龍膽苦苷的應用及其制劑的制作方法【
技術領域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種化合物的用途，尤其涉及龍膽苦苷作為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CAN)-NF-AT通路阻斷劑的非治療用途以及在制備鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CAN)-NF-AT通路阻斷劑中的用途，還涉及龍膽苦苷在制備用于治療或預防由免疫應答亢進引起的皮膚過敏性炎癥發(fā)應中的日化品或外用制劑中的用途。【
背景技術：
】[0002]f丐調(diào)磷酸酶（calcineurin，CaN)又稱蛋白磷酸酶2B(PP2B)，屬絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一受Ca2+/鈣調(diào)素（CaM)調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶。CaN參與多種細胞功能的調(diào)節(jié)，尤其在T細胞活化中起到調(diào)節(jié)樞紐的作用。CaN主要介導的T細胞核因子（NF-AT)的脫磷酸化反應，使NF-AT移位進入核中，進而啟動T淋巴細胞生長分化的生長因子白細胞介素2(IL-2)的轉(zhuǎn)錄，促進T細胞的分化生長。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（calcineurininhibitors，CNIs)是目前臨床上最有效的免疫抑制藥物，包括子囊霉素衍生物環(huán)孢素A(CyclosporineA，CsA)、他克莫司（tacrolimus，F(xiàn)K506)和匹美莫司(pimecrolimus，SDZ，ASM981)。如CsA通過與親環(huán)素結(jié)合形成復合物，然后與CaN結(jié)合并抑制其活性，阻斷它介導的NF-AT脫磷酸化反應，從而抑制該轉(zhuǎn)錄因子移位進入核中，抑制IL-2的轉(zhuǎn)錄，抑制T細胞的分化生長，發(fā)揮其免疫抑制作用。但CsA主要依賴進口、價格昂貴，而且在系統(tǒng)使用的情況下其嚴重的毒副作用也成為該類抑制劑應用的重要障礙。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)他克莫司和吡美莫司等CNIs在局部皮膚外用條件下進入血循環(huán)的量極低而不會有全身性的副作用，安全性高。這些外用的CNIs除了抑制皮膚侵潤的T細胞合成IL-2、IFN-y(Thl細胞來源）以及IL-4和IL-10(Th2細胞來源）以外，還同時抑制皮膚角質(zhì)細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞釋放炎性介質(zhì)，對多種嚴重的炎癥性皮膚病具有顯著療效。盡管他克莫司和吡美莫司等CNIs在臨床治療濕疹、接觸性皮炎等皮膚病方面取得了很好的療效，但仍有其局限性。首先，除原料藥依賴進口，價格昂貴外，該類藥物在治療皮膚病方面只能局部外用，系統(tǒng)性使用則毒副作用太強；其次，濕疹等皮膚病常有皮膚屏障功能缺陷的問題，他克莫司和吡美莫司在有屏障功能缺陷的皮損部位使用有可能使其進入循環(huán)的量增多，可能導致系統(tǒng)性不良反應；而且最近有研究發(fā)現(xiàn)他克莫司和吡美莫司能影響皮膚角質(zhì)細胞表達和皮膚屏障功能相關的基因，造成皮膚屏障功能受損或恢復減慢，而最新的研究進展皮膚屏障功能缺陷可能是濕疹發(fā)病的始動因素，因此他克莫司和吡美莫司的長期使用可能反而不利于疾病的最終康復。[0003]皮膚過敏性炎癥反應是皮膚對于化學制劑、蛋白、細菌與真菌等種種物質(zhì)的變應性反應，其病因復雜，臨床表現(xiàn)多樣，嚴重危害健康，影響正常的生活和工作。以濕疹為例，該病是一種由于免疫紊亂所導致的皮膚炎癥，以皮膚起紅斑、丘疹、水皰、甚至糜爛滲出，并伴有劇烈瘙癢為主要特征，發(fā)病率高，易反復發(fā)作，病程迀延難愈。采用傳統(tǒng)的治療方法，如激素、抗組胺藥、抗炎藥等，可以暫時緩解癥狀，但停藥后往往復發(fā)，且病情加重，甚至轉(zhuǎn)為慢性；外用糖皮質(zhì)激素作用迅速且療效顯著，然而這類藥物長期外用可能產(chǎn)生皮膚萎縮、毛細血管擴張、色素沉著、口周皮炎以及繼發(fā)感染等不良反應，如果全身大面積使用，還可造成腎上腺皮質(zhì)萎縮和全身系統(tǒng)性的不良反應，但由于長期以來沒有與之療效相當、不良反應少的替代藥物，所以外用糖皮質(zhì)激素一直作為皮膚科的首選藥而廣泛使用。目前已有逾7百萬患者外用1丐神經(jīng)素抑制劑（Pimecrolimus>5百萬，Tacrolimus>l.7百萬）顯示安全并和皮質(zhì)類固醇同樣有效，但近年報道多例皮膚癌和淋巴瘤的發(fā)生，所以其遠期效應及安全性尚需繼續(xù)觀察。因此當前仍亟待研發(fā)高效安全的新型抗過敏性炎癥反應的藥物?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明所要解決的技術問題在于本發(fā)明提供了龍膽苦苷作為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CAN)-NF-AT通路阻斷劑的用途。[0005]本發(fā)明還提供了龍膽苦苷作為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CAN)-NF-AT通路阻斷劑的非治療用途。[0006]本發(fā)明還提供了龍膽苦苷在制備鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CAN)-NF-AT通路阻斷劑中的用途。[0007]優(yōu)選的，所述的龍膽苦苷在鈣在調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CAN)-NF-AT通路阻斷劑中的含量為0·OOlwt%~0·00167wt%。[0008]本發(fā)明還提供了龍膽苦苷在預防或治療皮膚過敏性炎癥反應引起的濕疹、接觸性皮炎的用途。[0009]本發(fā)明還提供了龍膽苦苷用于制備預防或治療皮膚過敏性炎癥反應引起的濕疹、接觸性皮炎的日化品和外用制劑的用途。[0010]優(yōu)選的，所述的日用品或外用制劑的劑型為噴霧劑、軟膏、乳膏、膏霜、乳液或其他液態(tài)制劑。[0011]優(yōu)選的，所述的日用品或外用制劑中龍膽苦苷的含量為0.00014wt%~0.2wt%。[0012]更優(yōu)的，所述的日用品或外用制劑中龍膽苦苷的含量為0.0OOHwt%~0.067wt%。[0013]本發(fā)明的龍膽苦苷別名為龍膽苦戒，英文名為Gentiopicroside，分子式為C16H2()09,化學名為5-Ethenyl_6-(0-D-glucopyranosyloxy)_5,6-dihydr〇-lH，3H_pyrano[3,4-C]pyran-1-〇ne，CAS號為20831-76-9。[0014]本發(fā)明所述的日化品和外用制劑中除了龍膽苦苷以外，還可根據(jù)常識包含其它抗炎的活性成分，只要該活性成分與龍膽苦苷不產(chǎn)生明顯的拮抗作用即可。[0015]本發(fā)明的積極進步效果在于：本發(fā)明的龍膽苦苷作為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CAN)-NF-AT通路阻斷劑的非治療用途以及在制備鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CAN)-NF-AT通路阻斷劑中的用途，以及其在制備預防或治療由免疫反應亢進引起的皮膚過敏性炎癥反應的制品的用途。使龍膽苦苷作為一種潛在的高效低毒藥物，為預防或治療濕疹和接觸性皮炎提供了應用前景。另一方面，本發(fā)明使用的龍膽苦苷合成工藝已經(jīng)成熟，制備成本較低，有利于推廣應用，具有廣泛的應用前景。【附圖說明】[0016]附圖1實施例1中龍膽苦苷對K562細胞存活率的影響。[0017]附圖2實施例1中龍膽苦苷對CAN-NF-AT通路的抑制率。[0018]附圖3實施例2中龍膽苦苷對小鼠抓癢次數(shù)的影響。【具體實施方式】[0019]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但本發(fā)明并不限于此。[0020]實施例1龍膽苦苷對（CAN)-NF-AT通路的阻斷作用[0021]實驗原理[0022]采用從美國affimatrix公司購買的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NFAT報告基因的細胞系NFATK562R印orterStableCellLine，以PMA(蛋白激酶CPKC激活劑）和A23187(鈣通道激活劑）刺激K562細胞，檢測轉(zhuǎn)錄因子NFAT驅(qū)動的熒光素酶基因表達水平，反應鈣調(diào)磷酸酶（CaN)通路的活化水平。[0023]PMA和A23187分別活化蛋白激酶C(PKC)和鈣離子通道，模擬T淋巴細胞激活時必須的兩條信號通路，細胞內(nèi)鈣離子濃度提高后與鈣調(diào)蛋白（CaM)結(jié)合，激活鈣調(diào)磷酸酶，激活的鈣調(diào)磷酸酶使其特異性底物轉(zhuǎn)錄因子NFAT脫去磷酸，移位進入細胞核內(nèi)，通過活化的PKC進一步修飾，激活NFAT的促轉(zhuǎn)錄活性，驅(qū)動熒光素酶報告基因的表達。因此，熒光素的表達水平可以反映細胞內(nèi)鈣調(diào)磷酸酶（CaN)通路的活化水平。[0024]實驗方法[0025]1.龍膽苦苷對K562細胞存活率影響[0026]采用MTT法。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NFAT報告基因的K562細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10%肽牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，實驗采用生長健康、處于對數(shù)增長期的細胞，將上述細胞按2XIO5/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，4h后加入待測樣品龍膽苦苷（購買于成都曼斯特生物科技有限公司）1〇1^、2(^]\1、3(^]\1(相當于1\10^^%)、4(^]\1、5(^]\1、6(^]\1(相當于2X103wt%)，每個樣品濃度分別設置三個平行，同時設置空白對照組。孵育24h~48h，直接加入MTT(5mg/ml)20μL/每孔，輕微振蕩混勻，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h。棄去上清液，每孔加^甲基亞諷100IiL，振蕩溶解。酶標儀測定A57。。[0027]2.CAN-NF-AT通路抑制率測定[0028]穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NFAT報告基因的K562細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10%肽牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，實驗采用生長健康、處于對數(shù)增長期的細胞，將上述細胞按2XIO5/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板，加入待測樣品待測樣品龍膽苦苷10μM、20μM、30μM、40μM、50μM培養(yǎng)當前第1頁1 2