專利名稱：大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，特別是涉及一種大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體及 其構建方法與應用。更進一步涉及到大麥黃矮病毒GAV病毒基因表達載體，及其轉化禾本科 植物小麥并獲得抗性植株的方法。
技術背景由大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus,簡稱BYDV)引起的小麥黃矮病(Wheat yellow dwarfdisease)是發(fā)生最為普遍和最具毀滅性的禾谷類作物病毒病之一。該病主要危害小麥， 自1960年在我國陜西、甘肅的小麥上首次發(fā)現BYDV以來，目前該病在我國西北、華北、 西南及華東等近20個省、市、自治區(qū)的冬春麥區(qū)每年都有不同程度的為害。其中以豫西、晉 南、關中、隴東及華東和西南地區(qū)為冬小麥的主要流行區(qū)，甘肅省河西走廊、陜北等地為冬 春麥混種流行區(qū)，寧夏、內蒙古、晉北、冀北及東北地區(qū)為春小麥的主要流行區(qū)。 BYDV是由蚜蟲以持久性方式傳播。罹病寄主植物會出現葉片黃化、紅化、巻葉和植株矮化 等癥狀，光合作用與代謝遭到破壞，從而影響抽穗與結實。小麥黃矮病流行年份，全世界麥 區(qū)由此病造成的產量損失可達20%-30%， 一般年份也不少于2%-3%。根據不同種的麥蚜傳播 大麥黃矮病毒的能力不同，美國學者Rochow將大麥黃矮病毒劃分成5個株系，PAV、 MAV、 SGV、 RPV和RMV。在國內周廣和等將我國的大麥黃矮病毒分離物劃分為GAV、 GPV、 PAGV 禾口RMV，其中GPV為我國特有的株系。對于小麥黃矮病大發(fā)生的年份，治蟲防病是首選的應急措施?？梢酝ㄟ^藥劑防治降低蟲 口密度來控制病害的發(fā)生。但應慎重使用化學殺蟲劑，減少藥劑防治帶來的環(huán)境污染。調整 作物布局和播期以及清除田間雜草等栽培措施，在一定程度上也能起到減輕小麥黃矮病發(fā)生 的作用。選育和推廣抗耐病品種目前仍是防治小麥黃矮病乃至多種病毒病最經濟有效的方法。 迄今為止，普通小麥中尚未發(fā)現有抗性材料。小麥黃矮病的自然抗性基因主要存在于中間偃 麥草、偃麥草以及賴草屬等小麥近緣種屬中。辛志勇等運用細胞工程技術，即運用常規(guī)雜交 育種手段結合現代生物技術方法，將自然抗性基因從上述外源植物中導入到栽培小麥中。通 過中間偃麥草和普通小麥雜交獲得抗小麥黃矮病易位系，并選育出抗病品種"臨抗1號"。但是，常規(guī)育種的方法存在周期長、定向性差，易帶入不良性狀的缺陷。在分子生物學和植物生物技術迅速發(fā)展的近十余年中，基因工程技術為病毒病的綜合防治開辟了新途徑，植物病毒抗病基因工程的技術路線已趨向成熟，并且仍在不斷發(fā)展。迄今，應用的主要策略有A、病毒自身基因介導的抗性(Pathogen-derived resistance, PDR)包括 ①導入病毒外殼蛋白基因CP;②利用病毒非結構蛋白基因，如復制酶基因、運動蛋白基因、 其它一些功能基因等；③利用人工構建的缺損干擾顆粒(defective interfering particle);④利 用病毒弱毒株系全基因組介導的抗性。B、植物自身抗病基因，如N基因、R基因等。C、利 用植物源抗病毒活性物質基因，例如美洲商陸蛋白基因、天花粉蛋白基因等。D、直接或間 接作用于病毒核酸的策略，包括①反義RNA技術；②核酶基因；③dsRNA分解酶基因，如 Pacl基因等； 2'-5'寡聚腺苷系統(tǒng)(2'-5'A)。 E其它的抗病毒基因工程策略，包括①利用衛(wèi) 星RNA (satellite RNA， Sat-RNA);②利用抗體基因介導病毒抗性；③利用干擾素基因介導 病毒抗性。目前，國內外不同的研究小組已將BYDV的不同株系的外殼蛋白基因(CP)、復 制酶基因分別導入小麥或燕麥，并且獲得對BYDV有較強抗性的植株。RNA干擾是由RNA介導的通過特異性的相互作用來抑制基因表達的遺傳干擾現象，它 能夠特異、有效地降解mRNA，從而引起轉錄后水平的基因沉默。當表達來源與病毒某一基 因或核苷酸序列的轉基因植物發(fā)生RNA沉默時，能對入侵的同一病毒或同屬中相近病毒的 RNA進行降解，使入侵的病毒不能在植物中積累，從而賦予轉基因植物病毒抗性。近年來， RNA干擾技術在研究植物病毒基因功能與致病機制和植物抗病機理中有了廣泛應用，但在國 內外RNA干擾介導的BYDV-GAV抗性還未見報道。 發(fā)明內容基于上述領域中的空白，本發(fā)明提供了一種大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體，該載 體包含一種致病病毒的外殼蛋白基因。用該載體對植物進行遺傳轉化，所得到的轉基因植株 與入侵的致病病毒之間發(fā)生RNA沉默反應，入侵病毒不能繁殖或積累，從而具有抗病性。本 發(fā)明還提供該干擾病毒基因表達載體的構建方法及應用，為植物抗病育種提供了一種新的對 策和思路。一種大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體，其特征是采用的骨架載體是pMCG161，在其 上游的兩個酶切位點Ascl、 AvrII間插入大麥黃矮病毒外殼蛋白基因的正義鏈，在下游的兩個 酶切位點Spel、 Sgfl間插入其大麥黃矮病毒外殼蛋白基因的反義鏈。所述大麥黃矮病毒是大麥黃矮病毒GAV。上述干擾病毒基因表達載體的構建方法，包括如下步驟 (1)設計大麥黃矮病毒GAV外殼蛋白CP基因的引物 SEQ NOl: 5' ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3' SEQ NO 2: 5' CTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3'以BYDV-GAV的總RNA為模板，經RT-PCR擴增全長CP基因片段，回收目的片段后克隆 得到CP基因的陽性克隆，(2) 設計帶有四個酶切位點Ascl、 AvrII、 Spel和Sgfl的全長CP基因的RNA干擾引物 SEQ NO 3: 5' CTACTAGTGGCGCGCCATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3'SEQ NO 4: 5' CGGCGATCGCCTAGGCTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3'以CP基因的陽性克隆為模板，經RT-PCR擴增介導RNA干擾的BYDV-GAV外殼蛋白的前體雙鏈DNA，目的片段回收后，得到含目的片段陽性質粒，(3) 含目的片段的陽性質粒經AscI、 AvrII酶切得到正義鏈，經Spel、 AsiSI得到反義鏈，(4) pMCG161首先經Ascl、 AvrII酶切成線性片斷，將正義鏈連接到pMCG161載體的Ascl 和AwII位點，將反義鏈連接到pMCG161載體的Spel和Sgfl位點，最終構建成干擾載體。所述克隆獲取陽性質粒所用的載體pGEMT-easy載體，轉化菌株為大腸桿菌JMllO。 上述大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體的應用。所述應用是將上述大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體轉化有關受體植物使之對大麥黃 矮病毒產生抗性。所述轉化方法為基因槍法、農桿菌介導法或共轉化法。 所述轉化方法為基因槍法。 所述受體植物為未本科植物。 所述禾本科植物為小麥。本發(fā)明在BYDV-GAV的基因組(GenBank登錄號AY220739;晉治波等，2003)上設計 了 BYDV-GAV外殼蛋白(CP)介導的RNA干擾的dsRNA (600bp)前體，將BYDV-GAV的 CP基因連接到雙向干擾載體pMCG161載體的Ascl和AvrII位點，而后在正義鏈載體的基礎 上將BYDV-GAV的CP基因連接到雙向干擾載體pMCG161載體的Spel和Sgfl位點上構建 反義鏈片斷，最終構建了適合禾本科植物轉化的BYDV-GAV干擾載體。利用基因槍的方法進 行小麥的遺傳轉化，借助小麥組織中RdRp的轉錄作用，產生BYDV-GAV的CP基因的dsRNA 的形式，再由DicerIII的作用產生SiRNA，當小麥受BYDV-GAV侵染時，就可產生SiRNA， 從而達到利用RNA干擾介導對BYDV-GAV的抗性的目的。最終篩選出免疫或高抗 BYDV-GAV的轉基因小麥植株。本發(fā)明為植物抗病基因工程提供了一種干擾病毒基因表達載體及其構建方法與應用，為 轉基因技術及RNA干擾在生物抗性育種中的應用提供了新的思路。將該載體轉入小麥中，成 功獲得了抗病毒植株，實現了利用RNA干擾原理獲得抗BYDV—GAV小麥新品種的預期目標，為RNA干擾介導的植物抗性育種及基因工程提供了成功的實例，彌補了RNA千擾介導 的BYDV-GAV抗性在本領域研究中的空缺。本發(fā)明的干擾載體組合并不只限于對BYDV進行轉化和用于培育對BYDV有抗性的轉 基因植株。利用本發(fā)明的干擾載體轉化所得的抗性生物體可以是任何微生物、植物或其組織、 細胞，以及由此所獲得具有任何抗病活性的微生物、植物，以及該類植物后代的種子、雜交 和轉育后代。


圖1. RT-PCR擴增獲得BYDV-GAV的外殼蛋白(CP)基因的電泳圖片；圖2. RT-PCR擴增獲得介導RNA干擾的BYDV-GAV外殼蛋白(CP)的前體雙鏈DNA的電泳圖片；圖3A.大麥黃矮病毒GAV株系外殼蛋白干擾載體的構建過程中，正義鏈載體中正義鏈片段 的PCR鑒定；圖3B.大麥黃矮病毒GAV株系外殼蛋白干擾載體的構建過程中，正義鏈載體中正義鏈片段 的酶切鑒定(Ascl and AvrII);圖3C.大麥黃矮病毒GAV株系外殼蛋白反義鏈載體中反義鏈片段的酶切鑒定(Spel and AsiSI);圖3D.大麥黃矮病毒GAV株系外殼蛋白干擾載體的構建過程中，反義鏈片段的酶切鑒定 (Spel and AsiSI); M: DN A Marker DL2000; CK:陰性對照 圖4.載體pMCG161的結構示意圖； 圖5.質粒載體pMCG161外源片斷構建線性圖；圖6.小麥轉基因幼胚愈傷在含有PPT (5mg/L)分化培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)； 圖7.無激素的培養(yǎng)基上壯苗；圖8.在選擇壓為PPT6mg/L長勢旺盛的轉基因再生小麥；圖9.移栽到花盆中的轉基因小麥具體實施方式
實驗中使用的載體pMCG161 (該載體保存在中國農業(yè)科學院植物保護研究所病毒組實驗 室內，可向公眾發(fā)放)是專門適用于禾本科植物轉化的干擾載體(圖4)，它含有來源于水稻 的Rice waxy-a intron 1 ，位于5442bp-6576bp，在它的上游含有Ascl和AvrII兩個酶切位點， 用來構建CP基因的正義鏈，在它的下游含有AsiSI與Sgfl位點，用來構建CP基因的反義鏈(圖5)。實驗中所用的pGEM T-easy，購自Promega生物技術公司。 BYDV-GAV基因組在GenBank登錄號是AY220739。實施例l，大麥黃矮病毒GAV干擾病毒基因表達載體的構建歩驟l、依據BYDV-GAV的基因組序列，本發(fā)明首先設計全長CP基因的引物，如下 SEG NO 1: 5' ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3' SEQ NO 2: 5' CTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3'以BYDV-GAV的總RNA為模板，經RT-PCR擴增全長CP基因片段(600bp)(圖1)目的片 段回收后連接到pGEM T-easy載體上，轉化大腸桿菌JMllO，進行克隆測序鑒定，得到CP 基因的陽性克隆。步驟2、含RNA干擾的前體雙鏈CP基因陽性質粒的獲得按照RNA干擾的機制，本發(fā)明設計帶有四個酶切位點(Ascl、 AvrII、 Spel、 Sgfl)全長CP 基因的RNA千擾引物SEQ NO 3: 5' CTACTAGTGGCGCGCCATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3' SEq NO 4: 5' CGGCGATCGCCTAGGCTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3' 以CP基因的陽性克隆為模板，經RT-PCR擴增介導RNA干擾的BYDV-GAV外殼蛋白(CP) 的前體雙鏈DNA(圖2)。目的片段回收后連接到pGEM T-easy載體上，轉化大腸桿菌JMllO， 進行克隆測序鑒定，得到陽性質粒。步驟3、含目的片段的陽性質粒經Ascl、 AvrII酶切得到正義鏈，經Spel、 AsiSI(AsiSI與Sgfl 是同位酶)得到反義鏈。將載體pMCG161首先進行AscI、 AvrII酶切成線性片斷，將經AscI、 AvrII酶切得到正義鏈片斷，用T4連接酶連接到pMCG161載體的AscI和AvrlI位點，而后 在正義鏈載體的基礎上構建反義鏈片斷，即將經SpeI、 AsiSI(AsiSI與SgfI是同位酶)得到的 反義鏈片斷，用T4連接酶連接到pMCG161載體的Spel和Sgfl位點，最終構建成干擾載體 pMCG161+CP(SA)(簡寫pSA)(圖3)。同理可得到兩個對照載體正義鏈載體pMCG161+CP(S)(簡寫pS)、反義鏈載體 pMCG161+CP(A)(簡寫pA)。實施例2轉基因植物的獲得及檢測 歩驟l、取構建好的干擾載體及其對照載體，分別轉化JM110感受態(tài)細胞，涂板，37'C培養(yǎng) 過夜。挑取單菌落，經過小量液體LB (3-5ml)震蕩培養(yǎng)；中量培養(yǎng)(20-30ml)后；以1:50的比例接種200ml液體LB培養(yǎng)基，37'C震蕩培養(yǎng)2-3小時；加入終濃度為170p g/ml的 氯霉素，繼續(xù)培養(yǎng)16-18小時；5000rpml0分鐘離心收集菌體；采用大量質粒提取試劑盒 (Marligen)純化質粒。方法參見廠家說明書。獲得質粒濃度達2-3mg/ml，含有卯％以上的 超螺旋DNA，可用于基因槍轉化。步驟2、將授粉14天左右的小麥幼穗(品種揚麥158)從田間采回來，進行人工剝粒，然 后在超凈工作臺中經70%乙醇和10% (V/V)次氯酸納溶液消毒后，用解剖針，挑取小麥幼 胚，幼胚直徑約l-1.5mm為宜，放于SD2培養(yǎng)基上，盾片向上，胚芽向下，兩胚芽相互間距 0.5cm左右。幼胚進行剝離，并放入SD2培養(yǎng)基上培養(yǎng)。26。C黑暗條件下誘導愈傷組織，3d 后拔去伸長的胚芽，7-10d后將愈傷組織集中于培養(yǎng)皿中央，直徑約2cm左右，經0.4mol/L 滲透壓培養(yǎng)基(SD2添加0.2mol/L甘露醇，0.2mol/L山梨醇)處理4 6h以備基因槍轟擊之 用。步驟3、將步驟2備好的小麥愈傷組織和步驟1中提取的質粒應用于基因槍的轉化。轟擊后 的愈傷組織繼續(xù)在原滲透壓培養(yǎng)基上處理16 18h，然后轉入SD 2培養(yǎng)基黑暗條件下(26°C ) 恢復培養(yǎng)2周。歩驟4、恢復培養(yǎng)后的愈傷組織移到MS+NAA (lmg/L) +KT lmg/L +Bialaphos(PPT)3mg/L 的培養(yǎng)基上誘導分化3周(每日10h光照，24°C)(圖6),出現綠芽分化后，轉到無激素培養(yǎng) 基(MS+Bialaphos5mg/L)上培養(yǎng)1周，再轉入無激素培養(yǎng)基(MS+Bialaphos 5mg/L)上繼 續(xù)培養(yǎng)(每日10h光照，24 °C )(圖7),直到小苗生長到1 2em時，移入 MS+IAA(0.5mg/L)+Bialaphos(6mg/L)的培養(yǎng)基上壯苗(圖8)，再生植株生長到適宜大小(苗 高6 8cm，根系較好)時放入4'C冰箱中春化處理20 30天，然后移入裝有滅菌土的紙營 養(yǎng)缽中，外罩保鮮膜保濕。最后移入花盆，置于溫室。通過基因槍的遺傳轉化，獲得了四個 載體的TO代植株。(圖9)步驟5、本發(fā)明獲得了四個載體的轉基因小麥，pSA、 pS 、 pA、 pMCG161的陽性TO代轉基 因小麥株數分別是14株、4株、3株、3株。對轉基因小麥的TO、 Tl、 T2代分別進行了PCR 鑒定，T0代的陽性轉化率是分別是0.46。/。、 0.15%、 0.12%、 0.11%。干擾載體的T3代轉基因 小麥的接種試驗表明獲得了干擾載體的四個抗病性株系，他們是pSA-6、 9、 11、 12，發(fā)病嚴重度平均為3級以下(即抗病)。附錄SEQN0 1: 5' ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3'SEQN0 2: 5' CTATTTGGGAGTCATGTTGGC 37SEQ NO 3: 5' CTACTAGTGGCGCGCCATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3'SEQ NO 4: 5' CGGCGATCGCCTAGGCTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3'
權利要求
1、一種大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體，其特征是采用的骨架載體是pMCG161，在其上游的兩個酶切位點AscI、AvrII間插入大麥黃矮病毒外殼蛋白基因的正義鏈，在下游的兩個酶切位點SpeI、SgfI間插入其大麥黃矮病毒外殼蛋白基因的反義鏈。
2、 根據權利要求1所述的大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體，所述大麥黃矮病毒是大麥 黃矮病毒GAV。
3、 權利要求2所述的大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體的構建方法，包括如下步驟(1) 設計大麥黃矮病毒GAV外殼蛋白CP基因的引物 SEQ NO 1: 5' ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3'， SEQ NO 2: 5' CTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3'，以BYDV-GAV的總RNA為模板，經RT-PCR擴增全長CP基因片段，回收目的片段后 克隆得到CP基因陽性克隆， (2) 設計帶有四個酶切位點Ascl、 AvrII、 Spel和Sgfl的全長CP基因的RNA干擾引物 SEQ NO 3: 5' CTACTAGTGGCGCGCCATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3'，SEQ NO 4: 5' CGGCGATCGCCTAGGCTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3'， 以CP基因陽性克隆為模板，經RT-PCR擴增介導RNA干擾的BYDV-GAV外殼蛋白的 前體雙鏈DNA，目的片段回收后，得到含目的片段的陽性質粒，(3) 含目的片段的陽性質粒經AscI、 AvrII酶切得到正義鏈，經Spel、 AsiSI得到反義鏈，(4) pMCG161首先經Ascl、 AvrII酶切成線性片斷，將正義鏈連接到pMCG161載體的Ascl 和AvrII位點，將反義鏈連接到pMCG161載體的Spel和Sgfi位點，最終構建成干擾載體。
4、 根據權利權利3所述的構建軍方法，所述克隆獲取會目的片段的陽性質粒所用的載體 pGEMT-easy載體，轉化菌株為大腸桿菌JMllO。
5、 權利要求1或2所述的大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體的應用。
6、 根據權利要求5所述的應用，是將大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體轉化有關受體植 物使之對大麥黃矮病毒產生抗性。
7、 根據權利要求6所述的應用，所述轉化方法為基因槍法、農桿菌介導法或共轉化法。
8、 根據權利要求7所述的應用，所述轉化方法為基因槍法。
9、 根據權利要求6所述的應用，所述受體植物為未本科植物。
10、 根據權利要求9所述的應用，所述禾本科植物為小麥。
全文摘要
本發(fā)明涉及“大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體及其構建方法與應用”，屬于基因工程技術領域。本發(fā)明提供了一種大麥黃矮病毒干擾病毒基因表達載體，其特征是采用的骨架載體是pMCG161，在其上游的兩個酶切位點AscI、AvrII間插入大麥黃矮病毒外殼蛋白基因的正義鏈，在下游的兩個酶切位點SpeI、SgfI間插入其大麥黃矮病毒外殼蛋白基因的反義鏈。本發(fā)明構建的大麥黃矮病毒GAV干擾病毒基因表達載體，通過基因槍法將其轉入小麥中，獲得對大麥黃矮病毒GAV具有抗性的轉基因小麥品種。本發(fā)明為植物抗病育種提供了一種高效的育種途徑和新的策略。
文檔編號C12N15/63GK101215572SQ200810056509
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月21日 優(yōu)先權日2008年1月21日
發(fā)明者艷 劉, 吳蓓蕾, 周廣和, 王錫鋒 申請人:中國農業(yè)科學院植物保護研究所