影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提出了一種影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法。該方法是一種新的評(píng)估精子質(zhì)量與功能的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，可為臨床原因不明的男性不育患者提供檢測(cè)及臨床咨詢(xún)。其特征在于：第一步，通過(guò)單精子熒光強(qiáng)度分析直觀的量化唾液酸酶在精子中的表達(dá)，或者利用顯微鏡下熒光成像直觀的觀察唾液酸酶在精子中的表達(dá)；若唾液酸酶在精子中高表達(dá)，則進(jìn)行第二步，利用體外獲能液使精子獲能，并用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)療檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會(huì)工業(yè)的不斷發(fā)展，不育夫婦的總發(fā)病率明顯升高。2004年歐洲生殖學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì):育齡夫婦I年內(nèi)不能懷孕者占25%，其中15%尋求治療，男方因素引起不育占50%。男性不育的病因有性功能障礙(1.7% )，精索靜脈曲張(12.3% )，生殖道感染(6.6%)，先天性發(fā)育異常(2.1%)后天獲得性疾病(2.6% )，內(nèi)分泌紊亂(0.6%)，免疫性因素(3.1%)，其他異常(3%)，但是高達(dá)609^75%的患者找不到原因，稱(chēng)為特發(fā)性男性不育，他們只表現(xiàn)為少精、弱精或畸形精子癥等精子質(zhì)量異常。不明原因的男性不育可能由于多種因素造成，如長(zhǎng)期應(yīng)激環(huán)境因素引起內(nèi)分泌紊亂、活性氧和基因缺陷等。
[0003]多年來(lái)，傳統(tǒng)的精液常規(guī)分析一直是用于判斷男性生育力的最基本臨床指標(biāo)。臨床上對(duì)絕大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是臨床上大約有三分之一不育患者，男性的常規(guī)精液分析結(jié)果均正常和接近正常。臨床上把這類(lèi)患者劃為不明原因不育癥。因此，長(zhǎng)期以來(lái)，臨床對(duì)男性不育的診斷存在很大的困難。最主要的原因是常規(guī)精液分析只測(cè)定精子的數(shù)量，存活力，活動(dòng)率和形態(tài)。這些指標(biāo)只能反映最基本的精液質(zhì)量，不能反映所有的精子功能，比如，精子核的成熟和DNA損傷，精子與人卵透明帶結(jié)合反應(yīng)與穿透，頂體狀況和反應(yīng)及與卵黃膜結(jié)合能力等。因此，需要建立特殊的精子功能試驗(yàn)才能測(cè)定以上這些功能。精子獲能是精卵結(jié)合形成受精卵的必要條件，雖然精子獲能的相關(guān)研究已有一些進(jìn)展，但仍然存在很多尚未闡明的問(wèn)題。
[0004]臨床工作中，一部分原發(fā)或繼發(fā)的不育男性病人利用現(xiàn)有的常規(guī)精液質(zhì)量檢查項(xiàng)目提示精子及精液質(zhì)量無(wú)異常。目前常用的精子檢測(cè)手段為CASA(計(jì)算機(jī)輔助精子分析Computer aided of semen analysis),以及抗精子抗體等。當(dāng)今最為廣泛使用的CASA技術(shù)和一些形態(tài)學(xué)的相關(guān)檢測(cè)，主要能評(píng)價(jià)精子的活動(dòng)能力和活精子比率，從而推測(cè)其進(jìn)入女性生殖道的受精能力，而依賴(lài)目前的精子功能評(píng)價(jià)體系，對(duì)精子質(zhì)量及功能的評(píng)價(jià)存在一定的缺陷，以及難于給病人提供相應(yīng)的臨床咨詢(xún)`。事實(shí)上，這僅僅是評(píng)價(jià)精子功能的一個(gè)方面，我們應(yīng)該考慮到可能還有影響精子生殖能力的更多沒(méi)有被揭示的因素。
[0005]如文獻(xiàn)“哺乳類(lèi)動(dòng)物精子自身的唾液酸酶參與獲能過(guò)程中的唾液酸脫落，，(Sialidases on mammalian sperm mediate deciduous sialylationduring capacitation,〈〈The Journal of Biological Chemistry)), 2012 Nov2; 287 (45): 38073-9)，首次報(bào)道了精子膜上的唾液酸酶(NEU1/3)是影響精子生殖能力的新因素。唾液酸(sialic acid)在小鼠及人的體外獲能過(guò)程中以單個(gè)糖分子的方式從精子的細(xì)胞膜上脫落，而與此同時(shí)，精子膜上的唾液酸酶(NEU1/3)可能由于精子膜的流動(dòng)性而脫落參與剪切致單個(gè)唾液酸分子脫落，文獻(xiàn)證實(shí)了抑制NEU3的活性會(huì)降低精子的獲能過(guò)程中磷酸化ErK的表達(dá)，以及少量不明原因性不育的病人精子這兩種酶的低表達(dá)。[0006]文獻(xiàn)雖然提出了唾液酸酶可用于評(píng)價(jià)精子功能，并公開(kāi)了小鼠和少量人冰凍精子中唾液酸酶的檢測(cè)方法。但文獻(xiàn)只公開(kāi)了唾液酸酶在精子中的表達(dá)檢測(cè)，并沒(méi)有對(duì)唾液酸酶的活性檢測(cè)作進(jìn)一步報(bào)道；并且，所公開(kāi)的表達(dá)檢測(cè)方法無(wú)法順利檢測(cè)出新鮮精子中的唾液酸酶，還不能適用于臨床應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，提出了一種影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法。該方法是一種新的評(píng)估精子質(zhì)量與功能的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，可為臨床原因不明的男性不育患者提供檢測(cè)及臨床咨詢(xún)。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法，其特征在于:第一步，通過(guò)單精子熒光強(qiáng)度分析直觀的量化唾液酸酶在精子中的表達(dá)，或者利用顯微鏡下熒光成像直觀的觀察唾液酸酶在精子中的表達(dá)；若唾液酸酶在精子中聞表達(dá)，則進(jìn)行第_ 步，利用體外獲能液使精子獲能，并用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性。
[0008]所述的體外獲能液為HSA (人血清白蛋白)5mg/ml HTF (人輸卵管液)。
[0009]所述的第一步，按照下述步驟，分別進(jìn)行精子唾液酸酶NEUl和NEU3的表達(dá)檢測(cè): A收集新鮮液化精液標(biāo)本，低速離心分離出精子，PBS (磷酸緩沖液)洗滌精子，充分除
去殘留的精漿成分；
B計(jì)數(shù)精子數(shù)量，冰上置2(T30 min，用于制動(dòng)精子，便于后續(xù)的操作；` C采用0.1%的Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)對(duì)精子進(jìn)行預(yù)處理，PBS洗滌精子后，用3%的PFA (多聚甲醛)再次對(duì)精子進(jìn)行預(yù)處理；
D當(dāng)檢測(cè)NEUl時(shí)，采用1%的BSA (牛血清白蛋白)-PBS溶液進(jìn)行封閉；或者，當(dāng)檢測(cè)NEU3時(shí)，采用甲醇固定；
E采用lug/ul的抗人NEUl抗體孵育廣3 h，充分保證抗原-抗體結(jié)合時(shí)間，PBS洗滌精子；
F在常溫下，精子在1:1000的常規(guī)熒光二抗中孵育廣2 h ；
G采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)或熒光顯微鏡制作精子的細(xì)胞涂片，觀察唾液酸酶在精子中的表達(dá)。
[0010]所述的第二步，具體操作步驟如下:
A新鮮液化精液標(biāo)本收集，低速離心分離精子，保持精子完整性與活力；
B采用上游法，在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)精子，收獲上游精子，進(jìn)一步獲取活力優(yōu)良的精子，采用Bffff (Biggers, Whitten, and Whittinghamreedit)培養(yǎng)液洗漆精子，充分去除精漿中殘留的蛋白等成分，避免增加非特異性熒光背景和去除一些“去獲能因子”。
[0011]由于精子死后會(huì)釋放唾液酸酶，干擾實(shí)驗(yàn)增加非特異性表達(dá)，采用上游法可保證活力良好的精子獲能，避免死精子。
[0012]C計(jì)數(shù)精子數(shù)量，用體外獲能液HAS 5mg/ml HTF,在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育精子3-4 h ；
D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，收取的上清液再次離心分離，收取上清液，充分去除精子等有形成分，避免增加非特異性熒光背景； E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性。
[0013]所述第一、二步的A步驟，以500飛00 g/min的速度低速離心5?6min,以保證精子形態(tài)完整，與精漿分離。
[0014]所述第二步的B步驟，采用上游法于36?37 1:下，在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10?30min。
[0015]所述第二步的C步驟，計(jì)數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為IXlOVml以上，既保證足夠的接近生理的體外獲能環(huán)境，又使其唾液酸酶活性能夠被檢測(cè)；
所述第二步的C步驟，用體外獲能液HAS 5mg/ml HTF于36?37 °C下，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育:T4 h，反應(yīng)體積10(T200ul。
[0016]因?yàn)榫拥拿富钚韵鄬?duì)細(xì)菌非常低，所以為了保證的靈敏度，必須控制反應(yīng)體積為10(T200ul，既保證獲能又保證酶的可測(cè)的濃度。
[0017]所述第二步的D步驟，先以500?600 g/min的速度低速離心5?6min,再以500(T6000g/min的速度低速離心10?15min,充分去除精子等有形成分。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:
1、本發(fā)明提供了一種影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法，是新的評(píng)估精子質(zhì)量與功能的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，對(duì)患者無(wú)創(chuàng)，為原發(fā)性不育患者提供更多的檢測(cè)指標(biāo)和臨床解釋。
[0019]2、本發(fā)明使用熒光法來(lái)檢測(cè)和評(píng)估精子中的唾液酸酶，由于從精子上脫落的唾液酸酶在獲能過(guò)程中參與了精子表面的唾液酸剪切，因?yàn)闄z測(cè)唾液酸酶的活性理論依據(jù)是用唾液酸酶去剪切帶熒光的唾液酸復(fù)合物，如有活性，帶熒光基團(tuán)分離能產(chǎn)生熒光，所以能檢測(cè)和評(píng)估其活性。因此，本方法是精子的唾液酸酶活性需要的高靈敏度檢測(cè)法。
[0020]3、本發(fā)明在檢測(cè)唾液酸酶在精子中的表達(dá)時(shí)，將精子在冰上置2(T30 min，用于制動(dòng)精子，使新鮮的液化精子活動(dòng)靜止，便于后續(xù)的操作。
[0021]4、本發(fā)明在檢測(cè)唾液酸酶活性時(shí)，采用上游法來(lái)獲取活力優(yōu)良的精子，由于精子死后會(huì)釋放唾液酸酶，干擾實(shí)驗(yàn)增加非特異性表達(dá)，上游法可保證活力良好的精子獲能，避免死精子；同時(shí)，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子，充分去除精漿中殘留的蛋白等成分，避免增加非特異性熒光背景和去除一些“去獲能因子”，保證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
[0022]5、本發(fā)明在檢測(cè)唾液酸酶活性時(shí)，采取兩次離心分離的方法，充分去除精子等有形成分，避免增加非特異性熒光背景。并且，本發(fā)明嚴(yán)格控制離心速度，先以500飛00 g/min的速度低速離心5?6min,再以5000?6000g/min的速度低速離心10?15min,進(jìn)一步充分去除精子等有形成分，避免為檢測(cè)帶來(lái)干擾。
[0023]6、本發(fā)明在米集精子時(shí)，以500?600 g/min的速度低速離心5飛min,以保證精子
形態(tài)完整，與精漿分離完全。
[0024]7、本發(fā)明在檢測(cè)唾液酸酶活性時(shí)，計(jì)數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為IXlOVml以上，既保證足夠的接近生理的體外獲能環(huán)境，又使其唾液酸酶活性能夠被檢測(cè)。
[0025]8、本發(fā)明在檢測(cè)唾液酸酶活性時(shí)，用體外獲能液HAS 5mg/ml HTF于36?37 °C下，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育:T4 h，控制反應(yīng)體積為10(T200ul。因?yàn)榫拥拿富钚韵鄬?duì)細(xì)菌非常低，所以為了保證的靈敏度，必須控制反應(yīng)體積，既保證獲能又保證酶的可測(cè)的濃度?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為唾液酸酶(NEU1/3)在不明原因性男性不育患者的表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0028]實(shí)施例1
影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法，其特征在于:第一步，通過(guò)單精子熒光強(qiáng)度分析直觀的量化唾液酸酶在精子中的表達(dá)，或者利用顯微鏡下熒光成像直觀的觀察唾液酸酶在精子中的表達(dá)；若唾液酸酶在精子中聞表達(dá)，則進(jìn)行第_步，利用體外獲能液使精子獲能，并用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性。
[0029]實(shí)施例2
影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法，其特征在于:第一步，通過(guò)單精子熒光強(qiáng)度分析直觀的量化唾液酸酶在精子中的表達(dá)，或者利用顯微鏡下熒光成像直觀的觀察唾液酸酶在精子中的表達(dá)；若唾液酸酶在精子中聞表達(dá)，則進(jìn)行第_步，利用體外獲能液使精子獲能，并用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性。
[0030]所述的體外獲能液為HSA 5mg/ml HTF。
[0031]實(shí)施例3
本實(shí)施例的實(shí)施方式與實(shí)施例1基本相同，在此基礎(chǔ)上:
按照下述步驟，進(jìn)行精子唾液酸酶NEUl的表達(dá)檢測(cè):
A收集新鮮液化精液標(biāo)本，離心分離出精子，PBS洗滌精子2次；
B計(jì)數(shù)精子數(shù)量，冰上置20 min；
C采用0.1%的Triton X-100對(duì)精子進(jìn)行預(yù)處理，PBS洗滌精子2次，用3%的PFA再次對(duì)精子進(jìn)行預(yù)處理；
D采用1%的BSA-PBS溶液進(jìn)行封閉；
E采用lug/ul的抗人NEUl抗體孵育I h，PBS洗滌精子2次；
F在常溫下，精子在1:1000的常規(guī)熒光二抗中孵育I h ；
G采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)或熒光顯微鏡制作精子的細(xì)胞涂片，觀察唾液酸酶在精子中的表達(dá)。
[0032]實(shí)施例4
本實(shí)施例的實(shí)施方式與實(shí)施例1基本相同，在此基礎(chǔ)上:
按照下述步驟，進(jìn)行精子唾液酸酶NEU3的表達(dá)檢測(cè):
A收集新鮮液化精液標(biāo)本，離心分離出精子，PBS洗滌精子2次；
B計(jì)數(shù)精子數(shù)量，冰上置30 min；
C采用0.1%的Triton X-100對(duì)精子進(jìn)行預(yù)處理，PBS洗滌精子2次，用3%的PFA再次對(duì)精子進(jìn)行預(yù)處理；
D采用甲醇固定；
E采用lug/ul的抗人NEUl抗體孵育3 h，PBS洗滌精子2次；
F在常溫下，精子在1:1000的常規(guī)熒光二抗中孵育2 h ；
G采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)或熒光顯微鏡制作精子的細(xì)胞涂片，觀察唾液酸酶在精子中的表達(dá)。
[0033]實(shí)施例5
本實(shí)施例的實(shí)施方式與實(shí)施例1基本相同，在此基礎(chǔ)上:
按照下述步驟，檢測(cè)唾液酸酶活性:
A收集新鮮液化精液標(biāo)本，離心分離精子；
B采用上游法，在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)精子，收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子。
[0034]C計(jì)數(shù)精子數(shù)量，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF,在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育精子3h ；
D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，收取的上清液再次離心分離，收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性。
[0035]實(shí)施例6
本實(shí)施例的實(shí)施方式與實(shí)施例1基本相同，在此基礎(chǔ)上:
按照下述步驟，檢測(cè)唾液酸酶活性:
A收集新鮮液化精液標(biāo)本，離心分離精子；
B采用上游法于36 1:下，在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min,收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子3次。
[0036]C計(jì)數(shù)精子數(shù)量，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF,在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育精子4 h ;
D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，收取的上清液再次離心分離，收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光藍(lán)法檢測(cè)唾液酸酶活性。
[0037]使用ABCAM的唾液酸酶檢測(cè)試劑盒(Fluorometric - Blue) (abl38888),檢測(cè)獲能上清液中的唾液酸酶活性。
[0038]采用Ex/Em =?320廠450 nm的熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，按陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算唾液酸活性，單位為:uUAUS /I X IO6精子(微單位/I X IO6精子)。
[0039]實(shí)施例7
第一步，按照下述步驟，進(jìn)行精子唾液酸酶NEUl的表達(dá)檢測(cè):
A收集新鮮液化精液標(biāo)本，離心分離出精子，以500 g/min的速度低速離心6min, PBS洗滌精子3次；
B計(jì)數(shù)精子數(shù)量，冰上置25 min；
C采用0.1%的Triton X-100對(duì)精子進(jìn)行預(yù)處理，PBS洗滌精子3次，用3%的PFA再次對(duì)精子進(jìn)行預(yù)處理；
D采用1%的BSA-PBS溶液進(jìn)行封閉；
E采用lug/ul的抗人NEUl抗體孵育2h，PBS洗滌精子3次；
F在常溫下，精子在1:1000的常規(guī)熒光二抗中孵育1.5 h ;
G采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)或熒光顯微鏡制作精子的細(xì)胞涂片，觀察唾液酸酶在精子中的表達(dá)。
[0040]再按照下述步驟，進(jìn)行精子唾液酸酶NEU3的表達(dá)檢測(cè):
A收集新鮮液化精液標(biāo)本，離心分離出精子，以500 g/min的速度低速離心6min, PBS洗滌精子3次；
B計(jì)數(shù)精子數(shù)量，冰上置25 min；
C采用0.1%的Triton X-1OO對(duì)精子進(jìn)行預(yù)處理，PBS洗滌精子3次，用3%的PFA再次對(duì)精子進(jìn)行預(yù)處理；
D采用甲醇固定；
E采用lug/ul的抗人NEUl抗體孵育2h，PBS洗滌精子3次；
F在常溫下，精子在1:1000的常規(guī)熒光二抗中孵育1.5 h ;
G采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)或熒光顯微鏡制作精子的細(xì)胞涂片，觀察唾液酸酶在精子中的表達(dá)。
[0041]流式細(xì)胞儀檢測(cè)后分析單個(gè)精子熒光強(qiáng)度，采用兩種比較方法:a絕對(duì)比較:所檢測(cè)標(biāo)本與抗體的同型對(duì)照(同型對(duì)照是使用與一抗相同種屬來(lái)源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景)b相對(duì)比較:同批量檢測(cè)標(biāo)本之間比較單個(gè)精子熒光強(qiáng)度。
[0042]本發(fā)明利用單精子熒光強(qiáng)度分析(同型對(duì)照/批量對(duì)照)可相對(duì)直觀的量化唾液酸酶在精子的表達(dá)；或者利用顯微鏡下熒光成像可直觀的觀察到唾液酸酶的表達(dá)，所以本發(fā)明采用的是一種直觀成像與相對(duì)量化的檢測(cè)方法來(lái)評(píng)估精子表達(dá)唾液酸酶(NEU1/3)的一種方法。
[0043]上述檢測(cè)發(fā)現(xiàn)唾液酸酶NEUl和唾液酸酶NEU3在精子中的高表達(dá)，第二步，按照如下操作檢測(cè)唾液酸酶活性:
A收集新鮮液化精液標(biāo)本，離心分離精子，以500 g/min的速度低速離心6min ；
B采用上游法于37 1:下，在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子3次。
[0044]C計(jì)數(shù)精子數(shù)量，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF,在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育精子3.5h ；
D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，收取的上清液再次離心分離，收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性。
[0045]實(shí)施例8
本實(shí)施例與實(shí)施例7基本相同，在此基礎(chǔ)上:
按照如下操作檢測(cè)唾液酸酶活性:
A收集新鮮液化精液標(biāo)本，離心分離精子，以600 g/min的速度低速離心5min ;
B采用上游法于36.5 1:下，在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min，收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子3次。
[0046]C計(jì)數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為I X 107/ml以上，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF,在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育精子3.5h ；
D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，收取的上清液再次離心分離，收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性。
[0047]實(shí)施例9
本實(shí)施例與實(shí)施例7基本相同，在此基礎(chǔ)上:
按照如下操作檢測(cè)唾液酸酶活性: A收集新鮮液化精液標(biāo)本，離心分離精子，以550 g/min的速度低速離心5.5min ;
B采用上游法于36°C，在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min,收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子3次。
[0048]C計(jì)數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為IXlOVml以上，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF于36°C，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3.5 h，反應(yīng)體積IOOul。
[0049]D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，以500 g/min的速度低速離心6min,收取的上清液再次離心分離，以5000g/min的速度低速離心15min，收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性。
[0050]實(shí)施例10
本實(shí)施例與實(shí)施例7基本相同，在此基礎(chǔ)上:
按照如下操作檢測(cè)唾液酸酶活性:
A收集新鮮液化精液標(biāo)本，離心分離精子，以580g/min的速度低速離心5min ；
B采用上游法于37 1:下，在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 min，收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子3次。
[0051]C計(jì)數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為IXlOVml以上，用體外獲能液HAS 5mg/ml HTF于370C，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3.5 h，反應(yīng)體積200ul。
[0052]D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，以600 g/min的速度低速離心5 min,收取的上清液再次離心分離，以6000g/min的速度低速離心10 min,收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性。
[0053]實(shí)施例11
本實(shí)施例與實(shí)施例7基本相同，在此基礎(chǔ)上:
按照如下操作檢測(cè)唾液酸酶活性:
A收集新鮮液化精液標(biāo)本，離心分離精子，以520 g/min的速度低速離心5min ;
B采用上游法于36?37 1:下，在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 min，收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子3次。
[0054]C計(jì)數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為IXlOVml以上，用體外獲能液HAS 5mg/ml HTF于36.5°C下，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3.5 h，反應(yīng)體積150ul。
[0055]D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，以540 g/min的速度低速離心5.5min,收取的上清液再次離心分離，以5500g/min的速度低速離心12min，收取上清液；
E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性。
【權(quán)利要求】
1.影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法，其特征在于:第一步，通過(guò)單精子熒光強(qiáng)度分析直觀的量化唾液酸酶在精子中的表達(dá)，或者利用顯微鏡下熒光成像直觀的觀察唾液酸酶在精子中的表達(dá)；若唾液酸酶在精子中聞表達(dá)，則進(jìn)行第 步，利用體外獲能液使精子獲能，并用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法，其特征在于:所述的體外獲能液為HSA 5mg/ml HTF0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法，其特征在于:所述的第一步，按照下述步驟，分別進(jìn)行精子唾液酸酶NEUl和NEU3的表達(dá)檢測(cè): A收集新鮮液化精液標(biāo)本，離心分離出精子，PBS洗滌精子； B計(jì)數(shù)精子數(shù)量，冰上置2(T30 min； C采用0.1%的Triton X-1OO對(duì)精子進(jìn)行預(yù)處理，PBS洗滌精子，用3%的PFA再次對(duì)精子進(jìn)行預(yù)處理； D當(dāng)檢測(cè)NEUl時(shí)，采用1%的BSA-PBS溶液進(jìn)行封閉；或者，當(dāng)檢測(cè)NEU3時(shí)，采用甲醇固定； E采用lug/ul的抗人NEUl抗體孵育I~3 h，PBS洗滌精子； F在常溫下，精子在1:1000的常規(guī)熒光二抗中孵育廣2 h ； G采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)或熒光顯微鏡制作精子的細(xì)胞涂片，觀察唾液酸酶在精子中的表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法，其特征在于:所述的第二步，具體操作步驟如下: A收集新鮮液化精液標(biāo)本，離心分離精子； B采用上游法，在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)精子，收獲上游精子，采用Bffff培養(yǎng)液洗滌精子； C計(jì)數(shù)精子數(shù)量，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF，在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育精子3 ~4 h ； D先將經(jīng)上述操作得到的溶液離心分離，收取的上清液再次離心分離，收取上清液； E立即將獲能后的上清液用熒光法檢測(cè)唾液酸酶活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或者4所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法，其特征在于:所述的A步驟，以500~600 g/min的速度低速離心5~6min。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法，其特征在于:所述的B步驟，采用上游法于36~37 °C，在5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1(T30 min。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法，其特征在于:所述的C步驟，計(jì)數(shù)精子數(shù)量，調(diào)整為IXlOVml以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法，其特征在于:所述的C步驟，用體外獲能液HSA 5mg/ml HTF于36~37 °C，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育: 4 h，反應(yīng)體積100~200ul。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的影響精子功能的唾液酸酶檢測(cè)方法，其特征在于:所述的D步驟，先以500~600 g/min的速度低速離心5~6min,再以5000~6000g/min的速度低速離心`10 ~15 min。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK103454416SQ201310431847
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】馬芳, 許文明, 徐克惠, 岳煥勛, 蔣敏, 歐陽(yáng)運(yùn)薇, 林麗 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西第二醫(yī)院