專利名稱：一種高活性的人肝再生增強(qiáng)因子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種高活性的人肝再生增強(qiáng)因子及其制藥用途。具體而言，本發(fā)明涉及一種不成熟形式(截短型)的人肝再生增強(qiáng)因子，其可用于預(yù)防和/或治療肝損傷，尤其涉及利用中、低劑量的所述人肝再生增強(qiáng)因子來(lái)預(yù)防和/或治療肝損傷或制備相應(yīng)藥物。本發(fā)明還涉及所述人肝再生增強(qiáng)因子的制備方法及其編碼核酸等。
背景技術(shù)：
肝臟是人體的重要器官，肝損傷會(huì)對(duì)健康構(gòu)成了重大危害，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致肝硬化和肝功能衰竭，其中急性肝功能衰竭不但起病急、預(yù)后差，而且病死率高。某些病毒，如在我國(guó)的人群中普遍發(fā)病率高的乙型肝炎病毒等，通過致肝細(xì)胞病變可以造成肝損傷。還有研究表明，針對(duì)某些病毒(如丙型肝炎病毒(HCV))的免疫反應(yīng)也是引起肝損傷的主要原因。淋巴細(xì)胞(尤其是細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞)非但不能完全有效地清除HCV，反而在清除HCV感染的肝細(xì)胞的過程中會(huì)造成肝細(xì)胞的免疫性損傷，引起肝細(xì)胞調(diào)亡，由此甚至可以導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞性肝癌(例如可參見，Nelson等，J.Immunol.，1581473-1481(1997)；Wong等，J.Immunol.，1601479-1488(1998)；Ruggieri等，Virology，22968-76(1997))。此外，眾所周知，肝毒性化學(xué)物質(zhì)也會(huì)引起肝損傷。已知一些藥物通過氧化作用，尤其是產(chǎn)生的氧自由基，可以造成肝損傷，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞溶解和肝壞死。例如鎮(zhèn)痛藥醋氨酚(即撲熱息痛，化學(xué)名為4-(N-乙酰基氨基)酚)就是一種具有肝損傷作用的物質(zhì)，在大劑量服用時(shí)會(huì)引起人的肝壞死。又如，長(zhǎng)期服用利福平、吡嗪酰胺、異煙肼等抗生素，以及更年期長(zhǎng)期服用雌激素等也會(huì)造成嚴(yán)重的肝細(xì)胞壞死，導(dǎo)致急性或慢性肝炎、黃疸和肝纖維化等肝損傷。肝損傷是由肝臟細(xì)胞的病變、壞死而造成的，因此，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，使肝細(xì)胞再生，是預(yù)防和治療肝損傷、恢復(fù)肝臟功能的關(guān)鍵。
1994年，Hagiya等首先在大鼠的肝再生過程中獲得了一個(gè)全長(zhǎng)1.2kb的cDNA，包含375bp的開發(fā)讀框，編碼125個(gè)氨基酸的小分子蛋白，將其命名為肝再生增強(qiáng)因子(augmenter of liver regeneration，縮寫為ALR)。該鼠肝再生增強(qiáng)因子活性不受熱、酸、堿、1g/L SDS、10g/Lβ巰基乙醇、8M脲處理影響，不為Dnase、RNase、神經(jīng)氨酸糖苷酶破壞，但可被蛋白酶K、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等降解，分子量為15Kd左右。人們對(duì)ALR刺激肝細(xì)胞再生的機(jī)制還沒有完全清楚，有報(bào)道認(rèn)為，ALR通過跟胞外蛋白的受體結(jié)合激發(fā)胞內(nèi)的MAPK途徑發(fā)揮作用。純化的ALR可促進(jìn)小鼠及大鼠肝葉切除后的肝細(xì)胞DNA合成，從而對(duì)脾、肺、腎、心、腦等臟器細(xì)胞無(wú)刺激生長(zhǎng)作用，表明其活性存在肝組織特異性。但是對(duì)于人來(lái)說，鼠肝再生增強(qiáng)因子作為外源物質(zhì)，其上的表位會(huì)誘導(dǎo)人免疫系統(tǒng)對(duì)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)，難以直接應(yīng)用于預(yù)防和治療人的肝損傷。
在大鼠ALR分子克隆的基礎(chǔ)上，1999年劉杞等利用同源引物PCR技術(shù)獲得了人肝再生增強(qiáng)因子(縮寫為hALR)的基因組序列(Genbank號(hào)為AF146394)，據(jù)預(yù)測(cè)為375bp的開放讀框，但該研究沒有研究其活性。此外，在專利申請(qǐng)WO9748797A、WO9702346A、EP0668291A也公開了各種來(lái)源的ALR，但遺憾的是，都沒有具體研究其活性。之后Lisowsky發(fā)現(xiàn)hALR基因有3種不同的剪切形式，由125個(gè)氨基酸組成的hALR僅為不成熟形式；而由204個(gè)氨基酸組成的全長(zhǎng)hALR的形式為成熟形式，分子量為23kDa，主要分布于肝臟、腎臟，在組織中所占的比率最高，并且具有最強(qiáng)的生物學(xué)活性。受此認(rèn)識(shí)的影響，此后的研究集中于全長(zhǎng)hALR，如中國(guó)專利CN1233839C、CN1795924A，沒有觸及不成熟形式的人肝再生增強(qiáng)因子。另外，中國(guó)專利CN1532285A涉及ALR的同源二聚體蛋白，而CN1727479A涉及ALR作為免疫抑制劑的用途，也沒有涉及不成熟形式的人肝再生增強(qiáng)因子，更沒有涉及hALR治療肝損傷的劑量。
本發(fā)明人經(jīng)過艱苦的研究，令人意外地發(fā)現(xiàn)了不成熟形式的人肝再生增強(qiáng)因子不但能夠在我們構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)、穩(wěn)定保持，而且該人肝再生增強(qiáng)因子治療肝損傷的活性并不比全長(zhǎng)hALR低，克服了存在于現(xiàn)有技術(shù)中的偏見。更令人意外的是，不成熟形式的人肝再生增強(qiáng)因子的治療效果并不常規(guī)地與劑量呈正相關(guān)，竟然能以現(xiàn)有技術(shù)所未啟示過的中、低劑量來(lái)取得好的效果，而高劑量的使用甚至有害，由此形成該人肝再生增強(qiáng)因子的新的藥物應(yīng)用。另外，至今未見報(bào)道有人肝再生增強(qiáng)因子凍干制劑的報(bào)道，本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期的摸索，發(fā)現(xiàn)聚乙二醇不適于作為該凍干劑的輔料，并得出了前人無(wú)法預(yù)計(jì)的制劑配方。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的偏見、突破常規(guī)藥物劑量，提供了一種不成熟形式(截短型)的人肝再生增強(qiáng)因子，其能以中低劑量治療肝損傷，以及該人肝再生增強(qiáng)因子的藥物組合物及其在制備治療或預(yù)防肝損傷的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的還在于提供編碼所述人肝再生增強(qiáng)因子的核酸分子及其載體、宿主細(xì)胞和利用基因工程技術(shù)制備所述人肝再生增強(qiáng)因子的方法。
具體而言，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種不成熟形式的人肝再生增強(qiáng)因子，其氨基酸序列a)如序列表中的序列1所示；或b)是對(duì)序列表中的序列1所示的序列添加、缺失或取代一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而得的氨基酸序列，并且所述人肝再生增強(qiáng)因子能以中低劑量治療肝損傷。優(yōu)選本發(fā)明第一個(gè)方面的人肝再生增強(qiáng)因子的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。本發(fā)明人經(jīng)過艱苦的研究，令人意外地發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的第一個(gè)方面的人肝再生增強(qiáng)因子盡管是不成熟形式，但是其仍舊能穩(wěn)定保持并表現(xiàn)出不比全長(zhǎng)hALR低的治療或預(yù)防肝損傷的活性；更令人意外的是，本發(fā)明的第一個(gè)方面的人肝再生增強(qiáng)因子在對(duì)損傷的肝細(xì)胞進(jìn)行高劑量的使用時(shí)，不但無(wú)效，反而有害，需要以中低劑量來(lái)取得好的效果。當(dāng)然擁有這樣性質(zhì)的好處是明顯的只要中低劑量就能取得好療效，就可以減少藥物使用量，降低病人治療成本，并且相應(yīng)減輕病人用藥時(shí)的痛苦。
本發(fā)明的第一個(gè)方面的人肝再生增強(qiáng)因子的氨基酸序列可以是在序列表中的序列1所示的序列的基礎(chǔ)上添加、缺失或取代一個(gè)或幾個(gè)(優(yōu)選一個(gè)至五個(gè)，更優(yōu)選一個(gè)至三個(gè))氨基酸殘基而得的氨基酸序列，并且所述人肝再生增強(qiáng)因子仍舊能以中低劑量治療肝損傷。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，通過改變已知多肽的編碼基因序列并將其導(dǎo)入表達(dá)載體，可以制備出取代、添加或缺失了氨基酸殘基的多肽，這些方法廣泛記載于《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(北京科學(xué)出版社，2002年)等本領(lǐng)域公知的文獻(xiàn)中。在取代的氨基酸殘基中，優(yōu)選取代為與原氨基酸殘基側(cè)鏈性質(zhì)相似的其他氨基酸，從而更得以保持原有功能活性。側(cè)鏈性質(zhì)相似的氨基酸分別有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羥基側(cè)鏈的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子側(cè)鏈的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺側(cè)鏈的氨基酸(D、N、E、Q)、含堿性基團(tuán)側(cè)鏈的氨基酸(R、K、H)、含芳香族側(cè)鏈的氨基酸(H、F、Y、W)。目前已經(jīng)存在大量檢驗(yàn)中低劑量治療肝損傷能力的實(shí)驗(yàn)方法，必要時(shí)也可根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所述的具體實(shí)驗(yàn)方法從經(jīng)添加、缺失或取代的氨基酸序列中選出具有上述功能的人肝再生增強(qiáng)因子。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)對(duì)于小鼠損傷的肝細(xì)胞，高劑量的本發(fā)明的第一個(gè)方面的人肝再生增強(qiáng)因子不但無(wú)效，反而有害，因此對(duì)于小鼠，小鼠的用量應(yīng)當(dāng)?shù)陀?mg/Kg體重，優(yōu)選為12-1200μg/Kg體重，更優(yōu)選為24-600μg/Kg體重，更優(yōu)選為36-240μg/Kg體重，特別優(yōu)選為40-200μg/Kg體重，如40μg/Kg體重、200 μg/Kg體重等。根據(jù)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的等效劑量換算關(guān)系(通常可參見FDA、SFDA等藥品管理機(jī)構(gòu)的指導(dǎo)意見，也可參見“黃繼漢等.藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004Sep；9(9)1069-1072”)可從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的劑量推導(dǎo)出人的劑量。具體而言，對(duì)于本發(fā)明具體實(shí)施方式
中所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠而言，根據(jù)上述文獻(xiàn)，其與成人的換算關(guān)系一般為12∶1，因此對(duì)于成人，換算出的成人的用量應(yīng)當(dāng)?shù)陀?67μg/Kg體重，優(yōu)選為1-100μg/Kg體重，更優(yōu)選為2-50μg/Kg體重，更優(yōu)選為3-20μg/Kg體重，特別優(yōu)選為3.3-16.7μg/Kg體重，如3.3μg/Kg體重、16.7μg/Kg體重等。
本文中所用的“中低劑量”或“中、低劑量”，如不特別指明(即在沒有加人或動(dòng)物種類的限定時(shí))，指的是成人每Kg體重接受的大于0并且低于167μg的量(即指的是大于0并且低于167μg/Kg體重)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全有能力根據(jù)本文所提供的實(shí)驗(yàn)方法或相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步得出更優(yōu)選的中低劑量范圍。本發(fā)明優(yōu)選的中低劑量為1-100μg/Kg體重，更優(yōu)選為2-50μg/Kg體重，更優(yōu)選為3-20μg/Kg體重，特別優(yōu)選為3.3-16.7μg/Kg體重，如3.3μg/Kg體重、16.7μg/Kg體重等。
當(dāng)特別指明是小鼠時(shí)，小鼠的中低劑量指大于0并且低于2mg/Kg體重，優(yōu)選為12-1200μg/Kg體重，更優(yōu)選為24-600μg/Kg體重，更優(yōu)選為36-240μg/Kg體重，特別優(yōu)選為40-200μg/Kg體重，如40μg/Kg體重、200μg/Kg體重等。因此，在本發(fā)明一個(gè)并不優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了一種非人動(dòng)物使用的不成熟形式的人肝再生增強(qiáng)因子，其氨基酸序列a)如序列表中的序列1所示；或b)是對(duì)序列表中的序列1所示的序列添加、缺失或取代一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而得的氨基酸序列，并且所述人肝再生增強(qiáng)因子能以非人動(dòng)物的中低劑量治療肝損傷。其中，非人動(dòng)物優(yōu)選是小鼠。另外，該方面的人肝再生增強(qiáng)因子的氨基酸序列可以如序列表中的序列1所示。
為了便于描述，在下文中，術(shù)語(yǔ)“人肝再生增強(qiáng)因子”、“肝再生增強(qiáng)因子”及其縮寫“ALR”、“hALR”可以根據(jù)上下文意義而相互交替使用，如果沒有前提條件的說明，則指的是本發(fā)明第一個(gè)方面的人肝再生增強(qiáng)因子。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種核酸分子，其編碼本發(fā)明第一個(gè)方面所述的人肝再生增強(qiáng)因子。本發(fā)明的核酸分子，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，優(yōu)選DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是編碼鏈或模板鏈。通過常規(guī)技術(shù)，如PCR方法、重組法或人工合成的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易獲得本發(fā)明的人肝再生增強(qiáng)因子的核酸分子或其片段。這些序列一旦獲得，就可以將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入相應(yīng)的細(xì)胞，然后通過常規(guī)的宿主細(xì)胞進(jìn)行增殖，從中分離得到大量的核酸分子。優(yōu)選本發(fā)明的核酸分子的核苷酸序列如序列表中的序列2所示。該優(yōu)選序列優(yōu)化了在大腸桿菌的表達(dá)。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種載體，其含有本發(fā)明第二個(gè)方面所述的核酸分子。本文中的術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”、“表達(dá)載體”，有時(shí)僅稱“載體”，在此可以交互替換使用，是指本領(lǐng)域中常用的細(xì)菌質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、動(dòng)物病毒及其它各種病毒載體。本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)用的載體(原核表達(dá)載體)、在酵母中表達(dá)用的載體(如畢赤酵母載體、漢遜酵母載體等)、在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒載體、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)用的載體(痘苗病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達(dá)用的植物病毒載體以及在哺乳動(dòng)物乳腺中表達(dá)用的各種載體。總之，只要能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制，任何質(zhì)粒和載體都可使用。優(yōu)選表達(dá)載體包含選擇標(biāo)記基因，如細(xì)菌的氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、卡那霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷選擇標(biāo)志，如His，Leu，Trp等；真核細(xì)胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氫葉酸還原酶基因及熒光蛋白標(biāo)記基因等。本發(fā)明的載體優(yōu)選為原核載體，在實(shí)施方式中，其為pET-ALR，即在pET28a質(zhì)粒上克隆有序列表中的序列2所示核苷酸序列的表達(dá)質(zhì)粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用DNA重組技術(shù)等一系列技術(shù)，構(gòu)建含本發(fā)明所述編碼融合蛋白的DNA序列、合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列、啟動(dòng)子及選擇性標(biāo)記基因等特定元件的表達(dá)載體。上述載體可用來(lái)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，以便獲得所需要的人肝再生增強(qiáng)因子。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞含有本發(fā)明第三個(gè)方面所述的載體，或者所述細(xì)胞已用本發(fā)明第二個(gè)方面所述的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞，如，細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。宿主細(xì)胞在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染含本發(fā)明所述編碼融合蛋白的基因序列后，即構(gòu)成工程化細(xì)胞或細(xì)胞株，可用于生產(chǎn)所需融合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠恰當(dāng)?shù)剡x擇適當(dāng)?shù)妮d體、宿主細(xì)胞，并熟知如何將載體高效地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，所用方法包括但不限于氯化鈣法、電穿孔法用于細(xì)菌細(xì)胞，電穿孔法和原生質(zhì)體融合法用于酵母細(xì)胞，脂質(zhì)體包裹、磷酸鈣共沉淀、電融合法以及顯微注射法用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核細(xì)胞。優(yōu)選本發(fā)明的宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21(DE3)。該優(yōu)選宿主細(xì)胞能高效表達(dá)人肝再生增強(qiáng)因子。
在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明第一個(gè)方面所述人肝再生增強(qiáng)因子的方法，其包括，用本發(fā)明第四個(gè)方面所述的宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明第一個(gè)方面所述的人肝再生增強(qiáng)因子，然后分離純化所述人肝再生增強(qiáng)因子。換句話說，本發(fā)明第五個(gè)方面提供了制備人肝再生增強(qiáng)因子的方法，其包括，用宿主細(xì)胞表達(dá)所述人肝再生增強(qiáng)因子，然后分離純化所述人肝再生增強(qiáng)因子；其中，所述宿主細(xì)胞含有包含核酸分子的載體，或者所述細(xì)胞已用核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，其中所述核酸分子編碼所述人肝再生增強(qiáng)因子；而且其中，所述人肝再生增強(qiáng)因子的氨基酸序列a)如序列表中的序列1所示；或b)是對(duì)序列表中的序列1所示的序列添加、缺失或取代一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而得的氨基酸序列，并且所述人肝再生增強(qiáng)因子能以中低劑量治療肝損傷。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，人肝再生增強(qiáng)因子的氨基酸序列如序列表中的序列1所示；和/或，所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中的序列2所示。
獲得的工程細(xì)胞可以通過常規(guī)方法培養(yǎng)、誘導(dǎo)來(lái)表達(dá)所需要的融合蛋白，包括發(fā)酵過程和純化工藝。上述表達(dá)的蛋白可在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜上或分泌到細(xì)胞周質(zhì)、細(xì)胞外。根據(jù)需要，可利用融合蛋白的物理的、化學(xué)的以及其它生物學(xué)特性，進(jìn)行分離純化。方法包括但不限于裂菌(超聲波裂菌、滲透壓裂菌)，離心，鹽析，分子篩色譜(又稱為分子尺寸排阻色譜)，離子交換色譜，吸附色譜(親和層析、金屬鏊合層析)，反向色譜，高效液相色譜，毛細(xì)管電泳，制備性等電聚焦以及常規(guī)的變性、復(fù)性處理等，這些方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。為了能夠高效地獲得人肝再生增強(qiáng)因子，優(yōu)選在本發(fā)明制備方法的方面的方法中，宿主細(xì)胞為含有載體pET28-ALR的大腸桿菌BL21(DE3)，其中載體pET28-ALR含有權(quán)利要求4所述的核酸分子。該優(yōu)選實(shí)施方式能夠使人肝再生增強(qiáng)因子表達(dá)量占菌體蛋白總量的25％以上。其中，pET28-ALR如本申請(qǐng)具體實(shí)施方式
所定義。
另外，為了穩(wěn)定地獲得高純度的人肝再生增強(qiáng)因子，優(yōu)選在本發(fā)明制備方法的方面的方法中，分離純化所述人肝再生增強(qiáng)因子的步驟包括其中分離純化所述人肝再生增強(qiáng)因子的步驟包括宿主細(xì)胞裂解變性后，按順序用陽(yáng)離子交換色譜復(fù)性，用分子尺寸排阻色譜純化，用腸激酶酶切，用陰離子交換色譜純化。盡管這一制備步驟的步驟組合是本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期研究摸索出來(lái)的，但是其中每個(gè)單獨(dú)的變性、復(fù)性、純化、酶切等步驟是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，而且許多已經(jīng)商品化了。例如，陽(yáng)離子交換色譜有SPSepharose FF、CM Sepharose FF、SP Sepharose XL、SP Sepharose HP、SP Sephadex C25、CM Sephadex C25等；分子尺寸排阻色譜有Sephacry S200HR、Sephedex G-25、Sephedex G-100等；陰離子交換色譜有Q-Sepharose FastFlow、DEAE Sepharose FF、DEAE Sephadex A25、ANX Sepharose FF、Q SepharoseXL等。優(yōu)選其中陽(yáng)離子交換色譜是Sepharose FF，包括SP Sepharose FF、CM Sepharose FF；和/或，分子尺寸排阻色譜是Sephedex G-25；和/或，陰離子交換色譜是Q-Sepharose Fast Flow。也優(yōu)選其中腸激酶酶切后進(jìn)一步包括分離去除含His部分的融合蛋白片段的步驟，如將酶切產(chǎn)物過Sepharose FF柱和NTA柱，去除未酶切完全的產(chǎn)物。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，分離純化所述人肝再生增強(qiáng)因子的步驟包括如下步驟1)宿主細(xì)胞裂解變性后，裂解液用Sepharose FF柱復(fù)性，其中采用尿素濃度梯度復(fù)性緩沖液過柱復(fù)性，然后依次分別用含50mM、250mM和500mM咪唑的洗脫液洗脫；2)將上述洗脫液過Sephedex G-25柱去除咪唑及鹽離子；3)用腸激酶酶切，然后將酶切產(chǎn)物過Sepharose FF柱和NTA柱，去除未酶切完全的產(chǎn)物；和4)將上一步的流出液過Q-Sepharose Fast Flow柱純化，用0至1mol/LNaCl梯度洗脫，收集含人肝再生增強(qiáng)因子的洗脫峰。


圖1為構(gòu)建的ALR表達(dá)載體示意圖。
圖2為ALR表達(dá)菌株培養(yǎng)液的SDS-PAGE電泳圖，其中左側(cè)泳道上樣的是分子量標(biāo)記(從上至下依次為66kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD)；泳道1上樣的是用IPTG誘導(dǎo)前的培養(yǎng)液；泳道2上樣的是用IPTG誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液。
圖3為經(jīng)純化的ALR蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中左側(cè)泳道上樣的是分子量標(biāo)記(從上至下依次為從上至下依次為66kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD)；泳道C2，B2和A2分別上樣的是三個(gè)不同批次得到的經(jīng)純化的ALR蛋白。
圖4為經(jīng)純化的ALR蛋白的蛋白肽指紋圖譜。
圖5為經(jīng)純化的ALR蛋白的質(zhì)譜圖譜。
圖6為ALR正常對(duì)照組小鼠的肝組織的組織學(xué)HE染色圖，左圖為放大100倍，右圖為放大400倍，它們顯示為正常肝組織結(jié)構(gòu)。
圖7為陰性治療組小鼠的肝組織的組織學(xué)HE染色圖，左圖為放大100倍，右圖為放大400倍，它們顯示出中央靜脈周圍大塊壞死。
圖8為陽(yáng)性治療組小鼠的肝組織的組織學(xué)HE染色圖，左圖為放大100倍，右圖為放大400倍，它們顯示出中央靜脈周圍壞死，但有少量肝細(xì)胞出現(xiàn)。
圖9為造模+ALR低劑量組小鼠的肝組織的組織學(xué)HE染色圖，左圖為放大100倍，右圖為放大400倍，它們顯示出顯示出亞大塊出血壞死尚存在，但有少量正常肝細(xì)胞出現(xiàn)。
為了便于理解，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，其全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考。以下將通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說都是顯而易見了。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例所述實(shí)驗(yàn)方法，沒有具體說明的，按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(2002年，第三版，科學(xué)出版社)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(2001年，科學(xué)出版社)等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)所述的方法進(jìn)行，或者根據(jù)實(shí)驗(yàn)中具體用到的試劑、儀器的廠商所提供的說明書或手冊(cè)來(lái)進(jìn)行。
實(shí)施例1.ALR表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)當(dāng)前許多常規(guī)的基因克隆技術(shù)已經(jīng)商業(yè)化，因此為了有利于ALR在大腸桿菌中的表達(dá)，我們委托上海生工公司人工合成了適合大腸桿菌表達(dá)的如序列2所示的ALR基因。通過PCR技術(shù)在以上合成的序列兩端分別引入EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)以及腸激酶切點(diǎn)。具體PCR擴(kuò)增過程如下上游引物ttgGAATTCGACGACGACGACAAGATGCGTACCCAGCAGAAA；下游引物ttgCTCGAGTTAGTCGCAAGAACCGTC；PCR體系H2O 34μL，10×PCR緩沖液5μL，25mM MgSO42μL，2mM dNTP 5μL，上游引物(稀釋成50uM濃度)1μL，下游引物(稀釋成50uM濃度)1μL，合成的ALR基因(稀釋成10ng/uL濃度)1μL，KOD PLUSDNA聚合酶(Toyoba)1μL，總體積50μL；PCR條件首先94℃變性5分鐘，然后25個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)為94℃30秒，50℃30秒，68℃30秒)，最后68℃2分鐘。
然后，在瓊脂糖凝膠上電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，割膠回收約500bp大小的核酸片斷。用EcoRI和XhoI分別雙酶切該回收的PCR產(chǎn)物和pET28a+質(zhì)粒(可購(gòu)自Invitrogen公司)，將酶切后的PCR產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒用T4連接酶連接(構(gòu)建成ALR表達(dá)載體pET28-ALR，如圖1所示)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞(可購(gòu)自ATCC)。取轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α細(xì)胞抽提質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序檢測(cè)序列克隆有ALR正確序列后，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)(可購(gòu)自ATCC)中，由此得到ALR表達(dá)菌株。
取ALR表達(dá)菌株接種到LB液體培養(yǎng)基100mL中，在37℃振搖培養(yǎng)6小時(shí)后，加入10uL的1mol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。誘導(dǎo)前后各取菌液50μL，用12％SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)果如圖2所示，誘導(dǎo)后在15kD左右的位置上有明顯的ALR表達(dá)條帶，其表達(dá)量占菌體蛋白總量的25％以上，表明我們選用的核酸序列(序列2)、表達(dá)載體(pET28-ALR)和宿主菌(大腸桿菌BL21(DE3))已經(jīng)構(gòu)成了原核高效表達(dá)系統(tǒng)。
實(shí)施例2.ALR蛋白的分離純化對(duì)實(shí)施例1中誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌體進(jìn)行分離純化操作，收獲純化的ALR蛋白以供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)使用。具體步驟如下1)用10mL 50mM濃度的Tris-HCl(pH 8.0)裂解液重懸1克菌體，冰上超聲破碎。低溫高速(4攝氏度，10,000轉(zhuǎn)/分鐘)離心20分鐘，收集沉淀。
2)沉淀用3倍體積(30mL)的含2M尿素的裂解液徹底洗滌，低溫高速(4度，12,000轉(zhuǎn)/分鐘)離心10分鐘，棄上清，用3倍體積的含8M尿素的裂解液徹底溶解，低溫高速(4度，12,000轉(zhuǎn)/分鐘)離心棄去沉淀。
3)包涵體裂解液用CM Sepharose FF柱(購(gòu)自GE公司)純化，采用尿素濃度梯度復(fù)性緩沖液緩慢過柱洗滌，依次分別用含50mM、250mM和500mM咪唑的洗脫液以5倍柱體積洗脫。
4)過Sephedex G-25柱(購(gòu)自GE公司)脫去洗脫液中咪唑及鹽離子。
5)根據(jù)廠商說明書的指導(dǎo)，在20℃，20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.6的條件下，用1μl的rEK(重組腸激酶，可購(gòu)自上海生工公司)跟hALR反應(yīng)8小時(shí)。然后，過Sepharose FF柱將用rEK切下的含His部分的融合蛋白片段分離，再將流出液進(jìn)一步流經(jīng)鰲合有Ni的NTA柱(購(gòu)自Merck公司)以防止混入未酶切完全的蛋白。
6)將上一步的流出液1ml過Q-Sepharose Fast Flow(購(gòu)自GE公司)柱純化， 條件是以50mM Tris-HCl緩沖液平衡，用0至1mol/L NaCl梯度洗脫，收集含hALR的洗脫峰。
然后以下文中的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)該洗脫峰。
經(jīng)過以上步驟的純化，得到的純化的ALR蛋白電泳結(jié)果如圖3所示，在C2，B2和A2三個(gè)不同批次純化試驗(yàn)得到的結(jié)果中，純化的ALR蛋白純度均在90％以上。另外，通過對(duì)該純化的ALR蛋白進(jìn)行蛋白肽指紋圖譜分析(其結(jié)果如圖4所示)、質(zhì)譜測(cè)定(其結(jié)果如圖5所示)和蛋白測(cè)序分析等理化性質(zhì)的鑒定，表明純化得到的ALR蛋白與預(yù)期的不成熟形式的人肝再生增強(qiáng)因子相符。
實(shí)施例3.ALR蛋白體外活性鑒定取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人肝細(xì)胞株SMMC7721(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，按1×105個(gè)細(xì)胞/ml、100μl/孔的量接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃以5％CO2的條件培養(yǎng)24小時(shí)，然后換含0.2％FSC的RPMI 1640的培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時(shí)。然后，吸棄培養(yǎng)液，分別加入以上實(shí)施例所得的ALR(其用RPMI 1640的培養(yǎng)基稀釋成不同濃度)，加入量為100μl/孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔，其中加入不含ALR的RPMI 1640的培養(yǎng)基100μl/孔。每個(gè)藥物濃度及對(duì)照孔設(shè)置復(fù)孔，培養(yǎng)24小時(shí)后加入10μl/孔的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，吸棄培養(yǎng)上清液，加入100μl/孔的DMSO，培養(yǎng)板振蕩15分鐘后，在550nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的光密度(O.D.)，O.D.值越大表明孔中的細(xì)胞濃度越大，即ALR刺激細(xì)胞增殖的作用越大。測(cè)定結(jié)果參見表3-1，與空白對(duì)照相比，我們得到的ALR在體外具有顯著的刺激肝臟來(lái)源的細(xì)胞增殖的作用，并且在體外刺激效應(yīng)在一定范圍內(nèi)與劑量呈正相關(guān)關(guān)系。
表3-1.不同ALR濃度刺激下的O.D.值

其中，*表示P＜0.05實(shí)施例4.ALR對(duì)肝損傷保護(hù)作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一，ALR對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用1，實(shí)驗(yàn)方法取體重、年齡相仿的昆明種小鼠(購(gòu)自交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)24只，隨機(jī)分為6組，每組4只，分別為(1)造模+生理鹽水組(縮寫為NS，即陰性治療組)應(yīng)用CCl4造成小鼠的急性肝損傷，在治療時(shí)給藥生理鹽水；(2)造模+威佳促肝素組(縮寫為WJ，即陽(yáng)性治療組)應(yīng)用CCl4造成小鼠的急性肝損傷，在治療時(shí)給藥威佳(即促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，產(chǎn)自威海賽洛金藥業(yè)有限公司)，給藥劑量為20μg/Kg體重(3)造模+ALR高劑量組(縮寫為ALR高)應(yīng)用CCl4造成小鼠的急性肝損傷，在治療時(shí)給藥上述實(shí)施例得到的ALR，給藥劑量為2mg/Kg體重；(4)造模+ALR中劑量組(縮寫為ALR中)應(yīng)用CCl4造成小鼠的急性肝損傷，在治療時(shí)給藥上述實(shí)施例得到的ALR，給藥劑量為200μg/Kg體重；(5)造模+ALR低劑量組(縮寫為ALR低)應(yīng)用CCl4造成小鼠的急性肝損傷，在治療時(shí)給藥上述實(shí)施例得到的ALR，給藥劑量為40μg/Kg體重；(6)ALR正常對(duì)照組(即未造模組)不用CCl4造成小鼠急性肝損傷，但在其他組治療時(shí)給藥上述實(shí)施例得到的ALR，給藥劑量為2mg/Kg體重。具體實(shí)驗(yàn)過程如下除了ALR正常對(duì)照組之外，其他組的小鼠經(jīng)腹腔注射含10％(體積百分比)CCl4的橄欖油，給藥劑量為10ml/Kg體重；ALR正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水。4小時(shí)后，對(duì)以上六組的小鼠進(jìn)行治療，即分別按照以上分組情況對(duì)每只小鼠經(jīng)腹腔注射生理鹽水、威佳或ALR，共給藥4次，每次給藥體積均為200μl，每12小時(shí)給藥1次。最后1次給藥8小時(shí)后，對(duì)小鼠眶靜脈取血，分離血清后使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)和AST(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)的水平；同時(shí)留取小鼠肝組織，浸泡于10％中性福爾馬林溶液，進(jìn)行組織學(xué)HE染色觀察肝組織損傷和保護(hù)情況。
2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用不同試劑和劑量對(duì)急性肝損傷的小鼠治療后，各組的ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)和AST(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)水平如表4-1所示。對(duì)小鼠肝組織進(jìn)行組織學(xué)HE染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察的結(jié)果如圖6-9所示。
以上結(jié)果表明(1)相對(duì)于未使用CCl4的未造模組，使用CCl4后僅采用生理鹽水治療的陰性治療組的ALT、AST水平上升超過了20倍，兩者具有非常顯著差異(p＜0.01)，組織學(xué)HE染色圖也表明會(huì)對(duì)肝細(xì)胞造成損害，這表明CCl4能成功地造成小鼠的急性肝損傷。
(2)與陰性治療組相比，ALR在中、低劑量(200、40μg/Kg)使用時(shí)可顯著抑制急性肝損傷，具體表現(xiàn)為可顯著降低兩種轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST在血清中的含量，而且觀察到的肝組織損傷程度較輕，說明本發(fā)明的ALR對(duì)小鼠化學(xué)性肝細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，造模+ALR中劑量組跟陰性對(duì)照相比ALT水平的降低有顯著差異(P＜0.05)，造模+ALR低劑量組跟陰性對(duì)照相比ALT水平的降低有顯著差異(P＜0.01)，造模+ALR低劑量組跟陰性對(duì)照相比AST水平的降低有顯著差異(P＜0.05)，ALR的治療效果優(yōu)于常用的藥物威佳。
(3)最為令人吃驚的是，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，盡管高劑量的ALR對(duì)正常肝組織沒有損傷作用，但是對(duì)損傷的肝細(xì)胞，高劑量的ALR(2mg/Kg)不僅沒有保護(hù)作用，相反具有一定的協(xié)同損傷作用。造模+ALR高劑量組跟陰性治療組相比甚至可以升高AST水平，且升高幅度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異(P＜0.05)，說明高劑量的ALR對(duì)于受損傷的肝細(xì)胞有一定的破壞作用，這提示使用劑量應(yīng)控制在中、低劑量范圍內(nèi)。
表4-1.各組小鼠急性肝損傷經(jīng)治療后轉(zhuǎn)氨酶的水平


其中，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01二，ALR對(duì)小鼠急性肝損傷導(dǎo)致的致死效應(yīng)的保護(hù)作用取體重、年齡相仿的昆明種小鼠25只，隨機(jī)分為5，每組5，分別為(1)造模+生理鹽水組(縮寫為NS，即陰性治療組)應(yīng)用CCl4造成小鼠的急性肝損傷，在治療時(shí)給藥生理鹽水；(2)造模+威佳組(縮寫為WJ，即陽(yáng)性治療組)應(yīng)用CCl4造成小鼠的急性肝損傷，在治療時(shí)給藥威佳(即肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，購(gòu)自)，給藥劑量為20μg/Kg體重(3)造模+ALR高劑量組(縮寫為ALR高)應(yīng)用CCl4造成小鼠的急性肝損傷，在治療時(shí)給藥上述實(shí)施例得到的ALR，給藥劑量為2mg/Kg體重；(4)造模+ALR中劑量組(縮寫為ALR中)應(yīng)用CCl4造成小鼠的急性肝損傷，在治療時(shí)給藥上述實(shí)施例得到的ALR，給藥劑量為200μg/Kg體重；(5)造模+ALR低劑量組(縮寫為ALR低)應(yīng)用CCl4造成小鼠的急性肝損傷，在治療時(shí)給藥上述實(shí)施例得到的ALR，給藥劑量為40μg/Kg體重。具體實(shí)驗(yàn)過程如下首先，小鼠經(jīng)腹腔注射含50％(體積百分比)CCl4的橄欖油，給藥劑量為8ml/Kg體重。1小時(shí)后，對(duì)以上五組的小鼠進(jìn)行治療，即分別按照以上分組情況對(duì)每只小鼠經(jīng)腹腔注射生理鹽水、威佳或ALR，給藥體積均為200μl。然后，每天觀察小鼠存活情況，結(jié)果如表4-2。該結(jié)果表明，中、低劑量的ALR具有對(duì)小鼠急性肝細(xì)胞壞死的保護(hù)作用，而且保護(hù)效果優(yōu)于生理鹽水、威佳，更為令人吃驚的是，也優(yōu)于高劑量的ALR，提示了ALR(尤其是中、低劑量的ALR)具有通過減輕小鼠肝衰竭從而降低死亡率的作用。
表4-2.各組小鼠經(jīng)治療后的致死性損傷保護(hù)作用(存活率)

序列表<110>上海友恒生物科技有限公司<120>一種高活性的人肝再生增強(qiáng)因子及其制備方法<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>125<212>PRT<213>智人<400>1Met Arg Thr Gln Gln Lys Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp Cys Pro1 5 10 15Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly Arg His Ser Trp Ala Val Leu His Thr20 25 30Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp Leu Pro Thr Pro Glu Gln Gln Gln Asp35 40 45Met Ala Gln Phe Ile His Leu Phe Ser Lys Phe Tyr Pro Cys Glu Glu50 55 60Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu Cys Arg Asn His Pro Asp Thr65 70 75 80Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu Cys His Leu His Asn Glu85 90 95Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp Cys Ser Lys Val Asp100 105 110Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys Asp115 120 125
<210>2<211>378<212>DNA<213>智人<400>2atgcgtaccc agcagaaacg tgacaccaaa ttccgtgaag actgcccgcc ggaccgtgaa 60gaactgggtc gtcactcttg ggctgttctg cacaccctgg ctgcttacta cccggacctg 120ccgaccccgg aacagcagca ggacatggct cagttcatcc acctgttctc taaattctac 180ccgtgcgaag aatgcgctga agacctgcgt aaacgtctgt gccgtaacca cccggacacc 240cgtacccgtg cttgcttcac ccagtggctg tgccacctgc acaacgaagt taaccgtaaa 300ctgggtaaac cggacttcga ctgctctaaa gttgacgaac gttggcgtga cggttggaaa 360gacggttctt gcgactaa378
權(quán)利要求
1.一種不成熟形式的人肝再生增強(qiáng)因子，其氨基酸序列a)如序列表中的序列1所示；或b)是對(duì)序列表中的序列1所示的序列添加、缺失或取代一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而得的氨基酸序列，并且所述人肝再生增強(qiáng)因子能以中低劑量治療肝損傷。
2.權(quán)利要求1所述的人肝再生增強(qiáng)因子，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。
3.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1或2所述的人肝再生增強(qiáng)因子。
4.權(quán)利要求3所述的核酸分子，其核苷酸序列如序列表中的序列2所示。
5.一種載體，其含有權(quán)利要求3或4所述的核酸分子。
6.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞含有權(quán)利要求5所述的載體，或者所述細(xì)胞已用權(quán)利要求3或4所述的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
7.制備權(quán)利要求1或2所述的人肝再生增強(qiáng)因子的方法，其包括，用權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞表達(dá)權(quán)利要求1或2所述的的人肝再生增強(qiáng)因子，然后分離純化所述人肝再生增強(qiáng)因子。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中宿主細(xì)胞為含有載體pET28-ALR的大腸桿菌BL21(DE3)，其中載體pET28-ALR含有權(quán)利要求4所述的核酸分子。
9.權(quán)利要求7-8之任一所述的方法，其中分離純化所述人肝再生增強(qiáng)因子的步驟包括宿主細(xì)胞裂解變性后，按順序用陽(yáng)離子交換色譜復(fù)性，用分子尺寸排阻色譜純化，用腸激酶酶切，用陰離子交換色譜純化。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中陽(yáng)離子交換色譜是Sepharose FF；和/或，分子尺寸排阻色譜是Sephedex G-25；和/或，陰離子交換色譜是Q-Sepharose Fast Flow。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中腸激酶酶切后進(jìn)一步包括分離去除含His部分的融合蛋白片段的步驟。
12.權(quán)利要求9-11之任一所述的方法，其包括如下步驟1)宿主細(xì)胞裂解變性后，裂解液用Sepharose FF柱復(fù)性，其中采用尿素濃度梯度復(fù)性緩沖液過柱復(fù)性，然后依次分別用含50mM、250mM和500mM咪唑的洗脫液洗脫；2)將上述洗脫液過Sephedex G-25柱去除咪唑及鹽離子；3)用腸激酶酶切，然后將酶切產(chǎn)物過Sepharose FF柱和NTA柱，去除未酶切完全的產(chǎn)物；和4)將上一步的流出液過Q-Sepharose Fast Flow柱純化，用0至1mol/LNaCl梯度洗脫，收集含人肝再生增強(qiáng)因子的洗脫峰。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及一種高活性的人肝再生增強(qiáng)因子。具體而言，本發(fā)明涉及一種不成熟形式(或稱截短型)的人肝再生增強(qiáng)因子，其可用于預(yù)防和/或治療肝損傷，尤其涉及利用中、低劑量的所述人肝再生增強(qiáng)因子來(lái)預(yù)防和/或治療肝損傷。本發(fā)明還涉及所述人肝再生增強(qiáng)因子的制備方法及其編碼核酸等。
文檔編號(hào)C07K1/18GK101066996SQ20071010789
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月22日
發(fā)明者高春芳, 陳捷, 黃應(yīng)峰, 王皓 申請(qǐng)人:上海友恒生物科技有限公司