一種快速篩選產(chǎn)龍膽苦苷重組酵母菌株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于PCR擴增技術(shù)快速篩選產(chǎn)龍膽苦巧 重組酵母菌株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 龍膽苦巧（Gentiopicroside)為裂環(huán)環(huán)締離祗巧類化合物，大量存在于藥用植物 秦巧（Gentianamacrophylla，G. macrophylla)中，是評價龍膽屬藥材的主要指標，具有抗 氧化、抗炎、保肝、利膽及抗腫瘤等作用。但隨著臨床用藥量的增加、野生資源過渡采挖，造 成了秦巧資源的嚴重匿乏。因此，迫切需要尋求及擴大龍膽苦巧新型藥源途徑來滿足其日 益增長的需求。
[0003] 近年來，尋找和擴大龍膽苦巧藥源是一個十分活躍的研究領(lǐng)域，也取得了一定進 展，主要包括W下兩個方面；（1)秦巧的人工栽培；（2)利用生物技術(shù)提高秦巧中的龍膽苦 巧，包括秦巧組織培養(yǎng)、懸浮細胞培養(yǎng)和毛狀根的培養(yǎng)。但是，人工栽培存在周期長、成活率 低、農(nóng)藥殘留超標和有效成份較低等弊端；利用組織培養(yǎng)和懸浮細胞培養(yǎng)秦巧細胞生產(chǎn)龍 膽苦巧均存在龍膽苦巧產(chǎn)量不穩(wěn)定現(xiàn)象，同時在毛狀根培養(yǎng)體系中的有效成分產(chǎn)量提高并 不顯著。因此，隨著秦巧野生藥用植物資源日趨減少，W及利用傳統(tǒng)植物培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)龍膽 苦巧存在的各種問題，促使利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)探索獲得新型藥源途徑W期解決龍膽苦 巧來源問題已成為一個潛力巨大的新型策略。
[0004] 低能離子注入技術(shù)是在20世紀80年代由中科院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院等離子體 所和安徽省農(nóng)科院科研人員創(chuàng)立并發(fā)展起來的新興交叉學(xué)科離子束生物工程學(xué)，近幾年， 離子束生物工程技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物和微生物的品質(zhì)改良及種質(zhì)創(chuàng)新，并取得了豐碩成 果。毛培宏等分別通過Ar+和N +注入介導(dǎo)藍麻黃基因組DNA在漢遜酵母中的隨機轉(zhuǎn)化，獲 得了遺傳穩(wěn)定酵母工程菌，其培養(yǎng)液中麻黃堿和偽麻黃堿的最高產(chǎn)量分別為18. 85mg/L和 4. llmg/L。而利用離子注入介導(dǎo)甘草基因組DNA轉(zhuǎn)化漢遜酵母，獲得了遺傳穩(wěn)定的酵母工 程菌，其甘草酸的最高產(chǎn)量達到114. 49mg/L。低能離子注入技術(shù)雖然在重組工程菌的構(gòu)建 上有一定的方向性和目的性，但其也有較大的隨機性，即注入后候選重組菌株數(shù)量比較大， 所W建立一種高通量的快速篩選方法尤為重要。目前，基于低能離子注入介導(dǎo)的合成生物 學(xué)方法構(gòu)建重組菌株生產(chǎn)天然產(chǎn)物，其所采用的篩選方法一般是依據(jù)產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)設(shè)計 特征性化學(xué)反應(yīng)進行分析篩選，如毛培宏等利用低能離子注入方法介導(dǎo)麻黃基因組轉(zhuǎn)化酵 母，其所運用的篩選方法為根據(jù)目的產(chǎn)物麻黃堿的特征性顏色反應(yīng)進行篩選，結(jié)果研究人 員從3000多株重組菌株篩選獲得9株產(chǎn)麻黃堿酵母重組菌株，但該篩選方法存在工作量 大，篩選效率低，加上顏色反應(yīng)需要一定產(chǎn)量的目的產(chǎn)物，該嚴重制約了低能離子注入介導(dǎo) 的合成生物學(xué)的廣泛運用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速篩選產(chǎn)龍膽苦巧重組酵母菌株的方法。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明采用了 W下技術(shù)方案：
[0007] 1)重組菌株初篩：將經(jīng)過低能離子注入介導(dǎo)秦巧總基因組DNA轉(zhuǎn)化處理后的出發(fā) 酵母菌株接種至YTO固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)得到大量轉(zhuǎn)化子（即生長在YTO固體培養(yǎng)基上 的單菌落），提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，W轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，針對MECT基因、MECPS基 因W及GGPPS基因的特異性片段分別進行S輪PCR擴增，并分別對擴增產(chǎn)物進行核酸電泳 分析，根據(jù)電泳分析結(jié)果從轉(zhuǎn)化子中篩選得到同時含有MECT基因片段、MECPS基因片段W 及GGPPS基因片段的重組酵母菌株；
[000引2)重組菌株復(fù)篩；將步驟1)篩選得到的重組酵母菌株于YTO液體培養(yǎng)基中進行 發(fā)酵培養(yǎng)，通過對發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液進行HPLC分析篩選得到產(chǎn)龍膽苦巧重組酵母菌株。
[0009] 采用上游引物F1和下游引物R1對所述MECT基因的特異性片段進行PCR擴增，上 游引物F1的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，下游引物R1的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 2 所示。
[0010] 采用上游引物巧和下游引物R2對所述MECPS基因的特異性片段進行PCR擴增， 上游引物巧的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，下游引物R2的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 4 所示。
[0011] 采用上游引物F3和下游引物R3對所述GGPPS基因的特異性片段進行PCR擴增， 上游引物F3的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，下游引物R3的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 6 所示。
[0012] 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0013] 與現(xiàn)有篩選方法相比，本發(fā)明通過依據(jù)目的產(chǎn)物龍膽苦巧生物合成代謝途徑多個 酶基因作為分子標記，基于多輪PCR擴增技術(shù)，對基于低能離子注入介導(dǎo)秦巧總基因組DNA 轉(zhuǎn)化酵母技術(shù)所構(gòu)建的重組酵母菌株進行高通量篩選，極大地簡化了產(chǎn)龍膽苦巧重組酵母 菌株的篩選過程，此方法簡單、快速、高效、低廉、通用性強，是一種具有廣泛運用前景的高 通量篩選方法。
【附圖說明】
[0014] 圖1為實施例中秦巧總基因組DNA電泳圖。
[00巧]圖2為實施例中MECT (2-C-甲基-D-赤薛醇-4-磯酸脫氨酷轉(zhuǎn)移酶， 2-C-Methyl-D-e;ryt虹itol4 -地os地atec5ftid}dtransferase)基因 PCR 擴增電泳圖，其 中，M為Maker, 1、3為出發(fā)菌株，2為秦巧總DNA，4為重組菌株。
[0016] 圖3為實施例中MECPS(2-甲基赤薛糖-2, 4-環(huán)二磯酸合成酶 (2-C-methyle;ryt 虹 itol 2,4-cycl〇-Di 地 OS 地 ate synthetase)基因 PCR 擴增電泳圖，其 中，M為Maker, 1為秦巧總DNA，2為重組菌株，3為出發(fā)菌株。
[0017] 圖 4 為實施例中 GGPPS (牛兒基二磯酸合酶 Geran5dgeran}d-diphosphate synthase)基因PCR擴增電泳圖，其中，M為Maker, 1為秦巧總DNA，2、3、4為出發(fā)菌株，5為 重組菌株。
[0018] 圖5為實施例中產(chǎn)龍膽苦巧重組菌株HPLC圖譜。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細說明。
[0020] 為了對基于低能離子注入介導(dǎo)的合成生物學(xué)構(gòu)建重組菌株提供一種快速、高效、 通用性強的高通量篩選方法。本發(fā)明W通過低能離子注入技術(shù)將龍膽苦巧合成途徑部分基 因或全部相關(guān)基因?qū)氲浇湍富蚪MDNA中的重組菌株為篩選對象，通過多次PCR擴增初 步篩選出產(chǎn)龍膽苦巧重組酵母菌株，進而利用HPLC對其進一步分析確定。
[002U 本發(fā)明W多形漢遜酵母Dkl (H. polymo巧ha Dkl，來源為ATCC No. 26012)為出發(fā) 菌株，利用低能離子注入介導(dǎo)秦巧總基因組DNA隨機轉(zhuǎn)化出發(fā)菌株。
[00巧 （1)秦巧總基因組DNA的提?。?br>[0023] 秦巧新鮮嫩葉于陜西太白縣秦巧種植基地采集，洗凈后置于-20°C下冷凍保存。秦 巧總基因組DNA的提取采用的是經(jīng)典的CTAB法；秦巧嫩葉剪碎，液氮研磨至細粉狀，加入 預(yù)熱的 2% CTAB 緩沖液（2% CTAB、100mmol/L Tris-肥l、20mmol/L 邸TA、1.4mol/L 化C1、 0. 5% 0-琉基己醇），充分混勻后，65°C溫育比（每隔lOmin搖勻一次），4000巧m離屯、 lOmin，取上清液，等體積加入氯仿-異戊醇（24 ; 1)，搖至乳狀液，靜置lOmin，4000巧m離屯、 20min，取上層水相液體，加入等體積-20°C預(yù)冷的異丙醇，有白色絮狀物出現(xiàn)，-20°C靜置 30min，1200化pm離屯、lOmin，棄去上清液，70%己醇洗漆兩遍，于65°C水浴烘干，TE溶解保 存，取20 y L體積進行凝膠電泳檢測。結(jié)果，秦巧總基因組DNA電泳條帶非常清晰整齊（見 圖1)，表明所用CTAB法提取的秦巧總基因組DNA純度高、質(zhì)量好，非常適合于下個步驟的 PCR擴增。
[0024] (2)篩選體系的建立
[0025] 經(jīng)龍膽苦巧合成代謝中關(guān)鍵酶的確定及其基因序列的查找，并對其進行引物設(shè) 計，W秦巧總基因組DNA為模板進行S輪PCR擴增，優(yōu)化并確定擴增條件，建立重組菌株的 初步篩選方法；
[0026] 引物設(shè)計；根據(jù)龍膽苦巧生物合成特點，確定龍膽苦巧合成中的關(guān)鍵酶分別為 MECT、MECPS、GGPPS，然后在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中分別捜索其同源基因的蛋白序列，根據(jù) blast蛋白序列比對分別找到其同源性較高的五個蛋白序列，根據(jù)codehop網(wǎng)站化飾:// blocks, fhcrc. org/codeh op. html)分別進行特異性引物設(shè)計。各個基因的具體特異性引 物序列見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
[0027] 表1 MECT、MECPS、GGPPS特異性引物序列 [002引
【主權(quán)項】
1. 一種快速篩選產(chǎn)龍膽苦苷重組酵母菌株的方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 重組菌株初篩：將經(jīng)過低能離子注入介導(dǎo)秦艽總基因組DNA轉(zhuǎn)化處理后的出發(fā)酵母 菌株接種至Yro固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，以轉(zhuǎn)化子基因 組DNA為模板，針對MECT基因、MECPS基因以及GGPPS基因的特異性片段分別進行三輪PCR 擴增，并分別對擴增產(chǎn)物進行核酸電泳分析，根據(jù)電泳分析結(jié)果從轉(zhuǎn)化子中篩選得到同時 含有MECT基因片段、MECPS基因片段以及GGPPS基因片段的重組酵母菌株； 2) 重組菌株復(fù)篩：將步驟1)篩選得到的重組酵母菌株于YH)液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵 培養(yǎng)，通過對發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液進行HPLC分析篩選得到產(chǎn)龍膽苦苷重組酵母菌株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速篩選產(chǎn)龍膽苦苷重組酵母菌株的方法，其特征在于： 采用上游引物Fl和下游引物Rl對所述MECT基因的特異性片段進行PCR擴增，上游引物Fl 的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，下游引物Rl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速篩選產(chǎn)龍膽苦苷重組酵母菌株的方法，其特征在于： 采用上游引物F2和下游引物R2對所述MECPS基因的特異性片段進行PCR擴增，上游引物 F2的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，下游引物R2的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速篩選產(chǎn)龍膽苦苷重組酵母菌株的方法，其特征在于： 采用上游引物F3和下游引物R3對所述GGPPS基因的特異性片段進行PCR擴增，上游引物 F3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，下游引物R3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種快速篩選產(chǎn)龍膽苦苷重組酵母菌株的方法：1)提取候選菌株基因組DNA，以該基因組DNA為模板，分別進行三輪PCR擴增，根據(jù)電泳分析結(jié)果篩選得到同時含有MECT基因、MECPS基因以及GGPPS基因的片段的重組酵母菌株；2)于YPD液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，通過對發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液進行HPLC分析篩選得到產(chǎn)龍膽苦苷重組酵母菌株。本發(fā)明極大地簡化了產(chǎn)龍膽苦苷重組酵母菌株的篩選過程，方法簡單、快速、高效、低廉、通用性強，是一種具有廣泛運用前景的高通量篩選方法。
【IPC分類】C12Q1-04, C12Q1-68
【公開號】CN104630355
【申請?zhí)枴緾N201510036732
【發(fā)明人】錢衛(wèi)東, 周穎欣, 王婷, 毛培宏
【申請人】陜西科技大學(xué)
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月23日