異戊二烯合酶和其編碼基因以及用于產(chǎn)生異戊二烯單體的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了用于建立優(yōu)良的異戊二烯單體產(chǎn)生系統(tǒng)的方法。具體地，本發(fā)明提供了以下(a)、(b)或(c)的多核苷酸及其類(lèi)似物：(a)多核苷酸，包含(i)由SEQ ID NO:1所代表的核苷酸序列，或(ii)由SEQ ID NO:1所代表的核苷酸序列中的第133位至第1785位的核苷酸殘基組成的核苷酸序列；(b)多核苷酸，包含與以上的(i)或(ii)的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列，且該多核苷酸編碼具有異戊二烯合酶活性的蛋白質(zhì)；或(c)多核苷酸，其與由和以上(i)或(ii)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且該多核苷酸編碼具有異戊二烯合酶活性的蛋白質(zhì)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】異戊二烯合酶和其編碼基因以及用于產(chǎn)生異戊二烯單體的 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及異戊二烯合酶和編碼其的基因，以及類(lèi)似物。

【背景技術(shù)】
[0002] 天然橡膠是輪胎和橡膠工業(yè)中非常重要的原材料。而主要由于新興國(guó)家中的動(dòng)力 化，將在未來(lái)加大對(duì)其的需求，鑒于對(duì)森林砍伐的規(guī)定和棕櫚的競(jìng)爭(zhēng)，增加農(nóng)場(chǎng)是不易的， 且難以期望天然橡膠產(chǎn)量的增加。因此，供需平衡將變得緊張。合成的聚異戊二烯作為替換 天然橡膠的材料是可獲得的。其原料單體（異戊二烯（2-甲基-1，3-丁二烯））主要通過(guò) 從獲自石腦油裂化的C5成分提取而獲得。然而，在近幾年，隨著輕質(zhì)油裂化物的使用，產(chǎn)生 的異戊二烯的量?jī)A向于降低，其供給成為問(wèn)題。并且在近幾年中，由于油價(jià)變化的極大影響 需要建立源自非油來(lái)源經(jīng)濟(jì)地產(chǎn)生異戊二烯的系統(tǒng)，以穩(wěn)定地保證異戊二烯單體的供給。
[0003] 考慮到該需求，已公開(kāi)了利用轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生異戊二烯單體的方法，該轉(zhuǎn)化體通過(guò)將 異戊二烯合酶基因及其源自分離的野葛或楊樹(shù)的突變體導(dǎo)入到微生物中以用于發(fā)酵生產(chǎn) 而獲得（參見(jiàn)，專(zhuān)利文獻(xiàn)1和2)。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005] 專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0006] 專(zhuān)利文獻(xiàn)I JP公開(kāi)第2011-505841號(hào)
[0007] 專(zhuān)利文獻(xiàn)2 JP公開(kāi)第2011-518564號(hào)
[0008] 非專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0009] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) I :Kesselmeier J.等人，Journal of Atmospheric Chemistry,卷 33,第 23-88 頁(yè)，1999。
[0010] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2 :Monson R. Κ·等人、plant Physiol.，卷 98，第 1175-1180 頁(yè)，1992。
[0011] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 3 :Kuzma J.等人、plant Physiol.，卷 101，第 435-440 頁(yè)，1993。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明所解決的問(wèn)題
[0013] 然而，專(zhuān)利文獻(xiàn)1和2中所描述的異戊二烯合酶的酶活性低，且當(dāng)使用這些異戊二 稀合酶基因時(shí)，關(guān)于以商生廣力廣生異戊-稀仍存在提升空間。
[0014] 本發(fā)明鑒于以上情形而產(chǎn)生，且本發(fā)明的目的是提供用于建立優(yōu)良的異戊二烯單 體產(chǎn)生系統(tǒng)的方法。
[0015] 解決問(wèn)題的方法
[0016] 作為用于解決以上問(wèn)題的大量研究的結(jié)果，本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)源自黧豆（黧豆 (Mucuna pruriens))的異戊二烯合酶具有產(chǎn)生異戊二烯單體的優(yōu)良的能力，并且實(shí)現(xiàn)了本 發(fā)明。
[0017] 因此，本發(fā)明為如下所述。
[0018] [1]以下（a)、（b)或（c)的多核苷酸：
[0019] (a)多核苷酸，包含⑴由SEQ ID NO: 1所代表的核苷酸序列，或（ii)由SEQ ID NO: 1所代表的核苷酸序列中的第133位至第1785位的核苷酸殘基所組成的核苷酸序列；
[0020] (b)多核苷酸，包含與以上的⑴或（ii)的核苷酸序列具有90%或更高同一性的 核苷酸序列，且該多核苷酸編碼具有異戊二烯合酶活性的蛋白質(zhì)；或
[0021] (C)多核苷酸，其與由和以上⑴或（ii)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的 多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且該多核苷酸編碼具有異戊二烯合酶活性的蛋白質(zhì)。
[0022] [2]根據(jù)[1]的多核苷酸其中所述多核苷酸來(lái)源于黧豆。
[0023] [3]以下（A)、⑶或（C)的蛋白質(zhì)：
[0024] ㈧蛋白質(zhì)，包含（i'）由SEQ ID NO: 2代表的全長(zhǎng)氨基酸序列，或（ii'）由SEQ OD N0:2代表的氨基酸序列中的第45位至第594位處的氨基酸殘基組成的氨基酸序列；
[0025] (B)蛋白質(zhì)，包含與（i'）或（ii'）的氨基酸序列具有90%或更高同一性的氨基酸 序列，且該蛋白質(zhì)具有異戊二烯合酶活性；或
[0026] (C)蛋白質(zhì)，包含在（i'）或（ii'）的氨基酸序列中具有一個(gè)或若干個(gè)氨基酸的缺 失、置換、添加或插入的氨基酸序列，且該蛋白質(zhì)具有異戊二烯合酶活性。
[0027] [4]表達(dá)載體，包含根據(jù)[1]或[2]的多核苷酸，或包含編碼根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)的 多核苷酸。
[0028] [5]轉(zhuǎn)化體，通過(guò)將根據(jù)[4]的表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主中而制備。
[0029] [6]根據(jù)[5]的轉(zhuǎn)化體，其中所述宿主具有經(jīng)由甲基赤蘚醇磷酸鹽途徑合成二甲 基丙烯基二磷酸鹽的能力。
[0030] [7]根據(jù)[6]的轉(zhuǎn)化體，其中所述宿主是大腸桿菌（Escherichia coli)。
[0031] [8]根據(jù)[5]至[7]中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化體，其中所述轉(zhuǎn)化體具有經(jīng)由甲羥戊酸途徑和 甲基赤蘚醇磷酸鹽途徑合成二甲基丙烯基二磷酸鹽的能力。
[0032] [9]根據(jù)[5]的轉(zhuǎn)化體，其中所述宿主是屬于棒狀桿菌（Corynebacterium)屬、泛 菌（Pantoea)屬、腸桿菌（Enterobacter)屬或酵母菌（Saccharomyces)屬的微生物。
[0033] [10] -種產(chǎn)生根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)的方法，包括利用根據(jù)[5]至[9]中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn) 化體形成根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)。
[0034] [11] 一種產(chǎn)生異戊二烯單體的方法，包括在根據(jù)[3]的蛋白質(zhì)的存在下從二甲基 丙烯基二磷酸鹽形成異戊二烯單體。
[0035] [12]根據(jù)[11]的方法，其中通過(guò)培養(yǎng)根據(jù)[5]至[9]中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化體形成異戊 二烯單體。
[0036] [13]根據(jù)[12]的方法，其中通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體從培養(yǎng)基中的碳源供給二甲基丙烯 基二磷酸鹽。
[0037] [14] -種產(chǎn)生異戊二烯聚合物的方法，包括（I)和（II):
[0038] (I)通過(guò)根據(jù)[11]至[13]中任一項(xiàng)所述的方法形成異戊二烯單體；和
[0039] (II)使異戊二烯單體聚合以形成異戊二烯聚合物。
[0040] 發(fā)明的效果
[0041] 根據(jù)本發(fā)明，可能建立優(yōu)良的異戊二烯單體產(chǎn)生系統(tǒng)。
[0042] 附圖簡(jiǎn)述
[0043] 圖1是顯示每單位重量的來(lái)自不同植物的干葉產(chǎn)生的異戊二烯的量的圖；
[0044] 圖2是顯示每從不同植物的葉提取的總蛋白質(zhì)的量產(chǎn)生的異戊二烯的量；
[0045] 圖3是顯示固定的染色體上的甲羥戊酸途徑的下游及其鄰近區(qū)域的示意圖的概 圖；和
[0046] 圖4是顯示固定的染色體上的由tac啟動(dòng)子控制的甲羥戊酸途徑的下游及其鄰近 區(qū)域的概圖。
[0047] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的實(shí)施方案
[0048]〈編碼異戊二烯合酶的多核苷酸〉
[0049] 本發(fā)明提供了編碼異戊二烯合酶的多核苷酸。
[0050] 異戊二烯合酶是將二甲基丙烯基二磷酸鹽轉(zhuǎn)化為異戊二烯的酶。發(fā)明人首先在 高溫下在相同的條件下在不同的植物中評(píng)估了產(chǎn)生異戊二烯的能力。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)黧豆（黧 豆）產(chǎn)生異戊二烯的能力比楊屬植物（鉆天楊（Populus nigra var. italic))和葛藤（野 葛（Pueraria Iobata))產(chǎn)生異戊二烯的能力高幾倍到幾十倍。然而，該產(chǎn)生異戊二烯的高 能力是否歸因于植物產(chǎn)生二甲基丙烯基二磷酸鹽的能力的高能力、植物的異戊二烯合酶的 高產(chǎn)或植物具有的高酶比活性尚不清楚。特別地，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)2和3中，Monson和Kuzma 等人利用由硫酸銨分級(jí)分離部分地純化的酶檢查了黧豆中的異戊二烯合酶活性的PH依賴(lài) 性和其他性質(zhì)，但黧豆中的比活性是否高于楊屬植物或葛藤并不清楚。因此，發(fā)明人通過(guò)硫 酸銨分級(jí)分離從楊屬植物和葛藤中部分地純化了異戊二烯合酶，并檢查了粗提溶液的比活 性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)源自黧豆的異戊二烯合酶的比活性比源自葛藤的異戊二烯合酶高幾倍到幾 十倍。還證明了所測(cè)量的來(lái)自黧豆的異戊二烯合酶的比活性比來(lái)自專(zhuān)利文獻(xiàn)1和2中所報(bào) 道的楊樹(shù)中的粗酶中的一的比活性高數(shù)十倍?；谝陨希@示了黧豆?jié)撛诘鼐哂懈吖δ艿?異戊二烯合酶。
[0051] 因此，分析了來(lái)自黧豆的異戊二烯合酶基因的核苷酸序列。以下將描述分析方法 的一個(gè)例子。
[0052] 已知異戊二烯合酶僅在植物的葉中表達(dá)，且在強(qiáng)光和高溫下其表達(dá)水平增加。因 此，首先從黧豆的葉中提取了總RNA，其中在40°C的溫度下在光照下又到了異戊二烯合酶 mRNA的轉(zhuǎn)錄。確認(rèn)了所提取的總RNA未分解且未被基因組DNA所污染。然后，將總RNA轉(zhuǎn) 化為雙鏈并破碎，利用高效測(cè)序儀僅分析在3'端具有聚腺苷酸序列的核苷酸序列。組裝重 疊的序列以獲得多個(gè)重疊群序列。對(duì)于這些重疊群序列進(jìn)行BLAST檢索，并檢測(cè)了與來(lái)自 野葛和楊樹(shù)的已知異戊二烯合酶基因的已登記的序列具有同源性（核苷酸序列的同一性） 的重疊群序列，并獲得了來(lái)自黧豆的異戊二烯合酶基因的部分序列。基于該部分序列，利用 標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行5'RACE(cDNA末端的快速擴(kuò)增）以分析來(lái)自黧豆的異戊二烯合酶基因的全場(chǎng) 核苷酸序列，其由SEQ ID NO: 1所代表。
[0053] 可獲得來(lái)自黧豆的異戊二烯合酶的cDNA，例如通過(guò)RT-PCR，利用以上所獲得的總 RNA作為模板，利用基于來(lái)自黧豆的異戊二烯合酶基因的經(jīng)分析的核苷酸序列信息設(shè)計(jì)的 引物來(lái)獲得。
[0054] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是包含以下的多核苷酸：（i)由SEQ ID NO: 1所代表的核苷酸序列，或（ii)由SEQ ID NO: 1所代表的核苷酸序列中的第133位至 第1785位的核苷酸殘基所組成的核苷酸序列。由SEQ ID NO: 1所代表的核苷酸序列可編 碼由SEQ ID N0:2所代表的氨基酸序列，由第1位至第132位的核苷酸殘基組成的核苷酸 序列可編碼推測(cè)的葉綠體定位信號(hào)，且由第133位至第1785位的核苷酸殘基組成的核苷酸 序列可編碼成熟的異戊二烯合酶的氨基酸序列。
[0055] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是包含與以上（i)或（ii)的核苷酸序 列具有90%或更高同一性的核苷酸序列的多核苷酸，且該多核苷酸編碼具有異戊二烯合酶 活性的蛋白質(zhì)。與核苷酸序列的百分比同一性可以是 97%、98%或99%或更高。異戊二烯合酶活性指從二甲基丙烯基二磷酸鹽（DMAPP)(下文 同）形成異戊二烯的活性。
[0056] 如下文所述的核苷酸序列的百分比同一性和氨基酸序列的百分比同一性可利用 Karlin 和 Altschul 的 BLAST 算法（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))和 Pearson 的FASTA算法（Methods Enzymol. ,183,63(1990))來(lái)確定。基于該BLAST算法發(fā)展了稱(chēng) 作BLASTP和BLASTN的程序（參見(jiàn)http://www. ncbi. nlm. nih. gov)。因此，核苷酸序列和 氨基酸序列的百分比同一性可利用這些程序在缺省設(shè)置下來(lái)計(jì)算。同樣，例如，使用來(lái)自 Genetyx Corporation 的軟件 GENETYX 7. 0· 9 版應(yīng)用 Lipman-Pearson 方法利用 ORF 中所編 碼的全長(zhǎng)多核苷酸部分，在"待比較的單元長(zhǎng)度=2"的設(shè)置下通過(guò)計(jì)算相似性所獲得的作 為百分比的數(shù)值可用作氨基酸序列的同源性。來(lái)源于這些計(jì)算中的值的最低的值可用作核 苷酸序列和氨基酸序列的百分比同一性。
[0057] 在又一個(gè)另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是在嚴(yán)格條件下與由與以上（i) 或（ii)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交的多核苷酸，且該多核苷酸 編碼具有異戊二烯合酶活性的蛋白質(zhì)。
[0058] "嚴(yán)格條件"指其中形成所謂的特異性雜交而不形成非特異性雜交的條件。這樣的 條件是難以清楚定量的。然而，舉例而言，該條件是其中基本上相同的多核苷酸具有高度同 一性的條件，例如，以上所描述的具有百分比同一性的多核苷酸相互雜交，而具有較低同一 性的多核苷酸相互不雜交。特別地，該條件可包括在約45°C下在6 XSCC (氯化鈉/檸檬酸 鈉）中雜交，然后在50至65°C下在0.2 X SCC和0. 1% SDS中洗滌一次或兩次或多次。
[0059] 本發(fā)明的餓多核苷酸可以說(shuō)DNA或RNA，且優(yōu)選地為DNA。本發(fā)明的多核苷酸可源 自黧豆。本發(fā)明的多核苷酸還可以是編碼本發(fā)明下文的蛋白質(zhì)的一種多核苷酸。
[0060] 〈異戊二烯合酶〉
[0061] 本發(fā)明還提供了具有異戊二烯合酶活性的蛋白質(zhì)。所述異戊二烯合酶活性如以上 所述。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是包含以下的蛋白質(zhì)：（i'）由SEQ ID N0:2 所代表的全長(zhǎng)氨基酸序列，或（ii'）由SEQ ID N0:2所代表的氨基酸序列中的第45位至第 594位處的氨基酸殘基組成的氨基酸序列。由SEQ N0:2所代表的氨基酸序列中的第1位至 第44位處的氨基酸殘基組成的氨基酸序列可編碼推測(cè)的葉綠體定位信號(hào)，且由SEQ N0:2 所代表的氨基酸序列中的第45位至第594位處的氨基酸殘基組成的氨基酸序列可編碼成 熟的異戊二烯合酶。
[0063] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是包含與以上α'）或（ii'）的氨基酸序 列具有90%或更高同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，且該蛋白質(zhì)具有異戊二烯合酶活性。與 氨基酸序列的百分比同一性可以是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% 或更1?。
[0064] 在又一個(gè)另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是包含在以上α'）或（?'）的氨基 酸序列中具有一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的突變的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，且該蛋白質(zhì)具有異戊二烯 合酶活性。氨基酸殘基的突變的例子可包括氨基酸殘基的缺失、置換、添加和插入?？蓪⒁?個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的突變導(dǎo)入到氨基酸序列中的一個(gè)區(qū)域或多個(gè)不同的區(qū)域中。術(shù)語(yǔ)"一個(gè) 或數(shù)個(gè)"指其中三維結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的活性未較大程度地受損的范圍。在蛋白質(zhì)的情況下， "一個(gè)或數(shù)個(gè)"代表的數(shù)目是，例如，1至100,優(yōu)選地為1至80,更優(yōu)選地為1至50、1至30、 1至20、1至10或1至5。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是用于純化的標(biāo)簽，比如組氨酸標(biāo)簽。
[0065] 當(dāng)在相同的條件下測(cè)量時(shí)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選地具有包含以上α'）或ar)中 任一的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的異戊二烯合酶活性的50%或更高、60%或更高、70%或更高、 80 %或更高、90 %或更高或95 %或更高的異戊二烯合酶活性。關(guān)于穩(wěn)定性，還優(yōu)選地是，當(dāng) 在4°C下在某緩沖液[50mM Tris-HCKpH 8.0)，和0· 15mM MgCl2]中儲(chǔ)存蛋白質(zhì)48小時(shí)時(shí)， 本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有的剩余活性為原始活性的30%或更高、40%或更高、50%或更高、60% 或更高或65%或更高。
[0066] 在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中，可將突變導(dǎo)入到催化結(jié)構(gòu)域中的位點(diǎn)和除催化結(jié)構(gòu)域之外 的位點(diǎn)中，只要保持了目的活性。能夠保持目的活性的待突變的氨基酸殘基的位置是本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的。特別地，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠識(shí)別結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)聯(lián)，因?yàn)楸绢I(lǐng)域 技術(shù)人員能夠1)比較具有相同類(lèi)型的活性的多個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列（例如，由SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列與其他異戊二烯合酶的氨基酸序列），2)明確相對(duì)保守的區(qū)域和非 相對(duì)保守的區(qū)域，和然后3)從相對(duì)保守的區(qū)域和非相對(duì)保守的區(qū)域分別地預(yù)測(cè)能夠起重 要功能作用的區(qū)域和不能起重要作用的區(qū)域。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠異戊二烯合酶的 氨基酸序列的待突變的氨基酸殘基的位置。
[0067] 當(dāng)通過(guò)置換突變氨基酸殘基時(shí)，氨基酸殘基的置換可以是保守置換。如本文所用 的，術(shù)語(yǔ)"保守置換"指利用具有相似的側(cè)鏈的氨基酸殘基置換某些氨基酸殘基。具有相似 側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族是本領(lǐng)域中已知的。這樣的家族的例子可包括具有堿性側(cè)鏈的氨 基酸（例如，賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸），具有酸性側(cè)鏈的氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸）， 具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸（例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、 半胱氨酸），具有非極性側(cè)鏈的氨基酸（例如，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸），在具有β位置具有支鏈的氨基酸（例如，蘇氨酸，纈 氨酸、異亮氨酸），具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸），具 有含羥基（例如，醇式，酚式）側(cè)鏈的氨基酸（例如，絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸），和具有含硫 側(cè)鏈的氨基酸（例如，半胱氨酸、甲硫氨酸）。優(yōu)選地，氨基酸的保守置換可以是天冬氨酸和 谷氨酸之間的置換，精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸之間的置換，色氨酸和苯丙氨酸之間的置換， 苯丙氨酸和纈氨酸之間的置換，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸之間的置換，和甘氨酸和丙氨酸 之間的置換。
[0068]〈表達(dá)載體〉
[0069] 本發(fā)明提供了表達(dá)載體。本發(fā)明的表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸或編碼本發(fā)明 的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
[0070] 本發(fā)明的表達(dá)載體的例子可包括細(xì)胞系統(tǒng)載體，其在宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)，和 無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)載體，其利用蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)。表達(dá)載體還可以是質(zhì)?；蛘陷d體。表達(dá)載體 還可以是DNA載體或RNA載體。
[0071] 適宜于宿主細(xì)胞的已知載體用作細(xì)胞系統(tǒng)載體。表達(dá)載體的例子包括基于ColE 質(zhì)粒，代表為PBR322衍生物，具有pl5A起始點(diǎn)的基于pACYC質(zhì)粒，基于pSC的質(zhì)粒和來(lái)源 于Bac的F因子的小型F質(zhì)粒以及大腸桿菌（Escherichia coli)中類(lèi)似的表達(dá)載體。此 夕卜,還可包括具有色氨酸啟動(dòng)子諸如trc和tac的表達(dá)載體、Iac啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、T5啟動(dòng) 子、T3啟動(dòng)子、SP6啟動(dòng)子、阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、冷休克啟動(dòng)子、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子， 和類(lèi)似物。
[0072] 無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)載體的例子可包括具有在細(xì)胞系統(tǒng)載體中示例的T7啟動(dòng)子或T3啟動(dòng) 子的表達(dá)載體；和用于在小麥無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中合成蛋白質(zhì)的載體，比如基于PEU的質(zhì)粒，其具 有SP6啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子。
[0073] 在利用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)載體的蛋白質(zhì)合成中，首先利用轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將目的蛋白質(zhì)的cDNA 轉(zhuǎn)錄而合成mRNA。所述轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可包括常規(guī)地和公開(kāi)地已知的那些轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，其中通過(guò) RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄cDNA。RNA聚合酶的例子可包括T7RNA聚合酶。
[0074] 因此，利用無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)翻譯mRNA以合成蛋白質(zhì)，該系統(tǒng)為翻譯系統(tǒng)。 在該系統(tǒng)中，包含翻譯所需的核糖體、翻譯起始因子、翻譯延伸因子、解離因子和氨酰tRNA 合成酶。這樣的蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)的例子可包括大腸桿菌提取物、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞和小麥胚芽 提取物。
[0075] 并且，還可包括重構(gòu)的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，其由以上翻譯所需的因子組成，其 獨(dú)立地純化。
[0076] 利用細(xì)胞系統(tǒng)載體進(jìn)行的蛋白質(zhì)合成將在下文〈轉(zhuǎn)化體〉中描述。
[0077] 可純化利用細(xì)胞系統(tǒng)載體或無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)載體合成的蛋白質(zhì)。純化的方法的例子可 包括利用鹽析方法和多種層析方法的方法。當(dāng)設(shè)計(jì)表達(dá)載體以表達(dá)標(biāo)簽序列諸如目的蛋白 質(zhì)的C末端或N末端的組氨酸標(biāo)簽，可應(yīng)用利用諸如鎳或鈷的對(duì)該標(biāo)簽具有親和力的物質(zhì) 利用親和層析方法的純化方法。此外，通過(guò)適當(dāng)?shù)募兓椒ㄅc離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析 或類(lèi)似的方法相組合可提高本發(fā)明的蛋白質(zhì)的純度。
[0078] 〈轉(zhuǎn)化體〉
[0079] 本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是通過(guò)將本發(fā)明 的表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主中獲得的一種轉(zhuǎn)化體。用于本法麻煩的宿主優(yōu)選地是細(xì)菌或真菌。 細(xì)菌可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。
[0080] 革蘭氏陽(yáng)性菌的例子可包括屬于以下的屬的細(xì)菌：桿菌（Bacillus)、李 斯特菌（Listeria)、葡萄球菌（Staphylococcus)、鏈球菌（Streptococcus)、腸球 菌（Enterococcus)、梭菌（Clostridium)、棒狀桿菌（Corynebacterium)、和鏈球菌 (Streptomyces)。優(yōu)選的是屬于桿菌屬和棒狀桿菌屬的細(xì)菌。
[0081] 屬于桿菌屬的細(xì)菌的例子可包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)、炭疽桿菌 (Bacillus anthracis)和錯(cuò)樣芽抱桿菌（Bacillus cereus)。枯草芽抱桿菌是更優(yōu)選的。
[0082] 屬于棒狀桿菌的細(xì)菌的例子可包括谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)、有效棒狀桿菌（Corynebacterium efficiens)和帚石南棒狀桿菌 (Corynebacterium callunae)。谷氨酸棒狀桿菌是更優(yōu)選的。
[0083] 革蘭氏陰性細(xì)菌的例子可包括屬于以下的屬的細(xì)菌：大腸桿菌（Escherichia)、 泛菌（Pantoea)、沙門(mén)氏菌（Salmonella)、弧菌（Vivrio)、沙雷氏菌（Serratia)和腸桿菌 (Enterobacter)。屬于大腸桿菌屬和腸桿菌屬的細(xì)菌是優(yōu)選的。
[0084] 作為屬于大腸桿菌屬的大腸桿菌是優(yōu)選的。
[0085] 屬于泛菌屬的細(xì)菌的例子可包括菠蘿泛菌（Pantoea ananati s)、斯氏泛菌 (Pantoea stewartii)、成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans)和朽1 樣泛菌（Pantoea citrea)。 菠蘿泛菌和檸檬泛菌是優(yōu)選的。歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)0952221中示例的菌株可用作屬于 泛菌屬的細(xì)菌。屬于泛菌屬的細(xì)菌的代表性菌株的例子可包括公開(kāi)于歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公 開(kāi)0952221中的菠蘿泛菌AJ13355菌株（FERM BP-6614)和菠蘿泛菌AJ13356菌株（FERM BP-6615)。
[0086] 屬于腸桿菌屬的細(xì)菌的例子可包括成團(tuán)腸桿菌（Enterobacter agglomerans)和 產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes)。產(chǎn)氣腸桿菌是優(yōu)選的。歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)0952221 中示例的細(xì)菌菌株可用作屬于腸桿菌屬的細(xì)菌。屬于腸桿菌屬的細(xì)菌的代表性菌株的例 子可包括成團(tuán)腸桿菌ATCC12287菌株、產(chǎn)氣腸桿菌TACC13048菌株、產(chǎn)氣腸桿菌NBRC12010 菌株（Biotechnol. Bioeng.，2007, Mar. 27 ;98 (2) :340-348)和產(chǎn)氣腸桿菌 AJl 10637 (FERM BP-10955)。產(chǎn)氣腸桿菌AJl 10637菌株自2007年8月22日保藏于國(guó)際專(zhuān)利保藏庫(kù)（IPOD)、 國(guó)家先進(jìn)工業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究所（AIST) (Chuo No. 6, Higashi 1-1-1，Tsukuba市，Ibaraki Pref.，JP、郵編305-8566)，并于2008年3月13日基于布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)移到國(guó)際保藏中心， 并在此獲得編號(hào)FERM BP-10955。
[0087] 真菌的例子可包括屬于以下的屬的微生物：酵母（Saccharomyces)、裂殖酵 母（Schizosaccharomyces)、耶羅威亞酵母（Yarrowia)、木霉（Trichoderma)、曲霉 (Aspergillus)、鐮刀霉（Fusarium)和毛霉（Mucor)。屬于酵母屬、裂殖酵母屬、亞羅酵母屬 或木霉屬的微生物是優(yōu)選的。
[0088] 屬于酵母屬的微生物的例子可包括卡爾斯伯酵母（Saccharomyces carlsbergensis)、酉良酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、分散酵母（Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母（Saccharomyces douglasii)、克魯弗酵母（Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母（Saccharomyces norbensis)和卵形酵母（Saccharomyces oviformis)。釀酒酵母是優(yōu)選的。
[0089] 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)作為屬于裂殖酵母屬的微生物是優(yōu) 選的。
[0090] 解脂耶羅威亞酵母（Yarrowia Iypolytica)作為屬于耶羅威亞酵母屬的微生物是 優(yōu)選的。
[0091] 屬于木霉屬的微生物的例子可包括哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、康氏 木霉（Trichoderma koningii)、長(zhǎng)枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)和綠色木霉（Trichoderma viride)。里氏木霉是優(yōu)選的。
[0092] 此外，用于本發(fā)明的宿主不受具體局限，只要宿主具有經(jīng)由參與二甲基丙烯基二 磷酸鹽的合成的甲羥戊酸（MVA)途徑和/或甲基赤蘚醇磷酸鹽（MEP)途徑合成作為異戊二 烯合酶的底物的二甲基丙烯基二磷酸鹽（DMPP)的能力，且宿主可以是昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì) 胞、植物細(xì)胞和類(lèi)似物。
[0093] 在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中，可增強(qiáng)合成作為異戊二烯合酶的底物的二甲基丙烯基二磷 酸鹽（DMPP)的途徑。對(duì)于該增強(qiáng)，可將表達(dá)具有將異戊烯二磷酸（IPP)轉(zhuǎn)化為二甲基丙 烯基二磷酸鹽（DMPP)的能力的異戊烯-二磷酸δ異構(gòu)酶的表達(dá)載體導(dǎo)入到本發(fā)明的轉(zhuǎn) 化體中。還可將參與與IPP和/或DMPP的形成相關(guān)的甲羥戊酸途徑和/或甲基赤蘚醇磷 酸鹽途徑的一種或多種酶導(dǎo)入到本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中。用于這樣的酶的表達(dá)載體可以是質(zhì)粒 或整合型載體。用于這樣的酶的表達(dá)載體還可以是DNA載體或RNA載體。用于這樣的酶的 表達(dá)載體還可表達(dá)參與甲羥戊酸途徑和/或甲基赤蘚醇磷酸鹽途徑中的多種酶（例如，一 種、兩種、三種或四種或更多種），且可以是，例如，用于多順?lè)醋有詍RNA的表達(dá)載體。參與 甲羥戊酸途徑和/或甲基赤蘚醇磷酸鹽途徑中的一種或多種酶的來(lái)源可以是與宿主同源 的或異源的。當(dāng)參與甲羥戊酸途徑和/或甲基赤蘚醇磷酸鹽途徑中的酶的來(lái)源與宿主同源 時(shí)，例如，宿主可以是如以上所描述的細(xì)菌（例如，大腸桿菌）和參與甲羥戊酸途徑的酶可 以來(lái)源于真菌（例如，釀酒酵母）。此外，當(dāng)宿主固有地產(chǎn)生參與甲基赤蘚醇磷酸鹽途徑時(shí)， 待導(dǎo)入到宿主中的表達(dá)載體可表達(dá)參與甲羥戊酸途徑的酶。
[0094] 異戊烯-二磷酸δ異構(gòu)酶（EC:5. 3. 3. 2)的例子可包括Idilp (編號(hào)ΝΡ_015208)、 AT3G02780 (編號(hào) NP_186927)、AT5G16440 (編號(hào) ΝΡ_197148)和 Idi (編號(hào) ΝΡ_417365)。
[0095] 參與甲羥戊酸（MVA)途徑的酶的例子可包括甲羥戊酸激酶（EC:2. 7. 1. 36 ;例 l，Ergl2p，編號(hào) NP_013935 ;例 2，AT5G27450,編號(hào) NP_001190411)，磷酸甲羥戊酸激酶 (EC:2. 7. 4. 2 ;例 l，Erg8p，編號(hào) NP_013947 ;例 2，AT1G31910,編號(hào) NP_001185124,二磷 酸甲羥戊酸脫羧酶（EC:4. 1. 1.33;例 l，Mvdlp，編號(hào) NP_014441 ;例 2，AT2G38700,編號(hào) NP_181404 ;例 3, AT3G54250,編號(hào) NP_566995)，乙酰輔酶 A ?；D(zhuǎn)移酶（EC:2. 3. 1. 9 ;例 1，ErglOp，編號(hào) NP_015297 ;例 2, AT5G47720,編號(hào) NP_001032028 ;例 3, AT5G48230,編號(hào) NP_568694)，羥甲基戊二酰輔酶 A 合酶（EC:2. 3. 3. 10 ;例 1，Ergl3p，編號(hào) NP_013580 ;例 2, AT4G11820,編號(hào)NP_192919 ;例3, MvaS，編號(hào)AAG02438)，羥甲基戊二酸輔酶A還原酶 (EC:1. I. 1. 34 ;例 l，Hmg2p，編號(hào) NP_013555 ;例 2，Hmglp，編號(hào) NP_013636 ;例 3，AT1G76490， 編號(hào) NP_177775 ;例 4, AT2G17370,編號(hào) NP_179329, EC: I. I. L 88,例，MvaA，編號(hào) P13702)， 和乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酸輔酶A還原酶（EC:2. 3. 1.9/1. 1. 1.34,例，MvaE，編 號(hào) AAG02439)。
[0096] 參與甲基赤蘚醇磷酸鹽（MEP)途徑的酶的例子可包括1-脫氧-D-木酮糖5-磷 酸合酶（EC:2. 2. 1. 7,例 l，Dxs，編號(hào) NP_414954 ;例 2，AT3G21500,編號(hào) NP_566686 ;例 3, AT4G15560,編號(hào) NP_193291 ;例 4, AT5G11380,編號(hào) NP_001078570)，1-脫氧-D-木酮 糖 5-磷酸還原異構(gòu)酶（EC:1. I. 1. 267 ;例 l，Dxr，編號(hào) NP_414715 ;例 2, AT5G62790,編 號(hào) NP_001190600)，4_ 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶（EC:2. 7. 7. 60 ;例 1，IspD， 編號(hào) NP_417227 ;例 2，AT2G02500,編號(hào) NP_565286)，4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚 醇激酶（EC:2. 7. L 148 ;例 1，IspE，編號(hào) NP_415726 ;例 2，AT2G26930,編號(hào) NP_180261)， 2-〇甲基-0-赤蘚醇-2,4-環(huán)二磷酸合酶伍(：:4.6.1.12;例1，18口卩，編號(hào)即_417226 ; 例 2, AT1G63970,編號(hào) NP_564819)，1-羥基-2-甲基-2-(E) - 丁烯基-4-二磷酸合酶 (EC:1. 17.7. 1 ;例 1，IspG,編號(hào) NP_417010 ;例 2，AT5G60600,編號(hào) NP_001119467)和 4-羥 基-3-甲基-2-丁烯基磷酸還原酶（EC:1. 17. 1.2 ;例1，IspH，編號(hào)NP_414570 ;例2， AT4G34350,編號(hào) NP_567965)。
[0097] 將包含基因的表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主（轉(zhuǎn)化）中可利用已知方法來(lái)進(jìn)行。這樣的方 法的例子包括使用利用鈣處理的微生物細(xì)胞的感受態(tài)細(xì)胞方法和電穿孔方法。可通過(guò)利用 噬菌體載體而非質(zhì)粒載體感染微生物細(xì)胞來(lái)導(dǎo)入基因。
[0098] 并且，還可將編碼參與甲羥戊酸途徑或甲基赤蘚醇磷酸鹽途徑的酶的基因?qū)氲?本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中，所述酶合成作為異戊二烯合酶的底物的二甲基丙烯基二磷酸鹽。
[0099] 這樣的酶可包括1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶，其將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷 酸轉(zhuǎn)化為1-脫氧-D-木糖5-磷酸，和異戊基二磷酸異構(gòu)酶，其將異戊基二磷酸轉(zhuǎn)化為二甲 基丙稀基-憐酸鹽。
[0100] 可從本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中提取或純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)，且異戊二烯可通過(guò)培養(yǎng)表達(dá) 本發(fā)明的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體來(lái)產(chǎn)生。
[0101]〈產(chǎn)異戊二烯單體和異戊二烯聚合物的方法〉
[0102] 本發(fā)明提供了產(chǎn)生異戊二烯單體的方法。產(chǎn)生本發(fā)明的異戊二烯單體的方法包括 在本發(fā)明的蛋白質(zhì)的存在下從二甲基丙烯基二磷酸鹽形成異戊二烯單體。
[0103] 產(chǎn)生本發(fā)明的異戊二烯單體的方法不是特別局限的，只要在本發(fā)明的蛋白質(zhì)的存 在下進(jìn)行方法，且可通過(guò)使用利用本發(fā)明的蛋白質(zhì)自身（例如，純化的蛋白質(zhì)）的酶反應(yīng)系 統(tǒng)來(lái)進(jìn)行方法或培養(yǎng)產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。優(yōu)選地，其通過(guò)培養(yǎng)本發(fā)明 的轉(zhuǎn)化體來(lái)進(jìn)行。當(dāng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體用于本發(fā)明的產(chǎn)生異戊二烯單體的方法中時(shí)，通過(guò)本 發(fā)明的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中的碳源中有效地供給作為異戊二烯單體的原料的二甲基丙烯基 二磷酸鹽。在培養(yǎng)基中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生主要作為來(lái)自碳源的排氣的異戊二烯單體。因 此，通過(guò)收集從轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的氣體來(lái)回收異戊二烯單體。在培養(yǎng)基中經(jīng)由宿主中的甲羥戊 酸途徑或甲基赤蘚醇磷酸鹽途徑從碳源合成異戊二烯合酶的底物二甲基丙烯基二磷酸鹽。
[0104] 用于培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基優(yōu)選地包含待轉(zhuǎn)化為異戊二烯的碳源。碳源可 包括碳水化合物諸如單糖、二糖、寡糖和多糖；由水解蔗糖獲得的轉(zhuǎn)化糖；甘油；具有一個(gè) 碳原子的化合物（下文稱(chēng)作Cl化合物）諸如甲醇、甲醛、甲酸、一氧化碳和二氧化碳；油諸 如玉米油、棕櫚油和大豆油；乙酸鹽；動(dòng)物脂肪；動(dòng)物油；脂肪酸諸如飽和脂肪酸和不飽和 脂肪酸；脂質(zhì)；磷脂；甘油酯；甘油脂肪酸酯諸如甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯；多肽諸如 微生物蛋白質(zhì)和植物蛋白質(zhì)；可再生碳源諸如水解的生物質(zhì)碳源；酵母提取物，或其組合。 關(guān)于氮源，可使用無(wú)機(jī)銨鹽諸如硫酸銨、氯化銨和磷酸銨，有機(jī)氮諸如水解的大豆、氨氣、氨 水和類(lèi)似的氮源。理想的是包含合適的量的需要的物質(zhì)諸如維生素 Bl和L-高絲氨酸或酵 母提取物和類(lèi)似物，作為有機(jī)痕量營(yíng)養(yǎng)物來(lái)源。此外，若需要的話，添加少量的磷酸鉀、硫酸 鎂、鐵離子、鎂離子和類(lèi)似物。用于本發(fā)明的培養(yǎng)基可以是天然培養(yǎng)基或合成的培養(yǎng)基，只 要其包含碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子和任選地其他有機(jī)痕量成分。
[0105] 單糖的例子可包括丙糖諸如酮丙糖（二羥基丙酮）和丙醛糖（甘油）；四糖諸如酮 丁糖（赤蘚酮糖）和丁醛糖（赤蘚糖，蘇糖）；戊糖諸如戊酮糖（核酮糖、木酮糖），戊醛糖 (核糖、阿拉伯糖、木糖、來(lái)蘇糖）和脫氧糖（脫氧核糖）；己糖諸如已酮糖（諸如psychose、 果糖、山梨糖、塔格糖），己醛糖（阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、 妥爾糖（tallose)，和脫氧糖（巖藻糖、蔗糖、鼠李糖）；和庚糖諸如景天庚酮糖。C6糖諸如 果糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖；和C5糖諸如木糖和阿拉伯糖是優(yōu)選的。
[0106] 二糖的例子可包括蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、松二糖和纖維二糖。蔗糖和乳糖是 優(yōu)選的。
[0107] 寡糖的例子可包括三糖諸如棉子糖、松三糖和麥芽三糖；四糖諸如阿卡波糖和水 蘇糖；和其他寡糖諸如低聚果糖（FOS)、低聚半乳糖（GOS)和低聚甘露糖（MOS)。
[0108] 多糖的例子可包括糖原、淀粉（淀粉糖、支鏈淀粉）、纖維素、糊精和葡聚糖（β 1， 3-葡聚糖），和淀粉和纖維素是優(yōu)選的。
[0109] 微生物蛋白質(zhì)的例子可包括來(lái)源于酵母或細(xì)菌的多肽。
[0110] 植物蛋白質(zhì)的例子可包括來(lái)源于大豆、玉米、油菜、麻風(fēng)樹(shù)、棕櫚、椰子、向日葵、花 生、芥末、棉花種子、棕櫚仁油、橄欖、紅花、芝麻和亞麻子的多肽。
[0111] 脂質(zhì)的例子可包括包含C4或更多碳的一種或多種飽和或不飽和脂肪酸。
[0112] 油優(yōu)選地為包含C4或更多C的一種或多種飽和或不飽和脂肪酸的脂質(zhì)，且在室溫 下為液體，和油的例子可包括來(lái)源于大豆、玉米、油菜、麻風(fēng)樹(shù)、棕櫚、椰子、向日葵、花生、芥 末、棉籽、棕櫚仁油、橄欖、紅花、芝麻、亞麻子、油質(zhì)微生物細(xì)胞、烏柏樹(shù)，和其兩種或更多種 的組合的脂質(zhì)。
[0113] 脂肪酸的例子可包括由式RCOOH代表的化合物（"R"代表烴基）。
[0114] 不飽和脂肪酸是在"R"中的兩個(gè)碳原子之間具有至少一個(gè)雙鍵的化合物，且不飽 和脂肪酸的例子可包括油酸、異油酸、亞油酸、棕櫚烯酸和花生四烯酸。
[0115] 飽和脂肪酸是其中"R"是飽和脂族基的化合物，和飽和脂肪酸的例子可包括 二十二烷酸、花生酸、十八烷酸、十六烷酸、十四烷酸和十二烷酸。
[0116] 其中，包含一個(gè)或多個(gè)C2至C22脂肪酸的那些是優(yōu)選的脂肪酸，和包含C12脂肪 酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸和C22脂肪酸的那些是更優(yōu)選的。
[0117] 碳源可包括鹽和這些脂肪酸的衍生物及這些衍生物的鹽。鹽的例子可包括鋰鹽、 鉀鹽和鈉鹽。
[0118] 碳源的例子還可包括碳水化合物的組合，諸如糖與脂質(zhì)、油、脂肪，脂肪酸和甘油 脂肪酸酯的組合。
[0119] 可再生碳源可能包括解生物質(zhì)碳的來(lái)源。
[0120] 生物質(zhì)碳源的例子可包括基于纖維素的底物，諸如木材的廢料、紙和紙漿、多葉植 物和果漿；和部分植物諸如莖、谷物顆粒、根和塊莖。
[0121] 用作生物質(zhì)碳源的植物的例子可包括玉米、小麥、黑麥、高粱、小黑麥、大米、小米、 大麥、樹(shù)薯，豆類(lèi)諸如豌豆、馬鈴薯、甘薯、香蕉、甘蔗和木薯。
[0122] 當(dāng)將可再生碳源諸如生物質(zhì)添加到培養(yǎng)基時(shí)，優(yōu)選地碳源是預(yù)處理的。預(yù)處理的 例子可包括酶預(yù)處理、化學(xué)預(yù)處理和酶處理與化學(xué)預(yù)處理的組合。
[0123] 優(yōu)選的是可再生碳源在添加到培養(yǎng)基之前是完全或部分水解的。
[0124] 碳源的例子還可包括酵母提取物和酵母提取物與另外的碳源諸如葡萄糖的組合。 酵母提取物與Cl化合物諸如一氧化碳和甲醇的組合是優(yōu)選的。
[0125] 在培養(yǎng)與本發(fā)明有關(guān)的轉(zhuǎn)化體的方法中，優(yōu)選的是在含有鹽溶液和營(yíng)養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn) 培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
[0126] 培養(yǎng)基并不特別局限，且培養(yǎng)基的例子可包括現(xiàn)成的可從商業(yè)上獲得的一般培養(yǎng) 基，諸如Luria Bertani(LB)肉湯、沙氏葡糖瓊脂（SD)肉湯和酵母培養(yǎng)基（YM)肉湯。可選 自適于使用的培養(yǎng)特定宿主的培養(yǎng)基。
[0127] 理想的是，除細(xì)胞培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)奶荚粗?，包含合適的礦物、鹽、補(bǔ)充元素、緩沖 液和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適于培養(yǎng)和利于異戊二烯產(chǎn)生的成分。
[0128] 優(yōu)選的將糖、金屬鹽、抗菌物質(zhì)和類(lèi)似物添加到培養(yǎng)基以維持本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中 表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
[0129] 用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)條件并不特別局限，只要能夠表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)， 且能夠使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件。
[0130] 培養(yǎng)溫度優(yōu)選地為20°C至37°C，氣體組成優(yōu)選地為6-84%的CO2濃度，和pH值優(yōu) 選地為約5至約9。
[0131] 根據(jù)宿主的性質(zhì)不同，優(yōu)選地在有氧的、無(wú)氧的或厭氧的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。
[0132] 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的方法的例子可包括使用已知的發(fā)酵方法，諸如批量培養(yǎng)方法、補(bǔ)料 培養(yǎng)方法或連續(xù)培養(yǎng)方法。
[0133] 在批量培養(yǎng)方法中，在發(fā)酵起始添加培養(yǎng)基組合物，并將轉(zhuǎn)化體接種到培養(yǎng)基組 合物中，在PH和氧濃度受控下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0134] 在通過(guò)批量培養(yǎng)方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體時(shí)，轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)始于溫和誘導(dǎo)期，經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期并最終經(jīng)歷生長(zhǎng)速度下降或停止的靜止期。異戊二烯通過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和靜止期的轉(zhuǎn)化 體來(lái)產(chǎn)生。
[0135] 在補(bǔ)料培養(yǎng)方法中，除了以上批量方法之外，根據(jù)發(fā)酵進(jìn)程逐漸地添加碳源。當(dāng)培 養(yǎng)基中的碳源的量將受限時(shí)，補(bǔ)料培養(yǎng)方法是有效的，因?yàn)檗D(zhuǎn)化體的新陳代謝由于分解代 謝產(chǎn)物抑制傾向于降低。補(bǔ)料培養(yǎng)可利用限定的量或過(guò)量的量的碳源諸如葡萄糖來(lái)進(jìn)行。
[0136] 在連續(xù)培養(yǎng)方法中，以恒定的速率將某些量的培養(yǎng)基連續(xù)地供給到生物反應(yīng)器， 同時(shí)去除相同的量的培養(yǎng)基。在連續(xù)培養(yǎng)方法中，可以高濃度恒定地保持培養(yǎng)，且培養(yǎng)基中 的轉(zhuǎn)化體通常在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
[0137] 可通過(guò)適當(dāng)?shù)赝耆虿糠痔鎿Q培養(yǎng)基來(lái)補(bǔ)充培養(yǎng)，且可防止對(duì)轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)可能 具有副作用的代謝副產(chǎn)物的積累，及死亡細(xì)胞的積累。
[0138] 本發(fā)明的表達(dá)載體具有的啟動(dòng)子可包括組成型啟動(dòng)子和可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。當(dāng)本發(fā) 明的表達(dá)載體具有可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如Iac啟動(dòng)子時(shí)，可通過(guò)將IPTG(異丙基硫代半乳糖 苷）添加到培養(yǎng)基中來(lái)誘導(dǎo)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)。
[0139] 評(píng)估通過(guò)培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的異戊二烯的量的方法的例子可包括方法：其 中通過(guò)頂空法收集氣相并通過(guò)氣相色譜來(lái)分析該氣相。
[0140] 具體地，頂空中的異戊二烯單體通過(guò)在密封小瓶中伴隨振蕩培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體來(lái) 獲得，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)氣相色譜分析該異戊二烯單體。然后，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，將通過(guò)氣相色譜測(cè)量 的曲線所計(jì)算的面積轉(zhuǎn)化為利用轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的異戊二烯單體的量。
[0141] 收集通過(guò)培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體獲得的異戊二烯單體的方法的例子可包括氣提法、 分餾法或通過(guò)熱或真空吸附于固相的異戊二烯單體的解離，或利用溶劑提取。
[0142] 在氣提方法中，將異戊二烯氣體持續(xù)地從排氣中移除。該異戊二烯的移除可通過(guò) 多種方法來(lái)進(jìn)行。移除的例子可包括吸附于固相，分離于液相中，和其中將異戊二烯氣體直 接濃縮的方法。
[0143] 異戊二烯單體可通過(guò)單一步驟或多步驟來(lái)收集。當(dāng)通過(guò)單一步驟收集異戊二烯單 體時(shí)，將異戊二烯單體轉(zhuǎn)化為液相，同時(shí)伴隨從排氣中分離異戊二烯單體。還可將異戊二烯 單體從排氣中直接濃縮以生成液相。當(dāng)通過(guò)多階段收集異戊二烯單體時(shí)，從排氣中分離異 戊二烯單體，且然后將其轉(zhuǎn)化為液相。例如，使異戊二烯單體吸附于固相，并利用溶劑從固 相中提取異戊二烯單體。
[0144] 收集異戊二烯單體的方法還包括純化異戊二烯單體。純化的方法可包括通過(guò)蒸餾 和多種色譜法從液相提取物中分離。
[0145] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)在產(chǎn)生異戊二烯的能力上比常規(guī)異戊二烯合酶更為優(yōu)越。因此， 利用表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體可有效地產(chǎn)生異戊二烯單體。
[0146] 本發(fā)明還提供了產(chǎn)生異戊二烯聚合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)生異戊二烯聚合物 的方法包括以下的（I)和（II):
[0147] (I)通過(guò)本發(fā)明的方法形成異戊二烯單體；和
[0148] (II)使異戊二烯單體多聚和以形成異戊二烯聚合物。
[0149] 可與以上所描述的產(chǎn)生本發(fā)明的異戊二烯單體的方法相同的方式進(jìn)行步驟（I)。 步驟（II)中的異戊二烯單體的聚合可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何方法來(lái)進(jìn)行。 實(shí)施例
[0150] 以下將參照實(shí)施例具體描述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。
[0151] 實(shí)施例1 :在植物中評(píng)估產(chǎn)生異戊二烯的能力
[0152] 1-1)測(cè)量每單位重量干葉形成的異戊二烯的量
[0153] 首先，測(cè)量植物中每Ig干葉形成的異戊二烯的量以評(píng)估在植物中產(chǎn)生異戊二烯 的能力。使用黧豆（黃毛黧豆（Mucuna bracteata))、垂柳（Salix babylonica)、美洲楓 香（Liquidambar styraciflua)、桃金娘（香桃木（Myrtus communis))和野葛（Pueraria Iobata)作為植物。
[0154] 在形成的異戊二烯的量的測(cè)量中，將氣體可替換干燥器（商品名：Vacuum Desiccator，由 AS ONE Corporation 生產(chǎn)）置于孵育器（商品名：Growth Chamber MLR-351H，由SANYO生產(chǎn)），并將孵育器設(shè)置為高溫誘導(dǎo)條件（40°C下100 μ mol E/m2/s照 明），同時(shí)驅(qū)動(dòng)設(shè)置于氣體可替換干燥器中的用于攪動(dòng)空氣的風(fēng)扇攪動(dòng)氣體可替換干燥器 中的空間里的空氣。在氣體可替換干燥器中的空氣溫度達(dá)到40°C之后，將種植于種植器 中的黧豆的植物體置于其中并在空氣可替換干燥器密封的狀態(tài)下持續(xù)3小時(shí)。然后，通過(guò) 抽吸泵經(jīng)由硅管、吸附管和氣體收集管從氣體可替換干燥器中的空間中吸出從黧豆釋放 的氣體組分。從而，從黧豆中釋放的氣體組分中的水蒸氣（水含量）在吸附管中吸附和 分離，將已分離水蒸氣的氣體組分導(dǎo)入到氣體收集管。隨后，利用氣相色譜儀（商品名： GC-FID6890,由Agilent生產(chǎn)）定量分析氣體收集管中收集的氣體組分中所含的異戊二烯。
[0155] 關(guān)于干葉的重量，新鮮的單葉的葉面積和當(dāng)新鮮的單葉在干燥器中在80°C下干燥 8小時(shí)的干重建立了極好的正相關(guān)。因此，推導(dǎo)了從葉面積轉(zhuǎn)化為干重的公式，并從來(lái)自用 于測(cè)量形成的異戊二烯的量的黧豆的植物體的整個(gè)葉面積評(píng)估干重。
[0156] 通過(guò)將從黧豆的整個(gè)植物體形成的異戊二烯的量除以所估計(jì)的整個(gè)植物體的重 量得到每Ig干葉形成的異戊二烯的量。
[0157] 結(jié)果證明了在每單位重量干葉形成的異戊二烯的量方面，黧豆是優(yōu)越的（圖1)。
[0158] 1-2)測(cè)量由總蛋白質(zhì)量形成的異戊二烯的量
[0159] 然后，測(cè)量從不同的植物的葉提取的總蛋白質(zhì)的量形成的異戊二烯的量。使用黧 豆（樣品1和2)、垂柳、美洲楓香、桃金娘和野葛作為植物。
[0160] 關(guān)于提取蛋白質(zhì)，制備了緩沖液溶液（50mM Tris-HCl，20mM MgCl，5%甘油， 0.02%Triton-X100，pH 8.0)，在立即使用前添加 10%Polyclar AT，20mM DTT，完全蛋白 質(zhì)酶片（一片/50mL)，和ImM苯甲脒HC1(終濃度，每種），并用作蛋白質(zhì)提取緩沖液。將 50mL的蛋白質(zhì)提取緩沖液添加至5g的樣品，然后在冰上的冰冷的研缽中徹底地研磨混合 物并通過(guò)雙重重疊的Miracloth過(guò)濾。將濾出液在12, 000G下離心20分鐘，并在40, 000G 下離心40分鐘以獲得上清液，將上清液用作粗提取物。
[0161] 隨后，利用硫酸銨分級(jí)分離該粗提取物。將硫酸銨的終濃度的40% -55%的范圍 中沉淀的蛋白質(zhì)在40, 000G下離心40分鐘，并將獲得的沉淀物在蛋白質(zhì)提取緩沖液中重新 溶解以獲得硫酸銨級(jí)分。
[0162] 利用Bradford測(cè)定通過(guò)測(cè)量硫酸銨級(jí)分計(jì)算總（硫酸銨級(jí)分）蛋白質(zhì)的質(zhì)量。 將Bradford試劑與標(biāo)準(zhǔn)蛋白，牛血清白蛋白反應(yīng)，利用分光光度計(jì)測(cè)量595nm波長(zhǎng)處的吸 光度。利用獲得的吸光度數(shù)值生成蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。還在稀釋50倍的硫酸銨級(jí)分中測(cè)量 了 595nm波長(zhǎng)處的吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)估了總（硫酸銨級(jí)分）蛋白的量。
[0163] 在形成的異戊二烯的量的測(cè)量中，將在100°C下煮沸的IOOyL的粗提取物或 100 μ L的粗酶溶液置于4mL玻璃小瓶中，且然后將2 μ L的0. 5M MgCl2溶液和5 μ L的 0.2Μ DMPP溶液添至其中。利用帶隔板的螺旋帽緊密封閉小瓶，且然后輕輕震動(dòng)小瓶并置 于40°C下的孵育器中。0. 5、1和2小時(shí)后，通過(guò)氣密注射器取樣頂隙中的0. 5至2mL的氣 體層，并利用氣相色譜儀（商品名：GC-FID6890,由Agilent制造）測(cè)量形成的異戊二烯的 量。通過(guò)從利用粗酶的情況下測(cè)量的值中減去利用在l〇〇°C煮沸的粗酶溶液的情況下測(cè)量 的值，計(jì)算〇. 5小時(shí)、1小時(shí)和2小時(shí)之后利用粗酶形成的異戊二烯的量。從每小時(shí)形成的 異戊二烯的量計(jì)算每Img總蛋白質(zhì)的酶活性（比活性）。保持作為異戊二烯合酶的底物的 DMPP的量恒定下，測(cè)量形成的異戊二烯的量。
[0164] 結(jié)果，證明了在由總蛋白質(zhì)的量形成的異戊二烯的量方面，黧豆是優(yōu)異的（圖2， 表1)。如上所述，顯示了黧豆具有優(yōu)異的產(chǎn)生異戊二烯的能力。
[0165] 表1.由總蛋白質(zhì)的量形成的異戊二烯的量（相對(duì)于野葛的情況的指數(shù)數(shù)字）
[0166]

【權(quán)利要求】
1. 一種多核巧酸，為W下的（a)、（b)或（c)所示的多核巧酸： (a)-種多核巧酸，包含（i)由SEQ ID N0:1代表的核巧酸序列，或（ii)由SEQ ID N0:1 代表的核巧酸序列中的第133位至第1785位的核巧酸殘基組成的核巧酸序列； 化）一種多核巧酸，其包含與（i)或（ii)的所述核巧酸序列具有90%或更高同一性的 核巧酸序列，并編碼具有異戊二帰合酶活性的蛋白質(zhì)；或 (C) 一種多核巧酸，其在嚴(yán)格條件下與由與（i)或（ii)的核巧酸序列互補(bǔ)的核巧酸序 列組成的多核巧酸雜交，并編碼具有異戊二帰合酶活性的蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核巧酸，其中所述多核巧酸來(lái)源于驚豆（Mucuna)。
3. -種蛋白質(zhì)，為W下的（A)、做或似所示的蛋白質(zhì)： (A) -種蛋白質(zhì)，包含a')由SEQ ID NO:2代表的全長(zhǎng)氨基酸序列，或（ii')由SEQ ID NO:2代表的氨基酸序列中的第45位至第594位的氨基酸殘基組成的氨基酸序列； 炬）一種蛋白質(zhì)，其包含與a')或（ii')所述的氨基酸序列具有90%或更高同一性 的氨基酸序列，并具有異戊二帰合酶活性；或 (C) 一種蛋白質(zhì)，其包含在a')或（ii')所述的氨基酸序列中具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸 的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列，并具有異戊二帰合酶活性。
4. 一種表達(dá)載體，包含根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多核巧酸或編碼根據(jù)權(quán)利要求3所 述的蛋白質(zhì)的多核巧酸。
5. -種轉(zhuǎn)化體，所述轉(zhuǎn)化體通過(guò)將根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主中而制 備。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體，其中所述宿主具有經(jīng)由甲基赤薛醇磯酸鹽途徑合成 二甲基丙帰基二磯酸鹽的能力。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化體，其中所述宿主是大腸桿菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中所述轉(zhuǎn)化體具有經(jīng)由兩個(gè)途徑，即 甲輕戊酸途徑和甲基赤薛醇磯酸鹽途徑合成二甲基丙帰基二磯酸鹽的能力。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體，其中所述宿主是屬于棒狀桿菌屬 (Corynebacterium)、泛菌屬（Pantoea)、腸桿菌屬巧nterobacter)或酵母菌屬 (Saccharomyces)的微生物。
10. -種產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括利用根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn) 化體形成根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)。
11. 一種產(chǎn)生異戊二帰單體的方法，所述方法包括在根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)的 存在下從二甲基丙帰基二磯酸鹽形成所述異戊二帰單體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述異戊二帰單體通過(guò)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求5-9 中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體來(lái)形成。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述二甲基丙帰基二磯酸鹽通過(guò)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化 體而由培養(yǎng)基中的碳源來(lái)供給。
14. 一種產(chǎn)生異戊二帰聚合物的方法，包括（I)和（II): (I) 通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述的方法形成異戊二帰單體；和 (II) 使所述異戊二帰單體聚合W形成所述異戊二帰聚合物。
【文檔編號(hào)】C12N9/88GK104471061SQ201380028453
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月30日
【發(fā)明者】林泰行, 原田美奈子, 高岡紗彩, 福島靖王, 橫山敬一, 西尾陽(yáng)介, 田島義教, 三原洋子, 中田國(guó)夫 申請(qǐng)人:株式會(huì)社普利司通, 味之素株式會(huì)社