專(zhuān)利名稱(chēng)：具有抗癌特性的植物來(lái)源蛋白質(zhì):海特卡品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗癌特性的植物來(lái)源的人GHRH(人生長(zhǎng)激素釋放激素)結(jié)合蛋白。
生長(zhǎng)激素(“GH”)是具有191個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其刺激許多生長(zhǎng)因子如胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-1)的產(chǎn)生并引發(fā)許多組織(骨骼、結(jié)締組織、肌肉和內(nèi)臟)的生長(zhǎng)。GH還具有生理學(xué)活性，增加核酸、蛋白質(zhì)的合成和脂解作用減少尿的分泌(Frohman L.A.&Kineman，R.D.，生理學(xué)手冊(cè)，生長(zhǎng)的激素控制，Kostyo，J.L & Goodman，H.M.編著(牛津大學(xué)出版社，紐約，1999)，189-221頁(yè))。
GH的合成受到下丘腦分泌的正作用因子或負(fù)作用因子的調(diào)節(jié)?？刂艷H產(chǎn)生的主要因子是“生長(zhǎng)激素釋放激素”(GHRH)，它是人體中一種具有44個(gè)氨基酸的肽。
GH和GHRH與許多疾病有關(guān)。其中，尤其應(yīng)該提及下面的疾病癌癥(尤其是前列腺癌和肺癌)、肢端肥大癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病和腎??；對(duì)于這些病理，適應(yīng)用GHRH拮抗劑治療。由于潛在有關(guān)的許多疾病，工業(yè)上繼續(xù)在研究GHRH拮抗劑。
因此本申請(qǐng)人剛好已經(jīng)分離了一種植物來(lái)源的新蛋白質(zhì)，其具有結(jié)合人GHRH的特性。
因此本發(fā)明的一個(gè)主題是通過(guò)從植物異葉毛果蕓香(pilocarpusheterophyllus)提取可以得到的經(jīng)分離蛋白質(zhì)，其特征是其分子量約為90.9kDa并且含有肽序列SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的片段，所述蛋白質(zhì)能夠以糖基化或非糖基化形式存在。為了簡(jiǎn)化下面的公開(kāi)，該蛋白質(zhì)此后稱(chēng)為“海特卡品(heterocarpine)”。
所述SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3序列如下
SEQ.ID.NO.1KLIGARYFDKSEQ.ID.NO.2YGEDIIVGVIDSGVSEQ.ID.NO.3 PESESY上面用于定義該肽的命名法(如本申請(qǐng)剩下部分中的)為“生物化學(xué)命名IUPAC-IUB委員會(huì)”(IUPAC-IUB Commissioner on BiochemicalNomenclature)規(guī)定，其中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)表示，N-末端氨基酸(氨基基團(tuán))出現(xiàn)在左邊，C-末端氨基酸(羧基基團(tuán))出現(xiàn)在右邊。術(shù)語(yǔ)“天然氨基酸”表示天然蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的天然L-氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Lys、Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Phe、Tyr、Pro、Trp和His的一種。
如果蛋白質(zhì)被從其最初的環(huán)境中移出，那么稱(chēng)該蛋白質(zhì)“被分離”。具體地，如果天然蛋白質(zhì)從天然系統(tǒng)中與該蛋白質(zhì)共存的生物材料分開(kāi)，那么該天然蛋白質(zhì)被“分離”。
本發(fā)明優(yōu)選地涉及非糖基化形式的海特卡品。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選可變方案，從體外培養(yǎng)的植物異葉毛果蕓香的細(xì)胞提取物得到海特卡品。
而且，本發(fā)明的一個(gè)主題也為特異性結(jié)合海特卡品的單克隆抗體或單克隆抗體的抗原結(jié)合片段。
海特卡品具有結(jié)合人GHRH的特性。體外，海特卡品結(jié)合人GHRH并從而抑制人GHRH結(jié)合到其受體上時(shí)誘導(dǎo)的環(huán)AMP的合成。體內(nèi)，在大鼠中，在血室中形成海特卡品/人GHRH復(fù)合體，并且其以依賴(lài)劑量的方式以摩爾對(duì)摩爾比例抑制10μg人GHRH誘導(dǎo)的GH合成。海特卡品具有結(jié)合人GHRH的特性。
這些特性使得本發(fā)明的化合物適于藥用。因此，本發(fā)明的另一個(gè)主題是糖基化或非糖基化的海特卡品用作藥物。本發(fā)明還涉及含有作為活性成分的糖基化或非糖基化的海特卡品的藥物組合物，所述組合物還含有一種或多種可藥用賦形劑。另一個(gè)主題是糖基化或非糖基化形式海特卡品的用途，用于制備拮抗GHRH作用的藥物，以治療增殖性疾病(尤其是癌癥)，治療肢端肥大癥或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病或腎病。關(guān)于癌癥，海特卡品尤其適于制備治療良性腫瘤和胰腺腫瘤、下丘腦-垂體神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、支氣管的、腸的和肝的腫瘤、交感腎上腺素能腫瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體腺瘤和甲狀腺腫瘤的藥物。海特卡品尤其適于制備治療依賴(lài)于生長(zhǎng)因子GHRH生長(zhǎng)的癌的藥物，尤其用于制備治療選自小細(xì)胞肺癌和乳腺癌(尤其是小細(xì)胞肺癌)的藥物。
本發(fā)明的一個(gè)主題是作為藥物的特異結(jié)合海特卡品的單克隆抗體或者其抗原結(jié)合片段。還涉及含有作為活性成分的特異結(jié)合海特卡品的單克隆抗體或者其抗原結(jié)合片段的藥物組合物，所述組合物還含有一種或多種可藥用賦形劑。還涉及特異結(jié)合海特卡品的單克隆抗體或者其抗原結(jié)合片段的用途，用于制備拮抗GHRH作用的藥物，以治療增殖性疾病(尤其是癌癥)、治療肢端肥大癥或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病以及腎病。對(duì)于癌癥，所述單克隆抗體或者其抗原結(jié)合片段尤其適于制備治療良性腫瘤和胰腺腫瘤、下丘腦-垂體神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、支氣管的、腸的和肝的腫瘤、交感腎上腺素能腫瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體腺瘤和甲狀腺腫瘤的藥物。
本發(fā)明還涉及海特卡品作為用于GHRH緩釋的藥物組合物中賦形劑的用途。還涉及含有GHRH、海特卡品和一種或多種可藥用賦形劑的藥物組合物。
最后，本發(fā)明的其他主題是使得可能從植物異葉毛果蕓香的細(xì)胞提取和分離海特卡品的方法，所述細(xì)胞優(yōu)選地來(lái)自體外培養(yǎng)物。這些方法基本包括用溫度為0到50℃，優(yōu)選4到25℃的水提取來(lái)自植物異葉毛果蕓香的細(xì)胞的步驟，所述提取步驟后跟隨過(guò)濾步驟以從異葉毛果蕓香細(xì)胞分離富含海特卡品的濾液，和從植物異葉毛果蕓香提取的其他組分分離海特卡品的一個(gè)或多個(gè)步驟。
根據(jù)第一個(gè)可變方案，這些提取和分離方法基本上包括下面的連續(xù)步驟a)用溫度為0到50℃，優(yōu)選4到25℃的水提取來(lái)自植物異葉毛果蕓香的細(xì)胞的步驟，所述提取步驟后跟隨著從異葉毛果蕓香細(xì)胞分離富含海特卡品的濾液的過(guò)濾步驟；b)沉淀所提取的蛋白質(zhì)的步驟，例如通過(guò)加入硫酸銨沉淀，然后是分離沉淀物的步驟(通過(guò)過(guò)濾或者，優(yōu)選地通過(guò)離心)；c)將步驟b)中回收的沉淀物溶于水中；和d)凝膠過(guò)濾層析的步驟，目的是從溶液的其他組分分離出海特卡品。
根據(jù)另一可變方案，這些提取和分離方法基本上包括下面的連續(xù)步驟a)用溫度為0到50℃，優(yōu)選4到25℃的水提取來(lái)自植物異葉毛果蕓香的細(xì)胞的步驟，所述提取步驟后跟隨著從異葉毛果蕓香細(xì)胞分離富含海特卡品的濾液的過(guò)濾步驟；b)對(duì)a)中所得溶液脫脂(delipidation)的步驟，通過(guò)加入pH優(yōu)選為2到4的非氧化酸(例如，鹽酸、硫酸或磷酸)酸化，使用液-液提取(優(yōu)選通過(guò)有機(jī)溶劑如二氯甲烷、庚烷、己烷或環(huán)己烷)；c)通過(guò)將b)中所得的脫脂溶液與聚乙烯吡咯烷酮(或者尼龍66)接觸然后在大孔樹(shù)脂(優(yōu)選基于聚苯乙烯的樹(shù)脂如樹(shù)脂DiaionHP-20)上過(guò)濾除去鞣酸的步驟；d)通過(guò)加入堿如氫氧化銨、氫氧化鈉或氫氧化鉀將步驟c)后所得濾液調(diào)節(jié)到堿性pH(優(yōu)選9到11之間的pH)；e)在陰離子-交換樹(shù)脂上過(guò)濾的一個(gè)或多個(gè)步驟，該一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾步驟的洗脫液優(yōu)選為pH9到11的緩沖液并且任選含有鹽(例如，氯化鈉或硫酸銨)濃度梯度，該一個(gè)或多個(gè)步驟的目的是將海特卡品與溶液的其他組分分離；f)脫鹽步驟，包括將步驟e)中所得溶液通過(guò)基于它們的分子量分離混合物成分的樹(shù)脂(如樹(shù)脂SephadexG25或Superdex200HR)和用水從所述樹(shù)脂洗脫該混合物。
含有本發(fā)明化合物的藥物組合物可以是固體形式如，例如，粉劑、丸劑、粒劑、片劑、脂質(zhì)體、明膠膠囊或栓劑。丸劑、片劑或明膠膠囊可以用某種物質(zhì)包衣，該物質(zhì)可以保護(hù)組合物在足夠的時(shí)間不受受試者胃中的胃酸或酶的作用以允許該組合物穿過(guò)受試者小腸而不被消化。該化合物哈可以局部施用，例如，施用于腫瘤的實(shí)際部位。還可以根據(jù)緩釋方法使用該化合物(例如，通過(guò)使用緩釋組合物或灌注泵)。適宜的固體載體可以是例如磷酸鈣、硬脂酸鎂、碳酸鎂、滑石粉、糖、乳糖、右旋糖、淀粉、明膠、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮和蠟。
含有本發(fā)明化合物的藥物組合物也可以以液體形式如溶液劑、乳劑、懸浮劑或緩釋制劑給出。適宜的液體載體可以是例如水、有機(jī)溶劑(如甘油)或乙二醇(如聚乙二醇)，以及它們以各種比例在水中的混合物。
本發(fā)明藥物的施用可以通過(guò)局部、經(jīng)口、腸胃外途徑、通過(guò)肌內(nèi)注射等進(jìn)行。
為治療上面提到的疾病或失調(diào)所提供的本發(fā)明化合物的劑量根據(jù)施用方法、所要治療的對(duì)象的年齡和體重及狀態(tài)而變，并且將最終由主治醫(yī)生或獸醫(yī)決定。由主治醫(yī)生或獸醫(yī)確定的這種量在這里被稱(chēng)為“治療有效量”。
根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)此后描述的方法制備海特卡品。
海特卡品的制備根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選可變方案，進(jìn)行了來(lái)源于該植物不同器官的愈傷組織或細(xì)胞懸浮物的體外培養(yǎng)。培養(yǎng)于半固體或液體培養(yǎng)基中的這些組織能夠生物合成具有生物學(xué)特性的化合物。
本申請(qǐng)中“愈傷組織”指半固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的未分化細(xì)胞的宏觀群。本申請(qǐng)中術(shù)語(yǔ)“未分化的細(xì)胞”表示在一定條件下能夠以愈傷組織或細(xì)胞懸浮物的形式增殖而無(wú)任何形態(tài)發(fā)生現(xiàn)象的細(xì)胞。最后，“細(xì)胞懸浮物”指在液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中可形成微觀群的未分化細(xì)胞。
營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、激素、培養(yǎng)條件的選擇以及這些體外培養(yǎng)物的提取和提取物的分析形成了本發(fā)明的一個(gè)整體部分。
例如根據(jù)此后的步驟可以在懸浮液中培養(yǎng)來(lái)自異葉毛果蕓香種子的細(xì)胞。
根據(jù)常規(guī)方法在培養(yǎng)前將這些器官消毒。體外胚芽器官也作為愈傷形成(callogenesis)起始材料而不需要事先消毒。優(yōu)選的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基是通常用于體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的一種它是Gamborg培養(yǎng)基(在Gamborg等，大豆根細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)需求，Exp.Cell Res.(1968)，50(1)，151-158)。碳源為蔗糖但是也可以使用濃度為1到120g/l，優(yōu)選約30g/l的葡萄糖。宏觀成分含量也可以減半。向培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)素或加入生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，優(yōu)選組合這兩種激素，通常為2，4-二氯苯氧基乙酸和激動(dòng)素，但是α-萘乙酸(NAA)、β-吲哚乙酸(IAA)、β-吲哚丁酸(IBA)或毒莠定也可以與激動(dòng)素或苯甲基氨基嘌呤(BAP)組合。生長(zhǎng)素的濃度可以為0.1到10mg/l(例如可以選擇1mg/ml)，細(xì)胞分裂素的濃度可以是0.01到2mg/l(例如可以選擇0.06mg/ml)。維生素為那些與不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基相關(guān)的維生素。在光或黑暗中進(jìn)行培養(yǎng)。溫度為10℃到33℃，但是優(yōu)選約23℃。培養(yǎng)基的pH為4到6.5并且優(yōu)選在滅菌前調(diào)節(jié)到5.8。此外，培養(yǎng)基中可以加入或不加入瓊脂。
原代愈傷組織在幾天的培養(yǎng)后出現(xiàn)并且可以從最初的植入物分離，約1個(gè)月后取出并傳代培養(yǎng)，然后在瓊脂半固體培養(yǎng)基(試管或培養(yǎng)皿中)上培養(yǎng)，間隔4到8周，優(yōu)選6周，從而通過(guò)在新培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)可以將愈傷組織保存數(shù)年。愈傷組織也可以在攪拌的液體培養(yǎng)基中(錐形瓶或生物反應(yīng)器中)傳代培養(yǎng)，在2到6周，優(yōu)選3周進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
株系通過(guò)它們的遺傳起源、培養(yǎng)條件、外觀和形態(tài)發(fā)生的缺乏進(jìn)行區(qū)分。
用溫度為0到50℃，優(yōu)選4到25℃的水提取冷凍干燥的異葉毛果蕓香細(xì)胞。將所得提取物冷凍干燥，以后以適宜的濃度再溶解(例如，約30％的干物質(zhì))。通過(guò)加入濃縮的硫酸銨溶液(例如在代表70到90％飽和濃度的濃度)沉淀的蛋白質(zhì)溶于最少量的水中并通過(guò)離心分離出不溶物質(zhì)。然后通過(guò)柱層析(洗脫液優(yōu)選為水)分離蛋白質(zhì)并可以回收海特卡品(可通過(guò)其約90.9kDa的分子量進(jìn)行鑒定)。
特異結(jié)合海特卡品的抗體的制備本發(fā)明提供了特異結(jié)合海特卡品的結(jié)合劑，如抗體。如果這種結(jié)合劑在可檢測(cè)的水平(例如通過(guò)ELISA試驗(yàn))與所述蛋白質(zhì)反應(yīng)并且不與其他蛋白質(zhì)可檢測(cè)地反應(yīng)，那么這種結(jié)合劑被稱(chēng)為“特異結(jié)合”?！敖Y(jié)合”指兩種不同分子間的非共價(jià)結(jié)合從而形成復(fù)合體。結(jié)合能力可以例如通過(guò)確定復(fù)合體形成的結(jié)合常數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。結(jié)合常數(shù)是復(fù)合體濃度值除以非復(fù)合組分的濃度值的乘積所得的值。當(dāng)結(jié)合常數(shù)達(dá)到103l/mol時(shí)稱(chēng)兩種產(chǎn)物是“結(jié)合的”?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法確定結(jié)合常數(shù)。
可以滿(mǎn)足上面標(biāo)準(zhǔn)的任何試劑都可認(rèn)作結(jié)合劑。
本發(fā)明中，結(jié)合劑優(yōu)選為抗體或其片段。可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到的任何技術(shù)制備抗體(參考Harlow和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988)。通常，可通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)包括產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)產(chǎn)生抗體，或者通過(guò)將抗體基因轉(zhuǎn)染入來(lái)自細(xì)菌或哺乳動(dòng)物的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生重組抗體。
其他技術(shù)中，優(yōu)選此后描述的那些技術(shù)。將含有海特卡品的免疫原注射到一組哺乳動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、兔、綿羊或山羊)中。在該步驟，海特卡品可作為未修飾的免疫原。備選地，如果海特卡品與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如牛血清白蛋白或者形血藍(lán)蛋白組合，那么可以誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。優(yōu)選根據(jù)預(yù)定方案將免疫原注射到宿主動(dòng)物中，并對(duì)動(dòng)物定期取血。可以從這些抗血清純化對(duì)海特卡品特異的多克隆抗體，例如，使用與適宜固體載體偶聯(lián)的海特卡品通過(guò)親和層析純化。
用于釋放GHRH的藥物組合物可以具體地根據(jù)刊物De Wolf和Brett，PharmacologicalReviews(2000)，52，207-236和其中引用的參考文獻(xiàn)中描述的方法之一從海特卡品和GHRH制備組合物。
除非另外說(shuō)明，此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有和本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所通常理解的相同的意思。類(lèi)似地，此處提到的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、所有專(zhuān)利和所有其他參考文獻(xiàn)被并入作為參考。
下面給出的實(shí)施例用于闡明上面的方法并且絕不應(yīng)該被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
獲得海特卡品實(shí)施例1細(xì)胞的體外培養(yǎng)使異葉毛果蕓香種子發(fā)芽并移走發(fā)芽產(chǎn)生的莖。所述莖培養(yǎng)于Gamborg培養(yǎng)基(Gamborg等，大豆根細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求，Exp.CellRes.(1968)，50(1)，151-158)，該培養(yǎng)基中已經(jīng)被加入30g/l蔗糖、1mg/l2，4-二氯苯氧基乙酸和0.06mg/l激動(dòng)素。在23℃的溫度下黑暗中在試管中進(jìn)行培養(yǎng)。每6周在常規(guī)條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。這些株系外觀上具顆粒，具有淺褐色色素。
進(jìn)行株系的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究，為期8周，該動(dòng)力學(xué)基于來(lái)自生物量的鮮物質(zhì)和干物質(zhì)質(zhì)量的增加。將來(lái)自?xún)晒艿挠鷤M織組合并組成每周兩次的收獲物，第一次收獲在時(shí)間0進(jìn)行。然后收獲愈傷組織和半乳聚糖并冷凍干燥。觀察到出現(xiàn)穩(wěn)定的生長(zhǎng)期前生長(zhǎng)為指數(shù)的，長(zhǎng)達(dá)6周。
細(xì)胞培養(yǎng)物的提取將25g冷凍干燥的異葉毛果蕓香細(xì)胞提取兩次，該提取為將這些細(xì)胞浸于375ml 4℃水中，在4℃放置過(guò)夜，然后在250ml 4℃水中4小時(shí)，最后用125ml 4℃水洗滌。這樣所得每種水性溶液在真空中通過(guò)裝有硅藻土(celite)的玻璃過(guò)濾器過(guò)濾以將細(xì)胞殘?jiān)鼜乃匀芤悍蛛x。合并所得水性溶液并凍干得到9.4g干物質(zhì)。然后將凍干的干燥提取物溶于31ml 20℃水中以得到含有30％干提取物的溶液。在穩(wěn)定的磁力攪拌下以小份加入17.4g硫酸銨以沉淀蛋白質(zhì)級(jí)分。然后通過(guò)3000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘將蛋白質(zhì)沉淀物從硫酸銨溶液分離。倒出硫酸銨溶液并將沉淀的蛋白質(zhì)溶于22ml水中，再次離心并過(guò)濾以除去不溶微粒。
然后對(duì)所得濾液進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析。將其注射到根據(jù)生產(chǎn)商的推薦制備的裝有SuperdexTM20(Amersham Pharmacia Biotech，參考號(hào)17-1043-01；微粒平均直徑13μm)的柱子(Buchi N°19678，L＝230mm；內(nèi)徑＝26mm)，使用超純水(Water’s Milli-Q)作為洗脫液，流速為5ml/分鐘。收集多個(gè)40ml級(jí)分并在第3和第4級(jí)分中發(fā)現(xiàn)活性蛋白質(zhì)。將這些部分冷凍干燥以得到約14.2mg活性產(chǎn)物。
所得產(chǎn)物的純度通過(guò)在含有十二烷基硫酸鈉的電泳凝膠(SDS PAGE)上出現(xiàn)的單帶證明。對(duì)應(yīng)于該帶的產(chǎn)物此后指定為海特卡品。
實(shí)施例2根據(jù)與實(shí)施例1中描述的方法相同的方法體外培養(yǎng)細(xì)胞，根據(jù)此后描述的方法提取所培養(yǎng)細(xì)胞。
將100g凍干的異葉毛果蕓香細(xì)胞用2升20℃去離子水提取，混合物在攪拌下保持過(guò)夜。通過(guò)覆蓋硅藻土床(事先用酸洗滌；1到2cm厚)的過(guò)濾板(孔隙3，直徑20cm)上抽氣過(guò)濾細(xì)胞和提取物?；厥盏募?xì)胞用400ml去離子水洗滌然后將它們除去。然后將水性濾液通過(guò)加入約10ml 18％鹽酸酸化。使用400ml二氯甲烷通過(guò)液-液提取對(duì)酸性溶液脫脂。將二氯甲烷相倒出并清除。將經(jīng)脫脂的溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去殘留的二氯甲烷。然后將約30g聚乙烯吡咯烷酮加入經(jīng)脫脂溶液(pH約3.0)并攪拌混合物約30分鐘以除去鞣酸。通過(guò)被含有25g硅藻土(事先用酸洗滌)和25g聚乙烯吡咯烷酮的混合物床覆蓋的過(guò)濾板(孔隙率3，直徑10cm)上抽氣穿過(guò)床過(guò)濾混合物。然后濾液穿過(guò)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明預(yù)活化的400ml DiaionHP-20(Mitsubishi Chemical Company)的床。通過(guò)加入約60ml 20％氫氧化銨溶液使所得濾液為堿性(pH10)。放置30分鐘后出現(xiàn)少許沉淀。將1g硅藻土(事先用酸洗滌)加入該堿性溶液，然后將該溶液通過(guò)抽氣穿過(guò)膜過(guò)濾器(0.22μm)過(guò)濾。然后約2升濾液穿過(guò)安裝在Akta純化器上的HiPrepQ XL 16/10柱子，該柱子已經(jīng)用pH 10.2的哌嗪/HCl 0.1M緩沖液預(yù)平衡，流速為每分鐘0.5ml(HiPrep柱和Akta純化器都是AmershamBiosciences公司的產(chǎn)品)。將柱子用6柱體積的pH 10.2的起始緩沖液、5柱體積的含有0.2M NaCl的相同緩沖液、和10柱體積的含有1M NaCl的相同緩沖液連續(xù)洗滌。在含有1M NaCl的緩沖液的頭3個(gè)柱體積中回收大部分海特卡品?；钚约?jí)分通過(guò)穿過(guò)SephadexG25柱(床體積260ml)脫鹽，使用去離子水作為洗脫液。在相應(yīng)于滯留體積的第一個(gè)柱體積中發(fā)現(xiàn)活性級(jí)分，將該活性部分冷凍干燥得到170mg海特卡品。所得海特卡品在SDSPAGE凝膠上基本上是一條帶。
海特卡品的表征分析和微測(cè)序?qū)悠飞蠘又?0％聚丙烯酰胺凝膠。遷移后，將凝膠固定并用考馬斯亮藍(lán)染色。
相應(yīng)于泳道1、2、3、4和5的在圖3中描繪的凝膠泳道分別是分子量標(biāo)記(Amarsham)、如在實(shí)施例1中所得最終海特卡品級(jí)分的0.5、1和2μg含量和分子量標(biāo)記(Amersham)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子量圖使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算工具(例如，Viber Lourmat’s Bio-Profil BiolD軟件)確定分子量使得可表明海特卡品的分子量為90.9千道爾頓(±1.6千道爾頓)。
對(duì)于蛋白質(zhì)的微測(cè)序分析，切下含有該蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺帶并將其在存在0.4μg endolysine-C(Sigma)下在含有50mM Tris(pH 8.6)、0.03％十二烷基硫酸鈉的300μl消化緩沖液中35℃消化18小時(shí)。所得肽通過(guò)HPLC在直徑1mm的DEAE-C18內(nèi)嵌柱上分離。分離梯度基于乙腈(從2到70％)和0.1％三氟乙酸(TFA)的混合物。然后在Procise測(cè)序儀(AppliedBiosystem)上進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)該方法已經(jīng)測(cè)序了三個(gè)峰，使得可能以唯一方式表征海特卡品。相應(yīng)序列在本發(fā)明中確定為SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3。
通過(guò)檢測(cè)SDS-PAGE凝膠分離的糖蛋白的糖化結(jié)構(gòu)進(jìn)行糖蛋白的分析。該檢測(cè)系統(tǒng)是對(duì)“Periodic Acid-Schiff”方法的改良并導(dǎo)致品紅色帶的出現(xiàn)，證明是糖蛋白(Sigma)。對(duì)于如在實(shí)施例1中得到的海特卡品，得到在圖4中再現(xiàn)的結(jié)果。
海特卡品的藥理學(xué)性質(zhì)人GHRH受體(hGHRH-R)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染從Kelly Mayo博士(Northwestern University，芝加哥，IL)得到以穩(wěn)定方式表達(dá)人GHRH受體的人胚胎腎細(xì)胞HEK-293(Stuart Sealfon(MountSinai Medical School，紐約)博士開(kāi)發(fā)的細(xì)胞系)。
細(xì)胞培養(yǎng)和膜制備上述用人GHRH受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)加0.4mg/mlG418(Life technologies)且存在10％胎牛血清和4mM L-谷氨酰胺(Lifetechnologies)的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，高葡萄糖含量，Life technologies提供)中。將細(xì)胞在含有50mM HEPES(pH 7.4)、5mM氯化鎂(MgCl2)、2mM乙二醇-二(2-氨基-乙基)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)和50μg/ml桿菌肽的緩沖液A中勻漿并在相同緩沖液A中超聲處理。將勻漿的細(xì)胞在4℃以39,000g離心10分鐘，懸于緩沖液A中并4℃以40,000g再離心10分鐘。通過(guò)Bradford’s技術(shù)定量總膜蛋白。然后將沉淀的膜保存在-80℃?zhèn)溆谩?br> hGHRH-R的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)將用人GHRH受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞的膜用含有50mMHEPES(pH 7.4)、5mM MgCl2、2mM EGTA、50μg/ml桿菌肽和0.5％牛血清白蛋白(BSA)的反應(yīng)緩沖液稀釋到濃度100μg/ml。在濃度不斷增加的海特卡品存在下將膜與0.05nM[125I]GHRH(1-44酰胺)以終體積200μl在23℃下孵育2小時(shí)。通過(guò)在預(yù)裝0.1％聚氮丙啶的96孔GF/C過(guò)濾器上快速過(guò)濾中止反應(yīng)。然后使用Packard 96孔過(guò)濾站(filtration station)用含有50mM Tris(pH 7.4)的洗滌緩沖液在4℃下洗滌過(guò)濾器3次。將如此干燥的過(guò)濾器浸入20μl閃爍混合物(Microscint O，Packard)中并進(jìn)行Topcout計(jì)數(shù)(Packard)。存在100nM hGHRH時(shí)確定非特異性活性。所產(chǎn)生的hGHRH(0.001nM到100nM)劑量-應(yīng)答曲線(xiàn)及所得結(jié)果包括在

圖1中。
環(huán)AMP的競(jìng)爭(zhēng)性形成將用人GHRH受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞分布于48孔培養(yǎng)板中并培養(yǎng)3天。除去培養(yǎng)基并用含有250μl DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，高葡萄糖含量；Life technologies提供)并存在0.5％BSA、0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的培養(yǎng)基B代替并在37℃下預(yù)孵育5分鐘。在預(yù)孵育期間末，額外檢測(cè)海特卡品20分鐘。觀察到的濃度在圖2中報(bào)告。通過(guò)加入100μl 0.1M HCl中止孵育并使用FlashPlate試劑盒(NewEngland Nuclear)分析等分試樣的環(huán)AMP含量。
大鼠中GH的分析通過(guò)Spi-Bio(Spi-Bio，法國(guó))開(kāi)發(fā)的酶-免疫學(xué)試驗(yàn)在血樣中測(cè)量大鼠(雄性Sprague Dawley)中GH的水平。通過(guò)遞增劑量海特卡品的靜脈內(nèi)注射(只用載體、用1.3和10nmol海特卡品)，然后10分鐘后，通過(guò)10μg(3nmol)的hGHRH的靜脈內(nèi)注射處理大鼠。注射hGHRH后10分鐘，如上描述地測(cè)量血樣中生長(zhǎng)激素水平。所得結(jié)果在圖5中表示。
抗腫瘤活性的測(cè)量在無(wú)胸腺小鼠的皮下注射人腫瘤細(xì)胞，具體地為H-69小細(xì)胞肺癌細(xì)胞以便第一次移植后約10天產(chǎn)生約80mm3的人腫瘤異種移植物。每?jī)商焱ㄟ^(guò)增量(僅有載體、2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg)海特卡品的靜脈內(nèi)注射處理小鼠。在處理的全過(guò)程中每4天測(cè)量腫瘤體積。
附圖簡(jiǎn)述圖1是代表隨著海特卡品的濃度增加，對(duì)人GHRH與人GHRH受體結(jié)合的抑制的圖。
圖2是代表隨著海特卡品的濃度增加，存在10nM人GHRH下用人GHRH受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中抑制環(huán)AMP的產(chǎn)生的圖。
圖3是SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠板的再現(xiàn)，其顯示存在分子量為90.9kDa的海特卡品。
圖4是SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠板的再現(xiàn)，其顯示海特卡品是糖蛋白(圖4B)。
圖4以柱狀圖代表隨著海特卡品的濃度增加，存在10μg人GHRH時(shí)大鼠中GH合成的抑制。
序列表<110>科學(xué)研究和應(yīng)用咨詢(xún)公司<120>具有抗癌特性的植物來(lái)源蛋白質(zhì)海特卡品<130>RS 329 FR<140>FR 02/15560<141>2002-08-26<160>3<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>10<212>PRT<213>異葉毛果蕓香(Pilocarpus Heterophyllus)<400>1Lys Leu Ile Gly Ala Arg Tyr Phe Asp Lys1 5 10<210>2<211>14<212>PRT<213>異葉毛果蕓香<400>2Tyr Gly Glu Asp Ile Ile Val Gly Val Ile Asp Ser Gly Val1 5 10<210>3<211>6<212>PRT<213>異葉毛果蕓香<400>3Pro Glu Ser Glu Ser Tyr1 權(quán)利要求
1.通過(guò)從植物異葉毛果蕓香(pilocarpus heterophyllus)提取可以獲得的一種經(jīng)分離蛋白質(zhì)的用途，用于制備治療依賴(lài)生長(zhǎng)因子GHRH而生長(zhǎng)的癌癥的藥物，其中所述蛋白質(zhì)的特征在于其分子量約為90.9kDa并且包含肽序列為SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的片段；而且所述蛋白質(zhì)能夠以糖基化或非糖基化形式存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述蛋白質(zhì)已經(jīng)從體外培養(yǎng)的植物異葉毛果蕓香細(xì)胞的提取物得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于依賴(lài)生長(zhǎng)因子GHRH而生長(zhǎng)的癌選自小細(xì)胞肺癌和乳腺癌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其特征在于依賴(lài)生長(zhǎng)因子GHRH而生長(zhǎng)的癌是小細(xì)胞肺癌。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其特征在于依賴(lài)生長(zhǎng)因子GHRH而生長(zhǎng)的癌是乳腺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)合人生長(zhǎng)激素釋放激素(hGHRH)的具有抗癌特性的植物來(lái)源蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)從異葉毛果蕓香(pilocarpus heterophyllus)植物得到，尤其適于制備旨在治療依賴(lài)GHRH生長(zhǎng)因子而生長(zhǎng)的癌癥的藥物，尤其用于制備旨在治療包括小細(xì)胞肺癌和乳腺癌在內(nèi)的癌癥的藥物。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1787828SQ03819974
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2003年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月26日
發(fā)明者E·費(fèi)蘭迪斯, 鄧朋本, C·索耶, C·蒂里奧 申請(qǐng)人:科學(xué)研究和應(yīng)用咨詢(xún)公司