專利名稱：一種人干擾素α突變體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明為人α干擾素類似物(IFNal)及其制備方法和用途，它具有抗病毒比活性高于5×109IU/mg的特點，具有治療和預防病毒性感染疾病的巨大潛力。
干擾素為小分子量的蛋白多肽，具有抗病毒和免疫調節(jié)的功能，可用于臨床治療病毒性疾病、腫瘤等。人干擾素分為三大類即α、β和γ型，分別由白細胞、成纖維細胞和淋巴細胞產(chǎn)生而命名。人α干擾素由165個氨基酸組成，分子量在19000道爾頓左右?，F(xiàn)有的α干擾素制劑的臨床治療效果尚不理想，其抗病毒比活性僅為1×108IU/mg，存在著大劑量時副作用較大的缺點。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人α型干擾素亞成員有約20種，可用基因工程手段生產(chǎn)出相當數(shù)量的各種人α干擾素衍生物或類似物。其中最引人注目的是復合型α干擾素(concensusinterferon)，由165個氨基酸組成的重組復合型α干擾素由美國Amgen公司發(fā)明(商品名Infergen)，已批準用于治療慢性丙型病毒性肝炎，療效顯著。Infergen是根據(jù)10個已知的人α干擾素亞型的氨基酸序列中氨基酸同源性高的原則組合而成，再經(jīng)人工合成其相對應的基因，經(jīng)大腸肝菌表達純化而得，但有結構不均一性的缺陷。重組復合型干擾素的抗病毒比活性是目前發(fā)現(xiàn)的任何一種天然α型干擾素的10倍，比活性在1.0×109單位以上。
本發(fā)明中人α干擾素類似物由171個氨基酸組成，抗病毒比活性達到5×109IU/mg以上，比復合型α干擾素強5-10倍，比天然α干擾素強50-100倍。其氨基酸序列特征在于其N-末端比天然α干擾素多出5個氨基酸是GlySerGlyGlyGly，從第6位到171位氨基酸序列和組成同人α干擾素亞型成員的氨基酸序列。人α干擾素類似物的二對二硫鍵位于Cys7與Cys35，Cys54與Cys74之間，不處于其N末端第一氨基酸位置，十分有利于這二種二硫鍵的形成和穩(wěn)定。本發(fā)明所述人α干擾素類似物IFNal采用分泌型融合表達的方式，加上第一對二硫鍵位于Cys7和Cys34之間，因此有效地避免了變性和復性的過程對二硫鍵形成的影響，保證了二硫鍵的最佳構象形成。同時，第171位(C末端第1位)氨基酸用Asp同源取代Glu，經(jīng)實驗證明可有效防止C末端的降解，保證了IFNal終產(chǎn)物是含單一的171個氨基酸的重組IFNal及其生物活性的穩(wěn)定性。實例一.α干擾素類似物IFNal的基因獲得根據(jù)α干擾素類似物IFNal的氨基酸序列選擇大腸桿菌偏愛密碼子，清除不利于表達的二級結構設計和密碼子的簡并性，設計以下DNA序列GGATCCGGTGGTGGTTGTGACCTGCCGCAGACTCATTCCCTGGGTAACCGTCGCGCTCTGATCCTGCTGGCACAAATGCGTCGTATCAGCCCGTTTTCTTGTCTGAAGGATCGTCACGACTTTGGCTTTCCGCAAGAAGAATTCGATGGCAACCAGTTCCAGAAAGCACAGGCTATCAGCGTACTGCATGAAATGATCCAGCAAACCTTCAACCTGTTCTCCACTAAAGATAGCTCTGCTGCATGGGACGAAAGCCTGCTGGAGAAATTCTACACCGAACTGTATCAGCAGCTGAACGATCTGGAAGCATGCGTAATTCAGGAAGTAGGTGTAGAAGAGACTCCGCTGATGAACGTCGATTCTATCCTGGCAGTTAAAAAGTACTTCCAGCGTATCACCCTGTACCTGACTGAAAAAAAGTACTCTCCGTGCGCTTGGGAAGTAGTTCGTGCTGAAATCATGCGTTCCTTCTCTCTGTCTACTAACCTGCAAGAGCGTCTGCGTCGTAAGGACTAGTAAGCTT根據(jù)上述設計DNA序列，分別合成9段寡聚DNA單鏈片段，以第5段為模板，5’為正向引物，3’為反向引物，每對引物與前一段模板互補18個堿基。經(jīng)過4次PCR得到600bp大小的全基因序列，其中含有BamHI和HindIII兩個插入的酶切位點。經(jīng)回收純化后由BamHI和HindIII雙酶切，構建PUC18載體的BamHI和HindIII之間，含IFNal外源基因的重組質粒命名為PUC-IFNal，經(jīng)自動測序證實其DNA序列的正確性后用于表達載體的構建。9段DNA片段序列1.5’GGATCCGGTGGTGGTTGTGACCGCCGCAGACTCATTCCCTGGGTAACCGTCGCGCTC2.5’TGGGTAACCGTCGCGCTCTGATCCTGCTGGCACAAATGCGTCGTATCAGCCCGTTTTCTTGTCTGAAGGATCGTCAC3.5’TGTCTGAAGGATCGTCACGACTTTGGCTTTCCGCAAGAAGAATTCGATGGCAACCAGTTCCAGAAAGCACAGGCTA4.5’TTCCAGAAAGCACAGGCTATCAGCGTACTGCATGAAATGATCCAGCAAACCTTCAACCTGTTCTCCACTAAAGATAGC5.5’TTCTCCACTAAAGATAGCTCTGCTGCATGGGACGAAAGCCTGCTGGAGAAATTCTACACCGAACTGTATCAGCAGCTGAACGATCTGGAAGCAT6.5’TGAACGATCTGGAAGCATGCGTAATTCAGGAAGTAGGTGTAGAAGAGACTCCGCTGATGAACGTCGATTCTATCCT7.5’GAACGTCGATTCTATCCTGGCAGTTAAAAAGTACTTCCAGCGTATCACCCTGTACCTGACTGAAAAAAAGTACTCT8.5’CTGAAA AAAGTACTCTCCGTGCGCTTGGGAAGTAGTTCGTGCTGAAATCATGCGTTCCTTCTCTCTGTCTACTAACC9.5’CTTCTCTCTGTCTACTAACCTGCAAGAGCGTCTGCGTCGTAAGGACTAGTAAGCTT二.融合表達IFNal的重組載體的構建分泌型融合表達載體是PMAL-P2(Bio-lab公司)，啟動子為Ptac，IFNal的N末端與其載體malE的C末端融合相連，其中含有蛋白酶TEV(煙草蝕刻病毒蛋白酶)的特異識別位點Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly。TEV的識別位點前加入spacer間隔區(qū)的氨基酸序列為N N N N N N N N N。由人工合成含TEV蛋白酶識別位點和spacer區(qū)的氨基酸相應的DNA序列l(wèi)inker如下5’G AGC TCT AAC AAC AAC AAC AAC AAC AAC AAT AAC AAC CTGGGT ATC GAT ACT ACT GAG AAC CTG TAC TTT ACC GGA TCC 3’含限制性內切酶SacI和BamHI的linker序列首先插入PUC18的SacI和BamHI之間，構建成PUC-LK。將PUC-IFN的IFNal用BamHI和HindIII雙酶切后，插入PUC-LK的BamHI和HindIII之間構建成PUC-LK-IFN。經(jīng)測序證實其DNA序列后可用于表達載體的構建。
PMAL-P2載體屬于分泌型表達，所表達的重組融合蛋白位于大腸桿菌的胞周質。PMAL-IFN的構建方法是將PMAL-P2用SacI和HindIII雙酶切后，回收大片段，將PUC-LK-IFN用SacI和HindIII雙酶切后，回收約630bp的小片段。在T4連接酶下連接回收后轉化大腸桿菌，篩選重組子。經(jīng)酶切鑒定和序列分析確證后的克隆命名為PMAL-IFN。三.重組IFNal的融合表達與發(fā)酵將含IFNal基因的重組表達載體PMAL-IFN轉化大腸桿菌Top10F’，單菌落在含100ug/ml Amp的LB培養(yǎng)基中37℃搖瓶過夜，按1∶30接種后培養(yǎng)2-3小時，加入0.3mM IPTG后誘導4小時。菌體用2×電泳上樣緩沖破菌后，10％SDS-PAGE電泳后染色，顯示在68KD處有一明顯的融合蛋白表達帶，表達量占菌體蛋白的15-20％。
30升體系發(fā)酵罐發(fā)酵條件為含PMAL-IFN的工程菌單菌落，經(jīng)活化后在37℃，250rpm下含100ug/ml Amp和0.5％葡萄糖的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的種子液1000ml，按1∶20接種于20升的M9CA培養(yǎng)基中。37℃、650rpm、30％的溶氧、pH7.0條件下培養(yǎng)至OD到10.0，加入IPTG終濃度0.5mM，繼續(xù)誘導表達4小時。菌體經(jīng)10％SDS-PAGE電泳證實表達量在20％左右。四.α干擾素類似物IFNal的純化10升實例三中的發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體后，用滲透壓法破菌，得到的上清液經(jīng)陰離子交換層析(Q Sepharose Fast Flow)及淀粉親和層析(Amylose Agrose)純化融合蛋白至純度大于95％，加入TEV蛋白酶進行酶切后，再用凝膠過濾層析(Sephacryl S-100)得到高純度IFNal 340毫克，總收率約為42％。
得到的IFNal經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定為一條帶，分子量在20.0kD，與理論值19.7kD一致。高效液相色譜分析(HPLC)為一個峰，純度大于99％。五.重組IFNal的抗病毒活性測定重組IFNal抗病毒比活性的測定應用Wish細胞病變法，攻擊病毒為VSV(雞胚培養(yǎng)的濾泡口腔炎病毒)。按標準方法計算其抗病毒比活性。參照品重組干擾素為Schering公司的IFN-αla和Amgen公司的復合型α干擾素Infergen。干擾素類別 抗病毒比活性(IU/mg)IFNal8.6×109IFN-αla 1.2×108Infergen 1.1×109以上為三次測定結果的平均值。
權利要求
一.本發(fā)明中重組人α干擾素衍生物類似物(IFNal)由171個氨基酸組成，氨基酸序列如下g s g g g c d l p q t h s l g n r r a l i l l a q m r r i s p f sc l k d r h d l g f p q e e f d g n q f q k a q a i s v l h e m iq q t f n l f s t k d s s a a w d e s l l c k f y t e l y q q l nd l e a c v i q e v g v e e t p l m n v d s i l a v k k y f q r it l y l t e k k y s p c a w e v v r a e i m r s f s l s t n l q tr l r r k d
二、權利要求1中的重組人α干擾素類似物氨基酸序列N末端第1至5位為Gly1Ser2Gly3Gly4Gly5，第171位為Asp171。
三、權利要求2中的重組人α干擾素類似物包括大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。
四.本發(fā)明中重組人α干擾素類似物適應治療和預防病毒性感染疾病。
全文摘要
本發(fā)明為一種經(jīng)天然人α干擾素改造后由171個氨基酸組成的具有強勁抗病毒比活性的人α干擾素類似物(IFNal)及其重組制備方法。IFNal比天然人α干擾素的抗病毒比活性高50倍以上,超過5×10
文檔編號C07K14/52GK1365982SQ01101499
公開日2002年8月28日 申請日期2001年1月18日 優(yōu)先權日2001年1月18日
發(fā)明者劉斯香, 王平廣, 何家年 申請人:劉斯香