重組人成纖維細胞生長因子-17的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及重組人成纖維細胞生長因子-17的生產(chǎn)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 成纖維細胞生長因子（FibroblastGrowthFactor,FGF)是一類廣泛存在于多種 組織中的多肽細胞生長因子，目前已發(fā)現(xiàn)23個成員，分子量為16kD~34kD，其中心區(qū)域含 有高度同源性（30%~70% )的大約120個氨基酸序列，對來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的 多種類型細胞具有廣泛的生物學(xué)活性。FGFs在體內(nèi)含量甚微但分布廣泛，各個因子調(diào)控著 一系列的發(fā)育過程，包括腦的發(fā)育、肢體的分化和軀干的形成。大多數(shù)FGFs成員與胚胎發(fā) 育、組織損傷修復(fù)、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等等有密切關(guān)系，具有可觀的應(yīng)用價值。
[0003]FGF-17屬FGF8亞家族（FGF8、FGF17、FGF18)，與其他FGF成員一樣，均屬于旁分 泌因子，而在前列腺癌和肝癌中，F(xiàn)GF17還以自分泌方式參與其中。在胚胎發(fā)育過程中的組 織和器官形成中起重要作用。1998年，日本科學(xué)家MasamitsuHoshikawa等人從大鼠胚胎 中分離得到一種能夠編碼含有216個氨基酸的FGF17的cDNA，利用轉(zhuǎn)染了含cDNA的桿狀 病毒的HighFive昆蟲細胞有效得到了大鼠FGF17蛋白?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)FGF17mRAN在大鼠胚 胎腦組織峽部及隔膜的神經(jīng)上皮優(yōu)先表達。說明FGF17對于胚胎腦組織發(fā)育至關(guān)重要。人 FGF17有兩種亞型，F(xiàn)GF17a和b，b為主要形式，本實驗中要表達的人FGF17也就是FGF17b。 人FGF17基因定位于染色體8p21. 3,共有3個外顯子，6個突變位點，由216個氨基酸組成， 與其他已發(fā)現(xiàn)的家族成員之間具有30%~70%的同源性，人FGF-17與老鼠的氨基酸序列 具有93%的高度同源性。人FGF17分子量約為25kD，而本次實驗設(shè)計中切除了信號肽，只 獲取成熟蛋白部分序列，最終蛋白分子量為22. 6kD，等電點10. 43,為堿性蛋白。結(jié)構(gòu)上， FGF17與FGF8、FGF18相似，屬同一家族成員，其同源性分別為60%和50%，均具有信號肽 序列，采用大腸桿菌表達時需將其切除。
[0004]FGF17對腦組織神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育意義重大。FGF17是腦組織結(jié)構(gòu)正常發(fā)育的 關(guān)鍵因子，其表達和同家族的FGF8出現(xiàn)部分重疊，兩者在MHB區(qū)域（mid-hindbrain，中后 腦）和皮質(zhì)層扮演重要角色。Cholfin等研究發(fā)現(xiàn)FGF17是小鼠額葉皮層分區(qū)的重要參 與部分，敲除FGF17會導(dǎo)致背側(cè)額葉皮層縮小以及額葉皮層投射到皮層下靶部位程度的 減少JingsongXu等以FGF17敲除小鼠為模型發(fā)現(xiàn)無論是出生后兩天的幼鼠還是成年小 鼠，在解剖學(xué)上無異常且呈現(xiàn)健康狀態(tài)，而經(jīng)過組織學(xué)檢測卻發(fā)現(xiàn)其中腦尾端、下丘腦和 小腦蝴部出現(xiàn)顯著的組織缺失現(xiàn)象，即發(fā)育異常。（Hoshikawaetal.BiochemBiophys ResCommun. 1998, 244:187 - 191；Maruokaetal.MechDev,1998,74 (1-2):175 - 177 ； Reifersetal.MechDev, 2000, 99(1-2) :39 - 49；Cholfinetal.ProcNatlAcadSciU SA, 2007, 104(18):7652 - 7657；XuJetal.Development, 2000, 127(9):1833-1843 ；)
[0005]FGF17在研究神經(jīng)精神性疾病方面具有潛在價值。針對這點，要涉及FGF17于染 色體上的位置。2009年的一篇報道綜述了染色體8p為神經(jīng)精神病學(xué)易感位點，與神經(jīng) 精神性紊亂（精神分裂癥、自閉癥）、神經(jīng)退行性疾?。ò柎暮Ｄ　⑴两鹕?、卡爾曼 綜合征等密切聯(lián)系；8p21-23是腦胼胝體發(fā)育不全的關(guān)鍵位點，后者和認知缺陷、抽搐、自 閉癥以及精神分裂癥密切相關(guān)。FGF17基因位于染色體8p21. 3,從而對于研究上述病癥 意義重大。Zanni等人經(jīng)過研究案例來探討FGF17與小腦發(fā)育和疾病的關(guān)系，該案例中， 患者伴有嚴重的生長發(fā)育遲緩、癲癇以及DWM(Dandy-Walkermalformation，第四腦室 孔閉塞綜合征，也稱非交通性腦積水）癥狀，檢測發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)染色體8p21. 2-p21. 3距 始端2. 3Mb處有缺失現(xiàn)象，也即FGF17基因有所缺損，而分析患者的血液淋巴細胞和皮膚 成纖維細胞發(fā)現(xiàn)FGF17表達水平明顯降低，這是關(guān)于人類小腦畸形與FGF17基因轉(zhuǎn)錄下 調(diào)的首次報道；Scearce-Levie等研究發(fā)現(xiàn)FGF17 /小鼠社會行為出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為幼鼠 發(fā)聲減少，成年鼠社會互動缺陷，并發(fā)現(xiàn)在人體中，F(xiàn)GF17信號通路的干擾可能會導(dǎo)致一 系列神經(jīng)精神類疾病，比如精神分裂癥和自閉癥，而這些異常行為可能由于FGF17缺失的 額葉皮層結(jié)構(gòu)中Fos基因的激活減少所致，然而相關(guān)的神經(jīng)循環(huán)和信號通路機制依然所 知甚少，需待進一步探究。目前對于神經(jīng)精神方面的疾病治療仍有不足和很大的空間，從 而對于涉及在內(nèi)的FGF17基因的研究具有很大的前景。（Tabar6s_Seisdedosetal.Mol Psychiatry. 2009, 14(6):563-589；Pauletal.NatRevNeurosci, 2007, 8(4):287-299 ； Zannietal.Neurogenetics, 2011, 12(3):241-245 ；Scearce-Levieetal.GenesBrain Behav, 2008, 7(3):344-354)
[0006]FGF17在骨骼方面的研究具有重要價值?？赡芘cFGF17作用于受體FGFR3有 關(guān)。FGFR3在骨骼發(fā)育中起重要作用，是軟骨細胞中主要表達的受體，其激活突變會導(dǎo)致 一系列骨骼發(fā)育缺陷性疾病，如軟骨發(fā)育不全（ACH)、季肋發(fā)育不全（HCH)和致死性骨發(fā) 育不全（TD)，持續(xù)性活化骨細胞中FGFR3會導(dǎo)致侏儒癥。KrejciP等人利用免疫組化方 法檢測到在正常人類生長板軟骨中有FGF17蛋白的表達，且水平和FGF19 -致，隨后在細 胞增殖實驗中發(fā)現(xiàn)FGF17與FGF1同等水平抑制RCS(大鼠軟骨瘤軟骨細胞）的軟骨細胞 增殖，隨著FGF17濃度加大，抑制作用愈明顯。低濃度時，F(xiàn)GF17通過與肝素聯(lián)用顯著抑制 RCS增殖，而單獨的FGF17抑制效果不明顯，檢測發(fā)現(xiàn)FGF17能夠誘使ERK信號通路磷酸 化。從而可知FGF17參與激活軟骨細胞中FGFR3信號通路，誘使ERK磷酸化，抑制軟骨瘤細 胞的生長，而要想達到顯著抑制作用需要有肝素的配合使用。（Passos-Buenoetal.Hum Mutat, 1999, 14(2) :115-125；Naskietal.Front.Biosci, 1998, 3:d781-794；Naskiet al.NatGenet, 1996, 13(2) :233-237；Shiangetal.Cell, 1994, 78 (2) : 335-342；Krejci etal.PediatrRes, 2007, 61 (3) : 267-272.)
[0007]FGF17對于腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的影響。和其他成纖維細胞生長因子一樣，F(xiàn)GF17 也是一種潛在的致癌因子。FGF17主要通過與細胞表面的酪氨酸激酶受體FGFR3c、FGFR4、 FGFR2c和FGFRlc發(fā)生特異性結(jié)合（FGFR3c>FGFR4>FGFR2c>FGFRlc)，通過MAPK途徑引發(fā) DNA合成以及促進細胞增殖，且在促進DNA合成時，F(xiàn)GF17誘導(dǎo)有絲分裂的活性是FGF8的兩 倍JingsongXu等人將攜帶有FGF17a和FGF17b(人FGF17的主要表達形式）基因的載體 轉(zhuǎn)入NIH3T3細胞中，一個星期之后，含有FGF17b的細胞40%出現(xiàn)腫瘤化，兩個星期之后， 所有細胞全部形成腫瘤，而含有FGF17a的細胞依然成正常狀態(tài)；Polnaszek和Heer等人均 檢測FGF17在前列腺癌細胞中出現(xiàn)過表達，尤其DU145細胞系中FGF17表達水平較高，Heer 等還發(fā)現(xiàn)在高度分化的前列腺癌細胞中FGF17mRNA以4倍于BPH(良性前列腺增生）的水 平上調(diào)。Polnaszek等從根治性前列腺切除手術(shù)標本的癌細胞中檢測到癌細胞和正常上皮 細胞中均有類似水平的FGF17的表達（由于癌細胞密度大，所以總體而言，F(xiàn)GF17在腫瘤 組織濃度偏高），表達量相對于FGF7偏低（FGF7為28ng/g，F(xiàn)GF17為0. 4~0. 5ng/g);關(guān) 于乳腺癌，目前依然沒有足夠的證據(jù)證明FGF17在乳腺癌細胞中有表達，不過Meijer等人 在三苯氧胺治療乳腺癌中發(fā)現(xiàn)組織中的受體FGFR4與其配體FGF17的信號傳導(dǎo)造成了三苯 氧胺抵抗，這一通路的發(fā)現(xiàn)對于內(nèi)分泌治療乳腺癌無效的患者進行靶向治療提供了指導(dǎo)價 值。Gauglhofer等人研究人肝癌細胞（HCC，!fepG2andΗ印3B)發(fā)現(xiàn)包括FGF17在內(nèi)的FGF8 家族的表達出現(xiàn)上調(diào)，而此現(xiàn)象可能與wnt通路下調(diào)有關(guān)。當饑餓或添加模擬低氧藥物甲 磺酸去鐵胺進行肝癌細胞培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)FGF8家族的表達顯著增加，饑餓培養(yǎng)的肝癌細胞， 在添加了FGF8亞家族因子后，細胞凋亡減少，而這個與ERK1/2和核糖體蛋白S6的磷酸化 有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)無血清時，pERK和pS6下調(diào)，pGSK3β上調(diào)，細胞存活減弱，當添加FGF17后， pERK上調(diào)，肝癌細胞增多。目前已知FGF17與腫瘤密切相關(guān)，因此將其作為腫瘤診斷和治 療的靶分子具有廣闊的前景。（ZhangXeta.JBiolChem, 2006, 281 (23) : 15694 - 15700 ; Murrayetal.CurrCancerDrugTargets, 2009, 9(5):639 - 651；Reifersetal.Mech Dev,2000,99(1 - 2):39 - 49；XuJetal.MechDev,1999, 83(1-2):165-78；Polnaszek etal.Prostate, 2004, 60(1) :18-24；Heeretal.JPathol,2004, 204(5):578-586 ； Meijeretal.MolCancerRes, 2006, 4(6):379-86；Gauglhoferetal.Hepatolo gy, 2011, 53(3) :854-864.)
[0008] 由于FGF-17對于腦組織、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼及腫瘤等方面有著重要意義，其研究和 臨床應(yīng)用前景廣闊，