專(zhuān)利名稱(chēng)：人重組組織因子的構(gòu)建表達(dá)、純化方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人重組組織因子，特別是人重組組織因子的構(gòu)建表達(dá)和純化方法。本發(fā)明還涉及該人重組組織因子的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)初期，Schmid與Moranitz首次發(fā)現(xiàn)了組織中血液凝固的啟動(dòng)因子，并將其命名為組織因子(Tissue factor，TF)。到20世紀(jì)80年代，組織因子被證實(shí)是生理性凝血過(guò)程中最重要的啟動(dòng)因子。人們借助重組DNA、人工致突變及基因剔除等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步在分子水平和基因水平研究TF，發(fā)現(xiàn)TF與全身炎癥反應(yīng)綜合癥及休克、DIC、血栓性疾病、移植排斥反應(yīng)、惡性腫瘤等的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，近年來(lái)又研究發(fā)現(xiàn)TF還具有參與愈傷組織修復(fù)、新生血管形成及胚胎發(fā)育等多種生理功能。因此，組織因子在生物制藥領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用發(fā)展前景。
目前，國(guó)內(nèi)外組織因子的研究主要集中在與組織因子有關(guān)的生物技術(shù)新藥的研究開(kāi)發(fā)和凝血酶原時(shí)間檢測(cè)試劑的研制方面。
在生物制藥產(chǎn)業(yè)上，組織因子的研究主要集中在抗凝藥、心血管病方面的藥物上，如研究開(kāi)發(fā)的組織因子單克隆抗體、TFPI(TF pathway inhibitor)、失活的因子VIIa、rNAPc2、抗TF或VIIai的小分子化合物、靶向免疫絡(luò)合物等。
組織因子是凝血酶原時(shí)間(Prothrombin time，PT)檢測(cè)試劑的主要活性成分，是影響凝血酶原時(shí)間測(cè)定的主要因素，高質(zhì)量的組織因子能夠敏感地反應(yīng)出凝血因子的異常與否。凝血酶原時(shí)間測(cè)定是血液臨床檢驗(yàn)的常規(guī)項(xiàng)目，用于檢測(cè)病人凝血機(jī)制是否正常，特別是心胸外科、骨科、婦產(chǎn)科等手術(shù)前檢查病人的凝血功能，同時(shí)也是口服抗凝藥物治療監(jiān)控的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，凝血酶原時(shí)間的延長(zhǎng)和縮短與肝病、腫瘤、炎癥、糖尿病、心臟病、血液病、高血壓、高血脂等多種疾病有密切關(guān)系。
長(zhǎng)期以來(lái)，凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑的制備都是由從兔腦、牛腦、人腦、胎盤(pán)等組織中提取組織因子配制而成，如美國(guó)DadeBehring公司生產(chǎn)的胎盤(pán)凝血活酶、法國(guó)Diagnostia Stago公司生產(chǎn)的兔腦凝血活酶、我國(guó)陜西方舟公司生產(chǎn)的兔腦凝血活酶、上海太陽(yáng)公司用兔腦制備的含鈣凍干組織凝血活酶等。由于這些組織提取物所含的組織因子的濃度不同，尤其是不同種屬來(lái)源組織中的組織因子對(duì)凝血的反應(yīng)敏感度不同，所以用其生產(chǎn)的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑普遍存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，敏感性差，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定的問(wèn)題，不同的臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室之間得到的檢測(cè)結(jié)果難以比較。盡管采用了WHO的標(biāo)準(zhǔn)參照品，但仍然不能把誤差降低到可接受的水平。
近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，人們已經(jīng)克隆出組織因子的基因，清楚了它的結(jié)構(gòu)，并采用基因工程技術(shù)合成了重組組織因子。目前，國(guó)外有少數(shù)幾家公司(如DadeBehring公司)已經(jīng)利用兔重組組織因子或人重組組織因子開(kāi)發(fā)出了新型的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，由于重組組織因子分子結(jié)構(gòu)均一、質(zhì)量穩(wěn)定，且對(duì)凝血因子具有極高的敏感性，使用重組組織因子制成的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑提高了PT測(cè)定的敏感性、精密度和準(zhǔn)確度，在臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上被認(rèn)為是新一代的標(biāo)準(zhǔn)化凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑。使用重組組織因子生產(chǎn)的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑，已成為相關(guān)研究人員的共識(shí)和各級(jí)醫(yī)院的首選。
人組織因子是分子量為47KD的糖蛋白，含有263個(gè)氨基酸殘基，為跨膜受體蛋白質(zhì)。TF是凝血因子Ⅶ的受體和輔助因子，是外源凝血途徑的啟動(dòng)蛋白。TF蛋白分子分為3個(gè)部分，胞內(nèi)區(qū)21個(gè)氨基酸殘基，跨膜部分為23個(gè)氨基酸殘基，具有疏水性，膜外部分含219個(gè)氨基酸殘基，為氨基端，帶有糖鏈。研究證實(shí)，缺失胞內(nèi)區(qū)的截?cái)嘈腿私M織因子(TF243，由跨膜部分和膜外部分組成)具有全部的凝血活性。
國(guó)外利用人重組組織因子制備凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑的文獻(xiàn)以及專(zhuān)利報(bào)道基本上集中在了組織因子制備凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑的脂化、緩沖液組成、穩(wěn)定劑的加入等工藝上。復(fù)旦大學(xué)的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)“重組可溶性組織因子及其制備方法和應(yīng)用”提供了一種含有部分天然TF的氨基酸序列(1～218)及具有啟動(dòng)外源性凝血活性的重組可溶性組織因子r-sTF。其r-sTF的一種具體制備方法是從胎盤(pán)組織中提取總RNA，運(yùn)用RT-PCR、質(zhì)粒重組和大腸桿菌的陽(yáng)性克隆篩選，獲得sTF基因片段，進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒r-sTF-pLY-4，并導(dǎo)入大腸桿菌JF1125中表達(dá)；然后經(jīng)過(guò)離心收集菌體，菌體破碎，包涵體溶解，復(fù)性和Q-Sepharose F.F.層析純化等步驟，最終得到r-sTF。上述得到的r-sTF經(jīng)磷脂化處理后，可用于制備凝血酶原時(shí)間檢測(cè)試劑。
在復(fù)旦大學(xué)的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)中，獲得的r-sTF只是TF的胞外部分，與天然全長(zhǎng)型TF或TF243截?cái)嘈?含有跨膜結(jié)構(gòu))相比，其生物活性較低。此外，r-sTF在大腸桿菌的表達(dá)方式是通過(guò)提高發(fā)酵溫度誘導(dǎo)表達(dá)形成包涵體沉淀物，而較高的培養(yǎng)溫度常常會(huì)降低可溶性蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)包涵體沉淀物需要經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)變性及復(fù)性才能得到有活性的TF樣品，因此，r-sTF的純化過(guò)程繁瑣，TF結(jié)構(gòu)和活性的均一性較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型的人重組組織因子以及構(gòu)建、表達(dá)和純化該重組組織因子的方法。
本發(fā)明的目的還在于應(yīng)用該重組組織因子，制備高穩(wěn)定性和高敏感性的凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒。
本發(fā)明構(gòu)建的人重組組織因子recombinant human tissue factor簡(jiǎn)稱(chēng)rhTF243，其核苷酸序列和氨基酸序列見(jiàn)圖1，為由膜外區(qū)和跨膜區(qū)兩部分組成，缺失胞內(nèi)區(qū)的截?cái)嘈腿酥亟M組織因子，即TF的1～243氨基酸序列部分，具有和組織因子同樣活性的蛋白。
本發(fā)明從人胎盤(pán)組織中獲取總RNA，根據(jù)已知的TF核苷酸序列，設(shè)計(jì)PCR引物，并加入酶切位點(diǎn)；以總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR方法得到目的基因片段；將收集的TF基因片段與phoA質(zhì)粒(由美國(guó)血液技術(shù)公司焦進(jìn)安博士提供)重組，構(gòu)建出TF表達(dá)質(zhì)粒載體pTF243。圖2所示為T(mén)F表達(dá)質(zhì)粒載體pTF243的物理圖譜。
進(jìn)而將TF表達(dá)質(zhì)粒載體pTF243轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MM294中，用添加0.01％氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶酶切分析基因片段，篩選確認(rèn)陽(yáng)性克隆，得到高效表達(dá)的基因重組工程菌株。
取篩選得到的基因重組工程菌株接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃～37℃和pH6.0～7.2條件下直接發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)，得到含有rhTF243的發(fā)酵培養(yǎng)菌液。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基是以L(fǎng)B培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加2％～5％的葡萄糖、1％～5％無(wú)機(jī)鹽溶液和0.01％～0.05％氨芐青霉素后組成的。
其中的無(wú)機(jī)鹽溶液由0.1％～0.5％磷酸二氫鈉、0.5％～1.0％磷酸氫二鉀、0.01％～0.05％氯化鐵、0.01％～0.03％硫酸鋅、0.01％～0.03％氯化鈷、0.01％～0.03％硫酸銅、0.5％～1.0％硫酸銨和0.05％～0.10％硫酸鎂組成。
本發(fā)明中，rhTF243在大腸桿菌MM294中的表達(dá)是由phoA啟動(dòng)子控制的，而phoA啟動(dòng)子的抑制與激活又受到發(fā)酵培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)磷濃度的控制，當(dāng)無(wú)機(jī)磷濃度低于0.1mmol/L時(shí)，rhTF243蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)。
當(dāng)大腸桿菌在含無(wú)機(jī)磷濃度高的培養(yǎng)液里生長(zhǎng)時(shí)，phoA啟動(dòng)子受到抑制，不能進(jìn)行rhTF243的表達(dá)，在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，隨著大腸桿菌的生長(zhǎng)，無(wú)機(jī)磷逐漸消耗，當(dāng)無(wú)機(jī)磷濃度降低到一定水平(低于0.1mmol/L)時(shí)，phoA啟動(dòng)子受到激活，從而誘導(dǎo)rhTF243開(kāi)始表達(dá)。表1、表2列出了不同時(shí)間和不同無(wú)機(jī)磷濃度下的rhTF243表達(dá)情況(活性以凝血酶原時(shí)間表示，凝血酶原時(shí)間長(zhǎng)，活性較低，凝血酶原時(shí)間短，活性較高)。
表1 不同無(wú)機(jī)磷濃度下rhTF243的表達(dá)活性

表2 發(fā)酵過(guò)程中rhTF243活性的表達(dá)

本發(fā)明rhTF243的純化方法是，取發(fā)酵培養(yǎng)菌液溶于Tris-EDTA緩沖液中，用高壓勻漿機(jī)高壓破碎，釋放出rhTF243蛋白；先使用Q-Sepharose Fast Flow基質(zhì)對(duì)破碎液進(jìn)行離子交換層析，得到rhTF243蛋白的粗提液；再將粗提液通過(guò)TF單抗免疫親和層析柱進(jìn)行吸附和洗脫后，收集得到純度95％以上的rhTF243蛋白。
TF單抗免疫親和層析柱的具體吸附和洗脫方法為依次用pH8.0的Tris-HCl緩沖液、pH6.0的磷酸鹽緩沖液和pH4.0的醋酸鈉緩沖液洗滌，然后用pH3.0的醋酸緩沖液洗脫rhTF243蛋白，并收集。
本發(fā)明使用的TF單抗免疫親和層析柱是由TF單克隆抗體與Amersham公司的CNBr-actvated Sepharose Fast Flow偶聯(lián)后制備得到的，其中的TF單克隆抗體由美國(guó)血液技術(shù)公司焦進(jìn)安博士提供。本發(fā)明制備得到的TF單克隆抗體具有很強(qiáng)的專(zhuān)一性，可以重復(fù)多次使用。
通過(guò)使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在280nm波長(zhǎng)下的吸光度值A(chǔ)280和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法鑒定洗脫后的rhTF243蛋白純度。
本發(fā)明制備得到的rhTF243蛋白主要應(yīng)用于制備凝血酶原時(shí)間檢測(cè)試劑。
在鈣和磷脂存在條件下，TF具有引起血漿凝固的功能，TF的血漿凝固功能是通過(guò)測(cè)定凝血時(shí)間進(jìn)行的。
在進(jìn)行PT測(cè)定時(shí)，TF、CaCl2和磷脂混合在一起組成PT試劑。本發(fā)明制備凝血酶原時(shí)間檢測(cè)試劑的具體方法是在37℃條件下將純化的rhTF243蛋白加入溶解有磷脂的100mmol/L Tris緩沖液(pH7.5，含有100mmol/L CHAPS)中得到rhTF243磷脂液，再將rhTF243磷脂液與由100mmol/L HEPES、10mmol/LCaCl2、1mg/mL BSA組成的緩沖液(pH7.0)混合后，得到PT檢測(cè)試劑。
其中的磷脂是由Sigma公司提供的PC(產(chǎn)品號(hào)P6354)與PS(產(chǎn)品號(hào)P7769)混合組成。
本發(fā)明運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了新型的人重組組織因子的表達(dá)載體pTF243，改進(jìn)了TF的表達(dá)機(jī)理，使其能夠在大腸桿菌MM294的發(fā)酵中，隨著培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)磷的逐漸消耗而直接表達(dá)，不再需要增加誘導(dǎo)物和(或)改變發(fā)酵條件進(jìn)行誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)，簡(jiǎn)化了發(fā)酵生產(chǎn)的工藝，有效地提高了rhTF243蛋白的表達(dá)率，也不需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性和復(fù)性；同時(shí)在rhTF243蛋白的純化工藝中，采用了TF單抗免疫親和層析技術(shù)，依據(jù)人重組組織因子與TF單抗免疫親和層析柱上的抗體特異性結(jié)合，經(jīng)過(guò)洗滌、洗脫得到純化的重組組織因子蛋白，由于人重組組織因子與TF單克隆抗體之間結(jié)合的特異性和溫和性，人重組組織因子在純化過(guò)程中沒(méi)有受到不可逆的損傷，因此獲得了高純度和高活性的rhTF243。純化的rhTF243純度95％以上，收率大于60％。
使用本發(fā)明純化的rhTF243蛋白制備得到的PT試劑，穩(wěn)定性和敏感性均得到了提高，PT測(cè)定時(shí)間10s～14s，ISI值1.0±0.2。


圖1為人重組組織因子rhTF243的DNA序列和氨基酸序列；圖2為T(mén)F表達(dá)質(zhì)粒載體pTF243的物理圖譜；圖3為純化rhTF243蛋白的紫外分光光度圖；
圖4為純化rhTF243蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1rhTF243表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建從人胎盤(pán)組織中獲取總RNA，根據(jù)已知的TF核苷酸序列，設(shè)計(jì)PCR上游引物P1和下游引物P2。
上游引物P15’-ACCAGCCATGGCTCAGGCACTACAAATACTGTGGC-3’下游引物P25’-GGATCCTCAGTGTAGAGATATAGCCAGGATG-3’P1引物含有數(shù)個(gè)TF蛋白N端氨基酸及NcoI酶切位點(diǎn)，P2引物含有數(shù)個(gè)TF蛋白C端氨基酸、終止碼及BamHI酶切位點(diǎn)。
以總RNA為模板，P1、P2為引物，通過(guò)常規(guī)RT-PCR方法得到TF目的基因片段；將收集的rhTF243基因片段用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和BamHI處理，與phoA質(zhì)粒重組，構(gòu)建TF表達(dá)質(zhì)粒載體pTF243。
將TF表達(dá)質(zhì)粒載體pTF243轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MM294中，用添加0.01％氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶酶切分析基因片段，并測(cè)定TF基因的DNA序列，篩選確認(rèn)陽(yáng)性克隆，使用PT測(cè)定方法(檢測(cè)TF凝血活性)篩選得到高效表達(dá)的基因重組工程菌株。
實(shí)施例2rhTF243的發(fā)酵表達(dá)1、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備組成LB培養(yǎng)基1000mL、葡萄糖50g、無(wú)機(jī)鹽溶液10mL、0.01％氨芐青霉素。其中無(wú)機(jī)鹽溶液由0.1％磷酸二氫鈉、0.5％磷酸氫二鉀、0.01％氯化鐵、0.03％硫酸鋅、0.01％氯化鈷、0.03％硫酸銅、0.5％硫酸銨和0.05％硫酸鎂組成。
將LB培養(yǎng)基、葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽的混合溶液在121℃條件下滅菌20～30min后，加入氨芐青霉素制成發(fā)酵培養(yǎng)基。
2、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)取2mL篩選得到的基因重組工程菌菌液加入到含有1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，放入30℃恒溫?fù)u床內(nèi)，以200r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)16h～20h，至測(cè)定600nm處的OD值在1.5～2.5之間。
3、高密度發(fā)酵培養(yǎng)在30L發(fā)酵罐中加入6L發(fā)酵培養(yǎng)液，加入搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液，開(kāi)始高密度發(fā)酵培養(yǎng)，溫度35℃，攪拌速度400r/min，保持水溶性氧(dissolved oxygen)＞20％，用25％氨水維持pH值在6.0～7.5之間，發(fā)酵6h、8h時(shí)分別補(bǔ)加1L的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵18h，培養(yǎng)至測(cè)定600nm處的OD值10.0以上，得到發(fā)酵培養(yǎng)液。
測(cè)定表達(dá)rhTF243蛋白的活性為20s～30s(以凝血酶原時(shí)間計(jì))。
4、rhTF243蛋白活性的測(cè)定方法取純化的rhTF243蛋白30μL(含量為30μg/ml)、30μL磷脂混合物(含量為1mg/mL)、240μLTBSA緩沖液，振蕩混勻，37℃水浴中保溫30min，得到脂化的rhTF243。取0.5mL脂化的rhTF243、0.5mL 0.1mol/L CaCl2、4mL TBSA混合，在37℃水浴中保溫10min，按照血凝儀使用說(shuō)明進(jìn)行凝血酶原時(shí)間的測(cè)定。
磷脂混合物由Sigma公司的PC(產(chǎn)品號(hào)為P6354)和PS(產(chǎn)品號(hào)為P7769)按7∶3組成。
實(shí)施例3rhTF243蛋白的純化1、制備TP單抗免疫親和層析柱稱(chēng)取15mg純化的TF單抗、1g CNBr-活化的Sepharose基質(zhì)、100mL0.4mol/L NaHCO3偶聯(lián)緩沖液(pH8.3)、11.7克NaCl，在溫度25℃下混合裝柱，緩慢振蕩2h，排出液體；再用0.1mol/L Tris緩沖液(pH8.2)封閉2h，25℃靜置，排出液體；依次用pH3.0的0.1mol/L乙酸鈉溶液和pH8.3的0.1mol/LTris緩沖液洗滌，最后用5倍柱體積的PBS緩沖液4℃保存，制備成TP單抗免疫親和層析柱。
2、rhTF243蛋白的純化1)菌體破碎將得到的發(fā)酵菌體20g溶于2℃～8℃20mmol/L Tris-EDTA緩沖液100mL中，加1％Triton X-100，振蕩混勻，用高壓勻漿機(jī)以60Mpa～100Mpa的高壓進(jìn)行細(xì)胞破碎，連續(xù)三次破碎后，在4℃～8℃條件下以20000g離心力離心30min，收集上清液，得到釋放rhTF243蛋白的破碎液。
2)Q-Sepharose Fast Flow基質(zhì)層析將破碎液與Q-Sepharose Fast Flow基質(zhì)等比例充分混合，靜置5min，過(guò)濾除去基質(zhì)，清液在4℃～8℃條件下以20000g離心力離心30min，收集上清液，得到粗提液。
3)TP單抗免疫親和柱層析將粗提液在4℃～8℃條件下加入TP單抗免疫親和層析柱，依次用5倍柱體積的pH8.0 TrisI-HCl緩沖液、pH6.0磷酸鈉緩沖液、pH4.0醋酸鈉緩沖液，以240mL/h流速洗滌親和層析柱，再用pH3.0的醋酸緩沖液洗脫rhTF243蛋白，收集洗脫液，用MILIPORE ULTRA-15型10KB超濾管離心濃縮，收集得到純化的rhTF243蛋白，-70℃保存。
用紫外分光光度計(jì)測(cè)定收集液的A280值，計(jì)算蛋白含量1.15mg/mL，體積為2.8mL，SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果見(jiàn)圖4。
實(shí)施例4制備凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑1、rhTF243蛋白的磷脂化稱(chēng)取PC(產(chǎn)品號(hào)P6354，Sigma公司提供)28mg，PS(產(chǎn)品號(hào)P7769，Sigma公司提供)12mg，溶解于18.8mL含有100mmol/L CHAPS的Tris緩沖液(pH7.5，100mmol/L)中，37℃水浴保溫2h，加入純化的rhTF243蛋白1.2mL(含量為1.15mg/mL)，室溫靜置2h，得到rhTF243磷脂液。
2、配制PT測(cè)定試劑取rhTF243磷脂液20mL與1980mL緩沖液(100mmol/L HEPES pH7.0、10mmol/L CaCl2、1mg/mL BSA)混合，振蕩混勻，得到PT測(cè)定試劑。
3、試劑測(cè)定結(jié)果使用上述PT測(cè)定試劑，按照血凝儀使用說(shuō)明，可以進(jìn)行凝血酶原時(shí)間的測(cè)定。
1)室溫(20℃～25℃)放置的重組PT試劑正常人血漿凝血酶原時(shí)間測(cè)定結(jié)果

2)37℃放置的重組PT試劑正常人血漿凝血酶原時(shí)間測(cè)定結(jié)果

3)試劑的靈敏性與用兔腦組織因子制備的PT試劑進(jìn)行比較，本發(fā)明制備的PT試劑具有明顯的高敏感性和穩(wěn)定性，與Recombiplastin(另一用人重組組織因子制備的PT試劑)產(chǎn)品擁有相同的敏感性和穩(wěn)定性。

敏感性的測(cè)定

*正常血漿是指德靈DADE Ci-Trol 1；80％、40％為正常血漿用生理鹽水稀釋樣**ratio指稀釋血漿和正常血漿的比值，比值越大，敏感性越高
權(quán)利要求
1.一種人重組組織因子，含有天然人組織因子跨膜部分和膜外部分的243個(gè)氨基酸殘基，為缺失胞內(nèi)區(qū)的截?cái)嘈腿酥亟M組織因子recombinant humantissue factor，簡(jiǎn)稱(chēng)rhTF243，具有天然人組織因子的全部凝血活性。
2.權(quán)利要求1所述人重組組織因子的構(gòu)建表達(dá)方法，其特征是從人胎盤(pán)組織中獲取總RNA，設(shè)計(jì)PCR引物，通過(guò)RT-PCR方法得到目的基因片段；將收集的TF基因片段與phoA質(zhì)粒重組，構(gòu)建TF表達(dá)質(zhì)粒載體pTF243，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MM294中，篩選得到基因重組工程菌株，接入發(fā)酵培養(yǎng)基直接發(fā)酵表達(dá)，得到含rhTF243蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)菌液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組組織因子構(gòu)建表達(dá)方法，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)基是以L(fǎng)B培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加2％～5％的葡萄糖、1％～5％無(wú)機(jī)鹽溶液和0.01％～0.05％氨芐青霉素后組成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組組織因子構(gòu)建表達(dá)方法，其特征是所述的無(wú)機(jī)鹽溶液由0.1％～0.5％磷酸二氫鈉、0.5％～1.0％磷酸氫二鉀、0.01％～0.05％氯化鐵、0.01％～0.03％硫酸鋅、0.01％～0.03％氯化鈷、0.01％～0.03％硫酸銅、0.5％～1.0％硫酸銨和0.05％～0.10％硫酸鎂組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組組織因子構(gòu)建表達(dá)方法，其特征是rhTF243在大腸桿菌中的表達(dá)是由發(fā)酵培養(yǎng)液中的無(wú)機(jī)磷濃度控制的，隨著大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)液中的無(wú)機(jī)磷逐漸消耗，當(dāng)無(wú)機(jī)磷濃度低于0.1mmol/L時(shí)，rhTF243蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組組織因子構(gòu)建表達(dá)方法，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)在溫度30℃～37℃和pH6.0～7.5條件下進(jìn)行，并保持水溶性氧＞20％。
7.權(quán)利要求1所述人重組組織因子的純化方法，其特征是用高壓勻漿機(jī)破碎發(fā)酵培養(yǎng)菌液釋放rhTF243蛋白，先用Q-Sepharose Fast Flow基質(zhì)進(jìn)行離子交換層析，再通過(guò)TF單抗免疫親和層析柱，收集得到純化的rhTF243蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人重組組織因子的純化方法，其特征是依次用pH 8.0的Tris-HCl緩沖液、pH 6.0的磷酸鹽緩沖液和pH 4.0的醋酸鈉緩沖液洗滌吸附在TF單抗免疫親和層析柱上的rhTF243蛋白，然后用pH 3.0的醋酸緩沖液洗脫rhTF243蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人重組組織因子的純化方法，其特征是所述的TF單抗免疫親和層析柱是由TF單克隆抗體與CNBr-actvated Sepharose FastFlow偶聯(lián)后制備得到。
10.權(quán)利要求1所述的人重組組織因子在制備凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及人重組組織因子的構(gòu)建、表達(dá)和純化方法及應(yīng)用。從人胎盤(pán)中獲取得到的TF基因片段與phoA質(zhì)粒重組，構(gòu)建質(zhì)粒載體pTF
文檔編號(hào)C07K14/43GK1687125SQ20051001241
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月22日
發(fā)明者焦進(jìn)安, 趙邑, 郝建平, 李晉川, 謝紅, 趙峰梅 申請(qǐng)人:太原博奧特生物技術(shù)有限公司