一種重組豬干擾素ɑ雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組豬干擾素ɑ雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法，是將兔抗重組豬干擾素ɑ多克隆抗體、膠體金標記重組豬干擾素ɑ單克隆抗體根據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理，分別固定在硝酸纖維素膜和玻璃纖維素膜上，組成重組豬干擾素ɑ雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條。試紙條由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜及PVC底板4個部分組成，樣品墊用玻璃纖維素膜。本發(fā)明建立了敏感快速的檢測重組豬干擾素ɑ樣品的方法，具有高特異性，高穩(wěn)定性，供實驗室和市場上對重組豬干擾素ɑ產(chǎn)品的鑒定和驗證用。
【專利說明】一種重組豬干擾素α雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及重組豬干擾素α的檢測，具體是一種重組豬干擾素α雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法，供實驗室和市場上對重組豬干擾素α產(chǎn)品的鑒定和驗證用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬干擾素在畜牧業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用已受到高度關(guān)注。最早在國內(nèi)應(yīng)用于獸醫(yī)臨床的是豬白細胞干擾素，由于這種干擾素存在工藝成本高等問題。而基因工程技術(shù)的發(fā)展為豬干擾素大量生產(chǎn)提供了新的平臺。我室采用基因工程技術(shù)獲得了一種重組豬干擾素α (重組豬α干擾素的制備方法，專利號2008100201804)，臨床試用結(jié)果表明其可有效治療豬病毒性腹瀉等疾病。但目前市場上尚無重組豬干擾素α產(chǎn)品的檢測試劑盒，阻礙了其廣泛應(yīng)用，因此有必要研制重組豬干擾素α相應(yīng)檢測試劑盒，確立檢測方法，供實驗室和市場上對重組豬干擾素α產(chǎn)品的鑒定和驗證用。
[0003]膠體金免疫層析技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。它是繼傳統(tǒng)三大免疫標記技術(shù)之后又一較為成熟的、得到廣泛應(yīng)用的免疫標記技術(shù)。當待測樣品加入到 樣品膜上后，由于微孔濾膜的毛細管作用，使抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進行，檢測一般只要5~10 min就會出結(jié)果，相比其它方法(如ELISA需I~2h)大大的縮短了檢測時間。其測試結(jié)果以肉眼可見的顯色條帶來判斷，不需要特別儀器設(shè)備，只需要試紙條或滲濾試劑盒，樣品只要做非常簡單的處理或不需要做前處理。且具有成本較低、操作簡單、試劑穩(wěn)定不受溫度等外界因素影響、方便快捷、特異敏感、穩(wěn)定性強、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點，因而特別適合于現(xiàn)場快速檢查，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景，代表了診斷試劑簡單快速、便于普及的發(fā)展方向。本發(fā)明制備了一種重組豬干擾素α雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的就是為提供一種重組豬干擾素α雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
一種重組豬干擾素α雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法，包括以下步
驟:
(1)純化抗重組豬干擾素α單克隆抗體的制備:小鼠腹腔內(nèi)注射0.5 ml液體石蠟，第7(1后每只小鼠腹腔注射1\107!111抗重組豬干擾素0雜交瘤細胞懸液0.5 ml, 7^10 d后觀察小鼠腹部膨脹程度收集腹水，經(jīng)離心去沉淀后以辛酸-飽和硫酸銨粗純，再以DEAE陰離子交換層析進一步純化抗重組豬干擾素α單克隆抗體，-80°C保存；
(2)膠體金的制備:采用檸檬酸三鈉還原法制備40nm膠體金，取0.01% HAuCl4水溶液100 ml，加熱煮沸，迅速加入1%檸檬酸三鈉水溶液1ml，繼續(xù)煮沸約5 min，制成粒徑40nm金顆粒，此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸三鈉加入后很快變成灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成酒紅色，冷卻至室溫后4°C避光保存；
(3)膠體金標記抗重組豬干擾素α單克隆抗體:用0.1 mol/L K2CO3將膠體金溶液調(diào)到PH8.2，然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每100 ml溶液加入4.5 mg純化的抗重組豬干擾素α單克隆抗體，將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中，再滴加入到終濃度為0.05%的PEG 20000或1%的BSA封閉，標記結(jié)束后2500 r/min離心18~22 min，去除大的聚合物，再將上清以12000 r/min離心28~32 min，棄去上清，以含0.05% PEG的0.01 mol/L PBS重懸沉淀，離心，重復(fù)操作兩次，最后以原體積1/10 (含0.05% PEG) 0.01 mol/L PBS重懸沉淀，3飛。C保存，然后將標記膠體金溶液加樣于玻璃纖維素膜上，在溫度2(T25°C干燥2~4h，制成膠體金墊，干燥備用；
(4)膠體金標記抗重組豬干擾素α單克隆抗體的純化:先1800r/min、4°C低速離心18~22min,棄去凝聚的沉淀,然后14000r/min、4°C高速離心1^1.2h,吸出上清,沉淀物用
0.01 mol/L PBS溶液重懸，將沉淀重懸為原體積的1/10，再經(jīng)1500r/min離心18~22min，取上清加至AKTA? explorer蛋白純化儀葡聚糖凝膠層析柱純化,將純化的膠體金標記結(jié)合物過濾除菌、分裝，4°C保存；
(5)抗重組豬干擾素α多克隆抗體的包被:用0.01 mol/L pH7.4 PBS將抗重組豬干擾素α多克隆抗體稀釋為I mg/ml，然后用噴膜儀將抗原在硝酸纖維素膜上按?μ?/cm進行劃線包被，同時在硝酸纖維素膜上包被羊抗鼠多克隆抗體，用于產(chǎn)品的質(zhì)控，包被完成后將硝酸纖維素膜在干燥間干燥6-8h，備用；
(6)試紙條的組裝:在干燥間內(nèi)準備好·吸水濾紙、樣品墊、PVC底板，在PVC底板中央貼上包被好的硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上緣粘貼吸水濾紙，硝酸纖維素膜下緣粘貼膠體金墊，膠體金墊下緣粘貼樣品墊，完成后用裁切機將貼好的試紙板切成4 _寬的試紙條，再將試紙條密封于鋁箔袋中，完成產(chǎn)品的組裝。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點是:
一種重組豬干擾素α雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法，為獸藥管理部門提供一套實用有效的檢測試劑產(chǎn)品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1制備并純化的抗重組豬干擾素α單克隆抗體SDS-PAGE檢測結(jié)果 泳道1:蛋白分子標準；
泳道2:辛酸-飽和硫酸銨粗純抗重組豬干擾素α單克隆抗體結(jié)果；
泳道3 =DEAE陰離子交換層析進一步純化抗重組豬干擾素α單克隆抗體結(jié)果；
圖2重組豬干擾素α雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0008]實施例1:
(I)純化抗重組豬干擾素α單克隆抗體的制備:小鼠腹腔內(nèi)注射0.5 ml液體石蠟，第7d后每只小鼠腹腔注射I X 107/ml抗重組豬干擾素α雜交瘤細胞懸液0.5 ml，7~10 d后觀察小鼠腹部膨脹程度收集腹水，經(jīng)離心去沉淀后以辛酸-飽和硫酸銨粗純，再以DEAE陰離子交換層析進一步純化抗重組豬干擾素α單克隆抗體，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測其純度可達90%以上(所圖1所示)，_80°C保存；
(2)膠體金的制備:采用檸檬酸三鈉還原法制備40 nm膠體金，具體操作方法如下:取
0.01% HAuCl4水溶液100 ml，加熱煮沸，迅速加入I %檸檬酸三鈉水溶液lml，繼續(xù)煮沸約
5min，制成粒徑40 nm金顆粒，此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸三鈉加入后很快變成灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成酒紅色，冷卻至室溫后4°C避光保存。
[0009](3)膠體金標記抗重組豬干擾素α單克隆抗體:用0.1 mol/L K2CO3將膠體金溶液調(diào)到pH8.2。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每100 ml溶液加入4.5 mg純化的抗重組豬干擾素α單克隆抗體，將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中，再滴加入到終濃度為
0.05%的PEG 20000或1%的BSA封閉，標記結(jié)束后2500 r/min離心20 min，去除大的聚合物，再將上清以12,000 r/min離心30 min，棄上清，以含0.05% PEG的0.01 mol/L PBS重懸沉淀，離心，重復(fù)操作兩次，最后以原體積1/10 (含0.05% PEG) 0.01 mol/L PBS重懸沉淀，4°C保存。然后將標記膠體金溶液加樣于玻璃纖維素膜上，在溫度20°C~25°C干燥2~4 h，制成膠體金墊，干燥備用。
[0010](4)膠體金標記抗重組豬干擾素α單克隆抗體的純化:先1800r/min4°C低速離心20min,棄去凝聚的沉淀,然后14000r/min 4°C高速離心lh。仔細吸出上清,沉淀物用0.01mol/L PBS溶液重懸，將沉淀重懸為原體積的1/10，再經(jīng)1500r/min離心20min，取上清加至AKTA? explorer蛋白純化儀葡聚糖凝膠層析柱純化，最終純度達95%以上。將純化的膠體金標記結(jié)合物過濾除菌、分裝，4°C保存。
[0011](5)抗重組豬干擾素α多克隆抗體的包被:用0.01 mol/L pH7.4 PBS將抗重組豬干擾素α多克隆抗體稀釋為I mg/ml，然后用噴膜儀將抗原在硝酸纖維素膜上按?μ?/cm進行劃線包被，同時在硝酸纖維素膜上包被羊抗鼠多克隆抗體，用于產(chǎn)品的質(zhì)控，包被完成后將硝酸纖維素膜在干燥間干燥6~8h，備用。
[0012](6)試紙條的組裝:在干燥間內(nèi)準備好吸水濾紙、樣品墊、PVC底板，在PVC底板中央貼上包被好的硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上緣粘貼吸水濾紙，硝酸纖維素膜下緣粘貼膠體金墊，膠體金墊下緣粘貼樣品墊，完成后用裁切機將貼好的試紙板切成4 mm寬的試紙條。再將試紙條密封于鋁箔袋中，完成產(chǎn)品的組裝(所圖2所示)。
[0013](7)利用上述試劑條檢測重組豬干擾素α樣品:
將試紙條水平放置，準確滴加2滴(約100μ1)樣本溶液在試紙條的樣品墊。10分鐘內(nèi)讀取結(jié)果。
[0014]結(jié)果判斷:
陽性:控制線出現(xiàn)紅色條帶，測試線出現(xiàn)紅色條帶，則為樣品含有重組豬干擾素α蛋白；陰性:控制線出現(xiàn)紅色條帶，測試線不出現(xiàn)紅色條帶，則為樣品不含有重組豬干擾素α蛋白。失效:控制線不出現(xiàn)紅色條帶，或控制線、測試線均不出現(xiàn)紅色條帶，為試紙條失效。
【權(quán)利要求】
1.一種重組豬干擾素α雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)純化抗重組豬干擾素α單克隆抗體的制備:小鼠腹腔內(nèi)注射0.5 ml液體石蠟，第7d后每只小鼠腹腔注射I XlOVml抗重組豬干擾素。雜交瘤細胞懸液0.5 ml, 7^10 d后觀察小鼠腹部膨脹程度收集腹水，經(jīng)離心去沉淀后以辛酸-飽和硫酸銨粗純，再以DEAE陰離子交換層析進一步純化抗重組豬干擾素α單克隆抗體，-80°C保存； (2)膠體金的制備:取0.01% HAuCl4水溶液100 ml，加熱煮沸，迅速加入I %檸檬酸三鈉水溶液Iml,繼續(xù)煮沸約5 min,制成粒徑40 nm金顆粒,此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸三鈉加入后很快變成灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成酒紅色，冷卻至室溫后4 C避光保存； (3)膠體金標記抗重組豬干擾素α單克隆抗體:用0.1 mol/L K2CO3將膠體金溶液調(diào)到PH8.2，然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每100 ml溶液加入4.5 mg純化的抗重組豬干擾素α單克隆抗體，將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中，再滴加入到終濃度為0.05%的PEG 20000或1%的BSA封閉，標記結(jié)束后2500 r/min離心18~22 min，去除大的聚合物，再將上清以12000 r/min離心28~32 min，棄去上清，以含0.05% PEG的0.01 mol/L PBS重懸沉淀，離心，重復(fù)操作兩次，最后以原體積1/10 (含0.05% PEG) 0.01 mol/L PBS重懸沉淀，3飛。C下保存，然后將標記膠體金溶液加樣于玻璃纖維素膜上，在溫度2(T25°C干燥2~4h，制成膠體金墊，干燥備用； (4)膠體金標記抗重組豬干擾素α單克隆抗體的純化:先1800r/min、4°C低速離心18~22min,棄去凝聚的沉淀,然后14000r/min、4°C高速離心1^1.2h,吸出上清,沉淀物用0.01 mol/L PBS溶液重懸，將沉淀重懸為原體積的1/10，再經(jīng)1500r/min離心18~22min，取上清加至AKTA? explorer蛋白純化儀葡聚糖凝膠層析柱純化,將純化的膠體金標記結(jié)合物過濾除菌、分裝，4°C保存； (5)抗重組豬干擾素α多克隆抗體的包被:用0.01 mol/L pH7.4 PBS將抗重組豬干擾素α多克隆抗體稀釋為I mg/ml，然后用噴膜儀將抗原在硝酸纖維素膜上按?μ?/cm進行劃線包被，同時在硝酸纖維素膜上包被羊抗鼠多克隆抗體，用于產(chǎn)品的質(zhì)控，包被完成后將硝酸纖維素膜在干燥間干燥6~8h，備用； (6)試紙條的組裝:在干燥間內(nèi)準備好吸水濾紙、樣品墊、PVC底板，在PVC底板中央貼上包被好的硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上緣粘貼吸水濾紙，硝酸纖維素膜下緣粘貼膠體金墊，膠體金墊下緣粘貼樣品墊，完成后用裁切機將貼好的試紙板切成4 _寬的試紙條，再將試紙條密封于鋁箔袋中，完成產(chǎn)品的組裝。
【文檔編號】G01N33/68GK103592441SQ201310526205
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】王明麗, 趙俊, 關(guān)鑫 申請人:王明麗, 趙俊