專利名稱：針對(duì)人Cbfal基因的siRNA和其表達(dá)載體以及它們?cè)谥扑幹械膽?yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種特異性抑制人Cbfa1基因表達(dá)的siRNA與其表達(dá)載體以及它們?cè)谥扑幹械膽?yīng)用。
背景技術(shù)：
1.RNA干擾技術(shù)RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種高效、特異(專一性)的基因阻斷技術(shù)，被廣泛運(yùn)用于基因治療研究、功能基因組研究、藥物篩選、病毒感染研究、信號(hào)傳導(dǎo)途徑研究等領(lǐng)域。與用反義寡核苷酸技術(shù)的基因治療相比，雙鏈RNA干擾技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是①靶向性、專一性強(qiáng)。②雙鏈RNA干擾技術(shù)有放大持續(xù)作用，時(shí)間短，見效快，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和穩(wěn)定性均很好。③雙鏈RNA干擾技術(shù)所用合成的雙鏈RNA劑量小，比反義技術(shù)劑量小近萬倍。④雙鏈RNA可用載體進(jìn)行表達(dá)，一次轉(zhuǎn)染可持續(xù)表達(dá)一個(gè)月以上，穩(wěn)定并且表達(dá)量較高。目前RNAi技術(shù)已經(jīng)開始被應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)性治療，第一例是一名患有視網(wǎng)膜黃斑變性的患者。目前正在臨床或?qū)嶒?yàn)室研究階段的采用RNA干擾技術(shù)治療的疾病還有哮喘、Huntington′s病、艾治病、肝癌、炎性疾病、脊髓側(cè)索硬化、肝炎、心血管病和糖尿病等嚴(yán)重影響人類健康的疾患。RNA干擾技術(shù)給那些以往一些無法治療、難以治愈或難治性的疾病帶來了新的曙光。
2.目前骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)的治療狀況OA是全球最常見的肌-骨骼系統(tǒng)慢性退變性疾病之一。OA臨床治療手段極其有限，歸納起來主要有下面兩類針對(duì)緩解疼痛癥狀的藥物治療改善關(guān)節(jié)功能的手術(shù)治療。其中藥物治療主要有兩類(1)主要采用針對(duì)緩解疼痛的抗炎治療。這類藥物只是一定程度的緩解疼痛，并不能解除疼痛，并且還會(huì)帶來很多副作用，如胃腸道系統(tǒng)并發(fā)癥；(2)局部關(guān)節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸制劑，用于緩解疼痛癥狀和促進(jìn)早期OA病變組織修復(fù)。這兩類藥物治療是否能夠有效改善病變組織結(jié)構(gòu)或者延緩OA進(jìn)展還存在很大爭論。手術(shù)治療是目前治療OA晚期功能障礙的唯一有效手段。但是它存在很多不足之處，如手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥和高昂的手術(shù)費(fèi)用；而且這種膝、髖關(guān)節(jié)置換是有一定有效期限的，通常在10到20年左右需要做關(guān)節(jié)翻修手術(shù)。因此我們需要研究更為有效的治療方法，阻止其發(fā)展到晚期關(guān)節(jié)功能障礙的階段，提高患者的生活質(zhì)量，減少疾病給其帶來的巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。軟骨細(xì)胞肥大分化(即成熟分化)在OA中起了很非常重要的作用，是導(dǎo)致OA病變不可逆性的原因之一。
3.核心結(jié)合因子(core binding factor 1，Cbfa1)與軟骨細(xì)胞肥大分化以及骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系軟骨細(xì)胞肥大分化(即成熟分化)在OA中起了非常重要的作用，是導(dǎo)致OA病變不可逆性的原因之一。阻斷軟骨細(xì)胞肥大分化可以明顯緩解或預(yù)防病變進(jìn)展。我們準(zhǔn)備采用通過RNAi技術(shù)阻斷Cbfa1表達(dá)，進(jìn)而阻斷軟骨細(xì)胞肥大分化的途徑，來治療OA。我們的立論依據(jù)是(1)Cbfa1是調(diào)控軟骨細(xì)胞成熟分化和成骨細(xì)胞分化重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。無論在胚胎期還是出生后，Cbfa1都嚴(yán)格定位于骨骼系統(tǒng)的細(xì)胞系，而不表達(dá)于其他組織細(xì)胞。Cbfa1(-/-)小鼠動(dòng)物模型中，成骨細(xì)胞分化完全受阻，未見骨組織形成，軟骨細(xì)胞不能分化成熟，停留在肥大軟骨細(xì)胞前的狀態(tài)，但軟組織結(jié)構(gòu)沒發(fā)現(xiàn)異常改變。Cbfa1高表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大分化，促進(jìn)堿性磷酸酶活性和基質(zhì)鈣化。而在成熟分化的軟骨細(xì)胞中抑制Cbfa1表達(dá)，會(huì)顯著抑制堿性磷酸酶活性和基質(zhì)鈣化。(2)Cbfa1是基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13，MMP13)/膠原酶3轉(zhuǎn)錄合成所必要的調(diào)控因子，MMP13是II型膠原的主要降解酶，是導(dǎo)致軟骨結(jié)構(gòu)持續(xù)破壞的原因之一。成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞成熟分化為肥大軟骨細(xì)胞細(xì)胞后期，可以發(fā)現(xiàn)MMP13表達(dá)增高現(xiàn)象，但是在軟骨細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)有MMP13表達(dá)。在人骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中同時(shí)發(fā)現(xiàn)有Cbfa1和MMP13表達(dá)，Cbfa1和MMP13的分布一致，Cbfa1表達(dá)變化影響MMP13的表達(dá)水平。Cbfa1(-/-)小鼠中無MMP13表達(dá)。因此阻斷Cbfa1表達(dá)的同時(shí)會(huì)阻斷或減少M(fèi)MP13的表達(dá)。(3)應(yīng)用Cbfa1(+/-)實(shí)驗(yàn)小鼠研究發(fā)現(xiàn)，Cbfa1表達(dá)量減少會(huì)減輕OA的病變程度，延緩疾病進(jìn)展。(4)OA是一種局部病變，可以采用局部直接注射的給藥方式。

發(fā)明內(nèi)容
為此，本發(fā)明的目的是提供一種特異性有效抑制Cbfa1基因表達(dá)的siRNA和能夠產(chǎn)生上述siRNA的表達(dá)載體。它們可以特異地靶向作用于人Cbfa1mRNA，從而抑制Cbfa1表達(dá)，阻斷成骨細(xì)胞分化以及軟骨細(xì)胞肥大分化。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述siRNA或產(chǎn)生siRNA的表達(dá)載體在制備治療骨關(guān)節(jié)炎，以及與成骨細(xì)胞分化或軟骨細(xì)胞肥大分化相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
此類含有針對(duì)Cbfa1基因siRNA以及其表達(dá)載體的骨關(guān)節(jié)炎藥物適于局部直接灌注，或注射。
本發(fā)明中，含有針對(duì)Cbfa1基因的siRNA和其表達(dá)載體的藥物的主要用途是治療骨關(guān)節(jié)炎疾病具體包括如下原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎；繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；以及組織工程軟骨或細(xì)胞移植治療關(guān)節(jié)軟骨缺損遠(yuǎn)期發(fā)生的骨關(guān)節(jié)炎；以及與成骨細(xì)胞分化或軟骨細(xì)胞肥大分化相關(guān)疾病，在本說明書中，術(shù)語“治療”指的是預(yù)防性或防止性治療以及治療性或緩和疾病的治療，包括治療有患病危險(xiǎn)或者懷疑已經(jīng)患病的患者以及病態(tài)的或者已經(jīng)被診斷患有疾病或醫(yī)學(xué)狀況的患者。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種特異性抑制人Cbfa1基因表達(dá)的siRNA，其特征在于它包含表1中6種siRNA的其中任意一種或幾種，它們的堿基序列及作用部位(見表1)。
所述的針對(duì)Cbfa1基因siRNA，它們可通過人工合成以及質(zhì)粒、病毒表達(dá)載體表達(dá)形成，其特征在于該siRNA在3′端有2～6個(gè)dT或U修飾。
包括表1中所述的siRNA的表達(dá)載體。
所述的針對(duì)Cbfa1基因的siRNA和/或其表達(dá)載體在制備治療骨關(guān)節(jié)炎，以及與成骨細(xì)胞分化或軟骨細(xì)胞肥大分化相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明通過設(shè)計(jì)6種針對(duì)人Cbfa1mRNA序列的siRNA[見表1]，并且設(shè)計(jì)相應(yīng)的shRNA結(jié)構(gòu)，然后采用雙向或發(fā)夾結(jié)構(gòu)合成DNA鏈，通過重組將其構(gòu)建入質(zhì)粒載體或進(jìn)一步構(gòu)建入病毒載體。酶切鑒定法證實(shí)插入片斷正確。測序進(jìn)一步證實(shí)基因無點(diǎn)突變。將載有Cbfa1shRNA病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后，獲得慢病毒上清。體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Cbfa1shRNA表達(dá)載體抑制Cbfa1的表達(dá)效率。結(jié)果顯示本發(fā)明靶點(diǎn)1序列的Cbfa1siRNA表達(dá)載體抑制效率最好，達(dá)到了大于90％，其他的5個(gè)的siRNA序列的抑制Cbfa1表達(dá)的效率也均達(dá)到了大于70％。小鼠骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型驗(yàn)證，其具有明顯延緩疾病進(jìn)展，減輕關(guān)節(jié)病變程度。
表1干擾人Cbfa1基因表達(dá)的siRNA序列和作用位點(diǎn)

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明設(shè)計(jì)的針對(duì)Cbfa1的siRNA和其表達(dá)載體，能夠有效抑制Cbfa1基因表達(dá)75～90％以上，能有效阻斷軟骨細(xì)胞肥大分化以及成骨細(xì)胞分化，基本無毒副作用，作用劑量小，特異性非常高。


圖1設(shè)計(jì)雙鏈shDNA寡核苷酸鏈的模式2shRNA重組到質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)圖示圖3pEN_hH1c質(zhì)粒圖譜圖4psiCHECKTM-2圖譜圖5含有序列1(SEQ ID NO.1)Cbfa1shRNA的質(zhì)粒載體抑制Cbfa1表達(dá)的效果6pDSL_hpUGIP圖譜圖7將質(zhì)粒中的H1-Cbfa1-shRNA重組到病毒載體的演示圖具體實(shí)施方式
通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1.構(gòu)建Cbfa1siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體1、根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中的Cbfa1mRNA NM_001024630，NM_001015051和NM_004348序列，結(jié)合Ambion在線軟件和Maurice Ho設(shè)計(jì)的軟件設(shè)計(jì)選擇6條19nt的核苷酸序列作為RNAi靶點(diǎn)，它們能夠同時(shí)阻斷3個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)(見表1)。
我們以序列1(SEQ ID NO.1)為例靶點(diǎn)序列5’-GCACACCACTGTCCATTTA-3’2、構(gòu)建Cbfa1shRNA表達(dá)框架結(jié)構(gòu)；設(shè)計(jì)寡核苷酸鏈，末端引入BamH1和Xho1酶切位點(diǎn)，中間Loop序列TTCAAGAGA，設(shè)計(jì)模式圖見圖1。分別合成兩條含有shRNA對(duì)應(yīng)序列的互補(bǔ)DNA寡核苷酸單鏈。
正義寡核苷酸鏈5’-GATCCCCGCACACCACTGTCCATTTATTCAAGAGATAAATGGACAGTGGTGTGCTTTTTC-3’(SEQ ID NO.7)反義寡核苷酸鏈3’-GGGCGTGTGGTGACAGGTAAATAAGTTCTCTATTTACCTGTCACCACACGAAAAAGAGCT-5’(SEQ ID NO.8)3、構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程(如圖2所示)。取上述的正義和反義寡核苷酸鏈片斷各10μg，退火形成互補(bǔ)雙鏈。將中間載體pEN_hH1c(ATCC)(見圖3)BamH1和Xho1雙酶切后，凝膠電泳回收大片段。質(zhì)粒載體系統(tǒng)與shRNA重組(具體操作見AfCS protocol PP00000230.)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增、純化重組的質(zhì)粒DNA，限制性內(nèi)切酶篩選正確克隆的質(zhì)粒，基因測序保證序列的正確性，無基因突變4、將目標(biāo)基因Cbfa1cDNA連接融合到雙熒光酶(螢火蟲熒光酶和Renilla熒光酶)報(bào)告基因載體系統(tǒng)psiCHECKTM-2(Promega)(見圖4)中的Renilla基因結(jié)構(gòu)中，構(gòu)建psiCHECKTM-2Cbfa1；5、通過轉(zhuǎn)染試劑將psiCHECKTM-2Cbfa1分別與pEN_hH1cCbfa1shRNA、無關(guān)序列陰性對(duì)照和Renilla-shRNA陽性對(duì)照共同轉(zhuǎn)染到HEK239細(xì)胞中；應(yīng)用雙熒光酶報(bào)告分析系統(tǒng)，檢測螢火蟲和Renilla的熒光酶活性，測定Renilla/螢火蟲熒光酶活性比，同時(shí)比較pEN_hH1cCbfa1shRNA組和陰性、陽性對(duì)照組的Renilla/螢火蟲活性比值；結(jié)果顯示針對(duì)序列1(SEQ ID NO.1)的干擾能夠有效抑制Cbfa1表達(dá)達(dá)到95％(見圖5)。
實(shí)施例2.應(yīng)用上面篩選的最有效的Cbfa1siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建表達(dá)Cbfa1siRNA的慢病毒1、應(yīng)用LR.ClonaseTM II克隆酶反應(yīng)系統(tǒng)(invitrogen)處理pEN_hH1cCbfa1shRNA載體和pDSL_hpUGIP慢病毒表達(dá)載體(見圖6)，將質(zhì)粒中的hH1啟動(dòng)子-shRNA讀碼框架亞克隆到pDSL_hpUGIP載體中，構(gòu)建pDSL_hpUGIPCbfa1shRNA，模式圖參見圖7。限制性內(nèi)切酶篩選正確克隆的病毒載體。
2、分別將pDSL_hpUGIPCbfa1shRNA和pL_UGIP(空白對(duì)照，ATCC)與病毒包被載體共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，分別構(gòu)建出表達(dá)Cbfa1siRNA的慢病毒和空白對(duì)照慢病毒，兩者均具有綠熒光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)報(bào)告基因和Puromycin選擇性基因；基因測序保證序列的正確性，然后擴(kuò)增病毒。
實(shí)施例3.重組慢病毒pDSL_hpUGIPCbfa1shRNA抑制軟骨細(xì)胞肥大分化的體外實(shí)驗(yàn)1、聯(lián)合應(yīng)用IL-1α(10ng/ml)和維甲酸A(10-5M)作為誘導(dǎo)刺激因素進(jìn)行研究。(參考文獻(xiàn)Glasson SS，et al.Nature.2005；31；434(7033)644-8)2、取活檢得到的人關(guān)節(jié)軟骨組織塊，在添加IL-1α和維甲酸A無血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
3、實(shí)驗(yàn)分3組A組(實(shí)驗(yàn)組)應(yīng)用表達(dá)Cbfa1shRNA的慢病毒感染人關(guān)節(jié)組織塊中的軟骨細(xì)胞；B組(陰性對(duì)照組)空白對(duì)照腺病毒感染人關(guān)節(jié)組織塊中的軟骨細(xì)胞；C組(單純誘導(dǎo)組)體外培養(yǎng)的人關(guān)節(jié)組織塊。3組都在體外培養(yǎng)兩天后給予相同的刺激條件[即添加IL-1α(10ng/ml)和維甲酸A(10-5M)]。
4、分別于培養(yǎng)4周和8周后進(jìn)行檢測，觀察細(xì)胞表型改變，應(yīng)用定量RT-PCR和Western blot分別從mRNA和蛋白水平檢測Cbfa1、骨鈣素、堿性磷酸酶和磷酸甘油醛脫氫酶、脂蛋白脂酶、脂細(xì)胞蛋白2的變化。
5、結(jié)果顯示阻斷Cbfa1表達(dá)能夠阻斷軟骨細(xì)胞肥大分化。
實(shí)施例4.重組慢病毒pDSL_hpUGIPCbfa1shRNA抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞肥大方向分化的體外實(shí)驗(yàn)1、聯(lián)合應(yīng)用BMP2和TGFβ1作為誘導(dǎo)刺激因素進(jìn)行研究。
2、培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞，在添加BMP2和TGFβ1的無血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
3、實(shí)驗(yàn)分3組A組(實(shí)驗(yàn)組)應(yīng)用表達(dá)Cbfa1shRNA的慢病毒感染人MSCs，篩選陽性克隆細(xì)胞株；B組(陰性對(duì)照組)空白對(duì)照慢病毒感染人MSCs，篩選陽性克隆細(xì)胞株；C組(單純誘導(dǎo)組)提取、培養(yǎng)人MSCs。3組細(xì)胞都給予相同的刺激條件。
4、體外培養(yǎng)4周，觀察細(xì)胞表型改變，并且應(yīng)用定量RT-PCR和Westernblot檢測Cbfa1、骨鈣素、堿性磷酸酶和磷酸甘油醛脫氫酶、脂蛋白脂酶、脂細(xì)胞蛋白2的變化。
5、結(jié)果顯示阻斷Cbfa1表達(dá)能夠明顯阻斷間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化。
序列表<110>北京大學(xué)第三醫(yī)院<120>針對(duì)人Cbfa1基因的siRNA和其表達(dá)載體以及它們?cè)谥扑幹械膽?yīng)用<130>
<160>8<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>1gcacaccacu guccauuua 19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA
<400>2auacuuccau cuccaaaua 19<210>3<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>3uacuuccauc uccaaauau 19<210>4<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>4uggcagcacg cuauuaaau 19
<210>5<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>5auccaaauuu gccuaacca 19<210>6<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>6auuugccuaa ccagaauga 19<210>7<211>60<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>stem_loop<222>(27)..(35)<223>人工設(shè)計(jì)的正義鏈<400>7gatccccgca caccactgtc catttattca agagataaat ggacagtggt gtgctttttc 60<210>8<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>stem_loop<222>(23)..(31)<223>人工設(shè)計(jì)的反義鏈<400>8gggcgtgtgg tgacaggtaa ataagttctc tatttacctg tcaccacacg aaaaagagct 60
權(quán)利要求
1.一種特異性抑制人Cbfal基因表達(dá)的siRNA，其特征在于它包含下列6種的其中任意一種或幾種，它們的堿基序列以及作用于CbfalmRNA的具體部位如下①正義鏈5’-GCACACCACUGUCCAUUUA-3’反義鏈3’-CGUGUGGUGACAGGUAAAU-5’同時(shí)作用于CbfalmRNA的3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，具體部位是NM_001024630的第4038～4056位，NM_001015051的第3972～3990位，NM_004348的第4186～4204位。②正義鏈5’-AUACUUCCAUCUCCAAAUA-3’反義鏈3’-UAUGAAGGUAGAGGUUUAU-5’同時(shí)作用于CbfalmRNA的3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，具體部位是NM_001024630的第2853～2871位，NM_001015051的第2787～2805位，NM_004348的第3001～3019位。③正義鏈5’-UACUUCCAUCUCCAAAUAU-3’反義鏈3’-AUGAAGGUAGAGGUUUAUA-5’同時(shí)作用于CbfalmRNA的3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，具體部位是NM_001024630的第2854～2872位，NM_001015051的第2788～2806位，NM_004348的第3002～3020位。④正義鏈5’-UGGCAGCACGCUAUUAAAU-3’反義鏈3’-ACCGUCGUGCGAUAAUUUA-5’同時(shí)作用于CbfalmRNA的3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，具體部位是NM_001024630的第1644～1662位，NM_001015051的第1578～1596位，NM_004348的第1792～1810位。⑤正義鏈5’-AUCCAAAUUUGCCUAACCA-3’反義鏈3’-UAGGUUUAAACGGAUUGGU-5’同時(shí)作用于CbfalmRNA的3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，具體部位是NM_001024630的第1661～1679位，NM_001015051的第1595～1613位，NM_004348的第1809～1827位。⑥正義鏈5’-AUUUGCCUAACCAGAAUGA-3’反義鏈3’-UAAACGGAUUGGUCUUACU-5’同時(shí)作用于CbfalmRNA的3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，具體部位是NM_001024630的第1667～1685位，NM_001015051的第1601～1619位，NM_004348的第1815～1833位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性抑制人Cbfal基因表達(dá)的siRNA，它們可通過人工合成以及質(zhì)粒、病毒表達(dá)載體表達(dá)形成，其特征在于該siRNA在3′端有2～6個(gè)dT或U修飾。
3.包括權(quán)利要求1或者2所述的siRNA的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的特異性抑制人Cbfal基因表達(dá)的siRNA在制備治療骨關(guān)節(jié)炎，以及與成骨細(xì)胞分化或軟骨細(xì)胞肥大分化相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的特異性抑制人Cbfal基因表達(dá)的siRNA表達(dá)載體在制備治療骨關(guān)節(jié)炎，以及與成骨細(xì)胞分化或軟骨細(xì)胞肥大分化相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種特異性抑制人核心結(jié)合因子(core bindingfactor 1，Cbfa1)基因的siRNA及該siRNA的表達(dá)載體和它們?cè)谥苽渑cCbfa1基因有關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明以RNA干擾技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)出一組能誘發(fā)RNA干擾的siRNA，通過化學(xué)合成、轉(zhuǎn)錄合成siRNA，或通過質(zhì)粒、病毒載體表達(dá)一定量的siRNA，從而特異性抑制人Cbfa1基因的表達(dá)，達(dá)到抑制成骨細(xì)胞分化以及軟骨細(xì)胞肥大分化的目的。該siRNA及其表達(dá)載體可以用于制備高效快速、特異性強(qiáng)、副作用少的治療骨關(guān)節(jié)炎，以及與成骨細(xì)胞分化或軟骨細(xì)胞肥大分化相關(guān)的疾病的藥物。
文檔編號(hào)C07H21/00GK101067134SQ200710090980
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者孔清泉, 陳仲強(qiáng) 申請(qǐng)人:北京大學(xué)第三醫(yī)院