專利名稱：構(gòu)象改變的重組干擾素晶體、其三維結(jié)構(gòu)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及構(gòu)象改變的重組干擾素晶體、其結(jié)晶方法、其三維結(jié)構(gòu)及所述晶體和三維結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干擾素(IFN)是一種由多種細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性蛋白質(zhì)，其具有多種重要的生物功 能，包括抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能。根據(jù)生產(chǎn)細(xì)胞類型、受體、生物活性等的不同，干 擾素可分為I型、II型和III型干擾素。I型干擾素主要由病毒及合成的雙鏈RNA所誘導(dǎo)， 因此也稱為抗病毒干擾素?，F(xiàn)有三種類型的I型干擾素IFNci、INF^和IFNco。II型干 擾素也稱為免疫干擾素或IFN γ，由T細(xì)胞產(chǎn)生，并且在體內(nèi)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子。 III型干擾素則由IFN-λ分子構(gòu)成。如大量的相關(guān)專利和公開(kāi)文獻(xiàn)所顯示的，近年來(lái)，世界上許多公司都在參與干擾 素的研究。舉例來(lái)說(shuō)，美國(guó)專利第4，695，623號(hào)和第4，897，471號(hào)公開(kāi)了新型人干擾素多 肽，其氨基酸序列包含存在于天然α-干擾素多肽中的共同或占優(yōu)勢(shì)的氨基酸。該新型干 擾素多肽被命名為IFN-con(共有干擾素α)。所公開(kāi)的氨基酸序列被命名為IFN-conl、 IFN-con2和IFN-con3。還公開(kāi)了編碼IFN_cons的基因以及在大腸桿菌中的基因表達(dá)。研 究表明與白細(xì)胞干擾素或其它I型干擾素相比，該重組IFN-con具有更高的體外抗病毒、抗 增殖及天然殺傷細(xì)胞活性。美國(guó)專利第5，372，808號(hào)公開(kāi)了人IFN-con在疾病治療中的用途。與之前臨床 審批通過(guò)的α-干擾素如先靈葆雅公司生產(chǎn)的干擾能 (IFN-a2b，SGP)相比，重組人 共有干擾素顯示具有更低的副作用。1997年底，美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)了美 國(guó)安進(jìn)(Amgen)公司生產(chǎn)的人共有干擾素作為丙型肝炎臨床治療用藥，商品名為干復(fù)津 (INFERGEN interferon alfacon-1)。美國(guó)專利第7，364，724號(hào)和中國(guó)專利公開(kāi)號(hào)CN1740197均公開(kāi)了同一種功效增 強(qiáng)、副作用更小且能夠大劑量使用的重組干擾素。所述重組干擾素具有與干復(fù)津相同的氨 基酸序列，但其空間構(gòu)象和生物效力發(fā)生了變化。因此，獲得所述具有改變的結(jié)構(gòu)和功能的 重組干擾素晶體，并確定其三維結(jié)構(gòu)、建立模型并通過(guò)利用所述結(jié)構(gòu)和模型來(lái)開(kāi)展藥物設(shè) 計(jì)以及改良已有干擾素的效力是非常有意義的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供上述美國(guó)專利第7，364，724號(hào)和中國(guó)專利公開(kāi)號(hào) CN1740197公開(kāi)的重組干擾素的晶體，以及具有所述重組干擾素的三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)空間 結(jié)構(gòu)模型。在上述重組干擾素的三維結(jié)構(gòu)中，所述重組干擾素的每個(gè)單體都由6段α螺旋、1 段31(|螺旋及其間的連接肽段構(gòu)成。所述6段α螺旋對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基位置分別為13-20、 50-68,70-76,79-100,114-133和138-160 ；所述的1段31(1螺旋對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基位置為40-43。單體結(jié)構(gòu)的折疊方式屬于螺旋狀細(xì)胞因子型(helical cytokine)，特征在于在將 所述重組干擾素的α碳原子(Ca)骨架與IFN-α 2b蛋白的α碳原子骨架以最小二乘法方 式進(jìn)行疊合后，該重組干擾素在第25-33位殘基上的各α碳原子與所述IFN-a 2b蛋白在 對(duì)應(yīng)位殘基上的各α碳原子的位置均方根偏差(location root-mean-square deviation) 為3. 63埃。 優(yōu)選的是，所述重組干擾素與所述IFN-a2b蛋白在第25位殘基上的α碳原子的 位置均方根偏差為3. 291埃；在第26位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為4. 779埃； 在第27位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為5. 090埃；在第28位殘基上的α碳原 子的位置均方根偏差為3. 588埃；在第29位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為2. 567 埃；在第30位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為2. 437埃；在第31位殘基上的α 碳原子的位置均方根偏差為3. 526埃；在第32位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為 4. 820埃；在第33位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為2. 756埃。還優(yōu)選的是，所述重組干擾素在第44-52位殘基上的各α碳原子與所述IFN- α 2b 蛋白在對(duì)應(yīng)位殘基上的各α碳原子的位置均方根偏差為2. 90埃。其中，所述重組干擾素 與所述IFN-α 2b蛋白在第44位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為1. 614埃，在第45 位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為1.383埃，在第46位殘基上的α碳原子的位置 均方根偏差為2. 735埃，在第47位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為2. 709埃，在第 48位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為5. 018埃，在第49位殘基上的α碳原子的位 置均方根偏差為4. 140埃，在第50位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為3. 809埃，在 第51位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為2. 970埃，在第52位殘基上的α碳原子 的位置均方根偏差為0. 881埃(上述所列的“位置均方根偏差”均為坐標(biāo)位置的均方根偏 差)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的重組干擾素的三維結(jié)構(gòu)的蛋 白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型。根據(jù)基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法，該蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型可用來(lái)開(kāi)發(fā)新 型藥物并對(duì)已知干擾素進(jìn)行改良，使得干擾素的功效增強(qiáng)、副作用更低并可大劑量使用。使用基于結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)藥物設(shè)計(jì)方法，本發(fā)明的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型可用來(lái)開(kāi) 發(fā)新型藥物并對(duì)已知藥物如已知干擾素進(jìn)行改良?；诮Y(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)藥物設(shè)計(jì)是指用計(jì) 算機(jī)模擬來(lái)預(yù)測(cè)一種肽、多肽、蛋白質(zhì)的構(gòu)象，或者肽或多肽與一種治療用化合物之間構(gòu) 象的相互作用。計(jì)算機(jī)藥物設(shè)計(jì)方法在Maulik等人的1997年出版的《分子生物技術(shù)》 (MolecularBiotechnology)中有所披露。其中披露了定向設(shè)計(jì)方法、隨機(jī)設(shè)計(jì)方法以及基 于網(wǎng)格(grid-based)方法。因此，根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的三維結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型，本領(lǐng) 域的技術(shù)人員能夠?qū)σ阎蓴_素進(jìn)行改良或者開(kāi)發(fā)出抗病毒活性更強(qiáng)、副作用更低的新型 藥物。本發(fā)明的重組干擾素在結(jié)晶之前的純化產(chǎn)物是根據(jù)美國(guó)專利第7，364，724號(hào)說(shuō) 明書(shū)實(shí)施例1和2和/或中國(guó)專利公開(kāi)號(hào)CN1740197說(shuō)明書(shū)中第11_17頁(yè)記載的方法制得 的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組干擾素的氨基酸序列以及編碼所述氨基酸的核苷酸 序列分別如下所示MCDLPQTHSLGNRRALILLA1 ATGTGCGACC TGCCGCAGAC CCACTCCCTG GGTAACCGTC GTGCTCTGAT CCTGCTGGCT
TACACGCTGG ACGGCGTCTG GGTGAGGGAC CCATTGGCAG CACGAGACTA GGACGACCGAQMRRISPFSCLKDRHDFGFP
61 CAGATGCGTC GTATCTCCCC GTTCTCCTGC CTGAAAGACC GTCACGACTT CGGTTTCCCGGTCTACGCAG CATAGAGGGG CAAGAGGACG GACTTTCTGG CAGTGCTGAA GCCAAAGGGCQEEFDGNQFQKAQAISVLHE121 CAGGAAGAAT TCGACGGTAA CCAGTTCCAG AAAGCTCAGG CTATCTCCGT TCTGCACGAAGTCCTTCTTA AGCTGCCATT GGTCAAGGTC TTTCGAGTCC GATAGAGGCA AGACGTGCTTMIQQTFNLFSTKDSSAAffDE181 ATGATCCAGC AGACCTTCAA CCTGTTCTCC ACCAAAGACT CCTCCGCTGC TTGGGACGAATACTAGGTCG TCTGGAAGTT GGACAAGAGG TGGTTTCTGA GGAGGCGACG AACCCTGCTTSLLEKFYTELYQQLNDLEAC241 TCCCTGCTGG AAAAATTCTA CACCGAACTG TACCAGCAGC TGAACGACCT GGAAGCTTGCAGGGACGACC TTTTTAAGAT GTGGCTTGAC ATGGTCGTCG ACTTGCTGGA CCTTCGAACGVIQEVGVEETPLMNVDSILA301 GTTATCCAGG AAGTTGGTGT TGAAGAAACC CCGCTGATGA ACGTTGACTC CATCCTGGCTCAATAGGTCC TTCAACCACA ACTTCTTTGG GGCGACTACT TGCAACTGAG GTAGGACCGAVKKYFQRITLYLTEKKYSPC361 GTTAAAAAAT ACTTCCAGCG TATCACCCTG TACCTGACCG AAAAAAAATA CTCCCCGTGCCAATTTTTTA TGAAGGTCGC ATAGTGGGAC ATGGACTGGC TTTTTTTTAT GAGGGGCACGAffEVVRAEIMRSFSLSTNLQ421 GCTTGGGAAG TTGTTCGTGC TGAAATCATG CGTTCCTTCT CCCTGTCCAC CAACCTGCAGCGAACCCTTC AACAAGCACG ACTTTAGTAC GCAAGGAAGA GGGACAGGTG GTGGACGTCERLRRKE (SEQ ID NO 1)481 GAACGTCTGC GTCGTAAAGA ATAA (SEQ ID NO 2)CTTGCAGACG CAGCATTTCT TATT (SEQ ID NO 3)此外，本發(fā)明的重組干擾素在肌肉注射給體重指數(shù)(BMI)為20-27范圍內(nèi)的人體 后，以采血時(shí)間對(duì)受試人體血清中的2-5A寡聚核苷酸酶濃度作圖，所得曲線下的峰面積顯 著大于在同一條件下注射干復(fù)津所獲得的曲線下的峰面積。所述曲線一般表現(xiàn)為雙峰，雖 然該雙峰的形態(tài)、高度、雙峰之間的峰距可能因人的不同而有所差異。有時(shí)，所述雙峰之間 的峰距和兩峰的高度差異并不特別顯著，甚至其形態(tài)接近于梯形峰，但是，在肌肉注射給體 重指數(shù)為20-27范圍內(nèi)的人體后，以采血時(shí)間對(duì)受試人體血清中的2-5A寡聚核苷酸酶濃度 作圖，所得曲線下的峰面積顯著大于在同一條件下注射干復(fù)津所獲得的曲線下的峰面積。 此外，本發(fā)明的重組干擾素在注射給人體后其在人體內(nèi)的半衰期比干復(fù)津在人體內(nèi)的半衰 期更長(zhǎng)。已進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還證實(shí)，本發(fā)明的重組干擾素具有比目前投入臨床使用的其 它任何干擾素(包括干復(fù)津)更強(qiáng)的效力。例如，對(duì)于乙型肝炎病毒而言，本發(fā)明的重組干 擾素不僅能抑制乙型肝炎病毒的DNA復(fù)制而且還能抑制乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗 原(HBeAg)的分泌，抑制乙肝病毒核心抗原(HBcAg)DNA復(fù)制的效力與干復(fù)津相比提高約一 倍。本發(fā)明的重組干擾素的體外藥效學(xué)顯示它不僅能抑制乙型肝炎病毒的DNA復(fù)制，而且能抑制表面抗原和e抗原的分泌，其細(xì)胞學(xué)毒性僅為臨床現(xiàn)用干擾素的1/8，但抗病毒活性 卻是臨床現(xiàn)用干擾素的5-20倍，同時(shí)在人體內(nèi)具有更高更廣譜更長(zhǎng)時(shí)間的生物學(xué)應(yīng)答反應(yīng)。此外，無(wú)論是就病毒性疾病的預(yù)防還是就腫瘤的治療而言，所述干擾素都具有與 其它干擾素相比(包括干復(fù)津)，更高的抗病毒活性和更低的副作用。例如，本發(fā)明的重 組干擾素不但具有強(qiáng)于臨床現(xiàn)用干擾素20倍的抗病毒活性，以及明顯強(qiáng)于重組人α型干 擾素的抗腫瘤增生作用；還極大地降低了毒副作用并可安全的大劑量使用(每劑用量可> 1000萬(wàn)IU)，使需要大劑量用藥干擾素的部分病毒性疾病或腫瘤的成功治療成為可能。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種鑒定能與本發(fā)明的重組干擾素相結(jié)合的潛在配體 的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟將在此公開(kāi)的晶體暴露于一種或多種 包含潛在配體的樣品，并確定是否形成配體_干擾素分子復(fù)合物。在另一方面，本發(fā)明提供了一種獲取用于設(shè)計(jì)能與干擾素 形成分子復(fù)合物的潛在 配體的結(jié)構(gòu)信息的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟將在此公開(kāi)的晶體暴 露于潛在配體庫(kù)，并確定是否形成配體_干擾素分子復(fù)合物。在另一方面，本發(fā)明提供了一種非配體化的分子；所述分子具有在此公開(kāi)的干擾 素的至少一部分。例如，所述非配體化結(jié)合的分子可包含SEQ IDNO :4或SEQ ID Ν0:5所示 序列(分別為在此公開(kāi)的干擾素的AB環(huán)和BC環(huán)的序列)。在另一方面，本發(fā)明提供了一種可伸縮(scalable)的由點(diǎn)組成的三維構(gòu)象，所述 點(diǎn)的至少一部分來(lái)源于在此披露的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，或來(lái)源于包含本發(fā)明的重組干擾素的AB環(huán) 或BC環(huán)的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述可伸縮的由點(diǎn)組成的三維構(gòu)象展示為全息圖、立體 圖、模型或者計(jì)算機(jī)顯示圖片。在另一方面，本發(fā)明提供了一種獲取關(guān)于未知結(jié)構(gòu)分子或分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息 的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟結(jié)晶所述分子或分子復(fù)合物；由所述 結(jié)晶的分子或分子復(fù)合物產(chǎn)生X射線衍射圖；以及將所述的X射線衍射圖應(yīng)用于在此公開(kāi) 的干擾素的至少一部分的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，從而產(chǎn)生所述未知結(jié)構(gòu)分子或分子復(fù)合物的至少一部 分的三維電子密度圖。在另一方面，本發(fā)明提供了一種干擾素同系物的模建方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述方法包括以下步驟將推定的干擾素同系物的氨基酸序列與本發(fā)明的重組干擾素的氨基 酸序列進(jìn)行比對(duì)并將推定的干擾素同系物的氨基酸序列摻入由在此披露的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)形成 的干擾素模型中，從而生成干擾素同系物的初級(jí)模型；對(duì)所述初級(jí)模型進(jìn)行能量最小化以 生成能量最小化模型；重建所述能量最小化模型中違背立體化學(xué)約束的區(qū)域，從而生成干 擾素同系物的最終模型。在另一方面，本發(fā)明提供了一種計(jì)算機(jī)輔助的用于鑒定、設(shè)計(jì)或制備潛在干擾素 活性調(diào)節(jié)劑的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括篩選化學(xué)或者生物實(shí)體庫(kù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可應(yīng)用結(jié)晶學(xué)手段來(lái)篩選并鑒定可能成為干擾素配體的化學(xué)或 生物實(shí)體(見(jiàn)美國(guó)專利第6，297，021號(hào))。舉例來(lái)說(shuō)，一種優(yōu)選的方法可包括以下步驟獲 得非配體化的干擾素晶體；將所述非配體化的干擾素晶體暴露于一種或多種包含潛在干擾 素配體的測(cè)試樣品；和確定是否形成配體-干擾素分子復(fù)合物。可通過(guò)多種方法將所述干 擾素暴露于潛在配體，所述方法包括但不限于，將干擾素晶體浸泡于含有一種或多種潛在配體的溶液中，或者，在一種或多種潛在配體的存在下共結(jié)晶干擾素。來(lái)自所述配體_干擾素復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息可優(yōu)選地用于設(shè)計(jì)新配體，該新配體較 已知配體結(jié)合得更緊密、結(jié)合得更特異，具有期望的生物活性特性，具有更高的安全性，甚 至具有以上優(yōu)點(diǎn)的結(jié)合。舉例來(lái)說(shuō)，計(jì)算出的電子密度圖直接揭示了結(jié)合事件，鑒定了結(jié)合 的化學(xué)或者生物實(shí)體，并且提供了配體-干擾素復(fù)合物的詳細(xì)三維結(jié)構(gòu)。一旦命中(hit)， 就可通過(guò)傳統(tǒng)的篩選方法找出該命中的一系列具有更緊密結(jié)合或期望的生物活性的類似 物或衍生物。任選地，可將配體_干擾素迭代暴露于額外的潛在配體，使得兩次或更多次命 中能優(yōu)選地結(jié)合在一起以鑒定或設(shè)計(jì)更具效力的配體。X-射線結(jié)晶學(xué)分析在此公開(kāi)的干擾素的每一個(gè)組成氨基酸都通過(guò)一組結(jié)構(gòu)坐標(biāo)得到定義。術(shù)語(yǔ)“結(jié) 構(gòu)坐標(biāo)”指由數(shù)學(xué)方程式導(dǎo)出的笛卡兒坐標(biāo)，該數(shù)學(xué)方程式與X-射線單色光通過(guò)以晶體形 式存在的本發(fā)明的干擾素的原子(散射中心)衍射獲得的圖樣相關(guān)。衍射數(shù)據(jù)用于計(jì)算晶 體重復(fù)單元的電子密度圖。然后，電子密度圖用于建立干擾素蛋白或蛋白/配體復(fù)合物的 單個(gè)原子的位置。通過(guò)數(shù)學(xué)方式操作所述干擾素或者干擾素/配體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，還可產(chǎn)生輕微的結(jié)構(gòu) 坐標(biāo)改變。舉例來(lái)說(shuō)，在此公開(kāi)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)可通過(guò)如下手段進(jìn)行操作結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的結(jié)晶學(xué)置 換、結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的分段、結(jié)構(gòu)坐標(biāo)集合的整體加減、結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的翻轉(zhuǎn)，或上述手段的任意組合。 而由于氨基酸突變、添加、取代和/或缺失或在任何組成部分中的其他改變而導(dǎo)致的晶體 結(jié)構(gòu)的改變，也可引起結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的變化。在個(gè)體坐標(biāo)中這樣的輕微變化對(duì)總體形狀影響不 大。如果與原始坐標(biāo)相比這樣的改變處于可接受的標(biāo)準(zhǔn)誤差之內(nèi)，則所得到的三維形狀被 認(rèn)為是結(jié)構(gòu)等價(jià)的。應(yīng)當(dāng)指出本發(fā)明干擾素的個(gè)體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)中的輕微變化預(yù)計(jì)不會(huì)明顯改變上述實(shí) 體如可與干擾素或其部分(如上述AB或BC環(huán))結(jié)合的配體的特性。在上下文中，短語(yǔ)
“與......結(jié)合”指配體或其部分與干擾素分子或其部分之間相鄰近的情況。這樣的結(jié)合
可以是非共價(jià)的，其中這樣的相鄰近在能量上受益于氫鍵、范德華力或靜電相互作用；所述 結(jié)合也可以是共價(jià)的。因此，作為實(shí)例，與干擾素的結(jié)合口袋或結(jié)合區(qū)結(jié)合的配體也應(yīng)預(yù)期 能結(jié)合結(jié)構(gòu)等價(jià)的結(jié)合口袋或結(jié)合區(qū)，或與之相互作用。對(duì)于本發(fā)明而言，對(duì)于任何分子或分子復(fù)合物或其任意部分，當(dāng)疊合到在此描述 的相關(guān)骨架原子上，具有小于約0. 65埃的保守殘基骨架原子(如N、Ca、C、0)均方根偏差 時(shí)，被認(rèn)為是“結(jié)構(gòu)等價(jià)的”。換言之，這兩個(gè)分子的這些部位的晶體結(jié)構(gòu)在可接受的誤差范 圍內(nèi)是基本上相同的。特別優(yōu)選的結(jié)構(gòu)等價(jià)的分子或者分子復(fù)合物為具有如下限定的分子 或者分子復(fù)合物在此公開(kāi)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的完整集合士小于約0. 65埃的來(lái)自于那些氨基酸 的保守骨架原子的均方根偏差。更優(yōu)選地，所述均方根偏差最多約0. 5埃，還更優(yōu)選最多約 0. 35埃。本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括具有如下限定的分子復(fù)合物在此公開(kāi)的AB或BC環(huán) 的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)士小于約0. 65埃的均方根偏差，所述均方根偏差優(yōu)選最多約0. 5埃，還更優(yōu)選 最多約0. 35埃。 術(shù)語(yǔ)“均方根偏差”指偏差的平方的算術(shù)平均值的方根，其用于表示與趨勢(shì)或?qū)ο?的偏差或變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述“均方根偏差”規(guī)定了一種蛋白質(zhì)骨架相對(duì)于如在 此描述的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)所限定的干擾素骨架或其部分的變化。
X-射線 結(jié)構(gòu)坐標(biāo)定義了空間中點(diǎn)的獨(dú)特構(gòu)象。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解蛋白、或 蛋白/配體復(fù)合物、或它們的一部分的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)定義了一系列相應(yīng)的點(diǎn)；而這些點(diǎn)又繼而 定義了三維構(gòu)象。如果坐標(biāo)之間的距離和角度保持基本上相同，則相似或相同的構(gòu)象可為 一組完全不同的坐標(biāo)所定義。此外，只要保持角度基本上相同，可伸縮的點(diǎn)構(gòu)象就可通過(guò)在 坐標(biāo)之間增加或減少距離來(lái)定義。各種計(jì)算分析可用于確定分子或其部分與在此公開(kāi)的干擾素或其部分是否是根 據(jù)三維結(jié)構(gòu)定義的“結(jié)構(gòu)等價(jià)的”。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)各種計(jì)算分析進(jìn)行不同結(jié)構(gòu)、相同結(jié)構(gòu) 的不同構(gòu)象、或相同結(jié)構(gòu)的不同部分之間的比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分析可包括以下 四個(gè)步驟(1)加載需要比較的結(jié)構(gòu)；(2)在這些結(jié)構(gòu)中定義原子等價(jià)性；(3)執(zhí)行擬合操 作；和(4)分析結(jié)果。結(jié)構(gòu)同源的分子在此公開(kāi)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)可用于幫助獲得關(guān)于其他結(jié)晶分子或分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信 息。本發(fā)明的方法可以用于確定與在此公開(kāi)的干擾素具有一個(gè)或多個(gè)相似結(jié)構(gòu)特征的分子 或者分子復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)的至少一部分。所述的分子在此稱為“結(jié)構(gòu)同源的”。相似的結(jié) 構(gòu)特征可包括例如氨基酸同一性區(qū)域、保守的活性位點(diǎn)或結(jié)合位點(diǎn)基序、以及相似排列的 二級(jí)結(jié)構(gòu)元件(例如，α螺旋和β折疊)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)比對(duì)兩條氨基酸序 列的殘基以優(yōu)化其序列長(zhǎng)度上相同氨基酸的個(gè)數(shù)來(lái)確定結(jié)構(gòu)同源性；在進(jìn)行比對(duì)過(guò)程中， 允許再這兩條序列中的一條或兩條中存在空位，以優(yōu)化相同氨基酸的個(gè)數(shù)，但是，這些氨基 酸必須在其各自序列中保持固有順序。優(yōu)選地，結(jié)構(gòu)同源的分子是一種具有與SEQ ID NO 1至少65%同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，與本發(fā)明的干擾素結(jié)構(gòu)同源的蛋白 質(zhì)包含與SEQ ID NO 1的類似部分具有至少80%氨基酸序列同一性的至少50個(gè)氨基酸殘 基的連續(xù)區(qū)段。用于生成結(jié)構(gòu)同源分子或分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息的方法在本領(lǐng)域中是公知 的。在此公開(kāi)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)系還可用于解析相關(guān)干擾素、干擾素突變體或與各種配體共 復(fù)合的干擾素同系物的晶體結(jié)構(gòu)。該應(yīng)用使確定配體和干擾素(如候選的干擾素改性劑和 干擾素)之間相互作用的最佳位點(diǎn)得以可能。本方法還適用于鑒定分子的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)中 用于修飾的潛在位點(diǎn)。這一信息的獲得為確定最有效的結(jié)合相互作用(如在干擾素及其配 體之間增強(qiáng)的疏水相互作用)提供了額外的途徑。同源模建通過(guò)同源模建，可構(gòu)建或優(yōu)化未被結(jié)晶的干擾素同系物的計(jì)算機(jī)模型。首先，通過(guò) 序列比對(duì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)庫(kù)篩選或這些技術(shù)的任意組合，創(chuàng)建出于擾素同系物的初級(jí) 模型。計(jì)算軟件可用于實(shí)施所述的序列比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。諸如在插入或缺少周圍形成 的結(jié)構(gòu)碎片之類的結(jié)構(gòu)不連貫可通過(guò)篩選具有期望長(zhǎng)度和合適構(gòu)象的肽結(jié)構(gòu)庫(kù)從而模建 獲得。若所述干擾素同系物已經(jīng)結(jié)晶，則可通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)使用最終的同源模型來(lái)解 析該同系物的晶體結(jié)構(gòu)。其次，讓所述初級(jí)模型能量最小化以生成能量最小化模型。該能 量最小化模型可包含違背立體化學(xué)約束的區(qū)域，在這種情況下，可使用本領(lǐng)域已知技術(shù)對(duì) 這些區(qū)域重新模建以獲得最終的同源模型。合理藥物設(shè)計(jì)計(jì)算機(jī)技術(shù)可用于篩選、鑒定、選擇和/或設(shè)計(jì)能與干擾素或結(jié)構(gòu)同源的分子結(jié)合的化學(xué)實(shí)體或配體。在此公開(kāi)的干擾素的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的信息使得具有與在此公開(kāi)的干擾素的構(gòu)象互補(bǔ)形狀的合成化合物和/或其他分子的設(shè)計(jì)和/或鑒定得以可能。具體而言，計(jì) 算機(jī)技術(shù)可用于鑒定或設(shè)計(jì)與干擾素或其部分(如AB或BC環(huán))結(jié)合的化學(xué)實(shí)體或配體， 例如改性劑、激動(dòng)劑和拮抗劑等。潛在的改性劑可結(jié)合干擾素的活性位點(diǎn)或其部分，或干擾 之，并可以是競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性或無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑；或通過(guò)結(jié)合兩個(gè)單體之間的界面，從 而干擾二聚化。一旦針對(duì)生物活性進(jìn)行鑒定或篩選，這些抑制劑/激動(dòng)劑/拮抗劑就可在 治療上或預(yù)防上用于阻斷或增強(qiáng)干擾素活性。還可通過(guò)計(jì)算機(jī)技術(shù)獲得干擾素結(jié)合與干擾 之的配體類似物的結(jié)構(gòu)_活性數(shù)據(jù)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“化學(xué)實(shí)體”指化合物、兩種或更多種化合物的復(fù)合物、及 所述化合物或復(fù)合物的片段。被確定能與本發(fā)明的干擾素相結(jié)合的化學(xué)實(shí)體就是潛在的藥 物候選物。因此，如在此所鑒定的本發(fā)明的干擾素或結(jié)構(gòu)同源分子或其部分的結(jié)果的三維 結(jié)構(gòu)圖示可有利地用于藥物研發(fā)。通過(guò)本領(lǐng)域可獲得的多種計(jì)算機(jī)方法和技術(shù)中某一種， 所述化學(xué)實(shí)體的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)系可用于生成三維圖像，該三維圖像又可通過(guò)計(jì)算機(jī)與所述干擾 素或結(jié)構(gòu)同源分子的三維圖像進(jìn)行擬合。本發(fā)明的藥物設(shè)計(jì)方法的一個(gè)實(shí)施方案包括評(píng)估已知化學(xué)實(shí)體或配體與所述干 擾素或其結(jié)構(gòu)同源分子的潛在結(jié)合。因此，所述藥物設(shè)計(jì)方法還包括通過(guò)計(jì)算機(jī)來(lái)評(píng)估所 選擇的化學(xué)實(shí)體或配體與本文所列的任何一種分子或分子復(fù)合物的潛在結(jié)合。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述藥物設(shè)計(jì)方法包括與本發(fā)明干擾素、其同系物或它們的部分結(jié)合的化學(xué)實(shí) 體或配體的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)?；瘜W(xué)實(shí)體或配體可以步進(jìn)方式進(jìn)行設(shè)計(jì)，一次一條片段，或可 作為整體進(jìn)行設(shè)計(jì)或“從頭(de novo)”設(shè)計(jì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的重 組干擾素的晶體，其中該晶體的空間群為P3P1，在一個(gè)不對(duì)稱單位中包含2個(gè)分子，以及單 晶胞參數(shù)為a = b = 77. 92 埃，c = 125. 935 埃，α = β = 90°，γ = 120°。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述重組干擾素的α碳原子骨架與IFN-α 2b的α碳原 子骨架以最小二乘法方式進(jìn)行疊合后，該重組干擾素在對(duì)應(yīng)于IFNa 2b蛋白質(zhì)分子中第 25-33位殘基上的各α碳原子與IFN-α 2b蛋白質(zhì)分子在對(duì)應(yīng)位殘基上的α碳原子均方根 偏差為3. 63埃。更具體來(lái)說(shuō)，與IFN α 2b對(duì)應(yīng)位殘基相比，所述重組干擾素在第25_33位殘 基上的 α 碳原子偏差依次分別是 3. 291,4. 779,5. 090,3. 588,2. 567,2. 437,3. 526,4. 820 和2. 756埃。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述重組干擾素的α碳原子骨架與IFN-α 2b的α碳 原子骨架以最小二乘法方式進(jìn)行疊合后，該重組干擾素在對(duì)應(yīng)于IFNa 2b蛋白質(zhì)分子中第 44-52位殘基上的各α碳原子與IFNa 2b蛋白質(zhì)分子在對(duì)應(yīng)位殘基上的α碳原子均方根 偏差為2. 90埃。更具體來(lái)說(shuō)，與IFN α 2b對(duì)應(yīng)位殘基相比，所述重組干擾素在第44_52位殘 基上的 α 碳原子偏差依次分別是 1. 614,1. 383,2. 735,2. 709,5. 018,4. 140,3. 809,2. 970 和0. 881埃。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組干擾素晶體進(jìn)一步包含共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的金 屬離子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種包含在此公開(kāi)的重組干擾素晶體的組 合物。本發(fā)明還提供了包含在此公開(kāi)的序列的肽，或其衍生物、活性部分、類似物、變體或模擬物，及其用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在此公開(kāi)的干擾素多肽的模擬物。 所述模擬物可以是功能性模擬物或結(jié)構(gòu)性模擬物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述模擬物包含 SPFSCLKDR 序歹Ij (SEQ IDNO :4，即 AB 環(huán)的序列)，或 DGNQFQKAQ 序列(SEQ ID NO :5，即 BC 環(huán) 的序列)。本發(fā)明包含其中個(gè)體氨基酸可被在本領(lǐng)域中被認(rèn)為密切相關(guān)的其他氨基酸所取 代的變體肽。舉例來(lái)說(shuō)，所述個(gè)體氨基酸可由以下方式進(jìn)行取代可用任何疏水性脂肪族氨 基酸取代其他疏水性脂肪族氨基酸；可用任何疏水性芳香族氨基酸取代其他疏水性芳香族 氨基酸；可用任何帶有極性側(cè)鏈的中性氨基酸取代其他帶有極性側(cè)鏈的中性氨基酸；可用 任何酸性氨基酸取代其他酸性氨基酸；可用任何堿性氨基酸取代其他堿性氨基酸。當(dāng)在本 文使用時(shí)，“模擬物”、“功能性/結(jié)構(gòu)性模擬物”均指具有與在此公開(kāi)的多肽相同的功能/結(jié) 構(gòu)活性的肽變體或有機(jī)化合物。這樣的模擬物或者類似物的實(shí)例包括被模建以比擬在此 公開(kāi)的干擾素的三維結(jié)構(gòu)，特別是如上所述的氨基酸殘基的排列的化合物或肽?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域通常所知的模建技術(shù)生成適合的模擬物或者類似物。包括設(shè)計(jì)涉及 研究功能相互作用的“模擬物”以及設(shè)計(jì)包含以使之能產(chǎn)生上述相互作用的方式排列的官 能團(tuán)的化合物。對(duì)已知藥學(xué)活性化合物設(shè)計(jì)模擬物是一種基于“前導(dǎo)”化合物用于開(kāi)發(fā)藥物的已 知方法。這一方法可用于獲得不易合成或需高價(jià)合成的活性化合物，也可用于改良不宜于 常規(guī)給藥的活性化合物；所述不宜于常規(guī)給藥的活性化合物包括會(huì)在消化道中被蛋白酶 快速分解，從而不宜于口服的活性化合物多肽。模擬物設(shè)計(jì)、合成和測(cè)試可用于避免針對(duì)目 標(biāo)性質(zhì)隨機(jī)篩選大量分子。

在根據(jù)具有給定目標(biāo)特性的化合物/肽設(shè)計(jì)模擬物的過(guò)程中，通常包括以下幾 步首先，確定對(duì)于決定目標(biāo)性質(zhì)起關(guān)鍵和/或重要作用的化合物/肽的特定部分。就肽而 言，可通過(guò)系統(tǒng)性地改變肽中的氨基酸殘基從而實(shí)現(xiàn)這樣的確定，例如將每個(gè)殘基依次取 代。構(gòu)成化合物活性區(qū)的這些部分或殘基被稱為其“藥效團(tuán)”?！┌l(fā)現(xiàn)所述藥效團(tuán)，就可根據(jù)其物理性質(zhì)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行模建；所述物理性質(zhì)例 如立體化學(xué)性、鍵合、大小和/或電荷、該模建使用了來(lái)自多種來(lái)源例如光譜技術(shù)、χ-射線 衍射和NMR的數(shù)據(jù)。計(jì)算分析、相似性制圖(其模擬了藥效團(tuán)的電荷和/或體積，而非原子 間鍵合)以及其他技術(shù)可用于該模建過(guò)程中。在該方法的變型中，模建配體及其結(jié)合伴侶 的三維結(jié)構(gòu)。這一方法特別適用于配體和/或結(jié)合伴侶在結(jié)合中產(chǎn)生構(gòu)象變化的情況，從 而容許在模擬物設(shè)計(jì)中對(duì)該模型作進(jìn)一步考慮。然后，選擇可將模擬藥效團(tuán)的化學(xué)基團(tuán)移植到其上的模板分子?？杀憷剡x擇所 述模板分子及移植到其上的化學(xué)基團(tuán)，從而容易地合成所述模擬物；而所合成的模擬物除 了保持前導(dǎo)化合物的生物活性外，還可能是藥理學(xué)可接受的，并且不會(huì)在體內(nèi)降解。通過(guò)這 一手段獲取的模擬物經(jīng)篩選后，即可得知其是否具有目標(biāo)性質(zhì)或者在什么程度上顯示了目 標(biāo)性質(zhì)。然后，可進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化和改性，以獲得用于體內(nèi)或臨床測(cè)試的一種或多種最終 的模擬物。無(wú)論是就本發(fā)明而言用于人體給藥的多肽、抗體、肽、核酸分子、小分子、模擬物還 是其他藥學(xué)上有用的化合物，優(yōu)選的給藥劑量都是“預(yù)防有效劑量”或“治療有效劑量”(當(dāng) 然預(yù)防也可被認(rèn)為是治療的一個(gè)方面)，這樣的劑量足以顯示對(duì)個(gè)體的有益效果。本發(fā)明的實(shí)際給藥劑量、給藥頻率以及給藥時(shí)間隨受治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度而定。治療處方，如 劑量確定等問(wèn)題，由醫(yī)生或其他醫(yī)務(wù)工作者按情況而定。藥物組合物可依據(jù)情況單獨(dú)給藥 或聯(lián)合給藥。 根據(jù)本發(fā)明并供本發(fā)明所用的藥物組合物，除活性成分外，可包括藥學(xué)上可接受 的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或其它本領(lǐng)域公知的物質(zhì)。這類物質(zhì)應(yīng)當(dāng)是無(wú)毒且不會(huì)影 響活性成分效力的物質(zhì)。載體或其他物質(zhì)的確切性質(zhì)依據(jù)給藥方式而定；所述給藥方式包 括口服和注射；而注射則進(jìn)一步包括皮下注射、肌肉注射以及靜脈注射等。上述技術(shù)和給藥 方案的實(shí)例可見(jiàn) Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 16 版，Osol，Α·(編)，1980。本發(fā)明還提供了一種鑒定可與干擾素相互作用的候選化合物的方法，所述方法包 括步驟(a)提供本發(fā)明的干擾素晶體；(b)確定步驟(a)中干擾素晶體的原子坐標(biāo)；和(c) 選擇包含能與步驟(a)中獲得的結(jié)構(gòu)相互作用的結(jié)構(gòu)特征的候選化合物，從而鑒定能與所 述干擾素相互作用的候選化合物。蛋白的三維結(jié)構(gòu)可由多種方式展示，包括表面電荷或者 疏水核排列。在一個(gè)實(shí)施方案中，候選化合物的結(jié)構(gòu)特征包括抗原性位點(diǎn)、親水特性、表面 可接近性和結(jié)構(gòu)基序。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于計(jì)算機(jī)進(jìn)行候選化合物的選擇和鑒定。舉例來(lái)說(shuō)，所述的 基于計(jì)算機(jī)的選擇可包括以下步驟對(duì)多個(gè)候選化合物生成三維結(jié)構(gòu)；將上述三維結(jié)構(gòu)各 自與包含本發(fā)明干擾素晶體的原子坐標(biāo)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合，以發(fā)現(xiàn)在能量上最有利的相 互作用，從而鑒定能與所述干擾素相互作用的候選化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，上述方法進(jìn)一步包括以下步驟獲取或合成候選化合物； 使所述候選化合物與干擾素接觸以確定該候選化合物與所述干擾素相互作用的能力。該方 法還可包括測(cè)定所述干擾素與候選化合物接觸時(shí)的活性。舉例來(lái)說(shuō)，要被測(cè)試的干擾素活 性包括抗病毒活性、抗腫瘤活性、抗增殖活性、天然殺傷細(xì)胞活性以及免疫調(diào)節(jié)活性。本發(fā)明還提供了設(shè)計(jì)干擾素模擬物的方法，包括步驟(a)對(duì)多個(gè)模擬物生成三 維結(jié)構(gòu)；和(b)將步驟(a)中的各個(gè)三維結(jié)構(gòu)與包含本發(fā)明干擾素晶體的原子坐標(biāo)的三維 結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合，以發(fā)現(xiàn)所述干擾素的最佳擬合模擬物。本發(fā)明還提供了基于計(jì)算機(jī)的合理藥物設(shè)計(jì)方法，包括步驟(a)提供包含本發(fā) 明干擾素晶體的原子坐標(biāo)的三維結(jié)構(gòu)；(b)提供多個(gè)分子片段；(c)將所述多個(gè)分子片段與 步驟(a)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合；和(d)將所述分子片段組裝到一個(gè)分子中，從而得到候選藥物。 在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述多個(gè)分子片段與包含SEQ ID N0:4(AB環(huán)的序列)的序列進(jìn)行擬 合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述多個(gè)分子片段與包含SEQ ID NO :5 (BC環(huán)的序列)的序列 進(jìn)行擬合。上述方法還可包含以下步驟獲得或合成候選藥物；以及令所述候選藥物與干 擾素接觸，從而確定候選藥物與所述干擾素相互作用的能力。所述方法可用于構(gòu)建干擾素 同系物或與所述干擾素相互作用的配體。本發(fā)明將通過(guò)下列實(shí)施例得以詳細(xì)描述，所述實(shí)施例僅作為解釋說(shuō)明目的，并不 意在限制本發(fā)明的范圍。可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改而不背離的本發(fā)明的范圍。所有出版物、專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖艘云湔w并入作為參考，如同每篇獨(dú)立出版物、 專利或?qū)＠暾?qǐng)被明確且單獨(dú)地指出以其整體并入作為參考一樣。


圖l顯示了用于晶體結(jié)構(gòu)分析的本發(fā)明的重組干擾素(rSIFN-(。)的單晶。
圖2顯示了rSIFN-(。晶體的X一射線衍射圖(分辨率為2．6人)。
圖3顯示了rSIFN-(。分子晶體結(jié)構(gòu)中局部2F(’一FC的1．0 a電子密度圖。
圖4顯示了rSIFN-(。的所有原子的平均溫度因子隨殘基的分布圖；其中圖4a為A鏈的圖；圖4b為B鏈的圖。
圖5顯示了rSIFN-(。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)模型中所有氨基酸殘基的(中，＼V)值在拉氏構(gòu)象圖上的分布，此圖參考了分辯率至少2．o埃、R因子低于20％的118個(gè)結(jié)構(gòu)，在最佳區(qū)域內(nèi)有90％o以上是高質(zhì)量的模型，其統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如下
統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)
在最適區(qū)域內(nèi)的殘基[A、B、L]I24090．6％o
在附加允許區(qū)域內(nèi)的殘基[a、b、l、p—J249．1％
在一般允許區(qū)域的殘基[a、飛、l、p’Ji0．4％
在不允許區(qū)域內(nèi)的殘基00．o％
一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一[OL OO] 除甘氨酸和脯氨酸以外的殘基數(shù)265100．o％
末端殘基數(shù)(甘氨酸和脯氨酸除外)127
甘氨酸殘基數(shù)18
脯氨酸殘基數(shù)6
一一一一一一一一一一
總殘基數(shù)416
圖6顯示了rSIFN-(。晶胞堆積圖。
圖7顯示了rSIFN-(。二聚體結(jié)構(gòu)的組裝結(jié)構(gòu)對(duì)。
圖8顯示了rSIFN-(。晶體學(xué)二聚體的組織(圖8a，圖帥)及。碳原子的均方根偏差(RMSD，方框代表缺失殘基)(圖8C)。
圖9顯示了rSIFN-(。單分子的結(jié)構(gòu)(僅示出主肽鏈)；其中圖9a為側(cè)視圖；圖9b為俯視圖；圖9C為拓?fù)涫疽鈭D；圖9d為二級(jí)結(jié)構(gòu)的拓?fù)浣M織方式。
圖lo顯示了rSIFN-(。二級(jí)結(jié)構(gòu)與氨基酸序列匹配圖；其中灰線方框代表在結(jié)構(gòu)中未搭建的氨基酸殘基，藍(lán)線方框代表在結(jié)構(gòu)中構(gòu)建為Ala，或Gly n9氨基酸殘基，連線為兩對(duì)二硫鍵，下標(biāo)綠色為結(jié)構(gòu)中已構(gòu)建的l對(duì)二硫鍵。
圖11顯示了rSIFN-(。蛋白與同源IFN多肽的序列對(duì)比圖。
圖12顯示了rSIFN-(。
IFN-a 2b比較結(jié)果示意圖。
圖13顯示了rSIFN-(。(紅色) IFN-a 2b(黃色)二聚體疊合圖。
圖14顯示了(a)工FN-a類蛋白與受體的結(jié)合模型；(b)工FN-a類功能區(qū)示意圖(藍(lán)圈區(qū)為重要功能區(qū))。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l
重組王攏蓋工莖I型--CO的擊0備
本實(shí)施例為重組干擾素rSIFN_co(以下也可稱為“rSIFN_co”)(原液)的制備方 法(具體參見(jiàn)美國(guó)專利第7，364，7M號(hào)說(shuō)明書(shū)實(shí)施例1和2以及中國(guó)專利公開(kāi)號(hào)CN1740197 說(shuō)明書(shū)中第11-17頁(yè)記載的方法)。一、基因克隆根據(jù)已發(fā)表的編碼DNA序列及推斷的氨基酸序列資料(Klein ML, Bartley TD, Lai PH, et al. , Structural characterization of recombinant consensusinterferon-alpha. Journal of Chromatography, 1988 ；454 :205-215)，禾用大 腸桿菌優(yōu)先表達(dá)密石馬子(The Wisconsin Package, by Genetics Computer Group, Inc. Copyright 1992，Medison, Wisconsin, USA)，在保證氨基酸序列不變的情況下，對(duì)其DNA編 碼序列進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，然后人工合成其rSIFN-co全長(zhǎng)cDNA編碼基因。 大腸桿菌cDNA序列的合成rSIFN-co cDNA序列的重新設(shè)計(jì)合成rSIFN-co cDNA 序列rSIFN-co cDNA 5'-端和3'-端半分子的合成用PCR 方法直接合成 rSIFN-co cDNA 5'-端 ^Obp (I 片段)和 3 ‘-端洸8bp(II 片段)兩個(gè)cDNA半分子。片段I的3'-端與片段II的5'-端有41bp的核苷酸序列重
疊互補(bǔ)?；瘜W(xué)合成如下寡聚脫氧核苷酸片段Oligomer A 5 ‘ ATGTGCGACCTGCCGCAGACCCACTCCCTGGGTAACCGTCGTGCTCTGATCCTGCTGGCTCAGATG CGTCGTATCTCCCCGTTCTCCTGCCTGAAAGACCGTCACGAC3'OligomerB 5 ‘ CTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAGAGGTTCGACGGTAACCAGTTCCAGAAAGCT CAGGCTATCTCCGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGACCTTC3'Oligomer C 5' GCTGCTGGTACAGTTCGGTGTAGAATTTTTCCAGCAGGGATTCGTCCCAAGCAGCGGAGGAGTCTT TGGTGGAGAACAGGTTGAAGGTCTGCTGGATCATTTC3'Oligomer D 5 ‘ ATCCCTGCTGGAAAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTTGCGTTAT CCAGGAAGTTGGTGTTGAAGAAACCCCGCTGATGAAC3'Oligomer E 5 ‘ GAAGAAACCCCGCTGATGAACGTTGACTCCATCCTGGCTGTTAAAAAATACTTCCAGCGTATCACC CTGTACCTGACCGAAAAAAAATACTCCCCGTGCGCTTGGG3'Oligomer F 5 ‘ TTATTCTTTACGACGCAGACGTTCCTGCAGGTTGGTGGACAGGGAGAAGGAACGCATGATTTCAGC ACGAACAACTTCCCAAGCGCACGGGGAGTATTTTTTTTCGGTCAGG3'O) PCR 反應(yīng)PCR反應(yīng)I合成rSIFN-co 5'-端半分子用寡聚脫氧核苷酸片段B作為模板， A和C兩個(gè)寡聚脫氧核苷酸片段作為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)合成長(zhǎng)度為^Obp的rSIFN-co5'-端半分子產(chǎn)物。PCR I反應(yīng)混合物如下(單位μ 1)(總體積:50 μ 1)
權(quán)利要求
1.一種包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的重組干擾素的晶體，其中該晶體的空間 群為P3i21，在一個(gè)不對(duì)稱單位中包含2個(gè)分子，以及單晶胞參數(shù)為a = b = 77. 92埃，c = 125. 935 埃，α = β = 90° , γ = 120°。
2.權(quán)利要求1的干擾素晶體，其中將所述重組干擾素的α碳原子骨架與IFN-α2b的 α碳原子骨架以最小二乘法方式進(jìn)行疊合后，該重組干擾素在對(duì)應(yīng)于IFNa 2b蛋白質(zhì)分子 中第25-33位殘基上的各α碳原子與IFNa 2b蛋白質(zhì)分子在對(duì)應(yīng)位殘基上的α碳原子均 方根偏差為3. 63埃。
3.權(quán)利要求2的干擾素晶體，其中與IFNa2b對(duì)應(yīng)位殘基相比，所述重組干擾素在第 25-33 位殘基上的 α 碳原子偏差分別是 3. 291,4. 779,5. 090,3. 588,2. 567,2. 437,3. 526、 4. 820 和 2. 756 埃。
4.權(quán)利要求1的干擾素晶體，其中將所述重組干擾素的α碳原子骨架與IFN-α2b的 α碳原子骨架以最小二乘法方式進(jìn)行疊合后，該重組干擾素在對(duì)應(yīng)于IFNa 2b蛋白質(zhì)分子 中第44-52位殘基上的各α碳原子與IFNa 2b蛋白質(zhì)分子在對(duì)應(yīng)位殘基上的α碳原子均 方根偏差為2. 90埃。
5.權(quán)利要求4的干擾素晶體，其中與IFNa2b對(duì)應(yīng)位殘基相比，所述重組干擾素在第 44-52 位殘基上的 α 碳原子偏差分別是 1. 614、1. 383,2. 735,2. 709,5. 018,4. 140,3. 809、 2. 970 和 0. 881 埃。
6.權(quán)利要求1的干擾素晶體，進(jìn)一步包含共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的金屬離子。
7.一種包含權(quán)利要求1的干擾素晶體的組合物。
8.權(quán)利要求1的干擾素晶體的模擬物。
9.權(quán)利要求8的模擬物，其中所述模擬物是功能性模擬物或者結(jié)構(gòu)性模擬物。
10.一種鑒定能與干擾素相互作用的候選化合物的方法，所述方法包括步驟(a)提供權(quán)利要求1所述的干擾素晶體；(b)確定步驟(a)中干擾素晶體的原子坐標(biāo)；和(c)選擇包含能與步驟(a)中獲得的結(jié)構(gòu)相互作用的結(jié)構(gòu)特征的候選化合物，從而鑒 定能與所述干擾素相互作用的候選化合物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述結(jié)構(gòu)特征選自抗原性位點(diǎn)、親水特性、表面可接近性 和結(jié)構(gòu)基序。
12.權(quán)利要求10的方法，其中基于計(jì)算機(jī)進(jìn)行候選化合物的選擇和鑒定。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述基于計(jì)算機(jī)進(jìn)行候選化合物的選擇和鑒定包括步驟(i)對(duì)多個(gè)候選化合物生成三維結(jié)構(gòu)；和( )將步驟(i)的三維結(jié)構(gòu)各自與包含權(quán)利要求1的干擾素晶體的原子坐標(biāo)的三維結(jié) 構(gòu)進(jìn)行擬合，以發(fā)現(xiàn)在能量上最有利的相互作用，從而鑒定能與所述干擾素相互作用的候 選化合物。
14.權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括步驟(i)獲取或合成候選化合物；和( )使所述候選化合物與干擾素接觸以確定該候選化合物與所述干擾素相互作用的 能力。
15.權(quán)利要求14的方法，進(jìn)一步包括測(cè)定所述干擾素與候選化合物接觸時(shí)的活性。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述干擾素活性選自抗病毒活性、抗腫瘤活性、抗增殖活 性、天然殺傷細(xì)胞活性和免疫調(diào)節(jié)活性。
17.一種設(shè)計(jì)干擾素模擬物的方法，包括步驟(a)對(duì)多個(gè)模擬物生成三維結(jié)構(gòu)；和(b)將步驟(a)的各個(gè)三維結(jié)構(gòu)與包含權(quán)利要求1的干擾素晶體的原子坐標(biāo)的三維結(jié) 構(gòu)進(jìn)行擬合，以發(fā)現(xiàn)所述干擾素的最佳擬合模擬物。
18.一種基于計(jì)算機(jī)的合理藥物設(shè)計(jì)方法，包括步驟(a)提供包含權(quán)利要求1的干擾素晶體的原子坐標(biāo)的三維結(jié)構(gòu)；(b)提供多個(gè)分子片段；(c)將所述多個(gè)分子片段與步驟(a)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合；和(d)將所述分子片段組裝到一個(gè)分子中，從而得到候選藥物。
19.權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括步驟 (i)獲得或合成候選藥物；和( )令所述候選藥物與干擾素接觸，從而確定候選藥物與所述干擾素相互作用的能力。
20.權(quán)利要求18的方法，其中將所述多個(gè)分子片段與包含SEQID NO :4或5的序列進(jìn) 行擬合。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組干擾素晶體，其具有(i)與人共有干擾素相同的氨基酸序列，以及(ii)與IFN-α2b相比改變了的三維結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的干擾素具有增強(qiáng)的生物活性。本發(fā)明還提供了一種可用于藥物篩選和/或藥物設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)模型。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102101886SQ200910259339
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者王大成, 魏光文 申請(qǐng)人:四川輝陽(yáng)生命工程股份有限公司