專利名稱：一種高效表達目的蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種高效表達目的蛋白的方法。
背景技術：
抗體分子片段與其它蛋白融合，可得到具有多種生物學功能的融合蛋白，將酶、毒素、細胞因子等生物活性物質(zhì)的基因與抗體融合，可將這些生物活性靶向到特定的靶部位，能有效地發(fā)揮生物學功能，降低毒副作用。將抗體片段與細胞因子融合是靶向治療腫瘤的有效手段，此類融合蛋白被稱為“免疫細胞因子”。目前，免疫細胞因子的產(chǎn)量成為目前制約其臨床大規(guī)模應用的最大障礙。大多數(shù)文獻報道中免疫細胞因子的產(chǎn)量均低于20μg/ml，難以達到規(guī)模化生產(chǎn)的要求。迄今為止只有一種免疫細胞因子在臨床試驗中應用。
已上市的以及正處于臨床試用中的基因工程抗體多達上百種，其中絕大多數(shù)都是在哺乳動物細胞中表達的，更確切地說，是在CHO細胞中表達的。因此，對CHO細胞的改造以及培養(yǎng)條件的優(yōu)化成為人們研究的熱點。如Pak等將胰島素樣生長因子和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入CHO細胞，使之成為能自分泌這兩種蛋白的超級CHO細胞(Pak SCO，Hunt SMN，Bridres MW et al.SuperCHO-a cell line capable of autocrine growth under fully defined protein freeconditions.Cytotechnology.1996，22139-146.)；利用基因工程的方法，將Bcl-2基因(細胞凋亡抑制基因)導入工程化的CHO細胞，可減少細胞凋亡，提高目的蛋白的產(chǎn)量(Figueroa B Jr，Sauerwald TM，Mastrangelo AJ，Hardwick JM，Betenbaugh MJ.omparison of Bcl-2to a Bcl-2 deletion mutant for mammaliancells exposed to culture insults.Biotechnol Bioeng.2001，73(3)211-22)；向CHO細胞中導入P21或P27基因，可使細胞阻滯于G1期，從而提高外源蛋白產(chǎn)量(Carvalhal AV，Marcelino I，Carrondo MJ.Metabolic changes during cellgrowth inhibition by p27 overexpression.Appl Microbiol Biotechnol.2003，63(2)164-73；Ibarra N，Watanabe S，Bi JX，Shuttleworth J，Al-Rubeai M.Modulation of cell cycle for enhancement of antibody productivity in perfusionculture of NSO cells.Biotechnol Prog.2003，19(1)224-8)。提高培養(yǎng)基的滲透壓，或在培養(yǎng)環(huán)境中加入丁酸鈉或AMP也可達到類似效果。
培養(yǎng)溫度是影響重組蛋白類藥物生產(chǎn)的重要因素之一。優(yōu)化培養(yǎng)溫度，可提高重組蛋白的產(chǎn)量。與其他方法相比，此方法操作簡便，有較好的實用價值。但一些研究表明，僅通過優(yōu)化培養(yǎng)溫度，并不能使重組蛋白的產(chǎn)量提高到理想水平。(Yoon SK，Song JY，Lee GM.Effect of low culture temperatureon specific productivity，transcription level，and heterogeneity of erythropoietin inChinese hamster ovary cells.Biotechnol Bioeng.2003，82(3)289-98)這是因為降低培養(yǎng)溫度可提高目的蛋白的比生成率，但同時導致細胞增殖抑制，降低了細胞的相對數(shù)量，從而影響了目的蛋白產(chǎn)量的提高。因此，如何利用優(yōu)化培養(yǎng)溫度來提高重組蛋白產(chǎn)量仍需進一步研究。

發(fā)明內(nèi)容
為了提高重組融合蛋白的產(chǎn)量，本發(fā)明公開了一種高效表達目的蛋白的方法，該方法包含兩個主要內(nèi)容1.優(yōu)化穩(wěn)定表達目的蛋白的工程化細胞株的培養(yǎng)溫度；2.進行兩階段培養(yǎng)。
本發(fā)明的方法如下第一階段在36.5℃-37.8℃的培養(yǎng)溫度下使穩(wěn)定表達目的蛋白的工程化CHO細胞株生長至合適密度，第二階段將培養(yǎng)溫度降至25℃-32℃，繼續(xù)培養(yǎng)至合適時間，收集上清并純化蛋白。
其中培養(yǎng)溫度的優(yōu)化通過以下方法進行培養(yǎng)溫度對重組蛋白表達量的影響將經(jīng)篩選得到的穩(wěn)定表達重組蛋白的細胞株，分別在25℃-32℃和36.5℃-37.8℃下進行培養(yǎng)，25℃-32℃下重組蛋白的比生成率顯著高于36.5℃-37.8℃，同時細胞增殖明顯受到抑制。重組蛋白的產(chǎn)量沒有得到有效提高。
兩階段培養(yǎng)方法的應用在36.5℃-37.8℃下使細胞增殖至90％鋪滿，將培養(yǎng)溫度降低至25℃-32℃繼續(xù)培養(yǎng)。于合適時間收集上清，經(jīng)檢測重組蛋白的產(chǎn)量得到顯著提高。
本發(fā)明是基于優(yōu)化培養(yǎng)溫度和兩階段培養(yǎng)方法，提高重組蛋白產(chǎn)量。即當細胞增殖到理想密度后，再降低培養(yǎng)溫度，使目的蛋白的產(chǎn)量得到有效提高。目前在免疫細胞因子類重組蛋白的表達中，未見有此種策略的應用報道。將本發(fā)明應用于免疫細胞因子類重組蛋白的真核表達可有效提高目的蛋白產(chǎn)量。其優(yōu)點在于方法簡便、易行，提高產(chǎn)量，但不提高成本。大大節(jié)省了時間、人力、物力和財力。無論對于實驗室規(guī)?；蛏虡I(yè)化生產(chǎn)均有較好的應用價值。


圖1為不同溫度下融合蛋白表達量隨時間變化示意2為不同溫度下細胞增殖情況示意3為不同溫度下細胞活力變化示意4為不同溫度下細胞凋亡情況示意5為FACS分析融合蛋白與Her2表面陽性細胞的結合活性，其中左圖為陰性對照，右圖為融合蛋白圖6為MTT法檢測在不同溫度下生產(chǎn)的融合蛋白的生物學活性具體實施方式
利用兩階段培養(yǎng)方法提高融合蛋白(HFI)在重組CHO細胞中的表達量1.材料穩(wěn)定表達融合蛋白HFI的CHO細胞株(Shi，M.，Xie，Z.，F(xiàn)eng，J.，Sun，Y.，Yu，M.，Shen，B.，Guo，N.，2003.A recombinant anti-ErbB2，scFv-Fc-IL-2 fusion protein retains antigenspecificity and cytokine function.Biotechnol.Lett.25，815-819)；DMEM培養(yǎng)基和無蛋白培養(yǎng)基HyQSFM4CHO由HyClone公司生產(chǎn)；羊抗人IgG、辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG購自北京中山生物技術公司。
2.方法和結果將穩(wěn)定表達融合蛋白anti-erbB2-ScFv-Fc-IL-2的重組CHO細胞株以2×106/瓶的數(shù)量，接種于底面積為25cm2的培養(yǎng)瓶中，共16瓶。應用的培養(yǎng)基為DMEM+10％FBS，在36.5℃-37.8℃下培養(yǎng)待細胞貼壁后，用無血清培養(yǎng)基洗三次，加入5ml的無蛋白培養(yǎng)基HyQSFM4CHO。其中8瓶放入36.5℃-37.8℃繼續(xù)培養(yǎng)，另外8瓶放于25℃-32℃培養(yǎng)。每間隔24小時取出一瓶細胞，檢測以下各種指標的變化。
1.不同溫度下融合蛋白HFI表達量變化情況采用夾心ELISA法檢測融合蛋白的瞬時表達。用羊抗人IgG(10μg/ml，pH9.6)包被ELISA板4℃過夜，充分洗滌后用含1％BSA的PBS 37℃封閉1h，洗滌后加入待測上清37℃孵育1h，洗滌后加入HRP-GAH IgG 37℃孵育l h，洗滌后以OPD顯色，洗液為含0.05％Tween20的PBS。結果顯示應用兩階段培養(yǎng)策略可使融合蛋白的產(chǎn)量提高2倍以上，見圖1。
2.不同溫度下細胞增殖情況計數(shù)細胞總數(shù)觀察細胞增殖情況，結果見圖2；3.不同溫度下細胞活力檢測用苔盼藍染色的法檢測細胞活力，吸出培養(yǎng)液，加入消化液，在37℃條件下消化1-2分鐘，然后加入5ml培養(yǎng)液制成細胞懸液。取0.5ml苔盼藍溶液(4％的苔盼藍溶液，用PBS配置)、0.5ml培養(yǎng)液，充分混勻，然后放置15分鐘，取10ul混合液，注入細胞計數(shù)板小室。計數(shù)500個細胞，并計數(shù)其中著色細胞。細胞活力(％)＝(細胞總數(shù)-著色細胞)÷總細胞數(shù)×100％。結果顯示細胞在30℃的培養(yǎng)條件下可在長時間內(nèi)保持較高的活力，見圖3。
4.用PI染色法及FACS法檢測細胞凋亡情況的變化細胞用消化液消化后，用預冷PBS洗2次后，移入1.5ml Ep管中，離心去上清。每管加入1ml 70％乙醇，4℃下固定18小時以上。離心去乙醇，再用PBS洗2次，加入100ul RNAaseA(0.1mg/ml)，于37℃消化30分鐘。加入0.1mg/ml碘化丙啶(PI)染液100ul，4℃避光染色30分鐘。2小時內(nèi)測FACS，以ModFit LT軟件分析。結果顯示30℃下細胞凋亡的比例明顯少于37℃下培養(yǎng)的細胞，見圖4。
5.用FACS法和MTT法分析融合蛋白生物活性的變化
0.02％EDTA消化SK-BR-3細胞，用冷PBA(PBS，2％BSA，0.1％NaN3)離心洗滌2次；與融合蛋白(100ng/ml)0℃振蕩孵育30min，以冷PBA離心洗滌2次，與FITC-GAH IgG 0℃振蕩孵育30min；冷PBA離心洗滌2次，PBS重懸細胞，用FACSCalibur儀器進行分析，結果顯示30℃下生產(chǎn)的融合蛋白可與SK-BR-3細胞結合，見圖5。
將IL-2依賴的CTLL-2細胞，用含15％小牛血清的1640培養(yǎng)基洗3次，以3×104/孔的數(shù)量傳入96孔板，同時將經(jīng)過定量后的表達上清以不同濃度梯度加入96孔板，37℃培養(yǎng)20小時。加入MTT(5ng/ml，用PBS配置)10ul。4小時后加入DMSO裂解細胞，OD570比色，結果顯示在低溫下生產(chǎn)的融合蛋白的生物學活性與37℃下無顯著差別，見圖6。
權利要求
1.一種高效表達免疫細胞因子類重組蛋白的方法，其特征在于優(yōu)化工程化CHO細胞株培養(yǎng)溫度和兩階段培養(yǎng)策略。
2.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于兩階段培養(yǎng)的第一階段，是在常規(guī)培養(yǎng)溫度36.5℃-37.8℃下，使穩(wěn)定表達目的蛋白的工程化CHO細胞株生長至適當密度；第二階段是將溫度降低至25℃-32℃。
3.根據(jù)權利要求1所述方法，其中免疫細胞因子類重組蛋白為融合蛋白anti-erbB2-ScFv-Fc-IL-2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達目的蛋白的方法。該方法通過優(yōu)化穩(wěn)定表達目的蛋白的工程化CHO細胞株的培養(yǎng)溫度，并利用兩階段培養(yǎng)策略，使融合蛋白表達量得到顯著提高。本發(fā)明的方法簡單、易行、高效，不提高成本。無論對于實驗室規(guī)?；蛏虡I(yè)化生產(chǎn)均有較好的應用價值。
文檔編號C07K19/00GK1869214SQ20051001177
公開日2006年11月29日 申請日期2005年5月24日 優(yōu)先權日2005年5月24日
發(fā)明者施明, 郭寧, 沈倍奮 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所