專利名稱：假黃單胞菌及其在降解煙堿類殺蟲劑吡蟲啉中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及假黃單胞菌Pseudoxanthomonas indicaCGMCC6648及其應(yīng)用于煙堿類殺蟲劑吡蟲啉的降解及其羥基化。
背景技術(shù)：
卩比蟲啉(Imidacloprid,IMI)是一種高效安全、高選擇性的含氮雜環(huán)類殺蟲劑,其作用于昆蟲煙堿乙酰膽堿受體，具有觸殺、胃毒和內(nèi)吸活性。MI已廣泛用于刺吸式口器害蟲如蚜蟲和葉蟬及鞘翅目害蟲防治，用于建筑防治白蟻和防治貓和狗等寵物身上的跳蚤等。目前，頂I已在全球120個(gè)國家登記，在140多種作物上使用。自20世紀(jì)90年代以來，頂I已成為我國主要農(nóng)藥品種，主要用于防治水稻褐飛虱、蚜蟲等害蟲。越來越多的報(bào)道顯示，MI在土壤中有殘留，其降解半衰期超過100d。同時(shí)，隨著害蟲對MI抗性的增加，MI的使用 劑量呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，因而MI的環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)性也在不斷增加。MI通過以下3條途徑在環(huán)境中降解:(I)氧化咪唑環(huán)烷環(huán)，生成5-羥基吡蟲啉(5-hydroxyl Ml)，然后脫水轉(zhuǎn)變成烯式吡蟲啉(olefin IMI) ； (2)還原硝基基團(tuán)為亞硝基卩比蟲啉(nitrosimine IMI),水解nitrosimine基團(tuán)變成胍基卩比蟲啉(guanidine頂I)，然后進(jìn)一步氧化生成羰基吡蟲啉(urea IMI) ； (3)氧化斷裂吡蟲啉亞甲基橋途徑，生成6-氯煙酸。由于olefin IMI對桃蚜與棉蚜的殺蟲效果是IMI的16倍，因而IMI羥基化途徑受到研究者的廣泛關(guān)注，頂I經(jīng)由5-hydroxy IMI和olefin IMI途徑代謝，甚至可提高頂I的對蠶豆蚜的生物活性(Liu et al.2011)。微生物降解法是有機(jī)污染物降解的最有效的方法之一。申請人篩選到一株可降解IMI的假黃單胞菌Pseudoxanthomonas indica,該菌株已由申請人提交并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號為CGMCC6648。Pseudoxanthomonas indicaCGMCC6648菌株降解MI的主要途徑為羥基化MI生成5-hydroxy IM10在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中添加糖或有機(jī)酸可加速頂I的降解和促進(jìn)MI的羥基化。申請人也曾申請嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia CGMCC1.1788輕基化IMI的發(fā)明專利(專利號:ZL200310106283.X)。與 Stenotrophomonas maltophilia CGMCC1.1788 相比，Pseudoxanthomonas indica CGMCC6648具有更高的IMI的降解和輕基化能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可降解煙堿類殺蟲劑MI的細(xì)菌菌株及其在MI生物降解和羥基化中的應(yīng)用，本發(fā)明示意圖如圖1所示。本發(fā)明所提供的菌株為一種假黃單胞菌Pseudoxanthomonas indica,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC6648。本發(fā)明所提供的假黃單胞菌CGMCC6648具降解煙堿類殺蟲劑IMI的能力；其降解IMI過程中，產(chǎn)生主要代謝產(chǎn)物5-hydroxy IMI ;產(chǎn)物的液相色評質(zhì)譜聯(lián)用分析如圖2所示。本發(fā)明所提供的假黃單胞菌CGMCC6648降解IMI的方法為:將假黃單胞菌CGMCC6648在營養(yǎng)培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)24h，離心收集和洗滌菌體；將菌體懸浮于磷酸鹽緩沖液中，并加入10mmol/L的糖或有機(jī)酸鹽以及500mg/L卩比蟲啉,上述懸浮液分裝于體積為50ml的離心管中，每根離心管中分裝1-1Oml懸浮液；上述懸浮液于220rpm的搖床中30°C振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)48h，假黃單胞菌CGMCC6648可降解1_43%的MI，并生成0.015-0.67mmol/L 的 5-hydroxy IMI。在假黃單胞菌CGMCC6648靜息細(xì)胞的懸浮液中添加糖或有機(jī)酸鹽，能有效地促進(jìn)假黃單胞菌CGMCC6648降解MI及其羥基化活性(圖4、圖6)。


圖1假黃單胞菌CGMCC6648代謝MI的羥基化途徑。圖2假黃單胞菌CGMCC6648代謝MI的產(chǎn)物質(zhì)譜圖。圖3假黃單胞菌CGMCC6648在2ml反應(yīng)體積、磷酸鹽緩沖液中未添加糖和有機(jī)酸的條件下代謝頂I的HPLC圖。圖4假黃單胞菌CGMCC6648在2ml反應(yīng)體積、磷酸鹽緩沖液中添加100mmol/L葡萄糖的條件下代謝頂I的HPLC圖。圖5嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC1.1788在2ml反應(yīng)體積、磷酸鹽緩沖液中添加IOOmmoI/L葡萄糖的條件下代謝MI的HPLC圖。圖6假黃單胞菌CGMCC6648在2ml反應(yīng)體積、磷酸鹽緩沖液中添加100mmol/L乳糖的條件下代謝頂I的HPLC圖。圖7假黃單胞菌CGMCC6648在2ml反應(yīng)體積、磷酸鹽緩沖液中添加100mmol/L丙酮酸鈉的條件下代謝頂I的HP LC圖。圖8假黃單胞菌CGMCC6648在2ml反應(yīng)體積、磷酸鹽緩沖液中添加100mmol/L琥珀酸鈉的條件下代謝頂I的HPLC圖。圖9假黃單胞菌CGMCC6648在2ml反應(yīng)體積、磷酸鹽緩沖液中添加100mmol/L蘋果酸鈉的條件下代謝頂I的HPLC圖。圖10假黃單胞菌CGMCC6648在Iml反應(yīng)體積、磷酸鹽緩沖液中添加100mmol/L葡萄糖的條件下代謝頂I的HPLC圖。圖11假黃單胞菌CGMCC6648在IOml反應(yīng)體積、磷酸鹽緩沖液中添加100mmol/L葡萄糖的條件下代謝頂I的HPLC圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)例一:可生物降解IMI的菌株分離篩選、鑒定和生物學(xué)特性1、菌株分離從江蘇省南京市仙林地區(qū)采集土壤，取2g 土壤加入含5顆玻璃珠的18mL無菌水中，振蕩lOmin，靜置5min后，取Iml懸液加入19ml含200mg/UMI的礦物鹽培養(yǎng)基中。礦物鹽培養(yǎng)基的組成為:1.36g/LKH2P04, 2.13gL Na2HPO4,0.5gL MgSO4.7H20 和 10ml/L 金屬離子液，pH7.5。金屬離子液組成為:0.40gL CaCl2.2H20, 0.30g/L H3BO3, 0.04gLCuSO4.5H20, 0.lOg/L KI, 0.20g/L FeSO4.7H20，0.40g/LMnS04.7H20，0.20g/LNaMo04.2H20和10.0mL/L濃鹽酸。樣品于30°C、轉(zhuǎn)速為220rpm的搖床中培養(yǎng)一個(gè)月。取100 μ I樣品稀釋到10_3和10_4后，涂布LB平板。LB培養(yǎng)基組成為(g/L):蛋白胨10、酵母膏5、NaCllO,PH7.2。從LB平板挑取形態(tài)不同的單菌落劃線至LB平板上，30°C培養(yǎng)3_6天后，再次進(jìn)行菌種平板劃線純化?？偣搏@得9株形態(tài)各異的細(xì)菌。2、菌株降解MI能力的測定接種上述純化菌種至含20mL LB液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，30°C培養(yǎng)24h后離心收集細(xì)胞。細(xì)胞懸浮于含200mg/L IMI的0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液中(pH7.5)，安捷倫1200型HPLC儀分析檢測MI含量變化。HPLC條件為:流動(dòng)相為25%乙腈和75%的去離子水，流速為lml/min ;HPLC柱為安捷倫HC-C18反相柱(4.6 X 250mm，5 μ m)，柱溫為30°C ；檢測波長為269nm。在上述條件下，命名為Z_9的菌株具有可將MI轉(zhuǎn)化為一種極性更大的產(chǎn)物，該產(chǎn)物的HPLC保留時(shí)間與5-羥基吡蟲啉(5-hydroxy IMI)相同，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀檢測該產(chǎn)物的分子量為271 (m+H272)，與5-hydroxy IMI分子量一致(圖2)。上述結(jié)果表明Z-9菌株可羥基化MI生成5-hydroxy IM103、Z-9菌株的鑒定及生物學(xué)特性在LB固體培養(yǎng)基上，Z-9菌落呈米黃色、半透明、光滑、有粘液、凸起、邊緣規(guī)整。革蘭氏陰性。顯微鏡觀察，Z-9菌體呈橢圓狀，大小為0.5-0.7X1.3-1.5 μ m。無鞭毛，無芽孢。采用16S rRNA基因序列分析進(jìn)行 Z-9菌株的分類學(xué)鑒定。從含LB固體培養(yǎng)基上用無菌牙簽挑取Z-9單菌落接種于裝有20mLLB液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，于30 °C、220rpm的搖床中培養(yǎng)16h。發(fā)酵液于13000rpm離心5min后收集菌體，采用TaKaRa公司的MiniBEST細(xì)菌基因組提取試劑盒提取Z_9菌株的基因組DNA。采用16S rRNA基因擴(kuò)增通用引物Kl和K2擴(kuò)增Z-9菌株的16S rRNA基因。Kl 引物序列為:5 ' -AACTGAAGAGTTTGATCC-3 ' (SEQ ID No:1)，K2 引物序列為:5' -TAGGTTACCTTGTTGTTACGACTT-3' (SEQ ID No:2)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5min后，94°C變性lmin，59°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。所得序列由生工生物工程(上海)有限公司測序后，得到的部分16S rRNA基因序列(SEQ ID No:3)在美國國家生物技術(shù)信息中心的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast搜索。比對結(jié)果表明Z-9菌株與假黃單胞菌屬Pseudoxanthomonas indica親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到100%。Z-9菌株于2012年10月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，分類命名為假黃單胞菌Pseudoxanthomonas indica,保藏編號為CGMCC6648。實(shí)施例二:將-80。C保藏的 Pseudoxanthomonas indica CGMCC6648 劃線于 LB 固體培養(yǎng)基上，于30° C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取單菌落，接種于含25mL LB液體培養(yǎng)基的IOOmL錐形瓶中，30°C，220rpm下振蕩培養(yǎng)24h。以1%的接種量接入含IOOmL LB液體培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，30°C，220rpm下振蕩培養(yǎng)12h，當(dāng)OD6tltl值達(dá)到5時(shí)，取IOml菌液于4°C，8000rpm離心5min，收集菌體。菌體用磷酸鹽緩沖液(0.2mol/LNa2HP04/KH2P04,pH7.5)洗滌兩次后，懸浮于用IOmL含500mgL的MI磷酸鹽緩沖液。取2ml上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液，分裝在三個(gè)50ml的離心管里，每管各裝2ml，于30°C，220rpm搖床振蕩培養(yǎng)48h。HPLC分析(圖3) IMI的降解量和5-hydroxy IMI的生成量，結(jié)果顯示IMI減少了 0.09mmol/L,同時(shí)生成0.02mmol/L的5-hydroxy IMI, IMI 的降解率為 5.4%。實(shí)施例三:與實(shí)例二基本相同，只是磷酸鹽緩沖液中添加了 100mmol/L的葡萄糖，HPLC分析(圖 4)結(jié)果顯不，IMI 減少了 0.BBmmoI /I,,同時(shí)生成 0.SQmmoI /I,的 5-hydroxy IMI, IMI 的降解率為43.6%。上述結(jié)果表明葡萄糖可極大地促進(jìn)MI的降解和5-hydroxy IMI的生成。在相同的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化條件下，以嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia CGMCC1.1788替代假黃單胞菌屬CGMCC6648，HPLC分析(圖5)結(jié)果顯示MI減少了 0.48mmol/L,同時(shí)生成了 0.40mmol/L 的 5-hydroxy IMI, IMI 的降解率為 28.2%。上述結(jié)果表明，Pseudoxanthomonas indica CGMCC6648具有比嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCC1.1788高得多的IMI降解和羥基化能力。實(shí)施例四:與實(shí)例二基本相同，只是磷酸鹽緩沖液中添加了 100mmol/L的乳糖，HPLC分析(圖6)結(jié)果顯示，結(jié)果顯示IMI減少了 0.77mmol/L,同時(shí)生成0.67mmol/L的5-hydroxy IMI,IMI的降解率為43.1%。上述結(jié)果表明乳糖可極大地促進(jìn)MI的降解和5-hydroxy IMI的生成。實(shí)施例五:與實(shí)例二基本相同，只是磷酸鹽緩沖液中添加了 100mmol/L的丙酮酸鈉，HPLC分析(圖 7),結(jié)果顯不 IMI 減少了 0.62mmol/L,同時(shí)生成 0.61mmol/L 的 5-hydroxy IMI, IMI 的降解率為35.8%。上述結(jié)果表明丙酮酸鹽也能加速M(fèi)I的降解和5-hydroxy IMI的生成。實(shí)施例六:與實(shí)例二基本相同，只是磷酸鹽緩沖液中添加了 100mmol/L的琥珀酸鈉，HPLC分析(圖 8),結(jié)果顯不 IMI 減少了 0.174mmol/L,同時(shí)生成 0.048mmol/L 的 5-hydroxy IMI, IMI的降解率為10.39%。實(shí)施例七:與實(shí)例二基本相同，只是磷酸鹽緩沖液中添加了 100mmol/L的蘋果酸鈉，HPLC分析(圖 9),結(jié)果顯不 IMI 減少了 0.39mmol/L,同時(shí)生成 0.16mmol/L 的 5-hydroxy IMI, IMI的降解率為23.0%。實(shí)施例八: 與實(shí)例三基本相同，只是轉(zhuǎn)化液的體積由2ml縮小為1ml。HPLC分析(圖10)，結(jié)果顯不IMI減少了 0.71 mmol /I,,同時(shí)生成0.67mmol/L的5-hydroxy IMI, IMI的降解率為
43.5%。實(shí)施例九:與實(shí)例三基本相同，只是轉(zhuǎn)化液的體積由2ml增加為10ml。HPLC分析(圖11)結(jié)果顯不，結(jié)果顯不 IMI 減少了 0.016mmol/L,同時(shí)生成 0.015mmol/L 的 5-hydroxy IMI, IMI的降解率僅為1.0%。上述結(jié)果表明通氣量影響5-hydroxy IMI的生成和MI的降解。
權(quán)利要求
1.一種假黃單胞菌其保藏號為:CGMCC 6648。
2.黃單胞菌CGMCC6648在降解煙堿類殺蟲劑吡蟲啉中的應(yīng)用。
3.一種由權(quán)利要求1所述菌株降解吡蟲啉的方法，是將假黃單胞菌CGMCC 6648在營養(yǎng)培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)24h，離心收集和洗滌菌體；將菌體懸浮于磷酸鹽緩沖液中，并加入10mmol/L的糖或有機(jī)酸鹽以及500mg/L卩比蟲啉,上述懸浮液分裝于體積為50ml的離心管中，每根離心管中分裝1-1Oml懸浮液；上述懸浮液于220rpm的搖床中30°C振蕩培養(yǎng),假黃單胞菌CGMCC 6648可降解吡蟲啉 ，并生成產(chǎn)物5-羥基吡蟲啉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種降解煙堿類殺蟲劑吡蟲啉的假黃單胞菌Pseudoxanthomonas indica CGMCC6648；其降解吡蟲啉的主要途徑為羥基化吡蟲啉生成5-羥基吡蟲啉。在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中添加糖和有機(jī)酸，可極大地提高假黃單胞菌CGMCC6648的吡蟲啉羥基化能力。
文檔編號A62D101/28GK103087955SQ20131002247
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月21日
發(fā)明者戴亦軍, 翟閃, 馬源, 劉中華, 葛峰, 袁生 申請人:南京師范大學(xué)