專利名稱：一種提取動物組織總rna的試劑和提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)，具體涉及一種提取動物組織總RNA的試劑和提取方法。
背景技術(shù)：
RNA提取技術(shù)不僅是分子生物學(xué)技術(shù)的重要組成部分，也是功能 基因組學(xué)研究 技術(shù)的重要基礎(chǔ)。從RNA水平研究生物體內(nèi)基因的調(diào)控機制，已成為分子生物學(xué)研究 的一個重要手段。許多分子生物技術(shù)包括RNA作圖，Northern印跡、核酸酶保護試驗、 PT-PCR(reversetranscription polymerase chain reaction)、real time PCR、cDNA 文庫 構(gòu)建等實驗的成效在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。由于RNA不穩(wěn)定，所以提取時比DNA 面臨更多的困難。實驗成功與否的關(guān)鍵是有無RNA酶的污染。在提取RNA時，最大程度的 避免外源RNA酶的污染和抑制內(nèi)源RNA酶的活力，因此，創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，嚴格防 止RNA酶污染是成功提取RNA的關(guān)鍵。生物組織、細胞RNA的提取是目前分子生物學(xué)研究的基本方法之一。由于自然界 大量存在RNA酶，RNA的提取產(chǎn)物極易降解。因此，如何快速提取RNA并防止RNA降解一直 是分子生物學(xué)研究要解決的難題。有的動物組織如螃蟹肝胰腺組織中含大量內(nèi)源酶，極易 使RNA降解，用本試劑提取的RNA產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好、純度高。市場上的RNA提取試劑盒(如 TRIzol)極其昂貴，給普通分子實驗帶來了巨大的成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、穩(wěn)定性好的提取動物組織總RNA的試劑和提 取方法。本發(fā)明提供的一種提取動物組織總RNA的試劑，組分按重量份數(shù)計胍乙酸30-40 份，十二烷基硫酸鈉0. 1-0. 3份，苯酚5-10份，滅菌蒸餾水100份；冰醋酸調(diào)節(jié)pH至 5-6。-200C _4°C保存，有效期為1-2年。本發(fā)明提供的一種動物組織總RNA提取方法，包括如下步驟將上述試劑加入高溫滅菌離心管，按組織與試劑重量比1 8-10，將組織加 入離心管中，冰浴勻漿，直至無顆粒透明狀，室溫靜置5-20分鐘；10000-13000rmp離 心2-5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；加入上清液1/3以上體積的氯仿，震蕩混勻； 10000-13000rmp離心2_5min，將上清液轉(zhuǎn)移至第三離心管中；加入上清液1/2體積的IOM LiCL (或20% Li2SO4)和體積的冰凍異丙醇，充分混勻，靜置10-20min ； 10000-13000rmp 離心2-5min，回收沉淀，用75%的乙醇洗滌得總RNA，-80°C保存。用本發(fā)明試劑提取動物組織總RNA操作過程簡單，時間短，成本低，總RNA產(chǎn)品純 度高，穩(wěn)定性好。


圖1用本試劑提取長江華溪蟹組織總RNA瓊脂糖電泳圖
具體實施例方式實施例1 將胍乙酸40g、十二烷基硫酸鈉0. lg、苯酚5g和滅菌蒸餾水IOOg混合均勻，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH值至5. 5。實施例2:將胍乙酸350g，十二烷基硫酸鈉2g、苯酚60g和滅菌蒸餾水IOOOg混合均勻，用冰 醋酸調(diào)節(jié)PH值至5。下面為使用本發(fā)明提取試劑提取總RNA的實施例實施例3:將實施例1的試劑450 μ 1加入經(jīng)高溫滅菌的離心管，將螃蟹鰓組織50mg加入離 心管中，冰浴勻漿，直至無顆粒透明狀，室溫靜置10分鐘；IOOOOrmp離心2min，吸出上清，將 上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；加入上清液1/3體積的氯仿，震蕩混勻；IOOOOrmp離心3min， 吸出上清，將上清液轉(zhuǎn)移至第三離心管中；加入上清液1/2體積的20% Li2SO4和1/2體積 的冰凍異丙醇，充分混勻，_80°C靜置lOmin。IOOOOrmp離心2min，回收沉淀，用75%的乙醇 洗滌沉淀得總RNA。上述總RNA沉淀溶于100 μ 1無RNA酶的水中。電泳檢測電泳緩沖液為0. 5 X TBE緩沖液IL中加入3g乙酸胍，取5 μ 1總RNA溶 液，加6 X RNA上樣緩沖液1. 5 μ 1，1 %瓊脂糖甲醛凝膠80V電泳檢測，見圖1。用分光光度計檢測總RNA溶液，測得的OD26tZOD28tl的比值在1. 8 2. 0，RNA的濃 度=(OD26tl-OD28tl) Χ40 μ g/ml X稀釋倍數(shù)，計算得出每克組織中提取出總RNA 1. 2mg。實施例4 取實施例2的試劑100 μ 1，加入IOmg螃蟹肝胰腺組織勻漿，室溫靜置10分鐘； 13000rmp離心2min，吸出上清，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；加入上清液1/3體積的氯 仿，震蕩混勻；13000rmp離心3min，吸出上清，將上清液轉(zhuǎn)移至第三離心管中；加入上清液 1/2體積的20% Li2SO4和1/2體積的冰凍異丙醇，充分混勻，_80°C靜置15min。IOOOOrmp 離心2min，回收沉淀；用75%的乙醇洗滌沉淀。用分光光度計檢測，每克組織中提取出總 RNA 0. 9mg。實施例5 取實施例1的試劑100 μ 1，加入IOmg鯉魚肌肉組織勻漿，室溫靜置10分鐘； 13000rmp離心2min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；加入上清液1/3體積的氯仿，震蕩混 勻；13000rmp離心2min，吸出上清，將上清液轉(zhuǎn)移至第三離心管中；加入上清液1/2體積的 IOM LiCL和1/2體積的冰凍異丙醇，充分混勻，_80°C靜置15min。IOOOOrmp離心3min,回 收沉淀；用75%的乙醇洗滌沉淀。用分光光度計檢測，每克組織中提取出總RNA Img0實施例6 取實施例1的試劑100 μ 1，加入IOmg綿羊耳組織勻漿，室溫靜置10分鐘； 13000rmp離心2min，吸出上清，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；加入上清液1/3體積的氯 仿，震蕩混勻；13000rmp離心2min，吸出上清，將上清液轉(zhuǎn)移至第三離心管中；加入上清液 1/2體積的IOMLiCL和1/2體積的冰凍異丙醇，充分混勻，-80°C靜置15min。IOOOOrmp離心3min，回收沉淀；用75%的乙醇洗滌沉淀。用分光光度計檢測，每克組織中提取出總RNA 0.9mg。
權(quán)利要求
一種提取動物組織總RNA的試劑，其特征在于，組分按重量份數(shù)計胍乙酸30-40份，十二烷基硫酸鈉0.1-0.3份，苯酚5-10份，滅菌蒸餾水100份；冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5-6。
2.一種動物組織總RNA提取方法，其特征在于，包括如下步驟將權(quán)利要求1所述的試 劑加入高溫滅菌離心管，按組織與試劑重量比1 8-10，將組織加入離心管中，冰浴勻漿， 直至無顆粒透明狀，室溫靜置5-20分鐘；10000-13000rmp離心2-5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另 一離心管中；加入上清液1/3以上體積的氯仿，震蕩混勻；10000-13000rmp離心2_5min，將 上清液轉(zhuǎn)移至第三離心管中；加入上清液1/2體積的10M LiCL和1/2體積的冰凍異丙醇， 充分混勻，-20°C靜置10-20min ； 10000-13000rmp離心2_5min，回收沉淀，用75%的乙醇洗 滌得總RNA，-80°C保存。
3.權(quán)利要求2所述的動物組織總RNA提取方法，其特征在于，所述的10MLiCL用20% Li2S04 代替。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提取動物組織總RNA的試劑，其組分按重量份數(shù)計胍乙酸30-40份，十二烷基硫酸鈉0.1-0.3份，苯酚5-10份，滅菌蒸餾水100份；冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5-6。本發(fā)明提供了一種提取動物組織總RNA的方法，使用Li離子和異丙醇沉淀總RNA。整個過程操作簡單，成本低，獲得RNA純度高，穩(wěn)定性好。
文檔編號C12N15/10GK101831423SQ20101016355
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者王蘭, 袁慧, 高愛保 申請人:山西大學(xué)