專利名稱：用于改善蛋白質特性的方法
技術領域：
本發(fā)明提供了用于改造蛋白質以優(yōu)化某些目的環(huán)境條件下蛋白質性能的方法。在 一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于改造酶以優(yōu)化特定環(huán)境條件下酶催化活性的方法。在 一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于改造酶以優(yōu)化不利環(huán)境條件下酶催化活性和/ 或穩(wěn)定性的方法。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于改造酶以優(yōu)化它們的貯存 穩(wěn)定性，尤其不利環(huán)境條件下的貯存穩(wěn)定性的方法。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供 了用于改變酶(例如金屬蛋白酶)的表面凈電荷和/或表面電荷分布以獲得與初始酶或親 代酶相比在洗滌劑制劑中顯示改良性能和/或穩(wěn)定性的酶變體的方法。

背景技術：
在其天然環(huán)境之外發(fā)揮作用的蛋白質的特性往往是次優(yōu)的。例如，酶(例如蛋白 酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶等)經(jīng)常在一般包括有效成分的復雜組合的衣物洗滌劑中用 于從織物清除污漬。事實上，大部分清潔產(chǎn)品包括表面活性劑系統(tǒng)、漂白劑、助洗劑、抑泡
齊U、懸污齊U、去污齊U、光漂白齊U、柔軟齊U、分散齊U、染料轉移抑制化合物、研磨齊U、殺菌劑和香 料以及用于清潔的酶。因此，盡管當前洗滌劑的復雜，然而仍存在難以徹底除去的眾多污 點，這部分歸咎于次優(yōu)的酶性能。盡管在酶開發(fā)方面已有眾多研究，然而本領域仍需要用于 為特定用途和環(huán)境改造蛋白質的方法。確實地，本領域仍需要迅速和系統(tǒng)地修改其他蛋白 質的靜電特性以優(yōu)化它們在商業(yè)應用中性能的方法。尤其，本領域仍需要用于改造工業(yè)用 酶以提供了在清潔溶液中改良活性、穩(wěn)定性和溶解度的方法，所述工業(yè)用酶包括但不限于 脂肪酶、淀粉酶、角質酶、甘露聚糖酶、氧化還原酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶和其他酶。 發(fā)明概述 本發(fā)明提供了用于改造蛋白質以優(yōu)化某些目的環(huán)境條件下蛋白質性能的方法。在
一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于改造酶以優(yōu)化特定環(huán)境條件下酶催化活性的方法。在 一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于改造酶以優(yōu)化不利環(huán)境條件下其催化活性和/ 或穩(wěn)定性的方法。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于改造酶以優(yōu)化它們的貯存 穩(wěn)定性，尤其不利環(huán)境條件下的貯存穩(wěn)定性的方法。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供 了用于改變酶(例如金屬蛋白酶)的表面凈電荷和/或表面電荷分布以獲得與初始酶或親 代酶相比在洗滌劑制劑中顯示改良性能和/或穩(wěn)定性的酶變體的方法。 本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生改良蛋白質變體的方法，所述方法包括在第一特性的第 一試驗和在第二特性的第二試驗中測試多種單一替換的蛋白質變體，其中親代蛋白質的特 性在每個試驗中給予值1. O，適宜的第一或第二特性具有大于1. 0的值，并且非常不適宜的 第一或第二特性具有小于約0. 80的值或在一些優(yōu)選的實施方案中具有小于約0. 60的值； 在單一替換的蛋白質變體的至少之一中鑒定與適宜第一特性相關并且與非常不適宜的第二特性不相關的替換；在單一替換的蛋白質變體的至少之一中鑒定與適宜第二特性相關并 且與非常不適宜的第一特性不相關的替換；導入來自前述步驟的替換至蛋白質以產(chǎn)生多重 替換的蛋白質變體。在一些實施方案中，所述方法還包括在第一試驗和第二試驗中測試多 重替換的蛋白質變體，其中改良的蛋白質變體在所述第一和第二試驗中均實現(xiàn)大于1.0的 值，或在第一試驗中實現(xiàn)大于1. 0的值并且在第二試驗中實現(xiàn)0. 8至1. 0的值。在一些其 他實施方案中，所述方法還包括產(chǎn)生改良的蛋白質變體。在一些實施方案中，所述第一和第 二特性是負相關的。在一些額外的實施方案中，適宜的第一或第二特性具有大于約1. 2的 值。在一些其他實施方案中，非常不適宜的第一或第二特性具有小于約0.40的值。在一些 優(yōu)選的實施方案中，第一特性是穩(wěn)定性，并且第二特性是洗滌性能。在一些特別優(yōu)選的實施 方案中，所述穩(wěn)定性包含在洗滌劑中的穩(wěn)定性并且洗滌性能包含在洗滌劑中的血_乳_墨 (BMI)洗滌性能。在一些其他優(yōu)選的實施方案中，所述蛋白質是中性金屬蛋白酶。在一些其 他實施方案中，親代蛋白是中性金屬蛋白酶的野生型成熟形式，而在其他實施方案中，該變 體從芽孢桿菌科(Bacillaceae)中性金屬蛋白酶衍生，在一些特別優(yōu)選的實施方案中，該 變體從芽孢桿菌屬中性金屬蛋白酶衍生。又在額外的實施方案中，在具有5與12之間pH 的粉末或液體洗滌劑組合物中測試洗滌性能。在一些其他實施方案中，在具有堿性PH的冷 水液體洗滌劑中測試洗滌性能。又在額外的實施方案中，所述替換的至少之一包含相對于 親代中性金屬蛋白酶的0、-l或-2的凈電荷改變，而在一些備選實施方案中，所述替換的至 少之一包含相對于親代中性金屬蛋白酶的+1或+2的凈電荷改變。不意圖使所述步驟限于 上文所列的確切順序，因為在本發(fā)明中使用任何適宜的順序。在一些優(yōu)選的實施方案中，相 對于親代中性金屬蛋白酶，改良的蛋白酶變體具有+1或+2的凈電荷改變。又在額外的實 施方案中，所述替換位于親代中性金屬蛋白酶中具有大于約50%溶劑可及表面(SAS)的位 置中。仍在其他實施方案中，親代中性金屬蛋白酶中的一個或多個位置是具有大于約65% 溶劑可及表面(SAS)的位置。 本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生改良蛋白酶變體的方法，所述方法包括在第一特性的第 一試驗和在第二特性的第二試驗中測試多種單一替換的蛋白酶變體，其中在每個試驗中給 予親代蛋白酶的特性為1. 0的值，適宜的第一或第二特性具有大于1. 0的值，并且非常不適 宜的第一或第二特性具有小于約0. 80的值或在一些優(yōu)選的實施方案中具有小于約0. 60的 值；在單一替換的蛋白酶變體的至少之一中鑒定與適宜第一特性相關并且與非常不適宜的
第二特性不相關的替換；在單一替換的蛋白酶變體的至少之一中鑒定與適宜第二特性相關 并且與非常不適宜的第一特性不相關的替換；導入來自前述步驟的替換至蛋白酶以產(chǎn)生多
重替換的蛋白酶變體。在一些實施方案中，所述方法還包括測試第一試驗和第二試驗中多 重替換的蛋白酶變體，其中改良的蛋白酶變體在第一和第二試驗中均實現(xiàn)大于1.0的值， 或在第一試驗中實現(xiàn)大于1. 0的值并且在第二試驗中實現(xiàn)0. 8至1. 0的值。在一些其他實 施方案中，所述方法還包括產(chǎn)生改良的蛋白酶變體。在一些實施方案中，所述第一和第二 特性是負相關的。在一些額外的實施方案中，適宜的第一或第二特性具有大于約1. 2的值。 在一些其他實施方案中，非常不適宜的第一或第二特性具有小于約0. 40的值。在一些優(yōu)選 的實施方案中，第一特性是穩(wěn)定性，并且第二特性是洗滌性能。在一些特別優(yōu)選的實施方案 中，所述穩(wěn)定性包含在洗滌劑中的穩(wěn)定性并且洗滌性能包含在洗滌劑中的血_乳_墨(BMI) 洗滌性能。在一些其他優(yōu)選的實施方案中，所述蛋白酶是中性金屬蛋白酶。在一些其他實施方案中，親代蛋白酶是中性金屬蛋白酶的野生型成熟形式，而在其他實施方案中，該變體從芽孢桿菌科中性金屬蛋白酶衍生。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，該變體從芽孢桿菌屬中性金屬蛋白酶衍生。又在額外的實施方案中，在具有5與12之間pH的粉末或液體洗滌劑組合物中測試洗滌性能。在一些其他實施方案中，在具有堿性pH的冷水液體洗滌劑中測試洗滌性能。又在額外的實施方案中，所述替換的至少之一包含相對于親代中性金屬蛋白酶的0、_1或-2的凈電荷改變，而在一些備選實施方案中，所述替換的至少之一包含相對于親代中性金屬蛋白酶的+l或+2的凈電荷改變。不意圖使所述步驟限于上文所列的確切順序，因為在本發(fā)明中使用任何適宜的順序。在一些優(yōu)選的實施方案中，相對于親代中性金屬蛋白酶，改良的蛋白酶變體具有+l或+2的凈電荷改變。又在額外的實施方案中，所述替換位于親代中性金屬蛋白酶中具有大于約50%溶劑可及表面(SAS)的位置中。仍在其他實施方案中，親代中性金屬蛋白酶中的一個或多個位置是具有大于約65%溶劑可及表面(SAS)的位置。本發(fā)明也提供了使用本文中所述方法產(chǎn)生的多重替換的蛋白質。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了通過本文所述方法產(chǎn)生的中性金屬蛋白酶變體。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了蛋白酶變體，該蛋白酶變體在與SEQ ID N0:3所示的芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的殘基位置83對應的殘基位置處包含替換。在一些其他優(yōu)選的實施方案中，所述替換包含L83K替換。還提供了 NprE變體，該變體包含選自由i) 4K-45K-50R-54K-59K-90K-129I-138L-179P-190L-199E-214Q-220E-244S-265P-269H-285R-296E ;45K-50R-59K-90K-1291-138L-179P-190L-199E-214Q-220E-244S-265P-285R ;45K-59K-90K-1291-138L-179P-190L-199E-214Q-220E-265P-285R ;和59K-90K-1291-179P-190L-199E-214Q-220E-265P-285R組成的組中的替換組合。 本發(fā)明也提供了編碼本文所述蛋白酶變體的分離的多核苷酸。此外，本發(fā)明提供了包含與啟動子有效組合的本文所述多核苷酸的表達載體。本發(fā)明中也提供了用本文提供的表達載體所轉化的宿主細胞。本發(fā)明也提供了清潔組合物，其包含使用本發(fā)明方法產(chǎn)生的蛋白酶變體。 本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生改良的蛋白質變體的方法，所述方法包括a)在第一特性的第一試驗和在第二特性的第二試驗中測試多種單一替換的蛋白質變體，其中親代蛋白質的特性在每個試驗中給予值1. O，適宜的第一或第二特性具有大于1. 0的值，并且非常不適宜的第一或第二特性具有小于約0. 80的值；b)在單一替換的蛋白質變體的至少之一中鑒定與適宜第一特性相關并且與非常不適宜的第二特性不相關的替換；c)在單一替換的蛋白質變體的至少之一中鑒定與適宜第二特性相關并且與非常不適宜的第一特性不相關的替換；和d)導入來自步驟b的替換和來自步驟c的替換至蛋白質以產(chǎn)生多重替換的蛋白質變體。在一些實施方案中，所述方法還包括步驟e)在第一試驗和第二試驗中測試多重替換的蛋白質變體，其中改良的蛋白質變體在第一和第二試驗中均實現(xiàn)大于1.0的值，或在第一試驗中實現(xiàn)大于1. 0的值并且在第二試驗中實現(xiàn)0. 8至1. 0的值。 在一些實施方案中，蛋白質是選自由蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角質酶、果膠酶、氧化酶、轉移酶、過氧化氫酶和堿性蛋白酶(alkalase)組成的組中的酶。在一些優(yōu)選的實施方案中，該酶是蛋白酶或淀粉酶。在一些實施方案中，第一和所述第二目的特性包含選自底物結合作用、酶抑制、表達、洗滌劑中穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、反應速率、反應程度、熱活性、淀粉液化、生物質降解、糖化作用、酯水解、酶漂白、洗滌性能和紡織
6品修飾作用的兩種或多種特性。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括產(chǎn)生改良的蛋白質變體。在一些實施方案中，所述第一和第二特性是負相關的。在本發(fā)明的一些實施方案中，適宜的第一或第二特性具有大于約1. 2的值，和/或非常不適宜的第一或第二特性具有小于約0.60的值。在一些優(yōu)選的實施方案中，第一特性是穩(wěn)定性，并且第二特性是洗滌性能。在這些實施方案的亞類中，穩(wěn)定性包含在洗滌劑中的穩(wěn)定性并且洗滌性能包含在洗滌劑中的血-乳-墨(BMI)洗滌性能。在一些實施方案中，第一特性是蛋白質表達，并且第二特性是酶活性。在這些實施方案的亞類中，酶活性包含在洗滌劑中的稻淀粉洗滌性能。在一些優(yōu)選的實施方案中，蛋白酶選自由中性金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和枯草蛋白酶組成的組。在這些實施方案的亞類中，中性金屬蛋白酶是芽孢桿菌科的中性金屬蛋白酶。在一些示例性實施方案中，中性金屬蛋白酶來自芽孢桿菌屬(例如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)NprE)。在其他實施方案中，淀粉酶是芽孢桿菌科的a淀粉酶。在一些示例性實施方案中，該a淀粉酶來自芽孢桿菌屬(例如嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophilus)Amys)。在一些優(yōu)選的實施方案中，在具有5與12之間pH的粉末或液體洗滌劑組合物中和/或在具有堿性pH的冷水液體洗滌劑中測試洗滌性能。在一些實施方案中，所述替換的至少之一包含相對于親代酶的0、 -1或-2的凈電荷改變。在一些實施方案中，所述替換的至少之一包含相對于親代酶的+1或+2的凈電荷改變。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述替換的至少之一包含至少兩個替換，第一替換具有相對于親代酶的0、-l或-2的凈電荷改變；并且第二替換具有相對于親代酶的+1或+2的凈電荷改變。在一些實施方案中，所述至少一個替換包含從1至20個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)個替換。在一些實施方案中，相對于親代酶，改良的酶變體具有-2、-l、0、+l或+2的凈電荷改變。在一些實施方案中，所述替換位于親代酶中具有大于約25%、大于約50%或大于約65%溶劑可及表面(SAS)的位置內(nèi)。本發(fā)明也提供了編碼本文所述酶變體的分離的多核苷酸。在其他實施方案中，本發(fā)明提供了包含與啟動子有效組合的該多核苷酸的表達載體。在一些實施方案中，提供了包含該表達載體的宿主細胞。在其他實施方案中，提供了包含使用本發(fā)明方法產(chǎn)生的酶變體的清潔組合物。 本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生改良蛋白質變體的方法，所述方法以可操作的順序包括a)在第一特性的第一試驗和在第二特性的第二試驗中測試多種單一替換的蛋白質變體，其中親代蛋白質的特性在每個試驗中給予值1. O，適宜的第一或第二特性具有大于1. 0的值，并且非常不適宜的第一或第二特性具有小于約0. 80的值；b)在單一替換的蛋白質變體的至少之一中鑒定與適宜第一特性相關并且與非常不適宜的第二特性不相關的替換；c)在單一替換的蛋白質變體的至少之一中鑒定與適宜第二特性相關并且與非常不適宜的第一特性不相關的替換；和d)導入來自步驟b的替換和來自步驟c的替換至蛋白質以產(chǎn)生多重替換的蛋白質變體，其中所述多重替換的蛋白質變體是改良的蛋白質變體。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括步驟e)在第一試驗和第二試驗中測試多重替換的蛋白質變體，其中改良的蛋白質變體在第一和第二試驗中均實現(xiàn)大于1.0的值，或在第一試驗中實現(xiàn)大于1. 0的值并且在第二試驗中實現(xiàn)O. 8至1. 0的值。在一些額外的實施方案中，親代蛋白是酶并且其中改良的蛋白質變體是酶。在一些額外的實施方案中，所述酶選自蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角質酶、果膠酶、氧化酶、轉移酶和過氧化氫酶。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，該酶是蛋白酶或淀粉酶。在一些額外的實施方案中，第一和所述
7第二目的特性包含由底物結合作用、酶抑制、表達、洗滌劑中穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、反應速率、 反應程度、熱活性、淀粉液化、生物質降解、糖化作用、酯水解、酶漂白、洗滌性能和紡織品修 飾作用組成的組中的兩種或多種特性。仍在一些額外的實施方案中，所述方法還包括產(chǎn)生 改良的蛋白質變體的步驟。在一些額外的實施方案中，所述第一和第二特性是負相關的。 在一些特別優(yōu)選的實施方案中，適宜的第一或第二特性具有大于約1. 2的值。在一些額外 優(yōu)選的實施方案中，非常不適宜的第一或第二特性具有小于約0. 60的值。仍在一些額外的 實施方案中，非常不適宜的第一或第二特性具有小于約0. 40的值。在一些優(yōu)選的實施方案 中，第一特性是穩(wěn)定性，并且第二特性是洗滌性能。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，所述穩(wěn) 定性包含在洗滌劑組合物中的穩(wěn)定性并且洗滌性能包含血-乳-墨(BMI)洗滌性能。仍在 一些其他實施方案中，在包含約5與約12之間pH的粉末或液體洗滌劑組合物中測試洗滌 性能。在一些額外優(yōu)選的實施方案中，在包含堿性pH的冷水液體洗滌劑中測試洗滌性能。 在一些其他實施方案中，第一特性是蛋白質表達，并且第二特性是酶活性。在一些額外的實 施方案中，蛋白酶選自中性金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，該 絲氨酸蛋白酶是枯草蛋白酶。在一些其他實施方案中，中性金屬蛋白酶是從芽孢桿菌科成 員獲得的中性金屬蛋白酶。在一些備選實施方案中，淀粉酶是從芽孢桿菌科成員獲得的a 淀粉酶。在一些其他實施方案中，所述替換的至少之一包含相對于親代酶的0、 -1或-2的 凈電荷改變。在一些備選實施方案中，所述替換的至少之一包含相對于親代酶的+l或+2 的凈電荷改變。仍在一些其他實施方案中，所述替換的至少之一包含相對于親代酶的0、-1 或-2的凈電荷改變。在一些額外備選的實施方案中，所述替換的至少之一包含相對于親代 酶的+l或+2的凈電荷改變。仍在一些其他實施方案中，相對于親代酶，改良的酶變體具有 +1或+2的凈電荷改變。在一些備選的實施方案中，所述替換位于親代酶中具有大于約25% 溶劑可及表面(SAS)的位置內(nèi)。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述替換位于親代酶中具有大 于約50%或大于約65%溶劑可及表面(SAS)的位置內(nèi)。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，親 代酶是野生型酶。 本發(fā)明也提供了清潔組合物，其包含根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的改良的蛋白質變 體。 本發(fā)明也提供了分離的中性金屬蛋白酶變體，其具有包含至少一個氨基酸替換的 氨基酸序列，所述的氨基酸替換在與包含SEQ ID N0:3中所述氨基酸序列的中性金屬蛋白 酶的位置等同的位置處產(chǎn)生。在一些優(yōu)選的實施方案中，至少一個氨基酸替換在與SEQ ID NO :3中所述氨基酸序列的第83位置等同的位置處產(chǎn)生。在一些特別優(yōu)選的實施方案中， 該替換是L83K。
附圖簡述

圖1A顯示AmyS-S242Q組合電荷文庫(CCL)的BODIPY-淀粉水解的相對比活性與 振蕩管表達。 圖1B顯示AmyS-S242Q CCL在TIDE 2x中的稻淀粉微量樣品清潔的相對活性與振 蕩管表達。 圖2A顯示AmyS-S242Q CCL的相對振蕩管表達與相對凈電荷變化。 圖2B顯示AmyS-S242Q CCL的B0DIPY淀粉水解的相對比活性與相對凈電荷變化。 圖3A顯示AmyS-S242Q CCL的相對振蕩管表達與相對凈電荷變化。
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圖3B顯示AmyS-S242Q CCL的稻淀粉微量樣品清潔活性與相對凈電荷變化。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了用于改造蛋白質以優(yōu)化某些目的環(huán)境條件下蛋白質性能的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于改造酶以優(yōu)化特定環(huán)境條件下酶催化活性的方法。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于改造酶以優(yōu)化不利環(huán)境條件下其催化活性和/或穩(wěn)定性的方法。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于改造酶以優(yōu)化它們的貯存穩(wěn)定性，尤其不利環(huán)境條件下的貯存穩(wěn)定性的方法。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于改變酶(例如金屬蛋白酶)的表面凈電荷和/或表面電荷分布以獲得與初始酶或親代酶相比在洗滌劑制劑中顯示改良性能和/或穩(wěn)定性的酶變體的方法。
枯草蛋白酶是衣物洗滌劑中使用的主要酶并且可能是世界上使用最廣泛的酶。已經(jīng)指出表面靜電效應能調節(jié)枯草蛋白酶的催化活性(見例如Russell和Fersht， Nature328:496-500 [1987])。最近，觀察到涉及改變枯草蛋白酶凈電荷的突變對洗滌劑中的洗滌性能產(chǎn)生巨大影響(見例如歐洲專利號0 479 870 Bl)。認為這種有益效應是因枯草蛋白酶pl(等電點)向洗液pH方向改變所致。然而，稍后的工作證實這個結論并不總是適用(見例如美國專利號6，673，590 Bl)。如該專利中所示，枯草蛋白酶中電荷突變的作用明顯取決于洗滌劑濃度，即降低親代枯草蛋白酶pl的突變提供在低洗滌劑濃度上更有效的酶而升高親代枯草蛋白酶pl的突變產(chǎn)生在高洗滌劑濃度上更有效的酶。這是極有用的，因為洗液中的洗滌劑濃度在全球范圍內(nèi)變化很大。因此，本領域技術人員顯而易見的是，對于枯草蛋白酶洗滌性能的最適Pl ，其取決于洗液中的PH和洗滌劑濃度。此外，已經(jīng)描述了改善衣物洗滌劑中枯草蛋白酶活性的其他工作(見美國專利
發(fā)明者A·肖, J·T·小凱利斯, L·G·卡斯康-佩雷拉, W·埃赫勒 申請人:丹尼斯科美國公司