專利名稱：基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于激光共聚焦成像領(lǐng)域，涉及一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中
樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方法。
背景技術(shù)：
氯離子是機(jī)體內(nèi)最豐富的陰離子。調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外氯離子濃度的氯通道廣泛存在于 機(jī)體的細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜。氯通道在細(xì)胞多種活動(dòng)和調(diào)節(jié)過程如細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞興奮 性調(diào)節(jié)、pH調(diào)節(jié)、容量調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答中均發(fā)揮重要作用。因此，氯離子穩(wěn)態(tài)是維持細(xì)胞各 項(xiàng)代謝活動(dòng)的必要條件， 一旦氯離子穩(wěn)態(tài)被破壞，細(xì)胞就會(huì)受到功能性或器質(zhì)性損害甚至 死亡。 激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)是近年推出的集激光技術(shù)、電子技術(shù)、光學(xué)設(shè)計(jì)及計(jì) 算機(jī)于一體的影像檢測儀。其特點(diǎn)是照明點(diǎn)和探測點(diǎn)共軛，具有高分辨率和深度識別能力， 可對生物樣品(腦組織切片、活細(xì)胞等)進(jìn)行無損傷光切，并可通過三維重建，得到樣品的 三維立體結(jié)構(gòu)。它的另一個(gè)重要的特點(diǎn)是可實(shí)時(shí)觀察活組織切片及細(xì)胞內(nèi)各種離子的動(dòng)態(tài) 變化。利用激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)觀察腦片或者單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)氯離子濃度的變化是新 的細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度檢測方法，能夠可視化檢測不同區(qū)域、不同細(xì)胞的氯離子濃度水平。
在過去的二、三十年中，氯測定一直局限于電生理學(xué)方法，無法進(jìn)行可視化檢測。 現(xiàn)在，由于指示劑選擇和監(jiān)測系統(tǒng)方面都獲得了快速的發(fā)展，細(xì)胞內(nèi)氯成像探針(縮寫 MQAE，全稱為N_ (Ethoxycarbonylmethyl) -6-methoxyquinolinium bromide)的石開發(fā)成功使 得氯離子測定成為可能。但是，如何針對神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)特定細(xì)胞(主要是神經(jīng)元)進(jìn)行氯離 子濃度測定、如何可視化細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度、如何實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測氯離子濃度變化情況， 國內(nèi)尚未見報(bào)道。本技術(shù)的建立將為揭開氯離子生理和病理作用的奧秘提供支持，并為人 類認(rèn)識和最終戰(zhàn)勝由氯離子穩(wěn)態(tài)失衡造成的臨床疾病提供線索。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方法。
本發(fā)明的目的在于實(shí)現(xiàn)3個(gè)可能使針對神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)特定細(xì)胞(主要是神經(jīng)元) 進(jìn)行氯離子濃度測定成為可能、使細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度可視化成為可能、使實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地監(jiān)測 氯離子濃度變化情況成為可能。 針對以上問題，本發(fā)明要解決的技術(shù)難題主要是兩個(gè)第一，如何向中樞神經(jīng)系統(tǒng) 特定細(xì)胞導(dǎo)入氯成像探針MQAE，并保證該探針工作正常；第二，如何利用激光共聚焦顯微 鏡記錄細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度信號，并保證該結(jié)果真實(shí)有效。 為此，本發(fā)明提供一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方 法，按照如下步驟(1)腦片與氯離子熒光探針MQAE共孵育；(2)激光共聚焦顯微鏡成像、 記錄；(3)校正細(xì)胞內(nèi)氯離子熒光探針MQAE熒光值。
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所述步驟(1)是指將厚度為200 300微米的腦片平置于細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板內(nèi) 預(yù)先放置的圓形蓋玻片上。圓形蓋玻片在使用前經(jīng)濃度為l毫克每毫升的多聚酪氨酸溶液 包被，使之易于細(xì)胞貼附。用通入混合氣體的中性緩沖液，稱之為Krebs-HEPES緩沖液，洗 滌除去雜質(zhì)，要求洗3次，每次5分鐘。再將終濃度為5毫摩爾的氯成像探針(縮寫MQAE， 全禾爾為N_(Ethoxycarbonylmethyl)_6_methoxyquinolinium bromide)少許(100 200微
升)加入每個(gè)孔中，要求夠夠覆蓋住全部腦片。然后在溫度設(shè)置為37t:的恒溫培養(yǎng)箱(最
好使用專用細(xì)胞培養(yǎng)箱)中培養(yǎng)1小時(shí)左右，不要超過2個(gè)小時(shí)。在此期間，將氧氣和二氧 化碳?xì)馔瑫r(shí)注入另外的新鮮配制的中性緩沖液(Krebs-HEPES緩沖液)中。待培養(yǎng)結(jié)束后， 用此緩沖液再次洗滌腦片，以除去細(xì)胞外殘余的氯成像探針(MQAE)(要求洗滌3到5次，每 次不超過5分鐘)。之后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。 所述步驟(2)是指首先在激光共聚焦顯微鏡成像前，準(zhǔn)備中性緩沖液 (Krebs-HEPES緩沖液)，要預(yù)先通入濃度為95 %的氧氣和濃度為5 %的二氧化碳?xì)?。然后?緩沖液經(jīng)實(shí)驗(yàn)用輸液管勻速輸入灌流槽中，灌流速度不能超過1. 5到2. 0毫升每分鐘。再 將此灌流槽放置于激光共聚焦顯微鏡的載物臺上。這時(shí)，將步驟(2)所得腦片浸入灌流槽 內(nèi)。用顯微鏡的目鏡選定所需要的部位。開啟共聚焦顯微鏡紫色半導(dǎo)體激光器，經(jīng)過顯微 鏡上分光鏡過濾得到波長為405納米的紫外光。該束紫外光經(jīng)顯微鏡的物鏡聚焦后，能夠 激發(fā)腦片上的特殊細(xì)胞(神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的重要細(xì)胞，稱為神經(jīng)元)內(nèi)的氯成像探針MQAE。氯 成像探針MQAE被激發(fā)后發(fā)出波長為440納米的發(fā)射光，此發(fā)射光沿同一光路進(jìn)入物鏡，穿 過分光鏡后在探測針孔處成像，后經(jīng)光電倍增管接收、放大后迅速在計(jì)算機(jī)顯示屏上形成 熒光圖像。共聚焦顯微鏡以電信號的形式記錄圖像后，通過自帶軟件進(jìn)行圖像處理，最后獲 得氯成像圖片。 所述步驟(3)是指此時(shí)需要對以上獲得的氯成像結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)。首先將孵育液 更換，換為里面不含氯離子的中性緩沖液，即校正人工腦脊液。正常人工腦脊液內(nèi)含有氯 化鈉，所以帶有氯離子，而我們使用的改良后校正人工腦脊液，是用等摩爾的硫酸鉀鹽替換 氯化鈉，從而去除正常人工腦脊液的氯離子，達(dá)到我們需要的標(biāo)準(zhǔn)。在這種校正人工腦脊 液中加入氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑以平衡細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)外氯離子濃度，同時(shí)加入氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑 制劑以保證測定過程中細(xì)胞內(nèi)酸堿值保持不變。經(jīng)過抑制劑處理20分鐘后，理論上，這時(shí) 腦片上細(xì)胞內(nèi)外的氯離子濃度相平衡，就設(shè)此時(shí)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度為零，即基準(zhǔn)值。此時(shí)， 氯離子成像探針?biāo)l(fā)出的熒光強(qiáng)度是最小，我們記之為F。值。然后，我們將酸堿度為中性 的校正人工腦脊液內(nèi)，依次加入濃度為20毫摩爾、40毫摩爾、60毫摩爾和125毫摩爾的氯 化鈉，這樣獲得已知氯離子濃度的校正人工腦脊液。需要注意的是，需要在校正緩沖液中 同時(shí)加入三丁基錫和尼日利亞菌素，以抑制其它陰離子在細(xì)胞膜內(nèi)外運(yùn)動(dòng)。腦片在不同校 正人工腦脊液的孵育下，將產(chǎn)生不同的熒光強(qiáng)度，記之為FJ。熒光強(qiáng)度FJ均對應(yīng)已知的 氯離子濃度，這樣即可得到氯離子濃度與熒光信號之間的二維相關(guān)系數(shù)。最后，緩沖液內(nèi) 加入150毫摩爾的硫氰酸鉀，以完全淬滅胞內(nèi)染料，使此時(shí)熒光強(qiáng)度歸零，記為FSffl。最后， 根據(jù)Stern-Volmer公式，F(xiàn)。/Fcl— = K [Cl—]i。其中，[CI—]t代表細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度；F。= Fa—_FSCN。 K為Stern-Volmer淬滅常數(shù)，代表熒光淬滅率達(dá)到50%時(shí)的細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度 [cr]i。根據(jù)以上獲得的數(shù)據(jù)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出常數(shù)K。 實(shí)施過程中主要考慮了以下因素(l)采用的MQAE染料為可見光激發(fā)，自發(fā)熒光小，對細(xì)胞的損害較小，易于通過擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，不易發(fā)生滲漏和區(qū)室化；(2)實(shí)驗(yàn)體系的
構(gòu)建適用于激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)，保證該體系的構(gòu)建更適合于目前實(shí)驗(yàn)室裝備；(3)實(shí)
驗(yàn)中所用試劑的濃度、溫度和時(shí)間都經(jīng)過反復(fù)測試，能夠有效避免染料高濃度聚集；(4)本
流程中在指示劑負(fù)載前記錄待測細(xì)胞的背景熒光，而后從實(shí)際測量結(jié)果中減去此背景值，
保證自發(fā)熒光對結(jié)果的影響；(5)激光共聚焦顯微鏡采用激光束作光源，激光束通過照明
針孔和物鏡以聚焦的方式對標(biāo)本進(jìn)行層層掃描而收集氯信號，在此過程中，焦平面以外的
散射光線不能通過探測針孔而使測得的氯信號具有很強(qiáng)的空間分辨率。 綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)明確，主要是3點(diǎn)第一，可定量檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)特定
細(xì)胞(主要是神經(jīng)元)內(nèi)氯離子濃度及其變化情況；第二，對所檢測細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度以熒
光形式可視化展示出來；第三，由于采用的氯成像探針MQAE在可見光下被激發(fā)，故自發(fā)熒
光小，因此保證該種檢測手段對細(xì)胞的損害最小，結(jié)果更為可靠。
具體實(shí)施例方式
基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方法，按照如下步驟(1)腦片與氯離子熒光探針MQAE共孵育；(2)激光共聚焦顯微鏡成像、記錄；(3)校正細(xì)胞內(nèi)氯離子熒光探針MQAE熒光值。 1.腦片與氯離子熒光探針MQAE共孵育 (1)將厚度為200 300微米的腦片平置于細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板內(nèi)預(yù)先放置的圓形蓋玻片上。圓形蓋玻片在使用前經(jīng)濃度為1毫克每毫升的多聚酪氨酸溶液包被，使之易于細(xì)胞貼附。 (2)用通入混合氣體的中性緩沖液，稱之為Krebs-HEPES緩沖液，洗滌除去雜質(zhì)，要求洗3次，每次5分鐘。 (3)再將終濃度為5毫摩爾的氯成像探針(縮寫MQAE，全稱為N-(Ethoxycarbonylmethyl)_6_methoxyquinolinium bromide)少i午(100 200微升)力口入每個(gè)孑L中，要求夠夠覆蓋住全部腦片。然后在溫度設(shè)置為37t:的恒溫培養(yǎng)箱(最好使用專用細(xì)胞培養(yǎng)箱)中培養(yǎng)1小時(shí)左右，不要超過2個(gè)小時(shí)。 (4)在此期間，將氧氣和二氧化碳?xì)馔瑫r(shí)注入另外的新鮮配制的中性緩沖液(Krebs-HEPES緩沖液)中。待培養(yǎng)結(jié)束后，用此緩沖液再次洗滌腦片，以除去細(xì)胞外殘余的氯成像探針(MQAE)(要求洗滌3到5次，每次不超過5分鐘min)。之后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。 2.激光共聚焦顯微鏡成像、記錄； (5)在激光共聚焦顯微鏡成像前，準(zhǔn)備中性緩沖液(Krebs-HEPES緩沖液)，要預(yù)先通入濃度為95%的氧氣和濃度為5%的二氧化碳?xì)?。然后將緩沖液經(jīng)實(shí)驗(yàn)用輸液管勻速輸入灌流槽中，灌流速度不能超過1. 5到2. 0毫升每分鐘。 (6)再將此灌流槽放置于激光共聚焦顯微鏡的載物臺上。這時(shí)，將所得腦片浸入灌流槽內(nèi)。用顯微鏡的目鏡選定所需要的部位。 (7)開啟共聚焦顯微鏡紫色半導(dǎo)體激光器，經(jīng)過顯微鏡上分光鏡過濾得到波長為405納米的紫外光。該束紫外光經(jīng)顯微鏡的物鏡聚焦后，能夠激發(fā)腦片上的特殊細(xì)胞(神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的重要細(xì)胞，稱為神經(jīng)元)內(nèi)的氯成像探針MQAE。氯成像探針MQAE被激發(fā)后發(fā)出波長為440納米的發(fā)射光，此發(fā)射光沿同一光路進(jìn)入物鏡，穿過分光鏡后在探測針孔處成像， 后經(jīng)光電倍增管接收、放大后迅速在計(jì)算機(jī)顯示屏上形成熒光圖像。 (8)共聚焦顯微鏡以電信號的形式記錄圖像后，通過自帶軟件進(jìn)行圖像處理，最后 獲得氯成像圖片。 3.校正細(xì)胞內(nèi)氯離子熒光探針MQAE熒光值。
(9)將孵育液更換，更換為里面不含氯離子的中性緩沖液，即校正人工腦脊液。正
常人工腦脊液內(nèi)含有氯化鈉，所以帶有氯離子，而我們使用的改良后校正人工腦脊液，是用
等摩爾的硫酸鉀鹽替換氯化鈉，從而去除正常人工腦脊液的氯離子，達(dá)到我們需要的標(biāo)準(zhǔn)。
在這種校正人工腦脊液中加入氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑以平衡細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)外氯離子濃度，同時(shí)
加入氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑以保證測定過程中細(xì)胞內(nèi)酸堿值保持不變。經(jīng)過抑制劑處理20
分鐘后，理論上，這時(shí)腦片上細(xì)胞內(nèi)外的氯離子濃度相平衡，就設(shè)此時(shí)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度為
零，即基準(zhǔn)值。此時(shí)，氯離子成像探針?biāo)l(fā)出的熒光強(qiáng)度是最小，我們記之為F。值。 (10)將酸堿度為中性的校正人工腦脊液內(nèi)，依次加入濃度為20毫摩爾、40毫摩
爾、60毫摩爾和125毫摩爾的氯化鈉，這樣獲得已知氯離子濃度的校正人工腦脊液。需要注
意的是，需要在校正緩沖液中同時(shí)加入三丁基錫和尼日利亞菌素，以抑制其它陰離子在細(xì)
胞膜內(nèi)外運(yùn)動(dòng)。腦片在不同校正人工腦脊液的孵育下，將產(chǎn)生不同的熒光強(qiáng)度，記之為Fd—。
熒光強(qiáng)度Fa—均對應(yīng)已知的氯離子濃度，這樣即可得到氯離子濃度與熒光信號之間的二維
相關(guān)系數(shù)。 (11)最后，緩沖液內(nèi)加入150毫摩爾的硫氰酸鉀，以完全淬滅胞內(nèi)染料，使此時(shí)熒 光強(qiáng)度歸零，記為F^。 (12)根據(jù)Stern-Volmer公式，F(xiàn)。AV = K [Cl—]i。其中，[Cl—]i代表細(xì)胞內(nèi)氯離
子濃度；F。 = Fa—-FSffl。 K為Stern-Volmer淬滅常數(shù)，代表熒光淬滅率達(dá)到50%時(shí)的細(xì)胞內(nèi)
氯離子濃度[cr]i。根據(jù)以上獲得的數(shù)據(jù)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出常數(shù)K。 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
僅限于此，對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫 離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單的推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明由所
提交的權(quán)利要求書確定專利保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方法，其特征在于，按照如下步驟(1)腦片與氯離子熒光探針MQAE共孵育；(2)激光共聚焦顯微鏡成像、記錄；(3)校正細(xì)胞內(nèi)氯離子熒光探針MQAE熒光值。
2. 如權(quán)利要求1所述基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方法，其 特征在于，所述步驟(1)是指將厚度為200 300微米的腦片平置于細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板 內(nèi)預(yù)先放置的圓形蓋玻片上；圓形蓋玻片在使用前經(jīng)濃度為1毫克每毫升的多聚酪氨酸溶 液包被，使之易于細(xì)胞貼附；用Krebs-HEPES緩沖液，洗滌除去雜質(zhì)，要求洗3次，每次5分 鐘；再將終濃度為5毫摩爾的氯成像探針100 200微升加入每個(gè)孔中，要求夠夠覆蓋住全 部腦片；然后在溫度設(shè)置為37t:的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)左右，不要超過2個(gè)小時(shí)；在此 期間，將氧氣和二氧化碳?xì)馔瑫r(shí)注入另外的新鮮配制的中性緩沖液中；待培養(yǎng)結(jié)束后，用此 緩沖液再次洗滌腦片，以除去細(xì)胞外殘余的氯成像探針，要求洗滌3到5次，每次不超過5 分鐘；之后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
3. 如權(quán)利要求1所述基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方法，其 特征在于，所述步驟(2)是指首先在激光共聚焦顯微鏡成像前，準(zhǔn)備中性緩沖液，要預(yù)先 通入濃度為95%的氧氣和濃度為5%的二氧化碳?xì)?；然后將緩沖液經(jīng)實(shí)驗(yàn)用輸液管勻速輸 入灌流槽中，灌流速度不能超過1. 5到2. 0毫升每分鐘；再將此灌流槽放置于激光共聚焦顯 微鏡的載物臺上；這時(shí)，將步驟(2)所得腦片浸入灌流槽內(nèi)；用顯微鏡的目鏡選定所需要的 部位；開啟共聚焦顯微鏡紫色半導(dǎo)體激光器，經(jīng)過顯微鏡上分光鏡過濾得到波長為405納 米的紫外光；該束紫外光經(jīng)顯微鏡的物鏡聚焦后，能夠激發(fā)腦片上的特殊細(xì)胞內(nèi)的氯成像 探針MQAE ;氯成像探針MQAE被激發(fā)后發(fā)出波長為440納米的發(fā)射光，此發(fā)射光沿同一光路 進(jìn)入物鏡，穿過分光鏡后在探測針孔處成像，后經(jīng)光電倍增管接收、放大后迅速在計(jì)算機(jī)顯 示屏上形成熒光圖像；共聚焦顯微鏡以電信號的形式記錄圖像后，通過自帶軟件進(jìn)行圖像 處理，最后獲得氯成像圖片。
4. 如權(quán)利要求1所述基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方法， 其特征在于，所述步驟(3)是指此時(shí)需要對以上獲得的氯成像結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)；首先將孵 育液更換，換為里面不含氯離子的中性緩沖液，即校正人工腦脊液；正常人工腦脊液內(nèi)含 有氯化鈉，所以帶有氯離子，而我們使用的改良后校正人工腦脊液，是用等摩爾的硫酸鉀鹽 替換氯化鈉，從而去除正常人工腦脊液的氯離子，達(dá)到我們需要的標(biāo)準(zhǔn)；在這種校正人工 腦脊液中加入氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑以平衡細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)外氯離子濃度，同時(shí)加入氫離子轉(zhuǎn)運(yùn) 體抑制劑以保證測定過程中細(xì)胞內(nèi)酸堿值保持不變；經(jīng)過抑制劑處理20分鐘后，這時(shí)腦 片上細(xì)胞內(nèi)外的氯離子濃度相平衡，就設(shè)此時(shí)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度為零，即基準(zhǔn)值；此時(shí)，氯 離子成像探針?biāo)l(fā)出的熒光強(qiáng)度是最小，我們記之為F。值；然后，我們將酸堿度為中性的 校正人工腦脊液內(nèi)，依次加入濃度為20毫摩爾、40毫摩爾、60毫摩爾和125毫摩爾的氯化 鈉，這樣獲得已知氯離子濃度的校正人工腦脊液；需要注意的是，需要在校正緩沖液中同時(shí) 加入三丁基錫和尼日利亞菌素，以抑制其它陰離子在細(xì)胞膜內(nèi)外運(yùn)動(dòng)；腦片在不同校正人 工腦脊液的孵育下，將產(chǎn)生不同的熒光強(qiáng)度，記之為FJ ;熒光強(qiáng)度F^均對應(yīng)已知的氯離 子濃度，這樣即可得到氯離子濃度與熒光信號之間的二維相關(guān)系數(shù)；最后，緩沖液內(nèi)加入 150毫摩爾的硫氰酸鉀，以完全淬滅胞內(nèi)染料，使此時(shí)熒光強(qiáng)度歸零，記為Fsra ;最后，根據(jù) Stern-Volmer公式，F(xiàn)。/Fd—= K*[Cl—]i ;其中，[CI—]t代表細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度；F。 = Fcl—_FSCN ;K為Stern-Volmer淬滅常數(shù)，代表熒光淬滅率達(dá)到50%時(shí)的細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度[Cl—]i ;根 據(jù)以上獲得的數(shù)據(jù)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出常數(shù)K。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于激光共聚焦掃描顯微鏡系統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)氯成像方法，按照如下步驟(1)腦片與氯離子熒光探針MQAE共孵育；(2)激光共聚焦顯微鏡成像、記錄；(3)校正細(xì)胞內(nèi)氯離子熒光探針MQAE熒光值。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下①可定量檢測神經(jīng)元內(nèi)氯離子濃度及其變化情況；②對所檢測神經(jīng)元能夠以熒光形式、可視化氯離子濃度；③采用的氯離子熒光探針MQAE在可見光下被激發(fā)，故自發(fā)熒光小，對細(xì)胞的損害較小。
文檔編號G01N1/28GK101788484SQ20101011245
公開日2010年7月28日 申請日期2010年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月23日
發(fā)明者千年松, 季茹, 李云慶, 李俊杰, 楊雁靈, 武勝昔, 王亞云, 魏燕燕 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)