOBt，HBTU/HOBt，HATU/HOAt,DIC/HOBt,DCC/HOBt，DCC/HOSu，TBTU/HOSu,PyBOP/HOBt，BOP/HOBt,"c)和適量氮曱基嗎啉或二異丙基乙胺的DMF溶液。偶聯(lián)完成后，除去反應(yīng)液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌肽樹脂；加入20%-50%六氬吡咬的DMF溶液脫除氨基酸樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡淀。按照常規(guī)多肽固相化學(xué)合成方法(必要時(shí)有所改變)，依照本發(fā)明的BNEP的M酸序列進(jìn)行后續(xù)偶聯(lián)，如此循環(huán)完成整個(gè)BNEP肽鏈的合成，得到母體肽樹脂F(xiàn)moc-[BNEPl-CTC;充分洗滌，MeOH收縮，抽千，從合成柱中取出合成的肽樹脂，置凍干機(jī)中凍干，備用。2、氮端衍生物Y^BNEP卩CTC制備氮端衍生物最常見的是?；肿印ｕ；噭┖芏啵畛Ｒ姷脑噭┙M合有(RCO)20/pyridine;RC02H/activatingreagent(激活劑)。常見的激活劑有DCC/HOBt,DCC/HOSu,TBTU/HOBt,HBTU/HOBt,HATU/HOAt,DIC/HOBt,TBTU/HOSu,PyBOP/HOBt，BOP/HOBt，DIC/HOSu，PyBOP/HOSu。將Fmoc物EPhCTC母體肽樹脂倒入合成柱中，加入溶劑溶脹，抽干，加入20%-50%六氫吡啶的DMF溶液脫除Fmoc,洗滌后加入?；噭┑腄MF溶液，攪拌或通氮?dú)饣蛘袷?，控溫。偶?lián)完成后除去反應(yīng)液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，抽干，從合成柱中取出合成的BNEP肽衍生物樹脂，置凍干機(jī)中凍干，得Y-[BNEPhCTC。3、BNEP-amPEG分子的合成BNEP-amPEG的合成，主要采用了2種方法從自制amPEG開始的逐步合成法；固相合成Fmoc-ggH-CTC全保護(hù)肽，除去CTC樹脂后得到側(cè)鏈保護(hù)羧基游離的Fmoc-tBNE外OH,然后于溶液中與amPEG偶聯(lián)的片段合成法。3.1逐步合成法本發(fā)明的逐步合成法基本上和常規(guī)的液相合成法相似，但采用了可溶于DCM但在Et20中不溶的高分子樹脂amPEG,因此具有液相合成法的省料和高分子樹脂的方便。3.1.1全保護(hù)lBNE外amPEG制備通法脫除Fmoc圓底燒瓶中加入設(shè)計(jì)量的Fmoc-AAn….AA廣amPEG(1^1,2,3…14),適量15-50%六氫吡啶的DCM溶液，控溫?cái)嚢?0-60min。旋蒸，無水乙醚析出沉淀，抽濾，DCM-EtOH/Et20重結(jié)晶兩次，P205真空干燥得去Fmoc保護(hù)的AAn.…AA廣amPEG(n=l，2，3..,13)。偶聯(lián)圓底燒瓶中加入設(shè)計(jì)量的AAn....AA1-amPEG(n=l,2...13),2倍量的保護(hù)氨基酸Fmoc-AAx-OH(x=2，3...14)，0.02倍量的催化劑DMAP和適量DCM,溶解后加入計(jì)算量的DIC。20-40'C油浴中電磁撹拌，TLC檢測反應(yīng)過程。反應(yīng)畢，停止反應(yīng)。旋蒸，無水乙醚析出沉淀，抽濾，無水乙醚洗滌3次，DCM/Et20或DCM-EtOH/Et20重結(jié)晶2次，茚三酮監(jiān)測(應(yīng)與空白顏色相同或相似)，？205真空干燥得全保護(hù)的肽樹脂F(xiàn)moc-AAn.…AA廣amPEG(1^2，3…14),稱重計(jì)算收率。重復(fù)(必要時(shí)適當(dāng)改變)上述脫除Fmoc、偶聯(lián)操作，實(shí)現(xiàn)14個(gè)氨基酸的偶聯(lián)，得到全保護(hù)Fmoc-[BNEPl-amPEG，稱重計(jì)算收率。3.1.2BNEP-amPEG制備A.Fmoc-BNEP-amPEG制備全保護(hù)Fmoc-|BNEP|-amPEGlg,冰冷下加入10mL裂解試劑(TFA/Thioanisole/EDT/anisole94:3:2:1,v/v))，電》茲攪拌2誦4h,氮?dú)獯等ゴ蟛糠諸FA，無水乙醚沉降，離心；DCM溶樣，無水乙醚沉降，離心分出固體；再重復(fù)2次，凍千，得側(cè)鏈無保護(hù)Fmoc-BNEP-amPEG粗品，HPLC純化、凍干，得純品。氨基酸組成分析等方法確證結(jié)構(gòu)。B.BNEP-amPEG制備將1g全保護(hù)Fmoc-|BNEP|-amPEG除去Fmoc保護(hù)基后，按上述A法裂解去側(cè)鏈保護(hù)，沉降、離心、重結(jié)晶后得全去保護(hù)的BNEP-amPEG粗品。該粗品以適量水溶解，乙醚沉降，離心得固體；再重復(fù)2次，得較純品。HPLC純化，凍干，得純品。氨基酸組成分析等方法確證結(jié)構(gòu)。3.2片段合成法A.脫除樹脂計(jì)算量母體肽樹脂F(xiàn)moc-^NE外CTC，加入適量三氟乙醇裂解試劑,r.t反應(yīng)60-120min，過濾，適量DCM、THF洗滌樹脂，收集濾液，減壓旋蒸到?jīng)]有液體蒸出。加入適量1120,析出大量白色固體，加入適量THF溶解固體，加飽和食鹽水溶液，分液，減壓旋蒸THF層得白色固體，真空干燥，得除去CTC樹脂的全保護(hù)Fmoc-[BNEP|~OH。B.偶聯(lián)araPEG全保護(hù)Fmoc墨[BNEPkOH加入DMF和THF，攪拌溶解后，加入4-6倍HOBt，冰水冷卻下加入4-8倍DIC。攪拌，加入含有1-4倍自制amPEG的DMF溶液。撤除水浴，室溫?cái)嚢?8h后，置于25-40。C油浴攪拌反應(yīng)。TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束，轉(zhuǎn)入較大的圓底燒瓶，旋蒸除去THF，冷卻后加入冷凍的無水Et20，攪拌，靜置。抽濾，無水Et20洗滌，真空干燥。上述產(chǎn)物加入DCM,攪拌全溶后加入冷凍無水Et20,攪拌，抽濾，無水Et20洗滌，真空干燥，得到全保護(hù)Fmoc-[BNEPl-咖PEG。C.除去Fmoc全保護(hù)Fmoc-|BNEP|-amPEG，加入piperidine的DMF溶液，25-40。C油浴攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)入較大的圓底燒瓶，加入冷凍的無水Et20,攪拌，抽濾，無水Et20洗滌，真空干燥。上述產(chǎn)物，加入適量EtOH,攪拌全溶后加入冷凍無水Et20,攪拌，抽濾，無水Et20洗滌，真空干燥，得到側(cè)鏈全保護(hù)的lNE外amPEG。D.裂解去保護(hù)側(cè)鏈全保護(hù)iBNEP^amPEG,冰冷下加入裂解試劑(TFA/Thioanisole/EDT/anisole94:3:2:1，v/v,)，電》茲攪拌2-3h，氮?dú)獯等ゴ蟛糠諸FA，無水乙醚沉降，離心；DCM溶樣，無水乙醚沉降，離心分出固體；再重復(fù)2次，凍干，得BNEP-amPEG粗品，HPLC純化、凍干，得純品。本發(fā)明設(shè)計(jì)的BNEP-Z-amPEG多肽的生物活性研究本發(fā)明還通過測定BNEP-Z-amPEG多肽對部分人源病菌的體外殺菌活性、多濃度鱟試驗(yàn)、生物傳感器親和力試驗(yàn)、細(xì)胞因子刺激試驗(yàn)，研究其用于G-細(xì)菌感染、人內(nèi)毒素血癥治療防治的可能性，以便探索既能殺菌又能中和內(nèi)毒素的新藥物。體外抗菌試驗(yàn)表明，本發(fā)明的BNEP-Z-amPEG多肽在體外對金葡ATCC25923、金葡318MRS、金葡464、金葡465、表葡370、表葡372、大腸ATCC25922、大腸249、大腸339、大腸355、綠膿ATCC27853、綠膿328、綠膿451、綠膿460、肺克353、肺克452、肺克461和肺克468等細(xì)菌均有不同程度的抑菌活性；以相同重量給藥時(shí)，多數(shù)情況下經(jīng)amPEG修飾的BNEP、BPI較未經(jīng)修飾的BNEP抑菌活性要強(qiáng)；BNEP-amPEG-041108、BPI-咖PEG-041108抑菌活性稍弱于BNEP-amPEG-050304;BNEP-amPEG-041108(逐步合成產(chǎn)品)抑菌活性稍弱于BNEP-amPEG-050304(片段合成產(chǎn)品)。如果按照等摩爾量給藥，修飾肽的抑菌活性顯然要比未經(jīng)修飾的BNEP抑菌活性強(qiáng)得多。多濃度鱟試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)，BNEP-amPEG-050304(2#)，BNEP-amPEG-041108(3#)在各濃度水平均有不同程度的內(nèi)毒素中和活性，而BNEP-031112(1#)對內(nèi)毒素不具有中和作用。多肽樣品與LPS的親和力測定顯示，amPEG^"飾的多肽與LPS親和力最強(qiáng)者為BNEP-amPEG-050304,最弱者為amPEG;親和力高低依次為BNEP-amPEG-050304>BNEP-031112>BNEP-amPEG-041108>BPI-amPEG-041108>amPEG。通過初步體外拮抗內(nèi)毒素活性測定，發(fā)現(xiàn)該衍生物在體外對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子(TNF-a)和白細(xì)胞介素6(IL-6)具有很強(qiáng)的抑制作用；更為重要的是，初步的體內(nèi)活性測試顯示，體內(nèi)半衰期較BNEP更長、中和內(nèi)毒素活性較BNEP更強(qiáng)。上述結(jié)果表明，采用片段合成法得到的修飾肽BNEP-amPEG-050304,有望開發(fā)為新型中和內(nèi)毒素的藥物。圖1-1、本發(fā)明的BNEP—031112的MALDI-TOFMS圖譜(粗肽)圖1-2、本發(fā)明的BNEP~031112的MALDI-TOFMS圖譜(精肽)圖2-1、本發(fā)明的BNEP-amPEG-050304的MALDI-TOFMS圖譜圖2-2、本發(fā)明的BNEP-amPEG-050304的氨基酸組成分析圖語圖3-1、本發(fā)明的BNEP-amPEG-041108的MALDI-TOFMS圖譜圖3-2、本發(fā)明的BNEP-amPEG-041108的氨基酸組成分析圖譜圖4-1、LPS055:B5在疏水樣品池中的包被曲線圖4-2、多肽樣品與LPS的親和力檢測具體實(shí)施方式下面是本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述的優(yōu)選實(shí)施例是用于描述本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1本實(shí)施例涉及Fmoc-[BNEP|-CTC的固相手工合成以及BNEP-amPEG-050304的液相合成，用以說明本發(fā)明的BNEP-amPEG的片段合成法。下述操作僅僅是為了說明，而不是限制本發(fā)明。1.1FmoolBNEP卩CTC肽樹脂的合成稱取6.370g(2腿ol,Sub0.314腿ol/g)Fmoc-Lys(Boc)-CTCResin倒入合成柱中，加入55mLDCM-DMF(1:2,v/v)溶脹。30min后抽出溶劑，以35mL30。/o六氬吡啶的DMF溶液脫除氨基酸樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，15min后用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡啶(piperidine)。稱取3.750gFmoc-Lys(Boc)—OH于100mL錐形瓶中，加入10mLDMF溶解，加入19mLDIC、1.183gHOBt和55mL25%二異丙基乙胺的DMF溶液。茚三酮檢測反應(yīng)過程。偶聯(lián)完成后，除去反應(yīng)液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌肽樹脂；加入20%-50%六氬吡咬的DMF溶液脫除氨基酸樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涂，除盡六氫吡啶。按照類似的方法，投入后續(xù)Fmoc保護(hù)的氨基酸、DIC及HOBt(見表1),進(jìn)行后續(xù)偶聯(lián)，如此循環(huán)完成整個(gè)肽鏈的合成，得到Fmoc-|BNEP|~CTC肽樹脂9.673g;充分洗滌，MeOH收縮，抽干，從合成柱中取出樹脂，置凍干機(jī)中凍干，備用。Fmoc-AA-OH<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>取出0.5gFmoc-[BNEPl-CTC肽樹脂，加入2mLDCM溶脹，30min后抽干，加入5mL30%六氫吡啶的DMF溶液脫除肽樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氫吡咬，凍干。常規(guī)裂解[裂解劑(ReagentR):TFA/Thioanisole/EDT/anisole94:3:2:1，v/v,15mL;室溫，3h]，無水乙醚多次沉降得粗肽，粗肽純度87.53%,MALDI-TOFMS1684.055;證明母體合成成功。見附圖1-1,1-2。1.2BNEP-amPEG的合成稱取7.980gFmoc*NEP|-CTC肽樹脂，置于250mL的圓底燒瓶中，加入按投料表(見表2)配制好的裂解液70mL,r.t反應(yīng)90min,過濾樹脂，DCM(3x80mL)、THF(2x60mL)洗滌樹脂，收集濾液，減壓旋蒸到?jīng)]有液體蒸出。加入80mLH2O，析出大量白色固體，加入220mLTHF,固體溶解，加飽和食鹽水溶液，分液，減壓旋蒸THF層得白色固體，真空干燥。最終得Fmoc扭證l-OH(碳端氣基游離、氮端及側(cè)鏈全保護(hù))5.467g,收率92.77%。表1.2Fmoc-,<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>Fmoc-|BNEP|~OH2.066g(0.7010mmol),加入DMF30mL、THF20mL,攪拌，得無色透明溶液；加入HOBt380mg(4x0.701mmol),攪拌，冰水冷卻下加入DIC0.5mL(4x0.701mmol)。lOmin后，加入4.184g自制amPEG的DMF溶液30mL。撤除水浴,室溫?cái)嚢?8h后,置于35°C油浴攪拌反應(yīng)。TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束，轉(zhuǎn)入1OOOmL圓底燒瓶，旋蒸除去THF,冷卻后加入500mLEt20,攪拌30min，靜置lh。抽濾，無水Et20洗滌，真空干燥。上述產(chǎn)物，加入50mLDCM、20mLEtOH，M;拌全溶后加入冷凍Et20800mL，攪拌20min,抽濾，無水Et20洗滌(3xlOOmL),真空干燥，得到全保護(hù)Fmoc-[BNEP|-amPEG5.208g全保護(hù)Fmoc~|BNEP|~amPEG5.208g，加入DMF60mL、piperidine26mL,35。C油浴攪拌反應(yīng)，lh后轉(zhuǎn)入1OOOmL圓底燒瓶，加入冷凍的800mLEt2O，攪拌30min,抽濾,無水Et20洗滌，真空干燥。上述產(chǎn)物，加入50mLEtOH,攪拌全溶后加入冷凍無水Et20800mL,攪拌40min,抽濾,無水Et20洗滌(4xlOOmL),真空干燥，得到側(cè)鏈全保護(hù)的B卿-amPEG4.853g。|BNEP|~amPEGlg,冰冷下加入10mL裂解試劑(TFA/Thioanisole/EDT/anisole94:3:2:1,v/v，25mL),電磁攪拌3h,氮?dú)獯等ゴ蟛糠諸FA，200mL無水乙醚沉降，離心；lOmLDCM溶樣,100mL無水乙醚沉降,離心分出固體；再重復(fù)2次,凍干，得BNEP-amPEG-050304粗品，HPLC純化、凍干，得純品650mg,收率56.3%。MALDI-TOFMS圖譜見附圖2-1、氨基酸組成分析圖譜見附圖2-2。實(shí)施例2本實(shí)施例涉及本發(fā)明的BNEP-amPEG-041108的液相逐步合成。下述操作僅僅是為了說明，而不是限制本發(fā)明。2.1方法研究2丄1Fmoc-Lys(Boc)-amPEG(簡稱F-歐amPEG)制備2倍氨基酸投料A法lOOmL圓底燒瓶中加入lg(0.2mmol)amPEG-5000，184mg(0.4函o1)Fmoc-Lys(Boc)-OH,DCM溶解，冰鹽浴冷卻,滴加1滴DIC,18。C室溫?cái)嚢?。反?yīng)過夜。TLC檢測，停止反應(yīng)。旋蒸濃縮至粘稠，加入無水乙醚100mL，慢慢析出黃白色蠟狀固體，抽濾，收集濾餅。硅膠柱層析，流動(dòng)相先丙酮后曱醇。收集R產(chǎn)O.l的產(chǎn)物(n-Bu-OH/HOAc/H204:1:1,V/V;簡稱sysA)組分,減壓濃縮，加入無水乙瞇，析出豐交好晶型的產(chǎn)品，抽濾干燥后得淺黃色與白色固體共407mg,收率37.7%。茚三酮4企查,幾無色變。替代度檢測,黃色樣品sub=0.189mmol/g，白色樣品sub=0.241mmol/g。B法lOOmL圓底燒弁瓦中加入4.43g(0.9mmol)amPEG-5000,843mg(1.8mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，22mg(0.18mmol)DMAP，40mLDCM溶解，冰鹽浴冷卻，滴加0.6mL(3.6mmol)DIC，28。C攪拌。TLC顯示不再有明顯變化,停止反應(yīng)。向反應(yīng)瓶中加入200mL乙醚,電磁攪拌,沉降完全后靜置30min，抽濾，得白色固體。以30mLDCM溶解上述白色固體，加入2.5mL乙醇后得透明溶液，攪拌下加入250mL乙醚，沉降完全后冷藏30min,抽濾,乙醚洗3次,真空干燥,得白色固體4.391g，收率90.6%。5倍絲酸投料2g(0.4mmol)amPEQ0.937g(2腿o1)Fmoc陽Lys(Boc)陽OH,少量DMAP,加入25mLDCM溶解,冰浴下加入DIC后漸漸固化,補(bǔ)加20mLDCM至全溶，〗敎除冰浴,21。C攪拌15min后,3(TC恒溫?cái)嚢?。反?yīng)過夜,TLC不再有明顯變化,停止反應(yīng)。抽濾除去反應(yīng)液中不溶物,旋蒸濾液至粘稠，加少量DCM便固化聚集在并統(tǒng),瓶于熱水中放置，補(bǔ)加少量DCM,清亮后加入乙醚,至混濁出現(xiàn)為止。室溫(18°C)冷卻,析出白色與淺黃色的大粒狀沉淀,TLC顯示R產(chǎn)O(EtOAc，簡稱sysC),0.15(sysA)。抽濾,DCM/乙醚重結(jié)晶，得略帶淺黃色白色固體。再重結(jié)晶1次,抽濾干燥后得白色固體2.087g，收率95.7%。3倍絲酸投料5g(l函o1)amPEG5000，1.406g(3mmo1)Fmoc國Lys(Boc)-OH,36mg(0.3腿o1)DMAP于圓底燒瓶中，加入40mLDCM，攪拌下滴加0.5mL(3mmo1)DIC，恒溫30。C攪拌過夜。反應(yīng)液旋蒸至粘稠，補(bǔ)加少量DCM,加入適量無水乙醚，置冰箱放置，待沉淀完全后抽濾，干燥，得白色粉末狀物品5.622g。DCM-EtOH/乙醚重結(jié)晶2次，抽濾干燥后得白色固體5.310g,收率97.4%。F顯amPEG的DBLK反應(yīng)于50mL圓底燒瓶中加入407mg(0.075mmo1)F-K-amPEQ10mLDCM溶解后加入4mL六氫吡啶，30。C振蕩50min。加入適量無水乙醚，析出沉淀，靜置,抽濾,無水乙醚洗滌。取樣,DCM溶解,點(diǎn)樣，紫外燈下TLC板斑點(diǎn)顯色非常微弱；茚三酮檢查,深藍(lán)色。得白色片狀固體園-amPEG268mg，收率68.7%。2.1.2F-B~amPEG制備TBTU/2eq投料法268mg(0.049mmol)図-amPEG于100mL圓底燒瓶中，加入10mLDCM,溶解后加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(50mg，0.1腿o1)，TBTU(39mg,0.12腿o1),HOBt(16mg，0.12mmol)，30。C室溫?cái)嚢?14:00)過夜。旋蒸反應(yīng)液至粘稠，加入少量DCM溶解瓶壁粘稠物后，加入適量的無水乙醚，瓶底析出淺褐色粉末固體，收集干燥得F-BamPEG76mg，收率27.3%。送測替代度有Fmoc吸收，'H-NMR圖語確證。DIC/5eq投料法2.004g(0.368mmol)園-amPEQlg(2腿o1)Fmoc-Lys(Boc)-OH,48mg(0.4腿o1)DMAP，30mLDCM溶解；加入0.5mL(3mmo1)DIC，20。C攪拌,反應(yīng)過夜,次日停止反應(yīng)。濾去不溶物，TLC分析有殘余的原料點(diǎn)，拌樣柱層析分離,EtOAc洗脫,除去大部分雜質(zhì)(TLC板中上部斑點(diǎn)),EtOAc/CH3OH=2:l(v/v)洗脫其余雜質(zhì)，最后以CH3OH-DCM直接浸泡,抽濾，濾液旋蒸濃縮，加Et20析出，收集，干燥后得固體F國&amPEG775mg，收率68.2%。DIC/2eq投料法5.6g(1.028mmo1)F-因-amPEG于圓底燒底中，加入25%Piperidine/DCM40mL，室溫?cái)嚢?0min,沉降抽濾，DCM/Et20重結(jié)晶兩次，干燥后得3.990g(0.732mmo1)H2N-,amPEG。力口入0.656g(1.4mmo1)Fmoc-Lys(Boc)-OH、17mg(0.14mmo1)DMAP、55mLDCM、0.25mL(1.4mmo1)DIC，30。C油浴中攪拌反應(yīng)。次日停止，無水乙醚析出沉淀后，CH2C12/Et20重結(jié)晶兩次,干燥得淺黃色粉末狀固體F-目-amPEG3.877g，收率96.9%。2.2全保護(hù)[BNE^UmPEG制備通法DBLK反應(yīng)于圓底燒瓶中加入0.4腿ol-l.2mmo1F-AAn.…AA廣amPEG(n=2，3...13),適量(25mL-60mL)1540%六氫吡啶的二氯甲烷溶液，室溫?cái)嚢?0-60分鐘。旋蒸，無水乙醚析出沉淀，抽濾，DCM-EtOH/Et20重結(jié)晶兩次，P205真空干燥得去Fmoc保護(hù)的AAn....AA廣amPEG(n=2,3...13)。Coupling向上圓底燒瓶中加入設(shè)計(jì)量的AAn….AA廣咖PEG(n=l，2...13)，2倍量的保護(hù)氨基酸F-AAx-OH(x-2,3…14),0.02倍量的催化劑DMAP和適量DCM,溶解后加入計(jì)算量的DIC。30。C油浴中電磁攪拌，TLC檢測反應(yīng)過程。反應(yīng)畢，停止反應(yīng)。旋蒸，無水乙醚析出沉淀，抽濾，無水乙醚洗滌3次，DCM/Et20或DCM-EtOH/Et20重結(jié)晶兩次，茚三酮監(jiān)測(應(yīng)與空白顏色相同或相似)，P205真空干燥得全保護(hù)的肽樹脂F(xiàn)-AAn.…AAi-amPEG(n=2,3...14)或全保護(hù)Fmoc-BNEP|-amPEG，稱重計(jì)算收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及條件見Table2.1，Table2.2，Table2.3,Table2.4，Table2.5。Table2.1PreparativeconditionsandresultsofF-g-amPEG<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>Table2.2PreparativeconditionsandresultsofF-^^amPEG<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>Table2.3preparativeconditionsandresultsofF"JHKK|~amPEG<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>Table2,4preparativeconditionsandresultsofF-AAn…AAl-amPEG(2《咅投卑斗)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*為去Fmoc的AAn..,AAl彌PEG2.3BNEP-amPEG制備A.側(cè)鏈無保護(hù)F-BNEP-amPEG制備全保護(hù)Fmoc~JBNEP|~amPEGlg,冰冷下加入10mL裂解試劑(TFA/Thioanisole/EDT/anisole94:3:2:1，v/v))，電磁攪拌2-4h,氮?dú)獯等ゴ蟛糠諸FA,無水乙醚沉降，離心；DCM溶樣，無水乙醚沉降，離心分出固體；再重復(fù)2次，凍干，得側(cè)鏈無保護(hù)F-BNEP-amPEG粗品，HPLC純化、凍干，得純品465mg,40.45%。結(jié)構(gòu)確證(氨基酸組成分析，等)B.全去保護(hù)BNEP-amPEG制備將lg全保護(hù)Fmoc^NEP|~amPEG按照2.2除去Fmoc保護(hù)基的方法脫除Fmoc，然后按上述A法裂解去側(cè)鏈保護(hù)基，沉降、離心、重結(jié)晶后得全去保護(hù)的BNEP-amPEG-041108粗品。該粗品以適量水溶解，乙醚沉降，離心得固體；再重復(fù)2次，得較純品。HPLC純化，凍干，得純品450mg,收率39.0%。MALDI-TOF圖謙見附圖3-1、氨基酸組成分析圖譜見附圖3-2.實(shí)施例3本實(shí)施例涉及氨基酸組成分析。下述操作僅僅是為了說明，而不是限制本發(fā)明。3.1、AccQ-Tag方法測定氨基酸原理本法使用衍生劑為6-氨基喹啉-N-(羥基琥珀酰亞胺基)氨基甲酸酯(AQC),在pH810的條件下，可與各種氨基酸定量反應(yīng)生成單一產(chǎn)物。反應(yīng)如下+H:N-SH-C02H->〔TITTt+|/"—OH該衍生物有很強(qiáng)的紫外吸收，可以用紫外檢測器檢測^ax-248nm。3.2、儀器與試劑3.2丄儀器DIONEX公司-HPLC系統(tǒng)P680系列四元泵、紫夕卜/可見檢測器、四元脫氣裝置、柱溫箱、手動(dòng)/自動(dòng)進(jìn)樣器、M酸分析柱、CHROMELEON色譜工作站。3.2.2.輔助品微量內(nèi)襯管小瓶、15mL水解管、pH計(jì)、恒溫箱、溶劑過濾器、樣品過濾器、微量注射器或可變量程微量移液器(10100pL)。3.2.3.化學(xué)試劑及配制氨基酸標(biāo)樣(2.5pmol/mL);氨基酸衍生試劑AQC;EDTA-2Na溶液稱取100mgEDTA-2Na溶解于100mL純水中；稀磷酸溶液磷酸:7jc-l:l;流動(dòng)相A:稱取NaAc'3H2O19.04g溶解于lOOOmL純水中，用1:1的稀磷酸溶液調(diào)節(jié)pH到約5.2，加lmLEDTA-2Na溶液，精確加入三乙胺2.37mL,邊加邊攪拌。用稀磷酸溶液調(diào)p1^4.95，用0.45pm濾膜過濾，備用。使用之前超聲波脫氣20min。流動(dòng)相B:乙腈/水=3:2,混勻。使用之前超聲波脫氣20min。3.3、實(shí)驗(yàn)步驟3.3.1.衍生試劑準(zhǔn)備AccQ-TagFluorReagentKit(試劑盒)，臨用前，吸lmL乙腈移入2八#瓶中，蓋緊蓋子，搖10秒，55'C恒溫箱加熱使粉末完全溶解。3.3.2.氨基酸標(biāo)樣與樣品的衍生3..3.2.1氨基酸標(biāo)樣的衍生取氨基酸標(biāo)樣儲(chǔ)備液(2.5[imol/rnL)，臨用時(shí)用水(1:10)稀釋成氨基酸標(biāo)樣工作液lOOpmol/^L,用微量注射器精確吸取10pL工作液，加入微量內(nèi)襯管小瓶底部，用另一支微量注射器精確吸取pH8.8的硼酸鹽緩沖液70^L,加入小瓶中，在旋渦振蕩器上混合后，再用一支微量注射器精確吸取AQC溶液20nL,將小瓶放在旋渦混合器上邊振蕩混合邊加入AQC溶液。用封口膠帶將瓶口封好，放到55。C恒溫箱內(nèi)保溫510min，取出放置至室溫。3.3.2.2樣品的衍生多肽樣品510mg,加入lmL6MHCl，IIO'C加熱20h。減壓蒸干后，加入lmL20mMHC1,過濾取濾液O.lmL,加入到lmL20mMHC1溶液中，混勻。取該液40)aL，加入硼酸鹽緩沖液210pL,搖勻，50pLAQC邊加邊攪拌，然后于55。C水浴中放置510min，取出4寺用。3.3.3氬基酸組分的分析分別取衍生后的氨基酸標(biāo)樣和樣品20pL注入液相色譜儀，按下表中的色譜條件，在248nm波長下檢測。并以外標(biāo)法計(jì)算樣品中各氨基酸組分?jǐn)?shù)。Time(min)0151621293439444555Flow(mL/min)1.01.21.01.00.80.71.01.01.01.0B%0010152833100100003.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果將合成的樣品BNEP-amPEG-041108(2當(dāng)量投料，液相逐步合成法)，BNEP-amPEG-050304(液相片段合成法)，BPI-amPEG-041108(2當(dāng)量投料，液相逐步合成法)，分別稱取lOmg左右，按上述方法水解、衍生，測定。所得氨基酸組成分析結(jié)果表明，沒有缺損氨基酸，氨基酸比例合理，不過片段法合成結(jié)果更好。(見附圖2-2，附圖3-2)。實(shí)施例4本實(shí)施例涉及本發(fā)明的BNEP-amPEG對部分人源病菌的抑制試驗(yàn)。1.實(shí)驗(yàn)菌株實(shí)驗(yàn)所用菌抹均為2004年6月~2004年8月第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院臨床分離致病菌，由西南醫(yī)院檢驗(yàn)科分離并鑒定。其中金黃色葡萄球菌4抹、銅綠假單胞菌4林、表皮葡葡球菌2林、大腸埃希菌4林、肺炎克雷伯菌4林，共計(jì)18林。用標(biāo)準(zhǔn)菌大電子天平(Sartorius,德國)可調(diào)移液器(eppendorf，USA)腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853作質(zhì)控菌。2.培養(yǎng)基和試劑Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基(液體、固體)，中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品(批號010925);磷酸鹽緩沖液(PBS):磷酸氫二鉀8.17g,磷酸二氫鉀0.87g,加入蒸餾水1000mL,用O.lTVNaOH調(diào)pH為6.0。3.儀器多點(diǎn)接種儀(日本倉光^^式會(huì)社生產(chǎn))pH計(jì)(Beckman21，USA)4.實(shí)驗(yàn)方法4.1供試液制備精密稱取1-10號待測多肽樣品于2mL容量瓶中，分別用pH6.0磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，配成主藥含量為3840mg/L儲(chǔ)備液。4.2試驗(yàn)菌液制備實(shí)驗(yàn)前，從保存菌種的半固體培養(yǎng)基(或斜面)上取適量的菌苔，接種在MH培養(yǎng)基上，于37。C培養(yǎng)16~18h,再杏沐新鮮的單個(gè)菌落接種在MH肉湯培養(yǎng)基中，于37。C增菌培養(yǎng)16-18h,取出，每管菌液用MH肉湯培養(yǎng)基分別稀釋為0.5麥?zhǔn)媳确?biāo)準(zhǔn)(含菌量107-8CFU/mL)，保持菌液最終接種量為每點(diǎn)10"CFU。4.3最低抑菌濃度(MIC)測定采用瓊脂二倍稀釋法，將藥物含量為3840mg/L的儲(chǔ)備液用pH6.0PBS倍比稀釋成系列濃度，分別取lmL放入直徑90mm的平皿中，加入14mL熔化的MH瓊脂培養(yǎng)基，混勻，即得主藥含量分別為256,128,64,32,16，8，4,2,1,0.5,0.25，0.125mg/L的系列瓊脂平皿，待瓊脂凝固后，用多點(diǎn)接種儀在含藥瓊脂平亞及空白瓊脂平皿表面點(diǎn)種細(xì)菌，37。C孵育24h觀察結(jié)果，未見細(xì)菌生長的平亞內(nèi)的最小藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表。Table4.1amPEG修飾的BNEP對部分人源病菌的抑制試驗(yàn)(MIC:mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以相同重量給藥時(shí)，多數(shù)情況下經(jīng)amPEG修飾的BNEP、BPI較未經(jīng)修飾的BNEP抑菌活性要強(qiáng)；BNEP-amPEG-041108、BPI-amPEG-041108抑菌活性稍弱于BNEP-amPEG-050304;BNEP-amPEG-041108(逐步合成產(chǎn)品)抑菌活性稍弱于BNEP-amPEG-050304(片段合成產(chǎn)品)。如果按照等摩爾量給藥，修飾肽的抑菌活性顯然要比未經(jīng)修飾的BNEP抑菌活性強(qiáng)得多。這是對我們的極大鼓舞。實(shí)施例5本實(shí)施例涉及本發(fā)明的BNEP-amPEG進(jìn)行多濃度鱟試驗(yàn)。將BNEP-031112(1#),BNEP-amPEG陽050304(2#),BNEP-amPEG-0411084(3#)分設(shè)15、30、603個(gè)終濃度進(jìn)行鱟試驗(yàn)。每濃度3復(fù)管，另設(shè)陽性對照3復(fù)管和空白對照1管。1、材料鱟試劑湛江安度斯公司生產(chǎn)，批號0310310，靈敏度0.015EU/ml。多肽樣品BNEP-031112,BNEP-amPEG-0411084,BNEP隱amPEG-05030內(nèi)毒素4企測專用水，湛江安度斯公司生產(chǎn)，批號0411300。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品E.coli0111:B4，美國Sigma公司，批號69H4157。EDS99-內(nèi)毒素定量檢測儀，湛江正杰科學(xué)儀器有P艮公司生產(chǎn)。2、方法1)每支鱟試劑加入1.25ml的檢查用水稀釋、混勻；2)取檢測試管，每一試管中加入100^鱟試劑稀釋液；3)將LPS0111:B4用檢查用水稀釋為100ng/ml,在旋渦振蕩器上持續(xù)振蕩1h;4)將多肽樣品以檢查用水分別稀釋為3mM;5)實(shí)驗(yàn)設(shè)LPS組和藥物處理組，LPS組為1ng/ml的LPS溶液，藥物處理組為同終濃度的LPS溶液中分別加入多肽樣品。6)每個(gè)輻照EP管中加入200pi檢查用水，LPS組僅加入2nl的LPS(100ng/ml),藥物組分別加入l、2、4^1的多肽樣品(3mM)，再分別加入2pl的LPS(100ng/ml)，如此觀察不同濃度的多肽樣品(15、30、60pM)對LPS(1ng/ml)的中和效果；7)反應(yīng)體系設(shè)陰性對照，為200pl檢查用水；8)取陰性對照、LPS組及藥物處理組待檢測樣品100分別加入各試管中的鱟試劑稀釋液中，將檢測試管置于EDS-99細(xì)菌內(nèi)毒素測定系統(tǒng)中進(jìn)行檢測；9)每一濃度的待測樣品各做3復(fù)管；10)檢測結(jié)果以系統(tǒng)設(shè)定的單位(EU/ml)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，BNEP-amPEG-050304(2#)，BNEP-amPEG-041108(3#)在各濃度水平均有不同程度的內(nèi)毒素中和活性，而BNEP-031112(1弁)對內(nèi)毒素不具有中和作用。詳情見表5丄表5.1本發(fā)明多肽中和LPS鱟試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注P為各肽各濃度組與陽性對照組間比較。實(shí)施例6本實(shí)施例涉及本發(fā)明的變構(gòu)肽BNEP、BNEP-amPEG細(xì)胞因子刺激試驗(yàn)。眾所周知，細(xì)胞受到內(nèi)毒素LPS攻擊時(shí)，會(huì)主動(dòng)應(yīng)激發(fā)生炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生一系列炎癥因子如腫瘤壞死因子TNF-a、白細(xì)胞介素IL-6,IL-8等。TNF-a的檢查，可考察BNEP衍生物多肽對LPS攻擊細(xì)胞的保護(hù)作用。1.1材料與主要儀器1.1.1合成肽送樣編號為2(BNEP)、48(BNEP-ampeg-041108)多肽；l丄2其它試劑細(xì)胞株THP-1/CD14細(xì)胞抹由第一軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室提供；LPS7261:Sigma公司產(chǎn)品；IMDM培養(yǎng)液Invitrogen公司產(chǎn)品.TNF-a檢測試劑盒eBioscience公司產(chǎn)品；多粘菌素B(polymyxinBsulfate,PB):購自深圳晶美公司；l丄3;主要儀器恒溫孵育箱ThermoFormaModel3111電子天平SartoriusBP6196孔細(xì)胞培養(yǎng)板Falcon移液槍GILSON酶聯(lián)免疫測定儀(ELISAA45o值測定儀)BIO-RADModel550倒置顯微鏡:COICXDS-l(重慶光學(xué)儀器廠)1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1細(xì)胞試驗(yàn)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為lxl06/ml,取0.25ml于96孔板內(nèi)，置37。C、5。/。C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h;實(shí)驗(yàn)分對照組(Medium)和藥物處理組，對照組不加任何試劑，藥物處理組每孔加入多肽樣品(終濃度為15、30、60nM)繼續(xù)培養(yǎng)1h;藥物處理組加入LPS(終濃度100費(fèi)ng/ml),置37°C,5%C02培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h和12h后，取上清分別檢測TNF-a和IL-6濃度；每組設(shè)3復(fù)孔。1.2.2TNF-a和IL-6的測定(ELISA法)取出所需的酶標(biāo)板條，恢復(fù)至室溫，每孔中加入待測樣本100pi,37。C峰育1.5h，洗滌液洗板4次；加入1:100的生物素抗體工作液100pl，37。C醉育lh,棄去工作液，洗板4次；加入1:100的酶結(jié)合工作液，37°C孵育30min，洗板4次；加入100pi顯色液，避光顯色15min,加入100pi終止液，立即測定OD45o時(shí)各孔吸光值。按酶標(biāo)儀上讀取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行直線相關(guān)回歸分析，得出其直線回歸方程。將測得的不同標(biāo)本的OD值帶入直線回歸方程中，即得到相應(yīng)的細(xì)胞因子TNF-a和IL-6的含量。1.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果合成肽抑制試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下.表6-1多肽樣品對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化的影響("=3，3f±s)組別TNF-a(pg/ml)P值IL-6(pg/ml)P值Medium組LPS組2#88.6±18.33467.6±176.1277.0±1.81516.5±163.415nM3171.2±199.30.191469.9±217.20.8230nM3229.3±126.90.191508.7±199.30.9660nM3361.2±138.60.531461.7±156.70.740304#15nM3386.9±323.80.771259.4±120.10.1430nM1444.4±151.20細(xì)2958.3±42.90.0009601110.4±75.60.00006483.3±117.20.002l麵15nM3590.2±113.70.4541451.9±175.40.7230,3459.1±159.00.961377.2±152.80.4360—2889.6±1123.80.511492.1±156.60.88實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析三種多肽對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活化具有不同程度抑制作用，其中以0304#的活性具有量效關(guān)系且效果較為穩(wěn)定，1108弁僅在高濃度(6(^M)具有抑制作用，而2#盡管具有一定的活性但結(jié)果不具有量效關(guān)系，其活性有待進(jìn)一步研究。詳情見表6-2。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果僅支持0304#肽具有抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)細(xì)胞活化效果。實(shí)施例7本實(shí)施例涉及采用生物傳感器檢測BNEP-Z-amPEG多肽與LPS的親和力。1.材料含有BNEP的多肽1#Ac-CMT-Ahx-BNEP-030812;2#BNEP-031112;3#C17H35CO-BNEP-Ahx-CMT-030728;4#BNEP-Ahx-CMT-030625;9#Ac陽BNEP-Ahx-CMT-030625;11#BNEP-Tat-031222;0304#BNEP-amPEG-050304;1108#BNEP-amPEG-041108;PEG#amPEG-71;BPI#BPI-amPEG-041108。LPS055:B5，美國Sigma乂>司；無熱原磷酸緩沖液(PBS),按照無菌技術(shù)稱取磷酸氫二鉀8.17g,磷酸二氫鉀0.87g,加入蒸餾水100ml，用0.1mol/LNaOH調(diào)pH為7.0，再經(jīng)濾器過濾除熱原；生理鹽水(NS),pH7.0，西南醫(yī)院藥理基地生產(chǎn)；漩渦震蕩儀，XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠生產(chǎn)；生物傳感器及其疏7jc樣品池，美國Thermo公司；YJ-875SA型超凈工作臺，上海復(fù)星高科技有限公司。2.方法2.1生物傳感器疏水樣品池LPS的包被根據(jù)Thermo公司疏水樣品池的包被流程，將LPS包被在疏水樣品池中，并計(jì)算包被的LPS量。具體步驟如下根據(jù)包被的要求，儀器包被溫度設(shè)定為22°C,攪拌速率設(shè)定為85次/sec,數(shù)據(jù)采集設(shè)定為2次/sec;放入疏水樣品池，異丙醇清洗50x5,收集數(shù)據(jù)曲線1min;PBS/AE清洗60plx7，采集數(shù)據(jù)10min;異丙醇清洗50Hlx7,采集數(shù)據(jù)曲線1min;加入2mg/ml的LPS氯仿溶液20pl(用前超聲10sec)，留置1min;PBS/AE清洗50plx7,采集數(shù)據(jù)5min;1MHC1清洗50plx5,留置1min;PBS/AE清洗60)alx7,采集數(shù)據(jù)5min;lOmMNaOH清洗50[ilx5,留置1min;PBS/AE清洗60^1x7,采集數(shù)據(jù)5min,計(jì)算包被值；5mg/mlBSA90pl，保留5min;PBS/AE清洗60pix5，保留1min;檢查包被后的共掁圖形。2.2多肽樣品與LPS的親和力測定用PBS(pH7.0)配制模擬肽進(jìn)行生物傳感器檢測。以不同的模擬肽溶液為流動(dòng)相，分別與疏水樣品池中的LPS進(jìn)行結(jié)合、解離、再生反應(yīng)。具體步驟如下將模擬肽配制為100濃度液；生物傳感器攪拌速率設(shè)定為98次/sec,數(shù)據(jù)采集設(shè)定為3次/sec,溫度設(shè)定為25°C;包被LPS的疏水樣品池加入50pl的pH6.0、0.02MPBS，沖洗5次，保留至基線平4舒后吸出；結(jié)合反應(yīng)力口入PBS45^1,再加入5pl待測樣品，結(jié)合反應(yīng)平衡后吸出待測樣品；解離反應(yīng)PBS沖洗50plx3,解離反應(yīng)平衡后吸出；再生反應(yīng)O.IN的HC150^1x3,再生反應(yīng)平衡后吸出；PBS沖洗50plx3，曲線回至基線后加入45nlPBS，開始新的循環(huán)；儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。3.結(jié)果3.1生物傳感器疏水樣品池的包被LPS055:B5在疏水樣品池中的包被量為183.2arcsecond(A、B兩點(diǎn)間差的絕對值)，為脂類物質(zhì)在疏水樣品池中包被量的理想范圍。根據(jù)廠商提供的檢測方法，包被后的基線為銳利對稱的單峰圖形，證明所包被的LPS在疏水樣品池中形成均勻的單層脂膜，見圖4-l。3.2多肽樣品與LPS的親和力測定與LPS親和力最強(qiáng)者為3#,最弱者為PEG,親和力高低依次為3#>9#>11#>4#>1#>0304>2#>1108>BPI>PEG,見圖4-2。權(quán)利要求1、聚乙二醇修飾的抗菌、中和內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子，其特征在于具有下列結(jié)構(gòu)通式，Y-BNEP-Z-amPEG其中，Y是氫或其它修飾基團(tuán)，包括但不限于?；?、C1-C18烷基、芳基芐基、烯丙基；Z是各種連接基，包括但不限于-NH(CH2)nCO-(n＝1-8)、-NH(CH2)nX(n＝1-10，X＝O，S，NH，etc)，或者沒有連接基；amPEG的分子量包括但不限于2000，4000，6000，12000或20000。2、根據(jù)權(quán)利要求1中所述的聚乙二醇修飾的抗菌、中和內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子，其特征在于表現(xiàn)為多肽的藥學(xué)上可接受的各種無機(jī)酸或有機(jī)酸的鹽類。3、根據(jù)權(quán)利要求1中所述的聚乙二醇修飾的抗菌、中和內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子，其特征在于表現(xiàn)為多肽的鏈中或端位環(huán)肽。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌、抗內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子，其特征在于表現(xiàn)為各種多肽的鏈中或端位環(huán)肽的藥學(xué)上可接受的各種無機(jī)酸、有機(jī)酸的鹽類。5、權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的聚乙二醇修飾的抗菌、中和內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子用于制備治療或預(yù)防內(nèi)毒素膿毒癥、膿毒性休克疾病或癥狀藥物的用途。6、權(quán)利要求1-4中所述的聚乙二醇修飾的抗菌、中和內(nèi)毒素變構(gòu)肽分子的合成方法，其特征在于包括以下步驟(1)、母體肽樹脂F(xiàn)moc4BNEP^CTC合成通法稱取Fmoc-Lys(Boc)-CTC樹脂或其它多肽合成氨基酸樹脂倒入合成柱中，加入溶劑DCM、DMF或DCM/DMF溶脹，以10%-50%六氬吡咬的DMF溶液脫除氨基酸樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，檢測后抽濾至干，用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氬吡。定；稱取抗菌/中和內(nèi)毒素變構(gòu)肽BNEP的M酸序列C端第二個(gè)氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH于適宜的容器中，加入DMF溶解，然后加入偶聯(lián)劑和氮曱基嗎啉或二異丙基乙胺的DMF溶液；偶聯(lián)完成后，除去反應(yīng)液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌肽樹脂；加入20%-50%六氫吡啶的DMF溶液脫除^J^酸樹脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，除盡六氬吡啶；按照常規(guī)多肽固相化學(xué)合成方法，依照中國授權(quán)專利01104591.4中的BNEP9901315的氨基酸序列進(jìn)行后續(xù)偶聯(lián)，如此循環(huán)完成整個(gè)BNEP肽鏈的合成，得到母體肽樹脂F(xiàn)moc-^^CTC;充分洗滌，MeOH收縮，抽干，從合成柱中取出合成的肽樹脂，凍干機(jī)中凍干，備用；(2)、氮端衍生物乂-BNEP卩CTC制備將Fmoc棉EPl-CTC母體肽樹脂倒入合成柱中，加入溶劑溶脹，抽干，加入20%-50%六氬吡咬的DMF溶液脫除Fmoc,洗滌后加入?；噭┑腄MF溶液，攪拌或通氮?dú)饣蛘袷帲販?；偶?lián)完成后，除去反應(yīng)液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗滌，抽干，從合成柱中取出合成的BNEP肽Wf生物樹脂，置凍干機(jī)中凍千，得Y-[BNEPl國CTC;(3)、BNEP-amPEG分子的合成選擇采用以下兩種方法之一(3.1)從自制amPEG開始的逐步合成法(3.1.1)全保護(hù)[BNEPkmPEG制備通法脫除Fmoe圓底燒瓶中加入設(shè)計(jì)量的Fmoc-AAn.…AA廣amPEG，其中n=2,3...14，15-50%六氫吡啶的DCM溶液，控溫?cái)嚢?0-60min;旋蒸，無水乙醚析出沉淀，抽濾，DCM-EtOH/Et20重結(jié)晶兩次，P205真空干燥得去Fmoc保護(hù)的AAn....AA廣amPEG,其中n=l，2，3...13;偶聯(lián)圓底燒瓶中加入的AAn....AAi-amPEG,其中n=l,2...13，2倍量的保護(hù)氨基酸Fmoc-AAx-OH,其中x=2，3...14，0.02倍量的催化劑DMAP和DCM,溶解后加入的DIC;20-40。C油浴中電磁攪拌，TLC檢測反應(yīng)過程；反應(yīng)畢，停止反應(yīng)；旋蒸，無水乙醚析出沉淀，抽濾，無水乙醚洗滌3次，DCM/Et20或DCM-EtOH/Et20重結(jié)晶2次，茚三酮監(jiān)測，應(yīng)與空白顏色相同或相似，P20s真空干燥得全保護(hù)的肽樹脂F(xiàn)moc-AAn….AA,-amPEG，其中n=2,3...14，稱重計(jì)算收率；重復(fù)上述脫除Fmoc、偶聯(lián)操作，實(shí)現(xiàn)14個(gè)氨基酸的偶聯(lián)，得到全保護(hù)Fmoc-|BNEP|-amPEG,稱重計(jì)算收率；(3.1.2)BNEP-amPEG制備A.Fmoc-BNEP-amPEG制備全保護(hù)Fmoc-lBNEP|-amPEGlg，冰冷下加入lOmL裂解試劑TFA/Thioanisole/EDT/anisole94:3:2:1,v/v,電磁攪拌2-4h,氮?dú)獯等ゴ蟛糠諸FA,無水乙醚沉降，離心；DCM溶樣，無水乙醚沉降，離心分出固體；再重復(fù)2次，凍干，得側(cè)鏈無保護(hù)Fmoc-BNEP-amPEG粗品，HPLC純化、凍干，得純品，用氨基酸組成分析等方法確證結(jié)構(gòu)；B.BNEP-amPEG制備將1g全保護(hù)Fmoc-|BNEP|-amPEG除去Fmoc保護(hù)基后，按上迷A法裂解去側(cè)鏈保護(hù)，沉降、離心、重結(jié)晶后得全去保護(hù)的BNEP-amPEG粗品；該粗品以適量水溶解，乙醚沉降，離心得固體；再重復(fù)2次，得較純品；HPLC純化，凍干，得純品；用氨基酸組成分析等方法確證結(jié)構(gòu)；或，(3.2)從自制Fmoc~|BNEP|~CTC的片段合成法A.脫除樹脂計(jì)算量母體肽樹脂F(xiàn)moc-[BNEP|~CTC，加入三氟乙醇裂解試劑，r.t反應(yīng)60-120min,過濾，DCM、THF洗滌樹脂，收集濾液，減壓旋蒸到?jīng)]有液體蒸出；加入H20，析出大量白色固體，加入THF溶解固體，加飽和食鹽水溶液，分液，減壓旋蒸THF層得白色固體，真空干燥，得除去CTC樹脂的全保護(hù)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>B.偶聯(lián)amPEG全保護(hù)Fmoc國[BNE外OH加入DMF和THF,攪拌溶解后，加入4-6倍HOBt,冰水冷卻下加入4-8倍DIC;攪拌，加入含有1-4倍自制amPEG的DMF溶液；撤除水浴，室溫?cái)嚢?8h后，置于25-40。C油浴攪拌反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程；反應(yīng)結(jié)束，轉(zhuǎn)入較大的圓底燒瓶，旋蒸除去THF，冷卻后加入冷凍的無水Et20，攪拌，靜置。抽濾，無水Et20洗滌，真空干燥。上述產(chǎn)物加入DCM,攪拌全溶后加入冷凍無水Et20，攪拌，抽濾，無水Et20洗滌，真空干燥，得到全保護(hù)Fmoc-[BNEP|-amPEG;C.除去Fmoc全保護(hù)Fmoc-|BNEP|-amPEG,加入piperidine的DMF溶液，25-40。C油浴攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)入較大的圓底燒瓶，加入冷凍的無水Et20,攪拌，抽濾，無水Et20洗滌，真空干燥；上述產(chǎn)物，加入EtOH,攪拌全溶后加入冷凍無水Et20，攪拌，抽濾，無水Et20洗滌，真空干燥，得到側(cè)鏈全保護(hù)的BNEP-amPEG;D.裂解去保護(hù)側(cè)鏈全保護(hù)JBNEP"amPEG，水冷下加入裂解試劑TFA/Thioanisole/EDT/anisole94:3:2:1，v/v，，電》茲攪拌2-3h,氮?dú)獯等ゴ蟛糠諸FA，無水乙醚沉降，離心；DCM溶樣，無水乙醚沉降，離心分出固體；再重復(fù)2次，凍干，得BNEP-amPEG粗品，HPLC純化、凍干，得純品。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的合成方法，所述步驟(1)中所述偶聯(lián)劑為TBTU/HOBt、HBT固OBt、HATU/HOAt、DIC/HOBt、DCC/HOBt、DCC/HOSu、TBT固OSu、PyBOP/HOBt或BOP/HOBt。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的合成方法，其特征在于所述步驟(2)所述?；噭┻x自(RCO)20/pyridine或RC02H/激活劑；所述的激活劑為DCC/HOBt、DCC/HOSu、TBTU/HOBt、HBTU/HOBt、HATU/HOAt、DIC/HOBt、TBTU/HOSu、PyBOP/HOBt、BOP/HOBt、DIC/HOSu或PyBOP/HOSu。全文摘要本發(fā)明涉及聚乙二醇(PEG)修飾的抗菌/中和內(nèi)毒素變構(gòu)肽BNEP分子、其合成方法及其醫(yī)學(xué)用途。本發(fā)明采用多肽固相合成法、多肽液相合成法以及這兩種方法的組合，將抗菌/中和內(nèi)毒素變構(gòu)肽BNEP以具有安全無毒、免疫原性極低、可以延長藥物血漿半衰期等優(yōu)異特性的PEG修飾，合成了一類amPEG修飾的BNEP衍生物Y-BNEP-Z-amPEG生物活性檢測表明，該衍生物不僅保留了BNEP的中和內(nèi)毒素活性，而且延長了BNEP的體內(nèi)半衰期，顯示了進(jìn)一步開發(fā)成為新型中和內(nèi)毒素藥物的潛力，為由革蘭陰性桿菌(G-)引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒癥和膿毒性休克等危重患者的治療提供新的治療藥物或方法。文檔編號C07K7/00GK101148470SQ200710092699公開日2008年3月26日申請日期2007年9月14日優(yōu)先權(quán)日2007年9月14日發(fā)明者劉紅萍,夏培元,宏徐,李同金,李長兵,楊大成,肖光夏,莉范,郭毅斌,顧敬松申請人:西南大學(xué)