專利名稱：：因子vii的純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及因子VII的可控活化和降解的方法。凝血因子VII(FVII)是一種依賴于維生素K的絲氨酸蛋白酶，在血液凝固的外在途徑中起重要作用。它在肝臟中合成并與分泌到血液中，以一種分子量大約50,000的單鏈糖蛋白(酶原)形式在血液中循環(huán)。該蛋白酶以其活化的形式，F(xiàn)VIIa催化活化另兩個依賴于維生素K的絲氨酸蛋白酶家族的凝血因子，因子IX(FIX)和因子X(FX)。活化的FX(FXa)接著將凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶，凝血酶接著將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成血塊中的主要組分，纖維蛋白。因子VII能夠從血漿中純化和用Broze和Majerus，J.Biol.Chem.255(4)(1980)1242—1247和Hedner和Kisiel，J.Clin.Invest.71(1983)1836—1841所述的方法活化成因子VIIa。因子VIIa也可用DNA重組技術(shù)如下制得在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)用編碼因子VII的DNA序列轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞，分離產(chǎn)生的蛋白和將所說的蛋白活化成因子VIIa(參見歐洲專利申請書第/86302855，1號)。因子VIIa可以被用于治療已經(jīng)產(chǎn)生因子VII抑制劑的病人(Hedner，U.andKisiel，W，J.Clin.Invest.71(1983)1836—1841)和用于治療患出血疾病如血小板紊亂包括血小板減少癥、VonWillebrand’s癥和其它與嚴重的組織損傷相關(guān)的其它典型病癥(歐洲專利申請第86309.97.1號)在血漿衍生的牛蛋白(Redcliffe&Nermerson，J.Biol.Chem.250(1975)338—395)和人重組蛋白(Thim等人Birochemistry27(1988)7785—7793)的純化過程中通過Arg152—Ile153鍵的水解，F(xiàn)VII被活化成雙鏈形式。通過吸附于陰離子交換劑(二乙基氨基乙基或三甲基氨基乙基改性的聚合性凝膠基質(zhì))上(A.H.Pedersen等人Biochemistry28(1989)，9331—9336)FVII的活化被大大地增強了。FVII活化被增強的機理是未知的。除了活化外，一部分FVIIa分子主要在290和/或315位置上通過自身降解而被裂解(E.M.Nicolaisen等人FEBS＜ett.317(1993)245—249)。這樣的降解產(chǎn)物是無活化的分子，它們在FVIIa制劑中的存在會導(dǎo)致最終制劑產(chǎn)物較低的比活性。此外，從一批到另一批降解產(chǎn)物的數(shù)量和性質(zhì)是可變的，因而得到的制劑中生物學(xué)活性因子VIIa的含量也是可變的。最終制劑中的降解產(chǎn)物的含量可以觸發(fā)病人的免疫系統(tǒng)。再次給藥可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)，在嚴重情況下可以變?yōu)橹滤啦〕?。病人也可能產(chǎn)生高滴度的抗因子VIIa的抗體，使隨后的治療變得困難或無效。為了制備具有較低含量的降解產(chǎn)物的純化的FVIIa產(chǎn)物，在純化過程和隨后的加工過程中有必要控制活化和阻止降解。與FVIIa相反，單鏈形式FVII，在重鏈中可抵抗或更小傾向于裂解，因此這可能是以單鏈形式純化FVII的一個有利條件。因此本發(fā)明的目的是提供一種FVII的純化方法，用這種方法活化和降解可被避免或保持在可接受的較低程度，以提供一種高純度的均相產(chǎn)物，然后該產(chǎn)物可在另外的步驟中比較高的產(chǎn)率被活化成FVIIa以產(chǎn)生具有較高比活性的單一的和均相的產(chǎn)物。已知鋅離子可抑制重組FVIIa的酰胺分解和蛋白分解的活性(Pedersen.A.H.等人ThrombosisandHaemostasis，65(1991)528—534)。現(xiàn)以驚人地發(fā)現(xiàn)在通過色譜柱材料的純化過程中鋅離子的加入可被用來控制FVII的自活化和阻止FVII/FVIIa的降解。本發(fā)明最寬的方面是涉及一種在純化過程中FVII的可控活化和降解的方法，借此對因子VII的溶液進行一些色譜純化步驟，在這些純化步驟中至少一步存在有Zn++。本發(fā)明較窄的方面是涉及一種FVII的可控活化和降解的方法，其中FVII的溶液被施加到一些陰離子交換和免疫親合柱上。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中FVII溶液以下列次序被施加到色譜柱上1)陰離子交換；2)免疫親合；3)陰離子交換；4)陰離子交換柱，其中Zn++至少存在于前兩步中。圖1說明了當改變Zn++濃度時在有陰離子交換柱存在下FVII的活化。圖2說明了在純化步驟的一步或多步的緩沖溶液中包括有Zn++的純化方案中rFVII活化成rFVIIa。方案A到E的條件在表1中給出，結(jié)果列于表2。圖3說明了在純化步驟中的一步或多步的緩沖溶液中包括有Zn++的純化方案中FVIIa的降解。方案A到E的條件在表1中給出，結(jié)果列于表2。在闡述本發(fā)明之前，提出在下文中所用的某些術(shù)語的定義對理解本發(fā)明可能是有幫助的FVIIFVII包括從血漿中分離的或用DNA重組技術(shù)制備的FVII，也包括在不同的個體中可能存在和出現(xiàn)的等位基因的變體和因氨基酸殘基的缺失和/或取代而修飾的FVII蛋白，它們通過活化對于血液凝固具有與內(nèi)源性人FVIIa相同或基本上相同的生物學(xué)活性。“FVII”在上述定義范圍內(nèi)也包括當用DNA重組技術(shù)表達時具有糖基化程度和部位變化和/或其它根據(jù)選定的宿主細胞和培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)譯后修飾的FVII蛋白。FVIIa生物學(xué)活性FVIIa生物學(xué)活性的特征在于經(jīng)外在途徑調(diào)解血液凝固。FVIIa活化FX或為FXa，F(xiàn)Xa又將凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶，由此引發(fā)形成纖維蛋白血塊?？煽鼗罨徒到膺@一表達包括這樣一個過程，即在純化過程中FVII的活化和降解是根據(jù)給定參數(shù)的有意識被控制的變化進行的(此時有Zn++存在)。在Zn++不存在時，純化的工藝參數(shù)不得不被調(diào)整到同時發(fā)生活化和降解反應(yīng)，在Zn++存在時，已證明有可能控制這些反應(yīng)，使得獨立地使純化和活化盡可能完善成為可能。人FVII優(yōu)選地按歐洲專利申請第86302855.1號中所敘述的在轉(zhuǎn)染的哺乳動物的幼蒼鼠腎(BHK)細胞中表達。在色譜純化前用離心法和過濾法從細胞中分離出含有FVII和細胞增長刺激蛋白的培養(yǎng)基。為了純化的目的FVII被吸附于不同類型的色譜基質(zhì)上如陽離子交換劑，陰離子交換劑，免疫親合基質(zhì)、金屬離子螯合劑，染料親合基質(zhì)，疏水作用基質(zhì)和具有固定化了的生物特異性配體的親合基質(zhì)。FVII吸附于不同基質(zhì)上的機理是不同的，因此Zn++對FVII活化的影響可能不同，但是在吸附于不同類型的色譜基質(zhì)過程中仍是顯著的。鋅鹽可以被加入到一種或幾種洗脫溶液和用于平衡和洗脫的緩沖溶液中，鋅鹽可以是任何可溶性鋅鹽如乙酸鋅、檸檬酸鋅、氯化鋅或硫酸鋅。Zn++濃度可以在10μM至1mM間變化和優(yōu)選地是在大約20μM至大約1mM，更好地是在大約40μM至大約1mM間。隨后按照Hedner和Kiesel(J.Clin.INvest.71(1983)1836—1841)所述使用FXIIa或用其他具有胰蛋白酶樣特異性的蛋白酶可實現(xiàn)純化FVII活化成FVIIa?？蛇x擇地，F(xiàn)VII可以在有聚合的大分子如聚賴氨酸、基質(zhì)結(jié)構(gòu)、取代的瓊脂糖凝膠或膜存在下被活化。通過下列四個連續(xù)的色譜步驟來施行將rFVII純化和活化成rFVIIa的純化方案第1步陰離子交換；第2步免疫親合色譜；第3步陰離子交換；第4步陰離子交換。實施純化方案的一個實驗系列，其中一些方案包括向在表1中所概括的一步或多步的色譜步驟的所有緩沖溶液中加入鋅鹽。實驗條件在實施例2～4中給出。參此實驗(E)按照實施例2施行，但未加入Zn(CH3COO)2。表1</tables>+/-表示在緩沖溶液中存在或不存在鋅鹽測定每步洗脫物中FVII活化的程度(90FVII)和FVIIa降解產(chǎn)物的含量。FVII向雙鏈FVIIa形式的轉(zhuǎn)化用標準的聚丙烯酰胺電泳(PAGE)在十二烷基硫酸鈉(SDS)中在減壓條件下與考馬斯藍染色相結(jié)合并用激光密度計量法定量化來測量。FVIIa降解產(chǎn)物的含量用反相高效液相色譜(RP—HPLC)在丁基鍵合的硅膠柱上以線性乙腈梯度來定量?；旧习凑諏嵤├鰧嵤┑膶嶒灥慕Y(jié)果列于表2并用圖2和圖3表示。從圖2中明顯地看出在有鋅離子存在時(線A、B和C)在免疫親合步驟(第2步)和陰離子交換步驟(第3步和第4步)(線A和B)中沒有或非常有限的rFVII活化發(fā)生。與此相反，在不存在鋅離子時在第2步(線E)和在第3和第4步(線B、C和E)中發(fā)生了大范圍的活化。也很明顯，鋅離子與FVII/FVIIa相互作用引起的對FVII活化的抑制效應(yīng)具有可逆的性質(zhì)；由于通過與過量的EDTA配合除去鋅離子后，在隨后的純化步驟(線B和C)中FVII被活化。在第一步中很顯然在不存在鋅離子時沒有活化發(fā)生，這可能是由于柱上FVII的濃度太低。第一步的洗脫物，它被用于全部實驗中，含有少于1％的FVIIa。表2<p>實施例1結(jié)合于陰離子交換劑上時FVII活化的抑制作用Zn++對FVII活化的影響用一個實驗來測試，在該實驗中在不同濃度的Zn++存在下純化過的FVII被吸附于Q—SepharoseFF基質(zhì)上。在1.5ml的試管中將500μgFVII與50μlQ—SepharoseFF在800μl緩沖溶液10mMTris，50mMNaCl，2mMCaCl2和不同濃度的乙酸鋅中一起保溫。1小時和2小時后用離心法使基質(zhì)沉降并除去上清液，加入800μl10mMTris，50mMNaCl，25mMCaCl2PH8的緩沖溶液，混合和離心后取上清液的樣品用SDS—PAGE分析FVII/FVIIa。結(jié)果(圖1)表明在Zn++不存在時，在1小時內(nèi)55％的FVII被活化成FVIIa，在2小時后超過90％的FVII被活化成FVIIa。在有10μMZn++存在時，1小時后只有25％被活化，2小時后只有73％被活化。在有超過40μM濃度的Zn++存在時在2小時內(nèi)沒有活化發(fā)生。從該實驗清楚地看到在陰離子交換劑存在下大約10μM至大約100μM濃度范圍的Zn++對于FVII的活化具有抑制作用，可以設(shè)想在低于10μM至1mM的整個Zn++的全部濃度范圍中Zn++對于FVII的活化都有影響。看起來通過改變Zn++濃度有可能控制FVII的活化速率常數(shù)并且在高Zn++濃度下基本上可“保護”FVII不被活化和因此不被降解。實施例2rFVII的純化和活化成rFVIIa通過下列四個色譜步驟進行第1步通過稀釋將含有rFVII的細胞培養(yǎng)基調(diào)整至離子強度低于10MS/cm并施加到用緩沖溶液A10mM三羥基甲基氨基甲烷(Tris)；150mMNaClPH8預(yù)平衡的Q—Sepharose柱上。用在同樣緩沖溶液中的175mMNaCl洗滌后用緩沖溶液B10mMTris；150mMNaCl；25mMCaCl2PH8洗脫rFVII。第2步將含有104mg/LrFVII的洗脫溶液調(diào)整到最終組成10mMTris；1MNaCl；25mMCaCl2；70μMZn(CH3COO)2PH7.5并施用到具有固定化的抗FVII單克隆抗體的Sepharose柱上?？贵w柱用緩沖溶液C10mMTris；10mMNaCl；20mMCaCl2；70μMZn(CH3COO)2PH7.5預(yù)平衡，然后用10mMTris；2MNaCl；20mMCaCl2；70μMZn(CH3COO)2PH7.5沖洗柱子，接著用緩沖溶液C沖洗。此后用一種緩沖溶液75mMTris；30mM檸檬酸三鈉；70μMZn(CH3COO)27.5洗脫rFVII/rFVIIa。第3步將洗脫液立即施加到用緩沖溶液10mMTris；150mMNaCl；70μMZn(CH3COO)2PH8.6預(yù)平衡的Q—Sepharose柱上。用相同的緩沖溶液洗滌此柱并以線性梯度從緩沖溶液A至緩沖溶液D10mMTris；500mMNaCl；70μMZn(CH3COO)2PH8.6洗脫rFVII/rFVIIa。第4步通過稀釋將含有rFVII/rFVIIa的部分調(diào)整至離子強度低于10mS/cm并立即施加到用緩沖溶液10mM甘氨酰甘氨酸；150mMNaCl；70μMZn(CH3COO)2，PH8.6預(yù)平衡的Q—Sepharose柱上。用緩沖溶液10mM甘氨酰甘氨酸；175mMNaCl；70μMZn(CH3COO)2PH8.6；和緩沖溶液E10mM甘氨酰甘氨酸；100mMNaCl；70μMZn(CH3COO)2PH8.6洗滌后，以線性梯度從緩沖溶液E至緩沖溶液10mM甘氨酰甘氨酸；100mMNaCl；15mMCaCl2；70μMZn(CH3COO)2PH8.6將rFVII/rFVIIa洗脫。流速是1體積/小時。純化的rFVIIa制劑具有下列特征rFVIIa含量345mg/l用UV光譜測得(OD280)；外來蛋白質(zhì)含量＜1％(用RP—HPLC測得)rFVII含量89％(用SDS—PAGE測得)rFVIIa降解產(chǎn)物含量＜2％(用RP—HPLC測得)實施例3FVII的純化和活化成FVIIa通過下列四個色譜步驟進行第1步通過稀釋將含有rFVII的細胞培養(yǎng)基調(diào)整到離子強度低于10mS/cm并施加到用緩沖溶液A10mM三羥基甲基氨基甲烷(Tris)；150mMNaClPH8預(yù)平衡的Q—Sepharose柱上。用在同樣緩沖溶液中的175mMNaCl洗滌后用緩沖溶液B10mMTris；150mMNaCl；25mMCaCl2PH8洗脫rFVII。第2步將含有104mg/lrFVII的洗脫溶液調(diào)整到最終組成10mMTris；1MNaCl；25mMCaCl2；70μMZn(CH3COO)2PH7.5并施加到具有固定化了的抗FVII單克隆抗體的Sepharose柱上。抗體柱用緩沖溶液C10mMTris；100mMNaCl；20mMCaCl2；70μMZn(CH3COO)2PH7.5預(yù)平衡，然后用10mMTris；2MNaCl；20mMCaCl2；70μMZn(CH3COO)2PH7.5洗滌此柱，接著用緩沖溶液C洗滌。此后用一種緩沖溶液75mMTris；30mM檸檬酸三鈉；70μMZn(CH3COO)2PH7.5洗脫rFVII/rFVIIa。第3步將洗脫液立即施加到用緩沖溶液10mMTris；150mMNaCl；70μMZn(CH3COO)2PH8.6預(yù)平衡的Q—Sepharose柱上。用相同的緩沖溶液洗滌此柱并以線性梯度從緩沖溶液A至緩沖溶液D10mMTris；500mMNaCl；70μMZn(CH3COO)2PH8.6洗脫rFVII/rFVIIa。第4步將含有rFVII/rFVIIA的部分調(diào)整至2mM乙二胺四乙酸(EDTA)并通過稀釋將離子強度調(diào)整至低于10mS/cm，將其立即施加到用緩沖溶液10mM甘氨酰甘氨酸；150mMNaClPH8.6預(yù)平衡的Q—Sepharose柱上。用緩沖溶液10mM甘氨酰甘氨酸；175mMNaClPH8.6和緩沖溶液E10mM甘氨酰甘氨酸；100mMNaClPH8.6洗滌后，以線性梯度從緩沖溶液E至緩沖溶液10mM甘氨酰甘氨酸；100mMNaCl；15mMCaCl2PH8.6洗脫rFVII/rFVIIa。流速是1體積/小時。純化過的rFVIIa制劑具有下列特征rFVIIa含量492mg/l，用UV光譜測得(VD280)；外來蛋白質(zhì)含量＜1％，用RP—HPLC測得；rFVII含量18％，用SDS—PAGE測得；rFVIIa降解產(chǎn)物含量3.6％，用RP—HPLC測得。實施例4rFVII的純化和活化成rFVIIa通過下列四個色譜步驟進行第1步通過稀釋將含有rFVII的細胞培養(yǎng)基調(diào)整至離子強度低于10mS/cm并施加到用緩沖溶液A10mM三羥基甲基氨基甲烷(Tris)；150mMNaCl.PH8預(yù)平衡的Q—Sepharose柱上。用在同樣緩沖溶液中的175mMNaCl洗滌后用緩沖溶液B10mMTris；150mMNaCl；25mMCaCl2PH8洗脫rFVII。第2步將含有104gm/lrFVII的洗脫物溶液調(diào)整至最終組成10mMTris；1MNaCl；25mMCaCl2；70μMZn(CH3COO)2PH7.5并施加到具有固定化了的抗FVII單克隆抗體的Sepharose柱上?？贵w柱用緩沖溶液C10mMTris；100mMNaCl；20mMCaCl2；70μMZn(CH3COO)2PH7.5預(yù)平衡。然后用10mMTris；2MNaCl；20mMCaCl2；70μMZn(CH3COO)2PH7.5洗滌此柱，接著用緩沖溶液C洗滌。此后用緩沖溶液75mMTris；30mM檸檬酸三鈉；70μMZn(CH3COO)2PH7.5洗脫rFVII/rFVIIa。第3步將洗脫液調(diào)整至2mMEDTA并立即施加到用緩沖溶液10mMTris；150mMNaClPH8.6預(yù)平衡的Q—Sepharose柱上。將該柱用相同的緩沖溶液洗滌并以線性梯度從緩沖溶液A至緩沖溶液D10mMTris；500mMNaClPH8.6洗脫rFVII/rFVIIa。第4步通過稀釋將含有rFVII/rFVIIa的部分調(diào)整至離子強度低于10mS/cm并立即施加到用緩沖溶液10mM甘氨酰甘氨酸；150mMNaClPH8.6預(yù)平衡的Q—Sepharose柱上。用緩沖溶液10mM甘氨酰甘氨酸175mMNaClPH8.6和緩沖溶液E10mM甘氨酰甘氨酸100mMNaClPH8.6洗滌后，以線性梯度從緩沖溶液E至緩沖溶液10mM甘氨酰甘氨酸；100mMNaCl；15mMCaCl2PH8.6洗脫rFVII/rFVIIa。流速是1體積/小時。純化過的rFVIIa制劑具有下列特征；rFVHa含量1.2mg/ml，用UV光譜測得；外來蛋白質(zhì)含量＜1％，用RP—HPLC測得；rFVII含量1％，用SDS—PAGE測得；rFVIIa降解產(chǎn)物含量6.7％，用RP—HPLC測得。權(quán)利要求1.一種在純化過程中因子VII的可控活化和降解的方法，借此對因子VII的溶液進行一些色譜純化步驟，在這些純化步驟的至少一步中有Zn++存在。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中因子VII的溶液被施加到一些陰離子交換和免疫親合色譜柱上。3.根據(jù)權(quán)利要求1—2的方法，其中Z++以可溶性鋅鹽的形式存在。4.根據(jù)權(quán)利要求1—3的方法，其中Zn以大約10μM至大約1mM的濃度存在。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中Zn++以大約20μM至大約1mM的濃度存在。6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中Zn++以大約40μM至大約1mM的濃度存在。7.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中FVII的溶液以下列次序施加到色譜柱上1)陰離子交換；2)免疫親合；3)陰離子交換；4)陰離子交換柱和其中至少在兩步中存在有Zn#。全文摘要在通過一些色譜的純化步驟的純化過程中FVII的活化和降解用于至少在一個純化步驟中有Zn文檔編號A61K35/12GK1121723SQ9419183公開日1996年5月1日申請日期1994年3月25日優(yōu)先權(quán)日1993年3月31日發(fā)明者T·朱爾根森,A·H·佩德森申請人:諾沃挪第克公司