專利名稱：秦艽地上部分提取的龍膽總苷在促進(jìn)腸胃消化功能藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及龍膽總苷的提取方法，具體涉及從秦艽地上部分提取龍膽總苷的方法以及通過該方法得到的龍膽總苷的用途，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
秦艽為龍膽科多年生草本瀕危植物，以根入藥。具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛之功效，是臨床常用藥物之一。
龍膽苦苷可從秦艽或龍膽中提取。龍膽總苷(含龍膽苦苷在50％以上)可用于制備促進(jìn)胃腸消化功能藥物(中國(guó)專利97108434.3)，龍膽苦苷可用于制備抑制乙型肝炎病毒藥物(中國(guó)專利200410073488.7)，用于制備保肝利膽抗炎藥物(中國(guó)專利03114558.2)。
《中華人民共和國(guó)藥典》自1977年版至2000年版規(guī)定秦艽為龍膽科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.、麻花秦艽G.straminea Maxim.、粗莖秦艽G..crassicaulis Duthie ex Burk.或小秦艽G.dahurica Fisch.的干燥根，通常所述的秦艽為秦艽的干燥根，中國(guó)專利97108434.3公開了一種從秦艽中提取龍膽苦苷的方法。
目前，無論用于藥物，還是用于提取其有效成分龍膽苦苷均使用秦艽的干燥根。而我國(guó)藥用秦艽長(zhǎng)期以來主要靠野生資源供應(yīng)市場(chǎng)需求，由于長(zhǎng)期大量采挖，野生資源越來越稀少，市場(chǎng)資源十分緊缺。如果能夠綜合利用秦艽這種稀缺資源，將更有利于保護(hù)秦艽。本發(fā)明著眼于秦艽地上部分，從秦艽地上部分提取龍膽苦苷，有利于資源的保護(hù)利用。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供從秦艽地上部分提取的龍膽苦苷的方法。
本發(fā)明目的之二是提供從秦艽地上部分提取的龍膽苦苷在促進(jìn)腸胃消化功能的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的秦艽地上部分指除了秦艽的干燥根之外的部分，包括莖和葉，主要為葉。
本發(fā)明技術(shù)方案為 從秦艽地上部分提取得到龍膽總苷，特別是從秦艽地上部分通過水提得到龍膽總苷，主要是盡量避免葉綠素等油溶性成分進(jìn)入水相。
具體提取工藝為取秦艽地上部分，先通過水提得到的煎煮液，煎煮液過D101或者HPD-100型大孔樹脂，用水洗脫至洗脫液無色，再用20％-50％乙醇洗脫，濃縮洗脫液至干，得龍膽總苷粗品。將龍膽總苷粗品溶于10-40倍丙酮，過濾、濃縮至干可得提純后龍膽總苷。
上述提取方法得到龍膽總苷可用于促進(jìn)腸胃消化功能藥物中。
上述提取方法得到龍膽總苷含量測(cè)定方法 1、供試品溶液的制備 精密稱取所得成品適量，在容量瓶中配制濃度為2mg/ml的成品溶液，搖勻，靜置。
2、測(cè)定方法 2.1色譜柱 HIQ sil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相甲醇-水(30∶70)；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；流速1ml/min；柱溫室溫；進(jìn)樣量20μl。
2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷對(duì)照品10.78mg，置10ml容量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。
2.3線性關(guān)系的考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液1，3，5，7，9，10μl注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定龍膽苦苷的峰面積，得線性回歸方程Y＝(4.92X-0.63)×105，相關(guān)系數(shù)r＝0.999。結(jié)果表明，對(duì)照品進(jìn)樣量在1.078-10.78μg之間具有良好的線性關(guān)系。
2.4精密度考察 供試品溶液經(jīng)微孔濾膜過濾后，精密吸取20 μl注入高效液相色譜儀測(cè)定，重復(fù)6次，得龍膽苦苷峰面積RSD為0.52％(n＝6)。
2.5加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取1ml供試品溶液6份，每份中加入一定量的對(duì)照品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果龍膽苦苷平均回收率為99.12％，RSD為0.96％(n＝6)。
3、重金屬檢查法 3.1樣品溶液的制備精密稱取所得成品4.00g，溶于100ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得。
3.2標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液的配制，按05版藥典附錄IX E重金屬檢查法配制儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液10ml，置100ml容量瓶中即得(每1ml相當(dāng)于10μg的鉛)。
3.3檢查方法按05版藥典附錄IXE重金屬檢查法，取標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液1ml和樣品溶液25ml，分置甲乙兩支納氏比色管中，甲管加醋酸鹽緩沖液(PH＝3.5)2ml，再加適量稀焦糖溶液稀釋至25ml后使兩管顏色一致。向甲乙兩管中分別加入硫代乙酰胺試液各2ml，搖勻，放置2min，同置白紙上，自上向下透視，乙管中顯示的顏色與甲管比較，不深與甲管顏色。即成品重金屬含量不大于10ppm。
從秦艽地上部分提取得到的龍膽總苷藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下 一.試驗(yàn)材料 1.受試藥物(1).秦艽地上部分中龍膽總苷(以龍膽苦苷計(jì)含量58.1％)由陜西省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。黃色固體，水溶性良好。批號(hào)060916(以下稱“龍膽總苷”)。
(2).秦艽地下部分中龍膽總苷(艽龍膠囊)，西安正大制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030201，產(chǎn)品批號(hào)060101(以下稱“艽龍膠囊”)。
(3).西藥必納維(西沙必利膠囊)，黑龍江省地納制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20020655，產(chǎn)品批號(hào)05100l(以下稱“西沙必利膠囊”)。
2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康ICR品系小白鼠，雌雄兼有，18-22g。由陜西省中醫(yī)藥研究院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)動(dòng)證字08-24號(hào)； 健康SD品系大白鼠，雌雄兼有，220-260g。由陜西省中醫(yī)藥研究院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)動(dòng)證字08-25號(hào)。
3.實(shí)驗(yàn)條件室溫在20-25℃，相對(duì)濕度為38％-41％，人工照明，明暗各12h，供固體飼料和自來水，自由攝食飲水，良好通風(fēng)。每日打掃室內(nèi)衛(wèi)生2次，保持室內(nèi)沒有明顯的氨臭味。
4.實(shí)驗(yàn)試劑及儀器參見各項(xiàng)試驗(yàn)內(nèi)容及要求。
5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)方法試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(

±s)表示，組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，以判斷藥物作用的顯著性。
二.試驗(yàn)與結(jié)果 1.秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)正常小鼠排便功能的影響 1.1材料動(dòng)物健康ICR品系小白鼠，雌雄兼有，18-22g。由陜西省中醫(yī)藥研究院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)動(dòng)證字08-24號(hào)。藥品與試劑受試藥物，碳素墨汁。儀器灌胃針頭、注射器、250ml燒杯、3mm網(wǎng)徑的鐵絲網(wǎng)、吸水紙等。
1.2方法與結(jié)果 取ICR品系小白鼠96只，雌雄各半，按體重、性別隨機(jī)分成6組(1)水對(duì)照組(0.8ml/只)、(2)龍膽總苷小劑量(70mg/kg)、(3)龍膽總苷中劑量(140mg/kg)、(4)龍膽總苷大劑量(280mg/kg)組、(5)艽龍膠囊組(200mg/kg)、(6)西沙必利膠囊組(15mg/kg)。每日灌胃給藥一次，連續(xù)6天后禁食不禁水12h后再給藥一次，于末次給藥30分鐘后每組小鼠灌胃給予0.3ml碳素墨汁。每只小鼠單獨(dú)放入一倒扣的250ml燒杯內(nèi)，在3mm網(wǎng)徑的鐵絲網(wǎng)下接預(yù)先稱量好的吸水紙一張接糞便，觀察記錄每只小鼠首次排黑便時(shí)間和7小時(shí)排便粒數(shù)并稱糞便總重量，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，與水對(duì)照組進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。結(jié)果龍膽總苷各劑量組、艽龍膠囊組、西沙必利膠囊組均能提高小鼠排便粒數(shù)與排便重量，縮短首次排便時(shí)間的作用，但均未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)果詳見表1。
表1秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)正常小鼠排便功能的影響(

) 注組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比*P＜0.05，**P＜0.01 2.秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)地芬諾酯引起的便秘模型小鼠排便功能的影響 2.1材料動(dòng)物健康ICR品系小白鼠，雌雄兼有，18-22g。由陜西省中醫(yī)藥研究院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)動(dòng)證字08-24號(hào)。藥品與試劑受試藥物；地芬諾酯片，江蘇武進(jìn)制藥廠生產(chǎn) 蘇衛(wèi)藥準(zhǔn)字〔1982〕第246401號(hào)2.5mg/片；碳素墨汁。儀器灌胃針頭、注射器、250ml燒杯、3mm網(wǎng)徑的鐵絲網(wǎng)、吸水紙等。
2.2方法與結(jié)果取ICR品系小白鼠80只，雌雄各半，按體重、性別隨機(jī)分成7組(1)水對(duì)照組(0.8ml/只)、(2)便秘模型地芬諾酯組(50mg/kg)、(3)龍膽總苷小劑量(70mg/kg)、(4)龍膽總苷中劑量(140mg/kg)、(5)龍膽總苷大劑量(280mg/kg)劑量組、(6)艽龍膠囊組(200mg/kg)、(7)西沙必利膠囊組(15mg/kg)。除(1)、(2)組灌胃蒸餾水0.8ml/只外，余5組按劑量給藥，每日灌胃給藥一次，連續(xù)6天后禁食不禁水12h。試驗(yàn)當(dāng)天便秘模型組和各劑量組先灌胃給予地芬諾酯50mg/kg，一小時(shí)后各劑量組給予受試藥物，便秘模型組和水對(duì)照組給予等容積蒸餾水，間隔30分鐘，再以碳素墨汁按每鼠0.3ml灌胃給予，每只動(dòng)物單獨(dú)放入一倒扣的250ml燒杯內(nèi)，在3mm網(wǎng)徑的鐵絲網(wǎng)下接預(yù)先稱量好的吸水紙一張接糞便，觀察記錄每只小鼠首次排黑便時(shí)間和9小時(shí)排便粒數(shù)并稱糞便總重量，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，與便秘模型組進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。結(jié)果地芬諾酯組使首次排出黑便時(shí)間比對(duì)照組顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)，龍膽總苷小、中、大劑量組及艽龍膠囊、西沙必利組能顯著縮短因地芬諾酯引起的排便時(shí)間延長(zhǎng)作用(P＜0.01)；地芬諾酯使排便粒數(shù)及排便重量顯著減少(P＜0.01)，龍膽總苷小、中、大劑量組及艽龍膠囊、西沙必利膠囊組能顯著增加因地芬諾酯引起的排便粒數(shù)減少及排便重量減少作用(P＜0.05、P＜0.01)結(jié)果詳見表2。
表2秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)地芬諾酯引起的便秘模型小鼠排便功能的影響(

) 注組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，與地芬諾酯模型組比*P＜0.05，**P＜0.01 3.秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)小鼠胃排空及腸推進(jìn)功能的影響 3.1材料 動(dòng)物健康ICR品系小白鼠，雌雄兼有，18-22g。由陜西省中醫(yī)藥研究院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)動(dòng)證字08-24號(hào)。藥品與試劑受試藥物；地芬諾酯片，江蘇武進(jìn)制藥廠生產(chǎn) 蘇衛(wèi)藥準(zhǔn)字〔1982〕第246401號(hào)2.5mg/片；半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊(取10g羧甲基纖維素鈉(CMC)，溶于250ml蒸餾水中，分別加入16g奶粉、8g糖、8g淀粉和2g活性炭末，攪拌均勻。配置成300ml約300g的黑色半固體糊壯物)儀器灌胃針頭、注射器、直尺、手術(shù)剪、手術(shù)鑷、縫合線、天平。
3.2方法與結(jié)果取ICR品系小白鼠112只，雌雄各半，按體重、性別隨機(jī)分成7組(1)水對(duì)照組(0.8ml/只)、(2)龍膽總苷小劑量(70mg/kg)、(3)龍膽總苷中劑量(140mg/kg)、(4)龍膽總苷大劑量(280mg/kg)劑量組、(5)艽龍膠囊組(200mg/kg)、(6)西沙必利膠囊組(15mg/kg)、(8)地芬諾酯組(50mg/kg)。除(1)、(8)組灌胃蒸餾水0.8ml/只外，余5組按劑量給藥，每日灌胃給藥一次，連續(xù)6天后禁食不禁水12h。試驗(yàn)當(dāng)天灌胃給藥一次，地芬諾酯組灌胃給予50mg/kg地芬諾酯，40分鐘后各組小鼠灌胃給予半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊0.8ml/只。20分鐘后脫頸椎處死小鼠，開腹，結(jié)扎胃黃門和幽門，取胃，用濾紙拭干后稱全重，然后沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物后拭干，稱胃凈重。以胃全重和胃凈重的差值為胃內(nèi)殘留物重，計(jì)算胃內(nèi)殘留物占所灌半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊的百分比為胃內(nèi)殘留率，胃內(nèi)殘留率與100％的差值為胃排空率。同時(shí)迅速取出小腸，輕輕剝離腸系膜后將小腸平鋪與玻璃板上拉成直線，測(cè)量幽門至回盲部的小腸全長(zhǎng)及幽門至半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊前沿的距離。以幽門至半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊前沿的距離除以幽門至回盲部的小腸全長(zhǎng)的百分率為小腸推進(jìn)率。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，與水對(duì)照組進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。結(jié)果龍膽總苷中、大劑量，艽龍膠囊，西沙必利膠囊能顯著提高半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊胃內(nèi)排空率(P＜0.05、P＜0.01)；地芬諾酯能顯著減少半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊胃內(nèi)排空率(P＜0.01)。龍膽總苷小、中、大劑量，艽龍膠囊，西沙必利膠囊能顯著提高半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊小腸推進(jìn)率(P＜0.05、P＜0.01)；地芬諾酯能顯著減少半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊小腸推進(jìn)率(P＜0.01)。結(jié)果詳見表3 表3秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)小鼠胃排空及腸推進(jìn)功能的影響(

) 注組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比*P＜0.05，**P＜0.01 4.秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)抗阿托品引起的小鼠胃排空延遲作用及腸推進(jìn)延遲作用的影響 4.1材料動(dòng)物健康ICR品系小白鼠，雌雄兼有，18-22g。由陜西中醫(yī)藥研究院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)動(dòng)證字08-24號(hào)。藥品與試劑受試藥物；硫酸阿托品注射液，江蘇永大制藥有限公司生產(chǎn)國(guó)藥準(zhǔn)字H32020045，產(chǎn)品批號(hào)20051002；半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊(取10g羧甲基纖維素鈉(CMC)，溶于250ml蒸餾水中，分別加入16g奶粉、8g糖、8g淀粉和2g活性炭末，攪拌均勻。配置成300ml約300g的黑色半固體糊壯物)儀器灌胃針頭、注射器、直尺、手術(shù)剪、手術(shù)鑷、縫合線、天平。
2.2方法與結(jié)果取ICR品系小白鼠112只，雌雄各半，按體重、性別隨機(jī)分成7組(1)水對(duì)照組(0.8ml/只)、(2)硫酸阿托品注射液組(2mg/kg)、(3)龍膽總苷小劑量(70mg/kg)、(4)龍膽總苷中劑量(140mg/kg)、(5)龍膽總苷大劑量(280mg/kg)劑量組、(6)艽龍膠囊組(200mg/kg)、(7)西沙必利膠囊組(15mg/kg)。除(1)、(2)組灌胃蒸餾水0.8ml/只外，余5組按劑量給藥，每日灌胃給藥一次，連續(xù)6天后禁食不禁水12h，試驗(yàn)當(dāng)天硫酸阿托品注射液組和各劑量組先皮下注射給予硫酸阿托品注射液2mg/kg，20分鐘后各劑量組給予受試藥物，硫酸阿托品注射液組和水對(duì)照組給予等容積蒸餾水，40分鐘后各組小鼠灌胃給予半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊0.8ml/只。20分鐘后脫頸椎處死小鼠，開腹，結(jié)扎胃賁門和幽門，取胃，用濾紙拭干后稱全重，然后沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物后拭干，稱胃凈重。以胃全重和胃凈重的差值為胃內(nèi)殘留物重，計(jì)算胃內(nèi)殘留物占所灌半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊的百分比為胃內(nèi)殘留率，胃內(nèi)殘留率與100％的差值為胃排空率。同時(shí)迅速取出小腸，輕輕剝離腸系膜后將小腸平鋪于玻璃板上拉成直線，測(cè)量幽門至回盲部的小腸全長(zhǎng)及幽門至半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊前沿的距離。以幽門至半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊前沿的距離除以幽門至回盲部的小腸全長(zhǎng)的百分率為小腸推進(jìn)率。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，與硫酸阿托品注射液組進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。結(jié)果硫酸阿托品注射液組與正常水對(duì)照組比能顯著降低半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊胃內(nèi)排空率；龍膽總苷小、中、大劑量，艽龍膠囊，西沙必利膠囊均能顯著對(duì)抗因硫酸阿托品注射液引起的胃內(nèi)半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊胃內(nèi)排空率的降低作用(P＜0.01)。硫酸阿托品注射液組與正常水對(duì)照組比能顯著降低半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊小腸推進(jìn)率；龍膽總苷小、中、大劑量，艽龍膠囊，西沙必利膠囊均能顯著對(duì)抗因硫酸阿托品注射液引起的半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊小腸推進(jìn)率的降低作用(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果詳見表4。
表4秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)抗阿托品引起的小鼠胃排空腸推進(jìn)延遲作用的影響(

) 注組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，與硫酸阿托品注射液組比*P＜0.05，**P＜0.01 5.秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)大鼠在體胃收縮活動(dòng)的影響 5.1材料動(dòng)物健康SD品系大白鼠，雄性，260-280g。由陜西省中醫(yī)藥研究院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)動(dòng)證字08-25號(hào)。藥品與試劑受試藥物；10％烏拉坦溶液。儀器灌胃針頭、注射器、三通管、手術(shù)剪、手術(shù)鑷、縫合線、臺(tái)式自動(dòng)平衡記錄儀，中國(guó)上海大華儀表廠生產(chǎn)，型號(hào)XWT-264，編號(hào)1499。
5.2方法與結(jié)果取SD品系大白鼠60只，雄性。試驗(yàn)大鼠以10％烏拉坦溶液1.0g/kg(1ml/100g)腹腔注射麻醉，仰臥固定后開腹，分離出胃，在胃大彎處取相距1cm距離的兩點(diǎn)縫線，在縫線中點(diǎn)處穿一直線固定好后接臺(tái)式自動(dòng)平衡記錄儀的探頭，測(cè)量胃收縮頻率(次/10分)；胃收縮幅度(mm)并計(jì)算胃收縮力(收縮頻率*收縮幅度)。手術(shù)完畢，待所觀察的指標(biāo)穩(wěn)定后，記錄給藥前值。十二指腸給藥(將各組藥物按相應(yīng)給藥劑量配置成溶液2.5ml/只)或水。(1)水對(duì)照組水，2.5ml/只；(2)龍膽總苷小劑量組，55mg/kg；(3)龍膽總苷中劑量組，110mg/kg；(4)龍膽總苷大劑量組220mg/kg；(5)艽龍膠囊組320mg/kg；(6)西沙必利膠囊組15mg/kg。于給藥后10、20、30、40、50分鐘進(jìn)行上述指標(biāo)的記錄。將各項(xiàng)觀測(cè)指標(biāo)及參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以不同觀察時(shí)間的數(shù)值進(jìn)行給藥前后自身比較和與水對(duì)照組進(jìn)行組間比較，以t檢驗(yàn)判斷其顯著性。結(jié)果龍膽總苷小、中、大劑量組于給藥10分鐘后顯著升高大鼠胃收縮頻率(P＜0.05，P＜0.01)，分別持續(xù)40、40、50分鐘，艽龍膠囊與西沙必利膠囊組于給藥10分鐘后顯著升高大鼠胃收縮頻率(P＜0.05，P＜0.01)，分別持續(xù)30、40分鐘。結(jié)果詳見表5。
表5秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)大鼠在體胃收縮頻率的影響(

) 注藥前后自身比較*P＜0.05，**P＜0.01；與水對(duì)照組比△P＜0.05，△△P＜0.01 龍膽總苷小、中、西沙必利膠囊組于給藥10分鐘后顯著升高大鼠胃收縮幅度(P＜0.05，P＜0.01)，分別持續(xù)40、20、40分鐘，艽龍膠囊組于給藥30分鐘后顯著升高大鼠胃收縮幅度(P＜0.05)，持續(xù)10分鐘，龍膽總苷大劑量組自身給藥前后比有升高大鼠胃收縮幅度的趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；龍膽總苷大劑量與對(duì)照組比藥后10分、40分能顯著升高大鼠胃收縮幅度((P＜0.05)。結(jié)果詳見表6。
表6秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)大鼠在體胃收縮幅度的影響(

) 注藥前后自身比較*P＜0.05，**P＜0.01；與水對(duì)照組比△P＜0.05，△△P＜0.01 龍膽總苷小、中、大劑量組于給藥10分鐘后顯著升高大鼠胃收縮力(P＜0.05，P＜0.01)，分別持續(xù)50、40、50分鐘，艽龍膠囊與西沙必利膠囊組于給藥10分鐘后顯著升高大鼠胃收縮力(P＜0.05，P＜0.01)，分別持續(xù)50、50分鐘。結(jié)果詳見表7。
表7秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)大鼠在體胃收縮力的影響(

) 注藥前后自身比較*P＜0.05，**P＜0.01；與水對(duì)照組比△P＜0.05，△△P＜0.01 6.秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)大鼠胃排空及腸推進(jìn)功能的影響 6.1材料動(dòng)物健康SD品系大白鼠，雌雄兼有，220-260g。由陜西省中醫(yī)藥研究院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)動(dòng)證字08-25號(hào)。藥品與試劑受試藥物；半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊(取10g羧甲基纖維素鈉(CMC)，溶于250ml蒸餾水中，分別加入16g奶粉、8g糖、8g淀粉和2g活性炭末，攪拌均勻。配置成300ml約300g的黑色半固體糊壯物)儀器灌胃針頭、注射器、直尺、手術(shù)剪、手術(shù)鑷、縫合線、天平。
6.2方法與結(jié)果取SD品系大白鼠63只，雌雄各半，按體重、性別隨機(jī)分成6組(1)水對(duì)照組(2.5ml/只)、(2)龍膽總苷小劑量(55mg/kg)、(3)龍膽總苷中劑量(110mg/kg)、(4)龍膽總苷大劑量(220mg/kg)劑量組、(5)艽龍膠囊組(320mg/kg)、(6)西沙必利膠囊組(15mg/kg)。除(1)組灌胃蒸餾水2.5ml/只外，余5組按劑量給藥，每日灌胃給藥一次，連續(xù)6天后禁食不禁水12h再灌胃給藥一次，40分鐘后各組大鼠灌胃給予半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊2.5ml/只。20分鐘后脫頸椎處死大鼠，開腹，結(jié)扎胃賁門和幽門，取胃，用濾紙拭干后稱全重，然后沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物后拭干，稱胃凈重。以胃全重和胃凈重的差值為胃內(nèi)殘留物重，計(jì)算胃內(nèi)殘留物占所灌半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊的百分比為胃內(nèi)殘留率，胃內(nèi)殘留率與100％的差值為胃排空率。同時(shí)迅速取出小腸，輕輕剝離腸系膜后將小腸平鋪于玻璃板上拉成直線，測(cè)量幽門至回盲部的小腸全長(zhǎng)及幽門至半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊前沿的距離。以幽門至半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊前沿的距離除以幽門至回盲部的小腸全長(zhǎng)的百分率為小腸推進(jìn)率。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，與水對(duì)照組進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。結(jié)果龍膽總苷小、中、大劑量，艽龍膠囊，西沙必利膠囊均能顯著提高半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊胃內(nèi)排空率(P＜0.05、P＜0.01)。龍膽總苷大劑量，西沙必利膠囊能顯著提高半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊小腸推進(jìn)率(P＜0.05、P＜0.01)；其余各給藥組均有提高半固體營(yíng)養(yǎng)黑糊小腸推進(jìn)率的趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果詳見表8 表8秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)大鼠胃排空腸推進(jìn)功能的影響(

) 注組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比*P＜0.05，**P＜0.01 7.秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)大鼠胃內(nèi)給藥胃分泌的影響 7.1材料動(dòng)物健康SD品系大白鼠，雌雄兼有，220-260g。由陜西省中醫(yī)藥研究院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)動(dòng)證字08-25號(hào)。藥品與試劑受試藥物。儀器試劑灌胃針頭、注射器、直尺、手術(shù)剪、手術(shù)鑷、縫合線、刻度試管、堿式滴定管(0.02mol/LNaOH溶液)、1-14PH試紙、0.05mol/L鹽酸溶液、酚酞指示劑、麥特氏毛細(xì)管(將內(nèi)徑1-2mm粗細(xì)均勻的毛細(xì)管裁成10cm長(zhǎng)，洗凈烤干。用雞蛋一枚，取其蛋清充分打勻后用紗布過濾，將上述毛細(xì)管利用虹吸作用灌滿蛋清，然后放在85℃熱水中使蛋白凝固)、恒溫水浴箱、離心機(jī)。
7.2方法與結(jié)果取SD品系大白鼠48只，雌雄各半，按體重、性別隨機(jī)分成6組(1)水對(duì)照組(2.5ml/只)、(2)龍膽總苷小劑量(55mg/kg)、(3)龍膽總苷中劑量(110mg/kg)、(4)龍膽總苷大劑量(220mg/kg)劑量組、(5)艽龍膠囊組(320mg/kg)、(6)西沙必利膠囊組(15mg/kg)。除(1)組灌胃蒸餾水2.5ml/只外，其余5組按劑量給藥，每日灌胃給藥一次，連續(xù)6天后禁食不禁水12h。試驗(yàn)當(dāng)天再灌胃給藥一次，20分鐘后用10％烏拉坦1.0g/kg(1ml/100g)腹腔注射麻醉，開腹，結(jié)扎胃幽門，再按照各組劑量灌胃給藥一次(將各組藥物按相應(yīng)給藥劑量配置成溶液2.5ml/只)，水對(duì)照組給予蒸餾水2.5ml/只。5小時(shí)后脫頸椎處死大鼠，取胃，將胃內(nèi)容物倒入試管，用離心機(jī)(3000轉(zhuǎn)/分)離心15分鐘。取上清液計(jì)測(cè)量5小時(shí)胃液量及計(jì)算每小時(shí)胃液量(胃液量/5)，PH試紙測(cè)定胃液PH值，取清晰胃液1ml加酚酞指示劑2滴用0.02mol/LNaOH溶液進(jìn)行滴定，邊滴定邊搖晃直到紅色不褪為止，即為總酸度滴定終點(diǎn)，記錄所消耗NaOH溶液的總毫升數(shù)。計(jì)算總酸度(mEq/L)＝滴定消耗NaOH溶液的總毫升數(shù)×10。再取澄清胃液1ml放入10ml試管中，加入0.05mol/L鹽酸溶液5ml搖勻，放入蛋白管2根。塞好試管口，在37℃恒溫水浴箱中孵育24小時(shí)，取出蛋白管，用直尺測(cè)量透明部分的長(zhǎng)度(mm)，以4端之值的和求平均值。計(jì)算胃蛋白酶活性單位＝平均值的平方×16；胃蛋白酶排出量(活性單位/小時(shí))＝胃蛋白酶活性單位×每小時(shí)胃液量。結(jié)果龍膽總苷小、大劑量，艽龍膠囊，均能顯著增加大鼠胃液量(P＜0.05)；龍膽總苷小、中、大劑量，艽龍膠囊，西沙必利膠囊均能顯著增加胃蛋白酶活性及胃蛋白酶排出量(P＜0.05，P＜0.01)結(jié)果詳見表9。
表9秦艽地上部分中龍膽總苷對(duì)大鼠胃內(nèi)給藥胃分泌的影響(

) 注組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比*P＜0.05，**P＜0.01 結(jié)論 秦艽地上部分中龍膽總苷的主要藥效學(xué)試驗(yàn)研究表明秦艽地上部分中龍膽總苷具有一定的促進(jìn)正常小鼠排便功能的作用；能顯著對(duì)抗因地芬諾酯引起的便秘模型小鼠排便功能降低的作用；能顯著促進(jìn)正常小鼠固體、液體胃排空腸推進(jìn)的作用；能顯著對(duì)抗因阿托品引起的小鼠胃排空延遲作用及腸推進(jìn)延遲的作用；能顯著提高大鼠在體胃收縮頻率、收縮幅度、收縮力；能顯著促進(jìn)大鼠固體、液體胃排空腸推進(jìn)的作用；能顯著增加大鼠胃液分泌量，顯著提高大鼠胃蛋白酶活性及胃蛋白酶排出量。秦艽地上部分中龍膽總苷與秦艽地下部分中龍膽總苷(艽龍膠囊)相比較在以上7項(xiàng)試驗(yàn)中具有相同的效果，見表10。
表10秦艽地上部分中龍膽總苷與秦艽地下部分中龍膽總苷(艽龍膠囊) 在以上7項(xiàng)試驗(yàn)中作用效果的比較 “-”無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，促進(jìn)作用不明顯；兩組數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較無顯著性差異 “+”具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，促進(jìn)作用顯著明顯；兩組數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較無顯著性差異因此從上述試驗(yàn)中可見，秦艽地上部分中龍膽總苷與秦艽地下部分中龍膽總苷(艽龍膠囊)相比在促進(jìn)胃腸道動(dòng)力方面，在治療消化不良等胃腸道疾病方面具有相同的良好效果。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 取秦艽地上部分1kg，水15kg，將水煮沸，投入秦艽地上部分，煎煮30min，放冷濾過，濾渣如法再煎煮兩次，其中第二次煎液做為下次煎煮的水液套用，第一、二兩次煎煮的濾液合并，濃縮至原體積的一半，過D101或者HPD-100型大孔樹脂，先用4升水洗脫至洗脫液無色，再用30％乙醇洗脫，用薄層色譜法檢查(其中薄層板為硅膠G-CMC，展開劑為乙酸乙酯-甲醇-水比例為20∶2∶1，對(duì)照品為龍膽苦苷純品，碘蒸氣顯色)點(diǎn)樣10μl，直至洗脫液不能檢出含有龍膽苦苷，減壓濃縮洗脫液至干，得粗品。將粗品溶于25倍工業(yè)丙酮，攪勻，靜置7小時(shí)，過濾，取濾液濃縮至干即得成品。
權(quán)利要求
1.龍膽總苷的提取方法，其特征在于從秦艽地上部分提取得到龍膽總苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的龍膽總苷的提取方法，其特征在于從秦艽地上部分通過水提得到龍膽總苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的龍膽總苷的提取方法，其特征在于取秦艽地上部分，先通過水提得到的煎煮液，煎煮液過D101或者HPD-100型大孔樹脂，用水洗脫至洗脫液無色，再用20％-50％乙醇洗脫，濃縮洗脫液至干，得龍膽總苷粗品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的龍膽總苷的提取方法，其特征在于將龍膽總苷粗品溶于10-40倍丙酮，過濾、濃縮至干可得提純后龍膽總苷。
5.權(quán)利要求1-4任意之一所述的提取方法得到的龍膽總苷在促進(jìn)腸胃消化功能藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了從秦艽地上部分提取龍膽總苷的方法以及通過該方法得到的龍膽總苷在促進(jìn)腸胃消化功能藥物中的應(yīng)用。龍膽總苷的提取方法是從秦艽地上部分提取，所述的秦艽地上部分指除了秦艽的干燥根之外的部分，包括莖和葉，主要為葉，具體提取工藝為取秦艽地上部分，先通過水提得到的煎煮液，煎煮液過D101或者HPD－100型大孔樹脂，用水洗脫至洗脫液無色，再用20％－50％乙醇洗脫，減壓濃縮洗脫液至干，得龍膽總苷粗品。提取得到的龍膽總苷藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，秦艽地上部分中龍膽總苷與秦艽地下部分中龍膽總苷相比在促進(jìn)胃腸道動(dòng)力方面，在治療消化不良等胃腸道疾病方面具有相同的良好效果。
文檔編號(hào)C07H1/08GK101019924SQ20071001731
公開日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2007年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月29日
發(fā)明者孫文基, 謝人明, 皇甫澤坤, 姚灼, 侯杰文 申請(qǐng)人:西北大學(xué)