激光掃描顯微鏡系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了激光掃描顯微鏡系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括：鎖模激光器單元，被配置為發(fā)射具有預定頻率的激光束；間歇發(fā)光單元，被配置為以預定間歇發(fā)光周期間歇地發(fā)出從鎖模激光器單元中發(fā)射的激光束；檢測器，被配置為將熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)換為電信號，該熒光物質(zhì)接收間歇發(fā)出的激光束并且接著從對象中被激發(fā)■’以及A/D轉(zhuǎn)換單元，被配置為以與間歇發(fā)光周期同步的采樣周期采樣電信號。
【專利說明】激光掃描顯微鏡系統(tǒng)
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2013年5月30日提交的日本在先專利申請JP2013-113572的權(quán)益， 其全部內(nèi)容通過引用并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及一種激光掃描顯微鏡系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0004] 例如，在現(xiàn)有技術(shù)中，日本專利第5007092號公開了這樣一種掃描顯微鏡，其包括 掃描對象并且在振蕩脈沖頻率與采樣頻率之間執(zhí)行同步的掃描裝置。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 近幾年，由于利用半導體激光器的ΜΟΡΑ式光源，已經(jīng)開發(fā)了具有100W以上的高輸 出的顯微鏡。然而，在其中生物對象為測量目標的情況下，強大的激光束不幸地損傷生物對 象。
[0006] 為了抑制對生物對象的損傷，降低激光束的平均功率并且增大峰值功率是有效 的。因此，可以考慮通過間歇地發(fā)出激光束來抑制對生物對象的損傷。
[0007] 然而，在激光掃描顯微鏡中，對象中的激發(fā)的熒光物質(zhì)通過諸如ΡΜΤ的檢測器轉(zhuǎn) 換為電信號。然而，當間歇地發(fā)出激光束時，取決于轉(zhuǎn)換后的A/D轉(zhuǎn)換的采樣的獲取的圖像 可能不幸劣化。
[0008] 在日本專利第5007092中，描述了在振蕩脈沖頻率與采樣頻率之間執(zhí)行同步。然 而，未提及執(zhí)行間歇發(fā)光時的間歇發(fā)光周期。此外，在日本專利第5007092號中公開的技術(shù) 中，甚至在執(zhí)行高速采樣與脈沖發(fā)光同步時，并沒有實現(xiàn)提高分辨率并且難以增加信號量。
[0009] 因此，希望在間歇地發(fā)出激光束時通過最佳采樣由對象中激發(fā)熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)換的電 信號來抑制圖像中的劣化。
[0010] 根據(jù)本公開的實施方式，提供一種激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，包括：鎖模激光器單兀， 被配置為發(fā)射具有預定頻率的激光束；間歇發(fā)光單元，被配置為以預定間歇發(fā)光周期間歇 地發(fā)出從鎖模激光器單元中發(fā)射的激光束；檢測器，被配置為將熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)換為電信號，該 熒光物質(zhì)接收間歇地發(fā)出的激光束并且接著從對象中被激發(fā)；以及A/D轉(zhuǎn)換單元，被配置 為以與間歇發(fā)光周期同步的采樣周期采樣電信號。
[0011] 與采樣和間歇發(fā)光相關(guān)的頻率與相位可以是相同的。
[0012] 鎖模激光器單元可以發(fā)射用于雙光子激發(fā)的激光束。
[0013] 向A/D轉(zhuǎn)換單元提供采樣周期的采樣信號以及向間歇發(fā)光單元提供間歇發(fā)光周 期的間歇發(fā)光信號可以是相同的信號。
[0014] 激光掃描顯微鏡系統(tǒng)可以進一步包括：米樣信號產(chǎn)生單兀，被配置為產(chǎn)生向A/D 轉(zhuǎn)換單元提供采樣周期的采樣信號，以及間歇發(fā)光信號產(chǎn)生單元，被配置為產(chǎn)生向間歇發(fā) 光單元提供間歇發(fā)光周期的間歇發(fā)光信號?？梢曰谕粫r鐘產(chǎn)生采樣信號與間歇發(fā)光信 號。
[0015] 鎖模激光器單元或間歇發(fā)光單元可使激光束僅在預定有效發(fā)光周期期間入射到 對象上。
[0016] 激光掃描顯微鏡系統(tǒng)可進一步包括：第一檢測鏡，被配置為在對象的表面的第一 方向上執(zhí)行激光束掃描；第二檢測鏡，被配置為在與對象的表面的第一方向正交的第二方 向上執(zhí)行激光束掃描；以及檢測鏡控制單元，被配置為控制第一檢測鏡和第二檢測鏡。當在 第一方向的掃描完成時，檢測鏡控制單元可以將激光束返回至第一方向的起始位置并且通 過一行激光束在第二方向上執(zhí)行掃描，以及然后可在第一方向上再次執(zhí)行掃描。有效發(fā)光 周期可以為在第一方向執(zhí)行掃描的周期的至少一部分。
[0017] 激光掃描顯微鏡系統(tǒng)可以進一步包括：低通濾波器，被配置為對從檢測器中輸出 的電信號執(zhí)行頻帶限制以及將電信號輸入到A/D轉(zhuǎn)換單元。低通濾波器可以按針對采樣頻 率建立的奈奎斯特采樣定理的方式執(zhí)行頻帶限制。
[0018] 低通濾波器可以按采樣頻率的1/2以下的頻帶限制的方式執(zhí)行頻帶限制。
[0019] 根據(jù)本公開的實施方式，因此，可以在間歇地發(fā)出激光束時通過最佳采樣由對象 中激發(fā)熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)換的電信號來抑制圖像中的劣化。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1是示出根據(jù)本公開實施方式的顯微鏡系統(tǒng)的實例的示意圖；
[0021] 圖2是詳細地示出光源的配置的示意圖；
[0022] 圖3是示出通過間歇發(fā)光增大激光峰值功率時的特征的示圖；
[0023] 圖4是示出顯微鏡主體的配置的示意圖；
[0024] 圖5是示出使用光柵掃描方案產(chǎn)生二維圖像的方法的示意圖；
[0025] 圖6是示出其中采樣周期比間歇發(fā)光周期T短的情況的示意圖；
[0026] 圖7是示出其中采樣周期比間歇發(fā)光周期長的情況的示意圖；
[0027] 圖8是示出其中使得采樣周期與間歇發(fā)光周期T相同的情況的示意圖。

【具體實施方式】
[0028] 下文中，將參照附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。注意，在本說明書和 附圖中，基本具有相同功能和結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)元件將用相同參考號表示，并且這些結(jié)構(gòu)元件的 重復說明將被省略。
[0029] 將按以下順序進行說明。
[0030] 1.顯微鏡系統(tǒng)
[0031] 2.光源的配置的實例
[0032] 3.顯微鏡系統(tǒng)的配置的實例
[0033] 4.采樣周期與間歇發(fā)光周期之間的關(guān)系
[0034] 5.其中使得采樣周期與間歇驅(qū)動周期相同的配置的實例
[0035] 6.低通濾波器的配置
[0036] 7.激光束的光脈沖與激光束的調(diào)制之間同步
[0037] 8.光學分辨率與采樣頻率之間的關(guān)系
[0038] 【1.顯微鏡系統(tǒng)】
[0039] 首先，將參考圖1描述根據(jù)本公開的實施方式的顯微鏡系統(tǒng)。圖1是示出根據(jù)實 施方式的顯微鏡系統(tǒng)的實例的示意圖。顯微鏡系統(tǒng)是用于生物分析的激光掃描顯微鏡，具 體是包括雙光子激發(fā)光源的顯微鏡系統(tǒng)。如圖1所示，顯微鏡系統(tǒng)1000被配置為包括顯微 鏡主體100、光源200、以及控制單元300。
[0040] 顯微鏡主體100被配置為激光掃描顯微鏡并且沿測量樣品的垂直方向、水平方向 以及深度方向三維地掃描測量樣品S以產(chǎn)生對應(yīng)測量樣品S的擴展圖像組的圖像數(shù)據(jù)組。 因此，顯微鏡主體100被配置為包括光電倍增管（PMT)和檢測鏡。稍后將詳細地描述顯微 鏡主體100的配置。
[0041] 光源200使用脈沖激光器并且是被配置為包括激光器（鎖模激光二極管（在下文 中，稱作MLLD))的主振蕩功率放大器（ΜΟΡΑ)式光源，該激光器包括外部諧振器和半導體 光學放大器（S0A)。近幾年，由于利用半導體激光器的ΜΟΡΑ式光源，已經(jīng)開發(fā)了具有100W 以上的高輸出的顯微鏡。光源具有包括低價和小型化的特征。因此，當光源安裝于中間范 圍（middle range)的多光子顯微鏡上時，增大了在廣泛的各種研究組織的應(yīng)用性，并且因 而期望在醫(yī)藥領(lǐng)域有可觀的貢獻。在實施方式中，將描述使用這種ΜΟΡΑ式光源的顯微鏡系 統(tǒng)，具體地，使用雙子激發(fā)光源的顯微鏡系統(tǒng)。
[0042] 控制單元300具有控制顯微鏡主體100和光源200的功能。稍后將詳細地描述控 制單元300的配置。
[0043] 【2.光源的配置的實例】
[0044] 圖2是詳細地示出光源200的配置的示意圖。光源200被配置為包括Μ0ΡΑ210 和波長轉(zhuǎn)換模塊（〇?〇)250，在1?^4210中，鎖模振蕩式激光器和光學放大器組合。1?^4210 包括：鎖模激光器單元（鎖模激光二極管）220、光學隔離器單元230、以及光學放大器單元 (S0A 單元）240。
[0045] 圖2的下部示出了從鎖模激光器單元220、光學放大器單元240以及波長轉(zhuǎn)換模塊 250輸出的激光束的脈沖波形LI、L2和L3以及下面描述的用于間歇驅(qū)動的脈沖波形。
[0046] 鎖模激光器單元220被配置為包括：半導體激光器222以及元件，S卩，穿過從半導 體激光器222發(fā)射的激光束的透鏡224、帶通濾波器226、以及鏡（mirror) 228。帶通濾波 器226的功能是透射給定波長范圍內(nèi)的光并且不透射范圍外的光。外部諧振器（空間諧振 器）被配置于半導體激光器222的后側(cè)鏡與鏡228之間，并且從鎖模激光器單元220發(fā)射 的激光束的頻率是由外部諧振器的路徑長度決定的。因而，由于可將激光束的頻率強制鎖 定為特定頻率，所以可鎖定激光束的模式。
[0047] 鎖模激光器單元220可通過配置外部諧振器將短脈沖與比常規(guī)半導體激光器長 的周期（例如，約1GHz)同步。因此，從鎖模激光器單元220輸出的激光束L1具有低平均 功率和高峰值，并且從而對生物對象的損傷變小并且光子效率變高。
[0048] 光學隔離器單元230布置于鎖模激光器單元220的后級。光學隔離器單元230被 配置為包括光學隔離器232與鏡234。光學隔離器單元230具有防止從后級上的光學部件 等反射的光入射到半導體激光器222上的功能。
[0049] 光學放大器單元（S0A單元）240用作光學調(diào)制單元，其放大并調(diào)制從半導體激光 束222發(fā)射的激光束并且布置于光學隔離單元230的后級。因為從鎖模激光器單元220輸 出的激光束具有相對較小的功率，所以通過光學放大單元240放大激光束。光學放大單元 240被配置為包括半導體光學放大器（SOA)，即，半導體光學放大器242以及控制半導體光 學放大器242的SOA驅(qū)動器244。半導體光學放大器242是小型并低成本的光學放大器并 可用作光閘以及打開光和關(guān)閉光的光開關(guān)。在實施方式中，通過半導體激光學放大器242 的開（ON)和關(guān)（OFF)調(diào)制從半導體激光器222發(fā)射出的激光束。
[0050] 在光學放大器單元（S0A單元）240中，根據(jù)控制電流（直流）的量級放大激光束。 此外，光學放大器單元240在放大時通過由圖2所示的脈沖波形P1的控制電流以預定周 期T執(zhí)行間歇驅(qū)動打開和關(guān)閉具有脈沖波形L1的激光束并且輸出間歇激光束（脈沖波形 L2)。通過以這種方式產(chǎn)生具有期望時序和周期的脈沖波形，可以實現(xiàn)與系統(tǒng)具有的控制信 號的同步。因此，例如，在ΜΟΡΑ式光源的情況下，通過在放大前級上的振蕩單元的脈沖的后 級上的半導體光學放大器242 (其中，半導體光學放大器縮寫為S0A)中執(zhí)行間歇驅(qū)動能夠 實現(xiàn)間歇驅(qū)動。在ΜΟΡΑ式光源的情況中，光學放大器單元240(半導體光學放大器242)用 作間歇發(fā)光單元。
[0051] 在實施方式中，因為使用MLLD，例如，從半導體激光器222輸出的激光束的頻率是 在約500MHz至約1GHz的范圍內(nèi)并且其脈沖寬度在0. 5[ps]至約1. 0[ps]的范圍內(nèi)。正如 下述，除與S0A單元的間歇驅(qū)動的同步之外，通過注入來自振蕩同步信號注入單元316的 傳輸同步信號，從半導體激光器222輸出的振蕩脈沖也可與系統(tǒng)具有的控制信號同步。并 且，當使用TiSa時，激光束的振蕩頻率在約40MHz至約80MHz的范圍內(nèi)并且其脈沖寬度在 0. l[ps]至約0.2 [ps]的范圍內(nèi)。另一方面，通過使用MLLD，可以輸出具有高振蕩頻率的激 光束。
[0052] 在實施方式中，例如，從光學放大器單元240輸出的激光束的波長是405nm。因為 405nm的波長是光吸收較大的波長，波長高密度被轉(zhuǎn)換為到達生物對象內(nèi)部并且產(chǎn)生具有 雙光子效應(yīng)的波長（約900nm至約1300nm)。因此，從光學放大器單元240輸出的激光束被 輸入至后級上的波長轉(zhuǎn)換模塊250以便其波長被波長轉(zhuǎn)換模塊250的LB0252轉(zhuǎn)換。
[0053] 例如，波長轉(zhuǎn)換模塊250的LB0252將輸入激光束（脈沖波形L2)轉(zhuǎn)換成兩個波長。 接下來，從波長轉(zhuǎn)換模塊250中輸出兩個轉(zhuǎn)換的波長中具有更長的波長的激光束（脈沖波 形L3)。在實施方式中，波長轉(zhuǎn)換模塊250不是必不可少的構(gòu)成部件并且也可使用從光學放 大器單元240輸出的激光束作為最終的光照射對象（測量樣品S )。
[0054] 順便提及，在利用激光顯微鏡觀察生物對象中，為了降低對對象的損傷，降低激光 的平均功率并且增大激光的峰值功率是有效的。并且，包含在使用半導體激光器的ΜΟΡΑ式 光源中的激光器芯片尺寸小，并且因此，考慮由于由高功率的負載引起的發(fā)熱施加操作限 制。
[0055] 因為根據(jù)實施方式的光源200輸出間歇激光束（脈沖波長L2)并且執(zhí)行間歇操 作，所以與未執(zhí)行間歇操作的情況相比，盡管平均功率相同，但也能夠增加發(fā)光時的峰值。 并且，通過執(zhí)行間歇操作，可以抑制由高功率的負載引起的發(fā)熱。
[0056] 在實施方式中，用作雙光子激發(fā)光源200的光源200激發(fā)具有雙光子的熒光物質(zhì)。 具體地，在使用雙光子激發(fā)光源的顯微鏡中，已知品質(zhì)因數(shù)F0M(=(峰值功率） 2Χ脈沖寬 度X頻率=峰值功率X平均功率）。根據(jù)品質(zhì)因數(shù)，輸出可與峰值功率和平均功率的乘積 成比例地增加。因此，在利用激光顯微鏡觀察生物對象中，為了將對對象的損傷抑制到盡可 能小并且增大輸出，降低平均功率并且增大峰值功率是有效的。因此，在實施方式中，通過 執(zhí)行間歇操作降低占空比（占空比=脈沖寬度X頻率）并且增大峰值功率。
[0057] 圖3是示出通過間歇發(fā)光增大激光峰值功率時的特征的示圖。圖3的上部示出單 光子激發(fā)情況下的特征。上部左側(cè)的特征顯示連續(xù)發(fā)光的峰值功率以及其右側(cè)的特征顯示 當占空比設(shè)置為50%時間歇發(fā)光的峰值功率。因此在間歇發(fā)光的情況中，當間歇發(fā)光的占 空比設(shè)置為50%時，能夠輸出連續(xù)發(fā)光的信號強度（U的兩倍的信號強度（2XIJ。
[0058] 圖3的中部示出雙光子激發(fā)的情況中的特征。左側(cè)的特征顯示連續(xù)發(fā)光的峰值功 率以及右側(cè)的特征顯示當占空比設(shè)置為50%時間歇發(fā)光的峰值功率。在雙光子激發(fā)的情況 中，品質(zhì)因數(shù)F0M按峰值功率的平方增加。因此，在間歇發(fā)光的情況中，雙光子激發(fā)的信號 強度（=4X1/)是連續(xù)發(fā)光的信號強度（=I/)的四倍。另外，甚至在脈沖發(fā)光點和脈沖 非發(fā)光點的平均信號強度中，雙光子激發(fā)的平均信號強度（=2X1/)是連續(xù)發(fā)光的信號強 度（=1〇 2)的兩倍。因此，在實施方式中，通過在雙光子激發(fā)光源200中執(zhí)行間歇驅(qū)動，可 以增大峰值功率和平均信號強度。
[0059] 圖3的下部的特征示出將中部的特征經(jīng)由頻帶限制的低通濾波器（圖1中示出的 低通濾波器（LPF) 318)而獲得的信號。在A/D轉(zhuǎn)換之前執(zhí)行頻帶限制的低通濾波器執(zhí)行 的處理。因此，當開/關(guān)的占空比為50% (1/2)時，A/D轉(zhuǎn)換之前的信號幅度變成1/2。因 此，在雙光子激發(fā)的間歇發(fā)光中能夠獲得2倍的信號幅度。并且，當開/關(guān)的占空比為1/n 并且峰值功率變成η倍時，通過雙光子激發(fā)獲得變成η倍的信號幅度。因此，占空比優(yōu)選較 小。然而，在實踐中，因為從光源200所獲得的峰值功率存在上限，所以適當選擇等于或小 于1的適當值作為占空比。
[0060] 【3.顯微鏡系統(tǒng)的配置的實例】
[0061] 稍后將參照圖4描述顯微鏡主體100的配置。圖4示出了使用兩種檢測鏡的共焦 熒光顯微鏡的配置的實例。顯微鏡主體100通過兩個檢測鏡在目標樣品S上二維地執(zhí)行光 束掃描。
[0062] 從光源200發(fā)射的激發(fā)光通過安裝在諸如透鏡的光學系統(tǒng)中以及共軛位置處的 小孔，并隨后通過傳遞激發(fā)光并且反射熒光的二向色鏡。已經(jīng)通過二向色鏡的激發(fā)光穿過 諸如透鏡的光學系統(tǒng)以便X坐標由控制測量樣品的X方向的掃描的X方向檢測鏡120控制， 以及Υ坐標接著由控制Υ方向掃描的Υ方向檢測鏡130控制，然后通過物鏡聚光在測量樣 品S上的期望ΧΥ坐標處。
[0063] 從測量樣品發(fā)出的熒光被Υ方向檢測鏡130和X方向檢測鏡120反射，跟蹤與激 發(fā)光相同的路徑并且被二向色鏡反射。由二向色鏡反射的熒光穿過安裝在共軛位置處的小 孔并隨后被引導至諸如光電倍增管（ΡΜΤ)的檢測器110。
[0064] 這里，用于控制測量樣品的聚光位置的兩個檢測鏡的旋轉(zhuǎn)軸被連接至鏡，如圖4 示意性所示。在檢測鏡120和130中，根據(jù)輸入電壓的量級控制旋轉(zhuǎn)軸的旋轉(zhuǎn)量并且可以 高速和高精度改變鏡面面對的角度。
[0065] 圖4示出單光子激發(fā)的情況。在雙光子激發(fā)的情況中，因為沒必要使光通過檢測 鏡和小孔，所以從測量樣品發(fā)出的熒光可被引導至安裝在物鏡的后級的諸如光電倍增管 (ΡΜΤ)的檢測器。
[0066] 在圖4示出的激光掃描顯微鏡中，根據(jù)兩個檢測鏡120和130的操作方法的組合 掃描測量樣品的XY平面時激發(fā)光移動的方式是不同的。在下文中，將參照圖5描述使用光 柵掃描方案的二維圖像的生成方法，光柵掃描方案是最普通的掃描方案。在光柵掃描方案 的情況下，用X方向檢測鏡120在水平方向上執(zhí)行掃描并且返回到檢測器110的返回光在 將設(shè)定為圖像信息的中心部分而不是返回的附近采樣。
[0067] 例如，在下面的描述中，在其上限定圖5中示出的坐標系統(tǒng)的測量樣品S的樣品平 面上，假設(shè)控制X方向上的掃描的檢測鏡120的操作速度比控制Y方向上的掃描的檢測鏡 130的操作速度更快。
[0068] 在圖5的上部中示出的圖示意性地示出在假設(shè)樣品平面的左上位置為掃描的起 始點時激發(fā)光如何在XY方向上移動。
[0069] 在光柵掃描方案中，如圖5中的測量樣品S的樣品平面所示，在旋轉(zhuǎn)X方向檢測鏡 120期間執(zhí)行熒光的檢測（圖像的獲取）以便激發(fā)光在X方向上從樣品平面的左端移動至 右端。在光柵掃描方案中，在X方向檢測鏡120操作期間Y方向檢測鏡130停止。
[0070] 基本上，當激發(fā)光到達樣品平面的右端時，熒光的檢測暫停并且X方向檢測鏡120 改變旋轉(zhuǎn)軸的旋轉(zhuǎn)角度直至對應(yīng)于左端的位置。在此期間，Y方向檢測鏡130以一行在Y軸 正方向上移動一步。當這種操作重復行數(shù)時并且激發(fā)光到達樣品平面的右下處時，X方向 檢測鏡120和Y方向檢測鏡130通過大幅旋轉(zhuǎn)每個旋轉(zhuǎn)軸將位置返回至掃描的起始位置以 便產(chǎn)生一個二維圖像（幀）。
[0071] 在這樣的光柵掃描方案中，在X方向檢測鏡120操作的同時Y方向檢測鏡130停 止。因此，其中形成所產(chǎn)生的二維圖像的單位（圖像形成單位）的形狀是圖5的上部示出 的矩形形狀。
[0072] 圖5的下部示出的曲線圖是顯示Y坐標如何隨著時間而變化的時序圖。當、^是 獲得一幀圖像的所必需的時間時，時間被表示為以下等式11，如從圖5的下部中的時序圖 中顯而易見。這里，在以下等式11中，Τ_ η表示一個掃描時期，Ny表示Y方向上行的數(shù)量， 以及TY all表示Y方向上的返回時間。
[0073] Tframe = (TSCJ XNy+TY all…（等式 11)
[0074] 這里，掃描周期Ts_，有效掃描時間Trff，以及返回時間T badt具有以下等式12中表 達的關(guān)系。當Ty是Y方向中一行移動時間時，Y方向上的返回時間T Y all被表示為以下等式 13。這里，以下等式12中的返回時間Tbadt表示從有效掃描區(qū)（例如，圖5的上部中的樣品 平面上X方向中的實線表示的區(qū)）的末端移動到下一個周期的有效掃描區(qū)的起始點所必須 的總時間。
[0075] Teff = Ts_-Tback...(等式 12)
[0076] TY all = TyXN/··(等式 13)
[0077] 例如，將考慮在X方向的檢測鏡120的掃描頻率匕_是7. 8kHz的情況。在這種情 況中，掃描周期Tsean被表達為掃描頻率Fsean的倒數(shù)，T s_ = 1/Fsean = 1. 28X ΚΓ4秒。并且， 當該檢測鏡的有效掃描時間Teff基于掃描頻率被表示為{:掃描周期T S_X (1/3)}時，有效 掃描時間是4· 27ΧΚΓ5秒以及返回時間Tback是1. 28ΧΚΓ4 - 4· 27ΧΚΓ5 = 8· 53ΧΚΓ5秒。
[0078] 并且，當Y方向檢測鏡130在Y方向的返回時間Ty是1 X ΚΓ6并且Y方向上行的 數(shù)量Ny為512,從上述等式11可知拍攝一幀所必須的時間T fMe是6. 62X ΚΓ2秒。因為在 這樣的掃描系統(tǒng)中，幀速率表示為的倒數(shù)的值，幀速率=15. 1 (幀/s)。
[0079] 在圖5中示出的光柵掃描方案中，如圖5的上部中的樣品平面所示，在X方向檢測 鏡120旋轉(zhuǎn)并且激發(fā)光在X方向從樣品平面的左端移動至右端的周期中，使光源200僅在 有效掃描時間T rff發(fā)出光。就是說，在X方向的雙程掃描中，僅在獲取到圖像的有效掃描時 間Trff期間打開光源200并且在除了有效掃描時間I； ff之外的期間和方向改變期間關(guān)閉電 源。在這時，以約50Hz至約10kHz的范圍內(nèi)的頻率執(zhí)行光源200的開/關(guān)。因此，因為通 過使光源200僅在有效掃描時間T rff期間使光源200發(fā)出光而周期性地發(fā)光以及通過上述 脈沖波形P1的間歇驅(qū)動，可降低激光器的平均功率并增大峰值功率。
[0080] 另外，當顯微鏡主體100不是圖像獲取模式時，假設(shè)關(guān)閉光源200。在此時，可通過 關(guān)閉光學放大器單元240關(guān)閉光源200或者可關(guān)閉MLLD本身。
[0081] 【4.采樣周期和間歇發(fā)光周期之間的關(guān)系】
[0082] 諸如檢測光子的光電倍增管（PMT)的檢測器110是模擬元件并將所引入的光子光 電地轉(zhuǎn)換為電信號（電流值或電壓值）。所轉(zhuǎn)換的電信號經(jīng)受預定采樣周期的A/D轉(zhuǎn)換。 經(jīng)受A/D轉(zhuǎn)換的信號對應(yīng)一個像素圖像信息。圖6至圖8是示出采樣周期以及脈沖波形P1 的間歇發(fā)光周期T的特征的示圖。
[0083] 圖6示出了采樣周期比間歇發(fā)光周期T短的情況。換言之，圖6示出了采樣頻率 比間歇發(fā)光頻率高的情況。在圖6的下部的特征中，實線表示的特征代表由檢測器100執(zhí) 行光電轉(zhuǎn)換之后的電信號以及虛線表示連接采樣值的特征。在這種情況中，因為在非發(fā)光 時間執(zhí)行采樣，即，非激發(fā)時間，在某些情況下，所獲得的圖像是明暗在相鄰像素中交替的 圖像（斑點模樣圖像，即，所謂的牙缺損的圖像）。
[0084] 圖7示出了采樣周期比間歇發(fā)光周期T長的情況。換言之，圖7示出了采樣頻率 比間歇發(fā)光頻率低的情況。如圖6所示一樣，實線表示的特征代表由檢測器100執(zhí)行光電 轉(zhuǎn)換之后的電信號以及虛線表示連接采樣值的特征。在這種情況中，光電轉(zhuǎn)換后的電信號 包括頻率高于采樣頻率的電信號。因此，盡管電信號最初是恒定電平信號，對各種值進行采 樣，因而正確的波形可能由于混迭的影響不會再現(xiàn)。因而，當采樣周期與間歇發(fā)光周期T異 步時，信號電平不恒定。并且，當采樣周期與間歇發(fā)光周期T同步時，原始信號電平恒定。然 后，在異步情況中，由于不必要的激發(fā)出現(xiàn)褪色。當觀察生物對象時，也可能出現(xiàn)諸如不必 要的激發(fā)、待觀察的細胞等的滅絕的不利影響。
[0085] 圖8示出使得采樣周期與間歇發(fā)光周期T相同的情況。S卩，圖8示出了采樣頻率 與間歇發(fā)光頻率相同的情況。在圖8中，使得相位相同以便在間歇發(fā)光周期T的峰值處執(zhí) 行采樣。因而，當采樣周期與間歇發(fā)光周期T同步時，可獲得正確的信號并且褪色也可被抑 制到盡可能的小。
[0086] 例如，采樣頻率fs是在約100kHz至約10MHz的范圍內(nèi)?；旧?，從顯微鏡系統(tǒng) 1000的規(guī)格確定采樣頻率fs并使得間歇發(fā)光頻率與采樣頻率fs相同。另一方面，可以先 確定間歇發(fā)光頻率并且可使得采樣頻率與間歇發(fā)光頻率相同。
[0087] 并且，除了以上說明以外的脈沖發(fā)光，掃描束的開/關(guān)信號、或者圖像獲取的開/ 關(guān)信號也優(yōu)選地與A/D轉(zhuǎn)換的采樣周期同步，但并非必須同步。
[0088] 為了使采樣周期與間歇發(fā)光周期T同步，認為圖1的光學放大器單元240的開/關(guān) 周期與對檢測器11〇(諸如光電倍增管（PMT))所檢測的電信號執(zhí)行A/D轉(zhuǎn)換的A/D轉(zhuǎn)換電 路的采樣周期相同。即，通過SOA驅(qū)動器244無變化地向A/D轉(zhuǎn)換電路輸入相同的開/關(guān) 時鐘，可以可靠地使采樣周期與間歇發(fā)光周期T相同。因而，使得與采樣和間歇發(fā)光有關(guān)的 頻率和相位相同。
[0089] 如圖2所示，從波長轉(zhuǎn)換模塊250輸出的激光束L3在間歇發(fā)光的發(fā)光周期內(nèi)以脈 沖形狀發(fā)出。圖8示出在將脈沖處理成低通濾波器（圖1示出的低通濾波器318)看不見 的脈沖的程度之后的光發(fā)射。在這時，如以下詳細地描述，低通濾波器的頻帶限制優(yōu)選地等 于或小于采樣頻率的1/2。例如，當采樣頻率是1MHz時，將低通濾波器的頻帶限制設(shè)置為最 大500kHz。這樣，可以設(shè)立奈奎斯特采樣定理。因此，允許采樣周期與間歇驅(qū)動周期之間的 相位偏移。
[0090] 【5.使得采樣周期與間歇驅(qū)動周期相同的配置的實例】
[0091] 接下來，將參考圖1描述使得采樣周期和間歇驅(qū)動周期相同的配置。如圖1所示， 控制單元300被配置為包括：定時生成器302、采樣信號生成單元304、A/D轉(zhuǎn)換單元306、存 儲器308、電束控制單元310、D/A轉(zhuǎn)換單元312、間歇發(fā)光信號生成單元314、振蕩同步信號 注入單元316以及低通濾波器（LPF) 318。
[0092] 如圖1所示，定時生成器302生成時鐘CLK并且采樣信號生成單元304基于時鐘 CLK生成具有采樣頻率fs的采樣信號。并且，間歇發(fā)光信號生成單元314基于時鐘CLK生 成具有間歇發(fā)光的周期T的間歇發(fā)光信號。因而，能夠使得通過采樣信號生成單元340生 成的采樣信號與通過間歇發(fā)光信號生成單元314生成的間歇發(fā)光信號同步。例如，當采樣 信號生成單元304將時鐘CLK用作采樣頻率fs而無改變并且間歇發(fā)光信號生成單元314 將時鐘CLK用作間歇發(fā)光信號的頻率而無改變時，采樣周期與間歇發(fā)光周期T變得相同。
[0093] 通過檢測器110的光電轉(zhuǎn)換獲得的電信號被輸入至低通濾波器318。如上所述，低 通濾波器318對輸入信號執(zhí)行頻帶限制以便建立奈奎斯特采樣定理，并且將信號輸出至A/ D轉(zhuǎn)換單元306。A/D轉(zhuǎn)換單元306以采樣頻率fs對輸入信號執(zhí)行A/D轉(zhuǎn)換。S0A驅(qū)動器 244以間歇發(fā)光信號的頻率打開及關(guān)閉激光束（脈沖波形L1)并且輸出間歇激光束（脈沖 波形L2)。
[0094] 并且，電束控制單元310從定時生成器302接收時鐘信號CLK的輸入并生成檢測 鏡控制信號以控制檢測鏡120和130。檢測鏡控制信號經(jīng)受D/A轉(zhuǎn)換單元312的D/A轉(zhuǎn)換， 并且經(jīng)受D/A轉(zhuǎn)換的檢測鏡控制信號控制檢測鏡120和130。因而，也可基于時鐘CLK控 制檢測鏡120和130。如上所述，在光柵掃描方案中，使光源200僅在有效掃描時間T rff發(fā) 光。因此，間歇發(fā)光信號生成單兀314基于時鐘CLK僅在光柵掃描的有效掃描時間Teff生 成間歇發(fā)光信號并在除了有效掃描時間T rff以外時間的期間關(guān)閉間歇發(fā)光信號。同樣地， 采樣信號生成單元304基于時鐘CLK僅在有效掃描時間Teff生成采樣信號。因此，采樣信 號和間歇發(fā)光信號在檢測鏡的操作周期變得同步。因此，通過在除了有效掃描時間T eff以 外的時間期間關(guān)閉采樣信號和間歇發(fā)光信號，能夠降低平均功率并且因而增加峰值功率。
[0095] 【6.低通濾波器的配置】
[0096] 安裝在A/D轉(zhuǎn)換單元306的前級的低通濾波器318執(zhí)行檢測器（PMT) 110的輸出 的頻帶限制為滿足奈奎斯特采樣定理的頻率。更具體地，低通濾波器318執(zhí)行檢測器110 的輸出的頻帶限制為采樣頻率的1/2至1/3的頻率。例如，當采樣頻率為1GHz時，檢測器 110的輸出將經(jīng)受約300kHz至約500kHz的頻帶限制。當采樣頻率可變時，低通濾波器318 的頻帶也與采樣頻率成比例地變化。
[0097] 通過對檢測器110的輸出執(zhí)行滿足奈奎斯特采樣定理的頻率的頻帶限制，可以可 靠地防止采樣結(jié)果中包含不必要的信號并且因而可靠地改善圖像的再現(xiàn)。
[0098] 【7.激光束的振湯光脈沖與激光束的調(diào)制之間的冋步】
[0099] 接下來將描述激光束的振蕩光脈沖與間歇發(fā)光信號的周期之間的關(guān)系。在實施方 式中，激光束的振蕩光脈沖也可與定時生成器302的時鐘CLK同步。
[0100] 從鎖模激光器單元220發(fā)射出的激光束的振蕩頻率是由光速和上述外部諧振器 的路徑長度決定的。從定時生成器302注入的信號也被視為具有與諧振器的頻率幾乎相同 的頻率。然而，通過提供通過來自振蕩同步信號注入單元316的傳輸同步信號的注入系統(tǒng) 所具有的相位信息，可以將系統(tǒng)具有的相位信息與外部諧振器同步。
[0101] 因此，振蕩同步信號注入單元316基于定時生成器302的時鐘信號CLK將與時鐘 CLK同步的振蕩同步信號發(fā)送至偏置Tee的電容器。提供振蕩同步信號作為半導體激光器 222的增益電流Ig的AC成分。
[0102] 因為提供與時鐘CLK同步的振蕩同步信號作為半導體激光器222的增益電流Ig 的AC成分，從半導體激光器222發(fā)射的激光束的振蕩光脈沖可與時鐘CLK同步。
[0103] 如上所述，振蕩同步信號注入單元316為半導體激光器222供應(yīng)與時鐘CLK同步 的振蕩同步信號。因而，可以將從半導體激光器222發(fā)射的激光束的振蕩光脈沖與時鐘CLK 同步。
[0104] 如上所述，間歇發(fā)光信號生成單元314基于時鐘CLK為間歇發(fā)光生成間歇發(fā)光信 號并使用間歇發(fā)光信號驅(qū)動光學放大器單元240,在與時鐘CLK同步中打開及關(guān)閉待驅(qū)動 的光學放大器單元240并且在與時鐘CLK同步中調(diào)制激光束。因而，可以將從半導體激光 器222發(fā)射的激光束的振蕩光脈沖與激光束的調(diào)制同步。因而，甚至在激光束具有相當高 的脈沖光頻率時，可以容易地將激光束的振蕩光脈沖與激光束的調(diào)制同步并且從而獲取期 望的圖像。
[0105] 另外，通過振蕩同步信號注入單元316的激光束的振蕩光脈沖的同步是任意的， 并且可以不執(zhí)行同步。具體地，當激光束的振蕩光脈沖的周期與間歇發(fā)光信號的周期顯著 不同時，可以獲取期望圖像而不執(zhí)行同步。
[0106] 【8.光分辨率與采樣頻率之間的關(guān)系】
[0107] 激光掃描顯微鏡的分辨率是由與激發(fā)光源的波長λ [m]成比例的光分辨率決定 的。估計光分辨率為do為λ/2〇Γ〇.61*λ。然而，出于簡化，當使用λ/2時，在"λ = lOOOnm"的情況下光分辨率do = 500nm。當光電轉(zhuǎn)換元件的頻帶沒有限制時，電分辨率de 是由光束速度v[m/s]和采樣頻率fs[l/s]決定的。
[0108] 在電分辨率de中，通過奈奎斯特采樣定理的采樣間隔[m] = v/fs的1/2,并且因 而，能夠計算電分辨率"de = V(2*fs) "。
[0109] 能夠從掃描束往復頻率與掃描范圍計算光束速度v[m/s]。因此，當基于500Hz的 往復頻率和1mm的掃描范圍執(zhí)行計算作為代表數(shù)時，通過在周期2ms的一半的lms處掃描 1mm的范圍獲得"v = l[m/s] "。
[0110] 因此，電分辨率 de 在"fs = 1MHz" 處變成"de = l[m/sV(2*lE+6[l/2])= 500nm"，并且因而與光分辨率do相同。
[0111] 如上所述，甚至當使得光束速度快10倍時，10MHz對于采樣頻率足夠，并且其可理 解成使得采樣頻率變得任意更快是不存在優(yōu)勢的。因此，在日本專利第5007092號中，難以 獲得在實施方式中描述的優(yōu)勢。甚至在與脈沖發(fā)光同步執(zhí)行高速采樣時，沒有提高分辨率 并且也難以增加信號量。
[0112] 根據(jù)實施方式，如上所述，通過從光源200間歇地發(fā)射激光束，間歇發(fā)光的周期被 配置為與從檢測器100所獲得的圖像的電信號的采樣周期相同。因而，可以可靠地防止獲 取斑點模樣圖像（patched pattern-like image),即，牙缺損的圖像。并且，可以可靠地防 止正確的波形由于混迭的影響而不再現(xiàn)。此外，因為能夠抑制激光束的不必要的激發(fā)，也可 以防止諸如由于光毒性而出現(xiàn)待觀察的細胞等的滅絕的不利影響。
[0113] 已參考附圖詳細地描述了本公開的優(yōu)選實施方式，但本公開的實施方式不限于本 公開的技術(shù)范圍。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是在權(quán)利要求書中限定的技術(shù)范圍內(nèi)可以 出現(xiàn)各種修改或修正并且當然應(yīng)理解屬于本公開的技術(shù)范圍。
[0114] 另外，本技術(shù)還可配置如下。
[0115] (1) 一種激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，包括：
[0116] 鎖模激光器單元，被配置為發(fā)射具有預定頻率的激光束；
[0117] 間歇發(fā)光單元，被配置為在預定間歇發(fā)光周期中間歇地發(fā)出從鎖模激光器單元發(fā) 射的激光束；
[0118] 檢測器，被配置為將熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)換為電信號，熒光物質(zhì)接收間歇發(fā)出的激光束并 且然后從對象中被激發(fā)；以及
[0119] A/D轉(zhuǎn)換單元，被配置為以與間歇發(fā)光周期同步的采樣周期對電信號采樣。
[0120] (2)根據(jù)（1)的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，其中，與采樣和間歇發(fā)光相關(guān)的頻率和相位 是相同的。
[0121] (3)根據(jù)（1)的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，其中，鎖模激光器單兀發(fā)射用于雙光子激發(fā) 的激光束。
[0122] (4)根據(jù)⑴的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，其中，向A/D轉(zhuǎn)換單元提供采樣周期的采樣 信號以及向間歇發(fā)光單元提供間歇發(fā)光周期的間歇發(fā)光信號可以是相同的信號。
[0123] (5)根據(jù)（1)的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，進一步包括：
[0124] 采樣信號生成單元，被配置為生成向A/D轉(zhuǎn)換單元提供采樣周期的采樣信號；以 及
[0125] 間歇發(fā)光信號生成單元，被配置為生成向間歇發(fā)光單元提供間歇發(fā)光周期的間歇 發(fā)光信號，
[0126] 其中，基于相同的時鐘產(chǎn)生采樣信號與間歇發(fā)光信號。
[0127] (6)根據(jù)（1)的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，其中，鎖模激光器單元或間歇發(fā)光單元僅在 預定有效發(fā)光周期期間使激光束入射到對象上。
[0128] (7)根據(jù)（6)的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，進一步包括：
[0129] 第一檢測鏡，被配置為在對象的表面的第一方向上利用激光束執(zhí)行掃描；
[0130] 第二檢測鏡，被配置為在與對象的表面的第一方向正交的第二方向上利用激光束 執(zhí)行掃描；以及
[0131] 檢測鏡控制單元，被配置為控制第一檢測鏡和第二檢測鏡，
[0132] 其中，當在第一方向的掃描完成時，檢測鏡控制單元將激光束返回至第一方向的 起始位置并且通過激光束的一行來在第二方向上執(zhí)行掃描并且然后在第一方向上再次執(zhí) 行掃描，以及
[0133] 其中，有效發(fā)光周期是在第一方向執(zhí)行掃描的周期的至少一部分。
[0134] (8)根據(jù)（1)的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，進一步包括：
[0135] 低通濾波器，被配置為對從檢測器中輸出的電信號執(zhí)行頻帶限制以及將電信號輸 入到A/D轉(zhuǎn)換單元，
[0136] 其中，低通濾波器以為采樣頻率建立奈奎斯特采樣定理的方式執(zhí)行頻帶限制。
[0137] (9)根據(jù)（8)的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，其中，低通濾波器以頻帶限制等于或小于 1/2的采樣頻率的方式執(zhí)行頻帶限制。
【權(quán)利要求】
1. 一種激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，包括： 鎖模激光器單元，被配置為發(fā)射具有預定頻率的激光束； 間歇發(fā)光單元，被配置為以預定間歇發(fā)光周期間歇地發(fā)出從所述鎖模激光器單元發(fā)射 的所述激光束； 檢測器，被配置為將熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)換為電信號，所述熒光物質(zhì)接收間歇發(fā)出的所述激光 束并且接著從對象中被激發(fā)；以及 A/D轉(zhuǎn)換單元，被配置為以與所述間歇發(fā)光周期同步的采樣周期采樣所述電信號。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，其中，與所述采樣和所述間歇發(fā)光相 關(guān)的頻率和相位均是相同的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，其中，所述鎖模激光器單元發(fā)射用于 雙光子激發(fā)的所述激光束。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，其中，向所述A/D轉(zhuǎn)換單元提供所述采 樣周期的采樣信號與向所述間歇發(fā)光單元提供所述間歇發(fā)光周期的間歇發(fā)光信號是相同 信號。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，進一步包括： 采樣信號生成單元，被配置為生成向所述A/D轉(zhuǎn)換單元提供所述采樣周期的采樣信 號；以及 間歇發(fā)光信號生成單元，被配置為生成向所述間歇發(fā)光單元提供所述間歇發(fā)光周期的 間歇發(fā)光信號， 其中，基于同一時鐘生成所述采樣信號與所述間歇發(fā)光信號。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，其中，所述鎖模激光器單元或所述間 歇發(fā)光單元僅在預定有效發(fā)光周期期間使所述激光束入射到所述對象上。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，進一步包括： 第一檢測鏡，被配置為在所述對象的表面的第一方向上利用所述激光束執(zhí)行掃描； 第二檢測鏡，被配置為在與所述對象的所述表面的所述第一方向正交的第二方向上利 用所述激光束執(zhí)行掃描；以及 檢測鏡控制單元，被配置為控制所述第一檢測鏡和所述第二檢測鏡， 其中，當在所述第一方向的所述掃描完成時，所述檢測鏡控制單元將所述激光束返回 至所述第一方向的起始位置并且通過一行所述激光束在所述第二方向上執(zhí)行所述掃描，并 且接著在所述第一方向上再次執(zhí)行所述掃描，以及 其中，所述有效發(fā)光周期是在所述第一方向執(zhí)行所述掃描的周期的至少一部分。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，進一步包括： 低通濾波器，被配置為對從所述檢測器中輸出的所述電信號執(zhí)行頻帶限制以及將所述 電信號輸入到所述A/D轉(zhuǎn)換單元， 其中，所述低通濾波器以為所述采樣的頻率建立奈奎斯特采樣定理的方式執(zhí)行所述頻 帶限制。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，其中，所述低通濾波器以所述頻帶限 制等于或小于1/2的所述采樣頻率的方式執(zhí)行所述頻帶限制。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，進一步包括： 光學調(diào)制單元，被配置為根據(jù)控制電流的量級來放大從所述鎖模激光器單元發(fā)射的所 述激光束。
【文檔編號】G02B21/00GK104215612SQ201410223168
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月30日
【發(fā)明者】藤田五郎, 原雅明 申請人:索尼公司