microRNA-342-3p和microRNA-210及其抑制劑的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及小分子RNA-microRNA-342-3p 和miR-210及其抑制劑在制備類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的治療藥物和診斷試劑中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 在人和動(dòng)物組織中，長期進(jìn)化使得機(jī)體的各種細(xì)胞形成了精細(xì)復(fù)雜的低氧適應(yīng)機(jī) 制，絕大多數(shù)健康組織內(nèi)氧濃度維持在2. 5%~9%之間。而在一些病理狀態(tài)下，如呼吸系 統(tǒng)或心血管系統(tǒng)疾病引起的低氧血癥，敗血癥、自身免疫疾病和腫瘤等疾病中都存在著全 身性或局部組織的低氧狀態(tài)1% 〇2)。這種長期或不可逆轉(zhuǎn)的低氧狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的 組織細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的低氧適應(yīng)出現(xiàn)失代償現(xiàn)象，進(jìn)而引起多種炎性因子 和細(xì)胞因子產(chǎn)生異常，細(xì)胞生物學(xué)行為出現(xiàn)異常，最終導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡出現(xiàn) 異常，疾病經(jīng)久不愈。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)因炎癥使受累關(guān)節(jié)腔內(nèi)的氧濃度大大降低，從 而促進(jìn)了關(guān)節(jié)腔內(nèi)血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解，炎性細(xì)胞釋放炎性因子，促進(jìn)了炎癥的 進(jìn)一步發(fā)展。因此，研究低氧對(duì)免疫細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控和免疫細(xì)胞的低氧適應(yīng)機(jī)制，對(duì) 找到受低氧控制的關(guān)鍵信號(hào)分子，開發(fā)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷試劑和治療新藥具有潛在的 臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells, DCs)是機(jī)體連接天然免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁， DCs是目前已知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，能夠刺激初始T細(xì)胞（naive T cells)的活 化和增殖，從而啟動(dòng)和調(diào)控特異性免疫應(yīng)答。不同DC亞群、不同分化發(fā)育階段的DC、在不 同PAMP刺激下，對(duì)后天免疫應(yīng)答的類型和強(qiáng)度都具有不同的調(diào)控作用，而DC的功能狀態(tài)受 到其所處微環(huán)境的影響，而微環(huán)境中產(chǎn)生的一些內(nèi)源性炎性因子如C5a能促進(jìn)DC的成熟活 化，并促進(jìn)成熟DC誘導(dǎo)Thl或Th2細(xì)胞的分化。目前很多證據(jù)表明，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 慢性炎性腸病，以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病中，存在Thl和Th7的生成活躍而調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞生成減少的失衡。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DCs參與許多具有局部低氧特征疾病的發(fā)展過程，如 腫瘤的局部低氧條件可能參與誘導(dǎo)大量的耐受性DCs，與機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受機(jī)制有關(guān)； 動(dòng)脈硬化斑塊、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎局部聚集DCs的活性及功能變化影響疾病的發(fā)展和預(yù)后。這 些研究現(xiàn)象提示，DCs具有氧感受及適應(yīng)機(jī)制，這種氧感受與適應(yīng)可能影響DCs的生物學(xué)行 為，進(jìn)而影響免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和類型。因此，對(duì)DCs的低氧適應(yīng)機(jī)制的研究有助于臨床低氧 相關(guān)疾病的治療以及高效DCs疫苗的制備研究。
[0004] 補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體固有免疫抵抗病原微生物的重要組成部分，廣泛參與多種急慢性 炎癥性疾病，如自身免疫性疾病、敗血癥、急性肺損傷、缺血再灌注損傷和哮喘等。補(bǔ)體活化 不僅能直接發(fā)揮溶解細(xì)胞、細(xì)菌、病毒的作用，還能夠產(chǎn)生一系列活性片段，發(fā)揮調(diào)理吞噬 作用、清除凋亡細(xì)胞、趨化免疫細(xì)胞并參與調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的效應(yīng)功能，從而維持免疫自 身穩(wěn)態(tài)。補(bǔ)體活化產(chǎn)物過敏毒素 C5a具有強(qiáng)大的生物活性，是重要的炎癥介質(zhì)，對(duì)炎性細(xì)胞 如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等有強(qiáng)趨化活性，能夠活化巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其溶菌 酶和超氧離子的釋放，從而參與天然免疫的調(diào)控或促進(jìn)組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，C5a是通過與 其受體C5aRl (⑶88)和C5L2結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的，C5aRl屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族 成員，在多種免疫細(xì)胞表面都有廣泛表達(dá)，是介導(dǎo)C5a的主要受體。有研究指出，在敗血癥 發(fā)病初期C5a的過度活化會(huì)導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的進(jìn)一步釋放，導(dǎo)致組織損傷，疾病的進(jìn)一步惡 化。作為低氧相關(guān)疾病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也是一種已知的C5相關(guān)疾病，RA病人血清和關(guān)節(jié) 液中的C5a水平明顯升高，C5缺陷的小鼠其CIA誘導(dǎo)率和疾病嚴(yán)重程度明顯低于野生型小 鼠，說明C5a/C5aR參與RA的病理損傷機(jī)制。因此對(duì)C5a/C5aR信號(hào)通路調(diào)控的研究對(duì)炎性 疾病的預(yù)防和治療有著重要的科學(xué)意義。
[0005] 綜上，本領(lǐng)域尚需基于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)病機(jī)理機(jī)制，找到對(duì)于治療或診 斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病有效的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供microRNA-342-3p和microRNA-210及其抑制劑的用途。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種miR-342-3p下調(diào)劑或miR-210下調(diào)劑在制備治療 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的藥物中的用途。
[0008] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的下調(diào)劑包括：抑制劑、阻滯劑、拮抗劑等。例如，所述的下 調(diào)劑是攜帶可結(jié)合miR的海綿體病毒載體。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的miR-342-3p的下調(diào)劑的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示 或其經(jīng)修飾后的產(chǎn)物；較佳地，其修飾產(chǎn)物是在SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的基礎(chǔ)上，對(duì) 骨架部分磷酸基團(tuán)進(jìn)行硫代修飾、2'核酸進(jìn)行甲氧基修飾以及3'端偶聯(lián)膽固醇。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的miR-210的下調(diào)劑的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示或 或其經(jīng)修飾產(chǎn)物；較佳地，其修飾產(chǎn)物是在SEQ ID N0:8所示核苷酸序列的基礎(chǔ)上，對(duì)骨架 部分磷酸基團(tuán)進(jìn)行硫代修飾、2'核酸進(jìn)行甲氧基修飾以及3'端偶聯(lián)膽固醇。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物還用于治療具有低氧病理特征的疾?。?br>[0012] 在組織低氧微環(huán)境下阻斷細(xì)胞表面C5aRl的表達(dá)；或
[0013] 在組織低氧微環(huán)境下促進(jìn)STAT5和/或STAT6的表達(dá)和/或磷酸化；或
[0014] 在組織低氧微環(huán)境提高USP13的表達(dá)；或
[0015] 在組織低氧微環(huán)境降低PTPN1的表達(dá)。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，提供miR-342-3p或miR-210的用途，用于作為診斷或預(yù)后 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的標(biāo)志物；或用于制備診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的試劑。
[0017] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的診斷或預(yù)后類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病包括：檢測受試者的 miR-342-3p或miR-210表達(dá)水平，表達(dá)水平越高，則表示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的患病程度 越嚴(yán)重。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的診斷或預(yù)后類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的試劑是特異性識(shí)別或 擴(kuò)增miR-342-3p或miR-210的試劑（例如探針或引物）。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種特異性識(shí)別或擴(kuò)增miR-342-3p或miR-210的試劑 在制備用于診斷或預(yù)后類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的試劑盒中的用途。
[0020] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的特異性擴(kuò)增miR-342-3p的試劑是核苷酸序列如SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24 的引物；或
[0021] 所述的特異性擴(kuò)增miR-210的試劑是核苷酸序列如SEQ ID N0:20和SEQ ID N0:21 的引物。
[0022] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的潛在物質(zhì)的方 法，所述方法包括：
[0023] (1)將候選物質(zhì)與包含miR-342_3p和/或miR-210的體系接觸，所述的體系是細(xì) 胞培養(yǎng)物體系；和
[0024] (2)篩選出顯著下調(diào)（如顯著下調(diào)20%以上，較佳的下調(diào)50%以上；更佳的下調(diào) 80%以上）miR-342-3p和/或miR-210表達(dá)的物質(zhì)，所述物質(zhì)是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病 的潛在物質(zhì)。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，步驟（1)包括：向包含miR-342-3p和/或miR-210的體系中添 加候選物質(zhì)；和
[0026] 步驟（2)包括：檢測miR-342_3p和/或miR-210的表達(dá)情況，并與對(duì)照組比較，其 中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的、表達(dá)miR-342-3p和/或miR-210的體系；
[0027] 若候選物質(zhì)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上下調(diào)miR-342_3p和/或miR-210的表達(dá)，則該候選物質(zhì)是 治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在物質(zhì)。
[0028] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的體系選自（但不限于）：細(xì)胞體系（或細(xì)胞培養(yǎng)物體系）、 亞細(xì)胞體系、溶液體系、動(dòng)物體系或組織體系。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的候選物質(zhì)選自（但不限于）：針對(duì)miR-342_3p和/或 miR-210設(shè)計(jì)的干擾分子、核酸抑制物、結(jié)合分子（如抗體或配體）、小分子化合物。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括：對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病有用的 物質(zhì)。
[0031] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0032] 圖1、低氧條件單核來源樹突狀細(xì)胞高表達(dá)C5aRl并對(duì)C5a及其內(nèi)源性衍生物-去 除精氨酸的C5a(C5a desfcg)具有高反應(yīng)性。
[0033] (a) GM-CSF和IL-4刺激的單核細(xì)胞分別培養(yǎng)在不同氧濃度條件下，包括全程的常 氧（21%)，全程的低氧（分別為9,5,2%)，或者序貫性低氧（9%、3天，5%、2天，2%、1天， 和1 %、1天），7天后檢測常氧和低氧條件下單核來源樹突狀細(xì)胞表達(dá)C5aRl。
[0034] (b)C5a及其衍生物05_；3_介導(dǎo)常氧和低氧（2% )條件下單核來源樹突狀細(xì)胞的 趨化活性。以趨化指數(shù)表示：有C5a或C5_stog#在條件下進(jìn)入到下室的單核來源樹突狀細(xì) 胞數(shù)/無 C5a或C5_stog存在條件下進(jìn)入到下室的單核來源樹突狀細(xì)胞數(shù)（自由擴(kuò)散）。
[0035] (c)C5a及其衍生物C5adestog刺激的常氧和低氧（2% )條件下單核來源樹突狀細(xì)胞 表達(dá)共刺激分子-⑶86和HLA-DR的水平。
[0036] (d)C5a及其衍生物C5adestog刺激的常氧和低氧（2% )條件下單核來源樹突狀細(xì)胞 分泌炎性因子的水平。
[0037] (e)C5a及其衍生物C5adestog刺激的常氧和低氧（2% )條件下單核來源樹突狀細(xì)胞 誘導(dǎo)同種CD4+T細(xì)胞增殖的水平。CD4+T細(xì)胞預(yù)先用CFSE標(biāo)記，與樹突狀細(xì)胞共孵育5天 后，檢測CFSE的稀釋情況。
[0038] (f)C5a及其衍生物C5adestog刺激的常氧和低氧（2% )條件下單核來源樹突狀細(xì)胞 誘導(dǎo)同種CD4+T細(xì)胞活化的水平。
[0039] (g)C5a及其衍生物C5adestog刺激的常氧和低氧（2% )條件下單核來源樹突狀細(xì)胞 誘導(dǎo)同種⑶4+T細(xì)胞分化為分泌IFNY和IL-17的水平。
[0040] (h) C5a及其衍生物C5adestog刺激的常氧和低氧（2 % )條件下單核來源樹突狀細(xì)胞 誘導(dǎo)同種CD4+T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平。
[0041] 圖2、低氧上調(diào)單核來源樹突狀細(xì)胞表達(dá)miR-210和miR-342-3p。
[0042] 常氧（N)和低氧（H，2% 02，以下實(shí)驗(yàn)均采用2% 02)條件下人單核細(xì)胞在GM-CSF 和IL-4誘導(dǎo)MoDC分化過程中miR-210 (a)和miR-342-3p (b)的表達(dá)。
[0043] 圖 3、低氧上調(diào)的 miR-210 和 miR-342-3p 促進(jìn) MoDC 表達(dá) C5aRl。
[0044] 在常氧條件下對(duì)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-210或miR-342_3p的模擬物（mimic)及其陰 性對(duì)照（a)、在低氧條件下轉(zhuǎn)染miR-210或miR-342-3p的抑制劑（inhibitor)及其陰性對(duì) 照（b)，48h后在培養(yǎng)基中加入GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)其分化，誘導(dǎo)96h后檢測細(xì)胞表面C5aRl 表達(dá)的變化。
[0045] 圖4、miR-210和miR-342-3p在膠原誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎模型（CIA)中的表達(dá)。
[0046] 在II型膠原誘導(dǎo)的DBA/1小鼠關(guān)節(jié)炎模型（CIA)，發(fā)病不同時(shí)間血清miR-210 (a) 和miR-342-3p(b)的表達(dá)。Ctrl:對(duì)照（未誘導(dǎo)CIA)。
[0047] 圖5、miR-210和miR-342-3p模擬物及抑制物對(duì)CIA進(jìn)展的影響。
[0048] 對(duì)II型膠原誘導(dǎo)的DBA/1小鼠關(guān)節(jié)炎模型分別進(jìn)行尾靜脈注射單獨(dú)miR-210 或miR-342-3p的措抗劑（antagomir)或二者聯(lián)合或者措抗劑的陰性對(duì)照（NC)，每周給藥 一次，于第三周開始每2-3天觀察其關(guān)節(jié)炎發(fā)病情況，包括關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率（a)、臨床評(píng)分 (b)、各組代表性受累關(guān)節(jié)的炎癥腫脹程度（c)、關(guān)節(jié)軟骨受損情況（d)和病理（e)。
[0049] 圖6、低氧抑制GM-CSF和IL-4觸發(fā)的STAT5和STAT6活化誘導(dǎo)的單核來源樹突狀 細(xì)胞在分化過程中的C5aRl的下調(diào)。
[0050] (a)單核細(xì)胞分別在常氧和低氧條件（2 % )下，在有和無 GM-CSF、IL-4或二者聯(lián) 合存在情況下，培養(yǎng)7天后C5aRl的表達(dá)。
[0051] (b)單核細(xì)胞在轉(zhuǎn)染干擾RNA(陰性對(duì)照、STAT5或STAT6)后，在GM-CSF+IL-4存 在情況下，培養(yǎng)4天后C5aRl的表達(dá)。
[0052] (c)單核細(xì)胞分別預(yù)先在常氧和低氧條件（2 % )下36小時(shí)，然后在加入 GM-CSF+IL-4、8小時(shí)前后STAT5和STAT6的表達(dá)。
[0053] (d)單核細(xì)胞分別預(yù)先在常氧和低氧條件（2 % )下36小時(shí)，然后在加入 GM-CSF+IL-4、不同時(shí)間前后STAT5和STAT6磷酸化的水平。
[0054] 圖 7、miR-342-3p 和 miR-210 抑制 STAT5 和 STAT6 信號(hào)途徑。
[0055] (a)在常氧條件下對(duì)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-342_3p的模擬物及其陰性對(duì)照、在低氧條 件下轉(zhuǎn)染miR-342-3p的抑制劑及其陰性對(duì)照，